DE1815862C3 - Process for obtaining a weakly alkaline protease from Aspergillus melleus Amano-Seiyaku KJC, Nagoya, Aichi (Japan) - Google Patents
Process for obtaining a weakly alkaline protease from Aspergillus melleus Amano-Seiyaku KJC, Nagoya, Aichi (Japan)Info
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Description
Zur Reinigung von Enzymen sind bereits verschiedene Verfahren, wie das Aussalzen, die Dialyse, die Adsorption, die Chromatografie, die Elektrophorese, die Gel-Filtration und die Ausfällung mit einem Lösungsmittel oder einem spezifischen Reagens, sowie Kombinationen dieser Maßnahmen bekannt.Various processes such as salting out, dialysis, etc. are already available for the purification of enzymes Adsorption, chromatography, electrophoresis, gel filtration and solvent precipitation or a specific reagent, as well as combinations of these measures are known.
Diese Reinigungsverfahren bereiten jedoch große Schwierigkeiten, wenn man sie im technischen Maßstab durchführen will. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die genannten Verfahren aufwendiig sind, die Ausbeute der Protease verringern und lange Betriebszeiten erfordern. So wird ein typisches Verfahren zur Kristallisierung einer schwach alkalischen Protease nach d^m Dialyseverfahren folgendermaßen durchgeführt:However, these purification processes present great difficulties when they are used on an industrial scale want to perform. This is due to the fact that the processes mentioned are expensive, the yield of the Decrease protease and require long periods of operation. So becomes a typical process for crystallization a weakly alkaline protease after the dialysis process carried out as follows:
Die Taka-Diastase, die ein Stoffwechselprodukt von Aspergillus oryzae darstellt, wird zur Ausfällung der Verunreinigungen mit einer 100/oigen Calciumacetatlösung behandelt. Daran schließt sich eine weitere stufenweise Behandlung mit Aceton, Ammomiumsulfat und eine Dialyse an. Am Schluß wird das vorgereinigte Produkt zur Entfernung weiterer Verunreinigungen, wie unerwünschter Protease und Amylase, mit einer 2%igen Acrinol- (oder 2-Äthoxy-6.9-diamino-acridinlaktat)-lösung behandelt.The Taka-diastase, which is a metabolic product of Aspergillus oryzae, is treated to precipitate the impurities with a 10 0 / o calcium acetate. This is followed by a further step-by-step treatment with acetone, ammonium sulfate and dialysis. Finally, the pre-purified product is treated with a 2% acrinol (or 2-ethoxy-6.9-diamino-acridine lactate) solution to remove further impurities, such as undesired protease and amylase.
Ein anderes bekanntes Dialyseverfahren zur Kristallisierung einer schwach alkalischen Protease geht folgendermaßen vonstatten: <ioAnother known dialysis method for crystallization a weakly alkaline protease proceeds as follows: <io
Die Taka-Diastase wird mit einer Bleiacetatlösung behandelt und hierauf mit Ammoniumsulfat ausgesalzt Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung des Ammoniumsulfats dialysiert, worauf die Verunreinigungen mit Acrinol ausgefällt werden. Hierauf schließt sich eine Adsorptionsreinigung mit Stärke in 40%igem Alkohol zur Entfernung weiterer Verunreinigungen an, worauf die Protease mit Alkohol und Aceton ausgefällt wird.The Taka diastase is treated with a lead acetate solution and then salted out with ammonium sulfate The product obtained is dialyzed to remove the ammonium sulphate, whereupon the impurities be precipitated with acrinol. This is followed by adsorption cleaning with 40% starch Alcohol to remove further impurities, whereupon the protease is precipitated with alcohol and acetone will.
