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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum enzymatischen Enthaaren von Häuten. Bei dem alten Enthaarungsverfahren wurden die Häute in ein Bad gebracht, das Calciumhydroxyd und Natriumsulfid enthielt und einen pH-Wert von etwa 12 hatte. Dieses Enthaarungsverfahren ist schädlich für die Haare, die eventuell von kommerziellem Wert sind.
Während der letzten Jahre sind Enthaarungsmittelzusammensetzungen verwendet worden, die proteolytische Enzyme enthalten, und das Enthaaren ist bei einem niedrigeren PH-Wert von 7 bis 10, bei dem die Haare nicht beschädigt werden, durchgeführt worden. Anderseits wird keine erhebliche Quellung der Felle und Häute erreicht, wie es bei dem alten Enthaarungsverfahren der Fall war, was bei der weiteren Verarbeitung der Felle und Häute zu Schwierigkeiten führt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zum enzymatischen Enthaaren von geweichten Häuten mit proteolytischen Enzymen in alkalischer Flotte, ist dadurch gekennzeichnet, dass die Häute mit Enzymen, die eine optimale proteolytische Aktivität gegen Hämoglobin in Gegenwart von Harnstoff bei einem pH-Wert von mindestens 10 zeigen, behandelt werden.
Diese proteolytischen Enzyme sind bisher unbekannt, und ihr Vorhandensein in Enthaarungsmittelzusammen- setzungen stellt eine wesentliche Verbesserung auf diesem Fachgebiet dar.
Während des Stoffwechsels bilden eine grosse Anzahl von bisher unbekannten Bakterien proteolytische Enzyme, die eine schon erwähnte optimale proteolytische Aktivität zeigen.
Aus Proben von Erde, Tierdung und einer Reihe anderer in der Natur vorkommender Quellen haben die Erfinder etwa 100 Bakterienstämme isoliert, sie haben taxonomische Untersuchungen durchgeführt und festgestellt, dass all die bisher unbekannten Bakterien zu der Gattung Bacillus gehörten, dass aber keine von ihnen zu irgendeiner den Erfindern bekannten Art gehörten, und dass sie nach bestem Wissen der Erfinder nicht zu diesen Arten gehörten. Ausserdem gab es innerhalb der gleichen Arten in den meisten Fällen verschiedene Stämme und verschiedene Abarten.
Um die oben genannten, bisher unbekannten Bakterien zu isolieren, wurde ein neuartiges Verfahren verwendet.
Die Proben von Erde, Tierdung und anderen in der Natur vorkommenden Quellen wurden auf Nährmedien und mit einem hohen pH-Wert (9 bis 11) gebracht, und die Bakterien, die unter derartigen alkalischen Bedingungen wachsen können, werden dann isoliert und weiteren Untersuchungen hinsichtlich der Arten und Enzymproduktion unterzogen.
In den meisten Fällen werden auch eine Reihe von verschiedenen Anreicherungsverfahren angewendet.
Anreicherungsverfahren sind den Fachleuten bekannt. Wir können aufHayaishi in"Methods in Enzymology", Bd. l S. 126 bis 131 verweisen. Ein Prinzip besteht darin, eine aus der Natur kommende Probe auf einem Nährmedium mit einer spezifischen und ausgewählten Zusammensetzung, die das Wachstum eines Mikroorganismus begünstigt, der Stoffwechselprodukte mit den gewünschten Eigenschaften erzeugt, wachsen zu lassen. Ein weiteres Prinzip besteht darin, die aus der Natur kommende Probe zusammen mit einer Verbindung, z. B. einem anorganischen Salz, die die Entwicklung des gewünschten Mikroorganismus begünstigt, zu lagern (s. M. A. El-Nakeeb und H. A. Lechevalier, Appl.
Miorobiol., Bd. 11 [1963], S. 75, und danach die Probe auf ein geeignetes Nährmedium, dessen pH-Wert auf Werte zwischen 8 und 12 eingestellt ist, aufzubringen.
Einige der bisher unbekannten Mitglieder der Gattung Bacillus, die isoliert und taxonomisch auf die Erzeugung proteolytischer Enzyme untersucht wurden, sind inderbeiliegenden Tabelle I zusammengefasst, in der die erste Spalte die Bezugszahl der Erfinder, die zweite Spalte die Nummer, unter der das Bakterium bei The National Collection of Industrial Bacteria, Terry Research Station, Aberdeen, Scotland eingetragen wurde, die dritte Spalte die Isolierungsquelle und die vierte Spalte die verwendete Anreicherungsmethode enthält,
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EMI2.1
EMI2.2
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
EMI3.2
<Desc/Clms Page number 4>
inTabelle 1 (Fortsetzung)
EMI4.1
<tb>
<tb> Bezugs-Nr.