Zur Reinigung und Kristallisierung verschiedener <« Enzymarten wurde auch schon die Adsorption dieser Enzyme an anorganischen Adsorbentien, wie Bentonit, Kaolin, saurem Ton und Aktivkohle, vorgeschlagen. Hierzu wurden Tone eingesetzt, deren Hauptkomponente Aluminiumsilikat isl; und deren Acidität und i>5 Adsorptionsfähigkeit für die Proteinsubstanz entsprechend variiert wurde. Diese Tone können die Enzyme im sauren Zustand adsorbieren und setzen sie im neutralen oder schwach basischen Zustand wieder frei Die Reinigung kann chargenweise unter Verwendung der pulverförmigem Adsorbentien durchgeführt werden. Es wurde auch schon ein Calciumphosphatgel als anorganisches Absorbens eingesetzt, doch besitzt es keine selektive Adsorptionsfähigkeit für das Enzym und ist daher nicht wirksam.For cleaning and crystallizing various <« The adsorption of these enzymes on inorganic adsorbents such as bentonite, Kaolin, acid clay, and activated charcoal are suggested. For this purpose, clays were used, their main component Aluminum silicate isl; and their acidity and i> 5 Adsorptive capacity for the protein substance was varied accordingly. These clays can make the enzymes adsorb in the acidic state and release them again in the neutral or weakly basic state The purification can be carried out batchwise using the powdery adsorbents. Calcium phosphate gel has also been used as an inorganic absorbent, but it has does not have a selective adsorbability for the enzyme and is therefore ineffective.
Es wurde auch schon vorgeschlagen, Protease durch Adsorption der Protease auf einem organischen Adsorbens, wie einem Ionenaustauscher, insbesondere einem Kationenaustauscher, zu reinigen. So wird zur Reinigung und Kristallisierung der durch Züchten der Stämme Aspergillus sojae gebildeten alkalischen Protease Kationenaustauscher verwendet Ein Beispiel hierfür ist ein Copolymeres aus Methacrylsäure und Divinylbenzol. Dieses Reinigungsverfahren ist jedoch nicht großtechnisch durchführbar, da es aufwendig ist, gro'ße Pufferlösungen benötigt und den Durchsatz großer Mengen der rohen Protease nicht gestattetIt has also been proposed to produce protease by adsorbing the protease onto an organic To purify adsorbent, such as an ion exchanger, in particular a cation exchanger. So becomes Purification and crystallization of the alkaline protease formed by growing the Aspergillus sojae strains Cation exchanger used An example of this is a copolymer of methacrylic acid and Divinylbenzene. However, this cleaning process cannot be carried out on an industrial scale because it is expensive large buffer solutions are required and the throughput of large amounts of the crude protease is not permitted
In der DT-AS 10 36 192 wird ein Verfahren zur Entfärbung von verunreinigter Taka-Diastase-Lösung beschrieben, wobei eine Reinigung der in der Diastase enthaltenen Protease erzielt wird. Bei diesem bekannten Verfahren wird die Lösung über eine Säule mit dem Anionenaustauscher Duolite A-2 in der Acetatform geleitet. Bei Verwendung eines solchen Anionenaustauschers ist zwar eine Entfärbung erzielbar. doch ist die Auskristallisation des angestrebten Enzyms nur mit geringerer Geschwindigkeit erzielbar so daß dieses Verfahren für die technische Herstellung nicht anwendbar ist. Durch Zugabe eines geeigneten organischen Lösungsmittels kann nur eine geringe Vergrößerung der Kristallisationsgeschwindigkeit erzielt werden.In the DT-AS 10 36 192 a process for decolorizing contaminated taka diastase solution described, wherein a purification of the protease contained in the diastase is achieved. With this well-known The solution is passed through a column with the anion exchanger Duolite A-2 in the acetate form directed. When using such an anion exchanger, discoloration can be achieved. but it is Crystallization of the desired enzyme can only be achieved at a slower rate so that this Process for technical manufacture is not applicable. By adding a suitable organic Solvent only a slight increase in the rate of crystallization can be achieved.
Weiterhin wird bei dem bekannten Verfahren der DT-AS 10 36 192 keine Protease verwendet, die durch Züchten von Aspergillus melleus-Stämmen hergestellt worden ist.Furthermore, no protease is used in the known method of DT-AS 10 36 192, which by Breeding of Aspergillus melleus strains has been produced.
Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, eine durch Züchten von Aspergillus melleus-Stämmen hergestellte, rohe, schwach alkalische Protease in der Weise zu reinigen, daß eine Aktivitätserhöhung stattfindet, und daß das Enzym im kristallinen Zustand erhalten werden kann.The invention is now based on the object of providing one by breeding Aspergillus melleus strains to purify produced, crude, weakly alkaline protease in such a way that an increase in activity takes place and that the enzyme can be obtained in the crystalline state.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Gegenstand der Erfindung ist der im Anspruch definierte Gegenstand.This object is achieved by the invention. The subject of the invention is that in the claim defined subject.
Diese Anionenaustauscher-Harze in der AcetatForm können die schwach alkalische Protease nicht absorbieren. Vielmehr werden an ihnen die in dem rohen Enzym vorliegenden Verunreinigungen absorbiert. Aus der Lösung der gereinigten Protease von Aspergillus melleus kann dann die schwach alkalische Protease kristallisiert werden.These anion exchange resins in the acetate form cannot absorb the weakly alkaline protease. Rather, the impurities present in the crude enzyme are absorbed on them. From the Solution of the purified protease from Aspergillus melleus can then form the weakly alkaline protease be crystallized.
Das erfindungsgemäße Verfahren bringt verschiedene Vorteile mit sich. So kann die kristallisierte, schwach alkalische Protease im großen Maßstab hergestellt werden. Die Aktivität der erhaltenen Proteas« wird nicht verringert. Weiterhin können auch andere Verunreinigungen als diejenigen, die durch die übliche Lösungsmittelbehandlung entfernt werden können, sowie weitere Enzyme, sowie die alkalische Phosphatase, die saure Protease usw., herausgereinigt werden. Schließlich kann auf die Anwendung technischer Verfahren, wie des Aussalzens, der Dialyse, der Absorption der Chromatografie und der Ausfällung mit Acrinol, die bei der herkömmlichen Kristallisation der Enzyme unerläßliche Verfahrensschritte darstellen, verzichtet werden.The method according to the invention has various advantages. So can the crystallized, weak alkaline protease can be produced on a large scale. The activity of the proteas obtained «will not decreased. Furthermore, other impurities than those caused by the usual can also Solvent treatment can be removed, as well as other enzymes, such as alkaline phosphatase, the acidic protease, etc., can be purified out. Finally, the application can be more technical Processes such as salting out, dialysis, absorption chromatography and precipitation with Acrinol, which are indispensable process steps in the conventional crystallization of enzymes, be waived.
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Die Erfindung wird in dem Beispiel erläutert Herstellung der rohen EnzymeThe invention is illustrated in the example Preparation of the crude enzymes
Die in der Tabelle I angegebenen Stämme wurden in 4 kg eines Weizenkleie-Mediums, das 50 % Wasser enthielt, inkubiert Die einzelnen Stämme wurden 5 Tage bei 25° C kultiviert Die erhaltene fermentierte Kleie wurde mit Wasser im Gegenstrom ausgewaschen, bis ein Extrakt von 0,81 erhalten wurde. Nach Einstellen des pH-Wertes des Extraktes auf 8,5 durch Zugabe von to pulverisiertem gelöschten Kalk, wurde kaltes Äthanol ( — 10° C) zu dem Extrakt in der gleichen Volumenmenge zugesetzt, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt. Der resultierende Extrakt wurde mit kaltem Äthanol in der «5 zweifachen Volumenmenge des Extraktes vermischt, wodurch ein Niederschlag erhalten wurde. Dieser Niederschlag wurde von der Mutterlauge abgetrennt und im Vakuum zu einem rohen Enzymprodukt getrocknetThe strains given in Table I were grown in 4 kg of a wheat bran medium containing 50% water The individual strains were cultivated for 5 days at 25 ° C. The fermented strains obtained were obtained Bran was washed with countercurrent water until an extract of 0.81 was obtained. After setting the pH of the extract to 8.5 by adding to pulverized slaked lime, became cold ethanol (- 10 ° C) to the extract in the same volume added to form a precipitate. The precipitate was removed by filtration. the The resulting extract was treated with cold ethanol in the «5 twice the volume of the extract mixed, whereby a precipitate was obtained. This Precipitate was separated from the mother liquor and converted to a crude enzyme product in vacuo dried
Beispiel
und Vergleichsbeispiel (nachgereicht)example
and comparative example (submitted later)
Reinigung der rohen EnzymePurification of the raw enzymes
und deren Kristallisationand their crystallization
5 g der auf diese Weise erhaltenen rohen Enzyme wurden in 100 ml gereinigtem Wasser aufgelöst, wodurch die entsprechenden Lösungen des rohen Enzyms erhalten wurden. Die rohen Enzymlösungen wurden durch eine 100-ml-Säule geleitet, welche ein Anionenaustauscher-Harz gemäß der Erfindungsdefinition in der Acetatform enthielt. Das Durchleiten der Enzymlösung erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/min. Sodann wurde gereinigtes Wasser durch die Säule geleitet und es wurde ein Eluat mit einer Protease-Aktivität in einer Menge von 200 ml erhalten. Dieses Eluat wurde jeweils mit 600 ml kaltem Äthanol vermischt, wodurch ein Enzymniederschlag erhalten wurde. Der Enzymniederschlag wurde abzentrifugiert und das abgetrennte Enzym wurde in 50 ml gereinigtem Wasser zu einer wäßrigen Enzymlösung aufgelöst In identischer Weise wurde sodann mit Aceton eine Kristallisation der Proteasen aus diesen Lösungen versucht Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt5 g of the crude enzymes obtained in this way were dissolved in 100 ml of purified water, whereby the corresponding solutions of the crude enzyme were obtained. The raw enzyme solutions were passed through a 100 ml column, which a Anion exchange resin according to the definition of the invention in the acetate form. Passing the Enzyme dissolution occurred at a rate of 3 ml / min. Purified water was then through the Passed column and there was obtained an eluate having a protease activity in an amount of 200 ml. This eluate was mixed with each 600 ml of cold ethanol, whereby an enzyme precipitate was obtained would. The enzyme precipitate was centrifuged off and the separated enzyme was purified in 50 ml Water dissolved to form an aqueous enzyme solution. An identical solution was then made with acetone Crystallization of the proteases attempted from these solutions. The results obtained are shown in Table I. compiled
Daraus wird ersichtlich, daß nur 3 Stämme, nämlich Aspergillus melieus Amano Nr. 35, -ATCC 1032 und -ATCC 16889 eine alkalische Protease bilden können, die kristallisierbar war. Die anderen rohen Enzyme können zwar — wie aus der Tabelle ersichtlich wird — gereinigt und hinsichtlich ihrer spezifischen Aktivität erhöht werden, doch können sie nicht wie die 3 alkalischen Proteasen der 3 Aspergillus melleus-Stämme kristalHsiert werden.From this it can be seen that only 3 strains, namely Aspergillus melieus Amano No. 35, -ATCC 1032 and -ATCC 16889 can produce an alkaline protease that was crystallizable. The other raw enzymes can - as can be seen from the table - cleaned and with regard to their specific activity but they cannot be increased like the 3 alkaline proteases of the 3 Aspergillus melleus strains be crystallized.
Die Aktivität der alkalischen Protease wurde nach der Anson-Hagihara-Methode bestimmt; hierzu wurde im Einzelnen so vorgegangen:The activity of the alkaline protease was determined by the Anson-Hagihara method; this became proceeded as follows:
1 ml der Enzymlösung, deren Aktivität bestimmt werden sollte, wurde zu 5 ml einer 0,1 m Na2HPO.r KH2PO4-Pufferlösung (pH = 8,0) gegt">cp, welche 0,6% Casein (Merck nach Hammarsten) enthielt. Das Enzym wurde 10 Minuten bei 37° C inkubiert Die resultierende Lösung wurde mit 5 ml einer Lösung vermischt, die Trichloressigsäure in einer Konzentration von 0,11 Mol, Natriumacetat in einer Konzentration von 0,22 Mol und Essigsäure in einer Konzentration von 033 Mol enthielt, um das nicht umgesetzte Casein zu koagulieren. Sodann wurde die Lösung filtriert, 2 ml des erhaltenen Filtrats wurden zu 5 ml einer Lösung gegeben, welche Natriumcarbonat in einer Konzentration von 035 Mol enthielt. Hierzu wurde 1 ml Folin-Reagens, das zuvor mit Wasser auf das dreifache Volumen verdünnt worden war, zugegeben und das resultierende Gemisch wurde 30 Minuten auf 37° C erhitzt. Sodann wurde die Adsorption des resultierenden Gemisches bei einer Wellenlänge von 660 Γημ bestimmt. Die Enzymmenge, die zur Bildung von 10 μg Tyrosin je Minute erforderlich ist wird als eine Proteaseeinheit(l PE) bezeichnet1 ml of the enzyme solution, the activity of which was to be determined, was added to 5 ml of a 0.1 M Na2HPO.r KH 2 PO 4 buffer solution (pH = 8.0) "> cp, which contains 0.6% casein (Merck nach Hammarsten) The enzyme was incubated for 10 minutes at 37 ° C. The resulting solution was mixed with 5 ml of a solution containing trichloroacetic acid in a concentration of 0.11 mol, sodium acetate in a concentration of 0.22 mol and acetic acid in a concentration of 033 mol to coagulate the unreacted casein. Then the solution was filtered, 2 ml of the obtained filtrate was added to 5 ml of a solution containing sodium carbonate in a concentration of 035 mol. To this was added 1 ml of Folin's reagent, which had previously been diluted to three times its volume with water, was added and the resulting mixture was heated for 30 minutes at 37 ° C. The adsorption of the resulting mixture was then determined at a wavelength of 660 μm g of 10 μg tyrosine is required per minute is referred to as one protease unit (l PU)
Stammtribe
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
AspergillusAspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
melieus Amano Nr. 35 melieus ATCC 1032 melieus ATCC 16889 oryzae IAM 2686melieus Amano No. 35 melieus ATCC 1032 melieus ATCC 16889 oryzae IAM 2686
oryzae var microsporus IAM 2750 oryzae var magnasporus IAM 2660 aureus var acidus IAM 2281 aureus var brevis IAM 2396 awamori IAM 2299oryzae var microsporus IAM 2750 oryzae var magnasporus IAM 2660 aureus var acidus IAM 2281 aureus var brevis IAM 2396 awamori IAM 2299
awamori var minimus IAM 2349 candidus IAM 2015awamori var minimus IAM 2349 candidus IAM 2015
chevalerie IAM 2001 deflectus IAM 2010chevalerie IAM 2001 deflectus IAM 2010
fished IAM 2033 fished IAM 2033
flavus IAM 2007flavus IAM 2007
fumigatus IAM 2004fumigatus IAM 2004
Fortsetzungcontinuation
Stammtribe
Aspergillus giganteus IAM 2047 Aspergillus inui IAM 2255 Aspergillus nidulaas IAM 2067 Aspergillus niger IAM 2020 Aspergillus sojae IAM 2631 Aspergillus Itamarii IAM 2137Aspergillus giganteus IAM 2047 Aspergillus inui IAM 2255 Aspergillus nidulaas IAM 2067 Aspergillus niger IAM 2020 Aspergillus sojae IAM 2631 Aspergillus Itamarii IAM 2137
Das Zeichen + bedeutet, daß die rohen Enzyme kristallisiert werden konnten. Das Zeichen — bedeutet, daß die rohen Enzyme nicht kristallisiert werden konnten.The + sign means that the crude enzymes could be crystallized. The sign - means that the crude enzymes could not be crystallized.
Die Aktivität (PE/g) der kristallinen Enzyme wurde nach der »Anson-Hagihara-Methode« bestimmtThe activity (PU / g) of the crystalline enzymes was determined using the “Anson-Hagihara method”
!"ν, ί '.ir ν-! "ν, ί '.ir ν-
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19681815862 DE1815862C3 (en) | 1968-12-19 | Process for obtaining a weakly alkaline protease from Aspergillus melleus Amano-Seiyaku KJC, Nagoya, Aichi (Japan) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19681815862 DE1815862C3 (en) | 1968-12-19 | Process for obtaining a weakly alkaline protease from Aspergillus melleus Amano-Seiyaku KJC, Nagoya, Aichi (Japan) |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1815862A1 DE1815862A1 (en) | 1970-10-22 |
| DE1815862B2 DE1815862B2 (en) | 1976-09-30 |
| DE1815862C3 true DE1815862C3 (en) | 1977-05-18 |
Family
ID=
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