<SEP> NCIB-Isolierungsquelle <SEP> Anreicherungsmethode
<tb> Nummer
<tb> C <SEP> 413 <SEP> 10327 <SEP> Lehm <SEP> von <SEP> Wiese, <SEP> Stärkeanreicherung <SEP> (pH <SEP> 11)
<tb> aus <SEP> Ascheberg, <SEP> mit <SEP> anorganischem <SEP> Stickstoff
<tb> Holstein
<tb>
Die taxonomischen Untersuchungen all dieser Mitglieder der Gattung Bacillus wurden durchgeführt, wobei die von Smith, Gordon & Clark in "Aerobic Spore-forming Bacteria", U. S. Department of Agr., Monograph Nr. 16 [1952] beschriebenen Methoden angewendet wurden.
Bis jetzt werden diese Methoden als die geeignetsten angesehen, sie wurden jedoch angesichts der Tatsache, dass alle Nährmedien auf einen viel höheren pH-Wert als die von Smith, Gordon & Clark angegebenen Werte eingestellt werden mussten, da die in Tabelle I aufgeführten Bacillus-Arten bei höheren pH-Werten wachsen, modifiziert.
Die Bakterien können ziemlich genau in morphologische Gruppen eingeteilt werden. Diese Gruppen unterscheiden sich voneinander in einem Masse, dass sie eigentlich getrennte Arten darstellen.
Innerhalb der morphologischen Gruppen werden Schwankungen der biochemischen Reaktionen festgestellt.
Auf Grund dieser Schwankungen sind die Gruppen in Abarten aufgeteilt worden, die von einem oder mehreren Stämmen gebildet werden.
Die taxonomischen Untersuchungen werden in der Beschreibung der österr. Patentschrift Nr. 299101 beschrieben.
Auf Grund der taxonomischen Untersuchungen der Erfinder sollten die in Tabelle I aufgeführten Mitglieder der Gattung Bacillus so klassifiziert werden, wie es aus der Tabelle II hervorgeht.
Tabelle II
EMI4.2
<tb>
<tb> Arten <SEP> Abart <SEP> Stämme
<tb> a <SEP> C <SEP> 300, <SEP> C <SEP> 301, <SEP> C <SEP> 360
<tb> C <SEP> 372, <SEP> C <SEP> 374
<tb> b <SEP> C <SEP> 302, <SEP> C <SEP> 334 <SEP>
<tb> I
<tb> c <SEP> C <SEP> 323, <SEP> C <SEP> 339, <SEP> C <SEP> 352 <SEP>
<tb> C <SEP> 369 <SEP>
<tb> d <SEP> C <SEP> 304, <SEP> C <SEP> 311, <SEP> C <SEP> 335 <SEP>
<tb> , <SEP> f.
<SEP>
<tb> n <SEP> C <SEP> 335, <SEP> C <SEP> 341 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 303, <SEP> C <SEP> 354, <SEP> C <SEP> 357 <SEP>
<tb> C <SEP> 366, <SEP> C <SEP> 367, <SEP> C <SEP> 371 <SEP>
<tb> C <SEP> 357, <SEP> C <SEP> 378 <SEP>
<tb> IV <SEP> b <SEP> C <SEP> 351, <SEP> C <SEP> 356, <SEP> C <SEP> 364 <SEP>
<tb> C376, <SEP> C377, <SEP> C411 <SEP>
<tb> c <SEP> C358, <SEP> C410 <SEP>
<tb> V <SEP> C <SEP> 365, <SEP> C <SEP> 412 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 373 <SEP>
<tb> VI
<tb> b <SEP> C <SEP> 325, <SEP> C <SEP> 413 <SEP>
<tb> VII <SEP> C <SEP> 370
<tb>
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Die proteolytischen Enzyme, die im erfindungsgemässen Verfahren zum Enthaaren von Häuten verwendet werden, können durch aerobe Züchtung irgendwelcher in Tabellen I und II aufgeführten Arten und Stämme erzeugt werden.
Die Züchtung wird in Übereinstimmung mit den in der Fachwelt bekannten Prinzipien durchgeführt, abgesehen davon, dass das Nährmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoffquellen enthält, während der Züchtung bei einem höheren pH-Wert als bisher gehalten wird, u. zw. vorzugsweise zwischen 7,5 und 10, 5.
Die erhaltenen Ausbeuten werden mit Hilfe der bekannten Ansonschen Hämoglobinmethode, s. Journal of General Physiology, Bd. 22 [1939] S. 79 bis 89 bestimmt. In dieser Beschreibung bedeutet eine Anson-Einheit die Menge proteolytischen Enzyms, die Hämoglobin bei einem pH-Wert von 10, 1 und einer Temperatur von 250C während einer Reaktionszeit von 10 min mit einer derartigen Anfangsgeschwindigkeit zersetzt, dass pro Minute eine derartige Menge von nicht mit Trichloressigsäure auszufällenden Spaltprodukten gebildet wird, dass diese Spaltprodukte mit einem Phenolreagenz die gleiche Farbe ergeben wie ein Milliäquivalent Tyrosin.
Das Nährmedium ist in Übereinstimmung mit den im Fachgebiet bekannten Prinzipien zusammengesetzt
EMI5.1
Getreide-, Malz-, Reis-, Sorghummehl usw. Die Kohlehydratkonzentration kann sehr schwanken, d. h. von bis zu 25% bis herunter auf 1 bis 51o, gewöhnlich sind jedoch 8 bis l o geeignet, wobei der Prozentsatz auf Dextrose berechnet ist. Es ist festgestellt worden, dass das Vorhandensein von Kohlehydraten im Nährmedium zur Bildung von sauren Bestandteilen führt, was während der Züchtung in einem Absinken des pH-Wertes resultiert. Da es äusserst wichtig ist, einen pH-Wert des Nährmediums zwischen 7 und 12 während der Züchtung aufrechtzuerhalten, sollten Messungen durchgeführt werden, so dass der pH-Wert nicht für eine längere Zeit während der Züchtung unter 7 sinkt.
Um den pH-Wert innerhalb des erforderlichen Bereiches zu halten, kann eine begrenzte Menge Kohlehydrate zusammen mit einer Puffersubstanz verwendet werden, die den erforderlichen pH-Wert aufrechterhalten kann. Es ist festgestellt worden, dass Karbonate, und besonders Sesquikarbonate, die in dem Medium bis zu einer Konzentration von 0, 2 M verwendet werden, einen pH-Wert von etwa 10,5 bzw. 9,3 hervorrufen können.
Andere Puffersysteme, wie Phosphatpuffer, können ebenfalls verwendet werden.
Es ist ebenfalls möglich, die Züchtung mit einem niedrigen Kohlehydratgehalt zu beginnen und kleine Mengen Kohlehydrate nacheinander während der Züchtung zuzugeben.
Eine dritte Möglichkeit besteht darin, durch Zugabe von verschiedenen basisch reagierenden Substanzen, die auf diesem Fachgebiet verwendet werden, die automatische pH-Regelung einzusetzen.
Die Verwendung von Karbonaten und Sesquikarbonaten als pH-Wert regulierende Substanzen ist sehr nützlich, und es ist überraschend, dass es während der Züchtung möglich ist, diese Verbindungen in den genannten Konzentrationen zu verwenden.
Die Stickstoffquelle in dem Nährmedium kann anorganischer und/oder organischer Art sein. Geeignete anorganische Stickstoffquellen sind manchmal Nitrate und Ammoniumsalze, und von den organischen Stickstoffquellen sind ziemlich viele wegen ihrer Verwendung in Gärvorgängen und bei der Züchtung von Bakterien bekannt. Illustrierende Beispiele sind Sojamehl, Baumwollsamen- und Erdnussmehl, Kasein, zum Quellen von Mais verwendete Flüssigkeit, Hefeextrakte, Harnstoff, Albumin usw.
Daneben sollte das Nährmedium natürlich die üblichen Spurensubstanzen enthalten.
Die Temperatur, bei der die Züchtung stattfindet, liegt normalerweise im gleichen Bereich, der für die Züchtung der bekannten Arten der Gattung Bacillus zur Anwendung kommt. Gewöhnlich ist eine Temperatur zwischen 25 und 550C angebracht. Vorzugsweise liegt die Temperatur zwischen 30 und 40oC.
Da die Züchtung unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden muss, ist es bei der Verwendung von Gär-
EMI5.2
tungsverfahren angewendet wird, ähnlich.
Im allgemeinen wird man nach einer Züchtungszeit von 1 bis 5 Tagen maximale Ausbeuten proteolytischer Enzyme erhalten.
Illustrierende Beispiele geeigneter Züchtungsmedien sind folgende :
1) Medium BPFA mit der folgenden Zusammensetzung :
EMI5.3
<tb>
<tb> Kartoffelmehl <SEP> 50 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Saccharose <SEP> 50 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Gerstenmehl <SEP> 50 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Sojamehl <SEP> 20 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Natriumkaseinat <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> NaHPO. <SEP> IZHO <SEP> 9 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Polyoxypropylenglycol <SEP> (Emulgator) <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
2) Medium BSX mit der folgenden Zusammensetzung :
EMI6.1
<tb>
<tb> Gerstenmehl <SEP> 100 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Sojamehl <SEP> 30 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Polyoxypropylenglykol <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb>
Diese beiden Medien werden durch Zugabe von Sesquikarbonat oder Natron unter sterilen Bedingungen auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Vor der Sterilisation wird anwesende Stärke mittels Cl-Amylase verflüssigt.
Die beiden Züchtungsmedien BPFA und BSX bringen bei Unterwasserzüchtung in Tanks mit künstlicher Belüftung unter Verwendung von 550 1 fassenden rostfreien Stahltanks die Ergebnisse, die in der Tabelle III, die auch Informationen über die verwendeten Stämme und die Züchtungsbedingungen enthält, zusammengefasst sind.
Tabelle III
EMI6.2
<tb>
<tb> Stamm <SEP> C <SEP> 335 <SEP> C <SEP> 339 <SEP> C <SEP> 351 <SEP>
<tb> Medium <SEP> BPFA <SEP> BPFA <SEP> BSX
<tb> pH-Wert <SEP> vor
<tb> Inokulation <SEP> 10,2 <SEP> 10,5 <SEP> 10,2
<tb> Züchtungstemperatur <SEP> in
<tb> Grad <SEP> Celsius <SEP> 34 <SEP> 34 <SEP> 34
<tb> cm3 <SEP> Luft/min <SEP> 0,25 <SEP> 0,25 <SEP> 0,3
<tb> Züchtungszeit
<tb> in <SEP> Stunden <SEP> 84 <SEP> 97 <SEP> 83
<tb> Letzter <SEP> pH-Wert <SEP> 9,2 <SEP> 9, <SEP> 1 <SEP> 9,35
<tb> Letzte <SEP> proteolytische
<tb> Aktivität, <SEP> ausgedrückt
<tb> in <SEP> Anson-Einheiten
<tb> pro <SEP> kg <SEP> Substrat <SEP> 40 <SEP> 29 <SEP> 33
<tb>
Mit dem Stamm C 303 wurden in vier Durchgängen bei verschiedenen Bedingungen die in der folgenden Tabelle IV zusammengefassten Ergebnisse erzielt,
Tabelle IV
EMI6.3
<tb>
<tb> Züchtung <SEP> Nr.
<SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Gerstenmehl <SEP> g/l <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 150 <SEP> 200
<tb> Sojamehl <SEP> g/l <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 45 <SEP> 60
<tb> Polyoxypropylenglykol
<tb> ml/l <SEP> 0,03 <SEP> 0,03 <SEP> 0,03 <SEP> 0,03
<tb> Na. <SEP> CCL <SEP> (sterile <SEP> Zugabe <SEP> vor <SEP> der
<tb> Inokulation) <SEP> bis <SEP> 0,2 <SEP> M <SEP> 0,2 <SEP> M <SEP> 0,2 <SEP> M <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> M
<tb> pH <SEP> vor <SEP> der <SEP> Inokulation <SEP> 10,0 <SEP> 10,0 <SEP> 10,35 <SEP> 10,1
<tb> Züchtungstemperatur <SEP> oc <SEP> 34 <SEP> 34 <SEP> 34 <SEP> 34
<tb> m'Luft/min <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0,3 <SEP> 0,3 <SEP> 0,3
<tb>
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Tabelle IV (Fortsetzung)
EMI7.1
<tb>
<tb> Züchtung <SEP> Nr.
<SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Zf1chtungszeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> 125 <SEP> 104 <SEP> 113 <SEP> 126
<tb> maximaler <SEP> pH-Wert <SEP> 9, <SEP> 3 <SEP> 9,3 <SEP> 9,6 <SEP> 9,3
<tb> Maximale <SEP> Anson-Einheiten/kg
<tb> 67 <SEP> 80 <SEP> 77 <SEP> 66
<tb>
Die proteolytischenEnzyme können aus der Züchtungsbouillon zurückgewonnen werden, indem die Bouillon zentrifugiert, die Enzyme aus der so erhaltenen Flüssigkeit durch Zugabe von Na30, oder Äthanol ausgefällt, der Niederschlag aus der Flüssigkeit durch Filtern mit Kieselgur als Filtermittel getrennt und der Niederschlag zu einem Pulver getrocknet wird, das die aktiven proteolytischen Enzyme enthält.
Genauere Informationen über die Erzeugung und Zurückgewinnung der proteolytischen Enzyme, die entsprechend der Erfindung zum Enthaaren von Häuten verwendet werden, findet man in der Beschreibung der österr.
Patentschrift Nr. 299101.
Die Analyse der proteolytischen Enzyme, die von den in Tabelle II aufgeführten Stämmen erzeugt werden, hat gezeigt, dass es wesentliche Unterschiede zwischen den Enzymen in bezug auf etliche Eigenschaften gibt.
In bezug auf die proteolytische Aktivität scheint es so, dass die Enzyme in zwei Gruppen oder Arten aufgeteilt werden können, wenn die proteolytische Aktivität nach der Ansonschen Methode bei pH 12 gemessen und in Prozent der Maximalaktivität ausgedrückt wird :
Art 1 : 100 bis 801o
Art 2 : 80 bis 5 Olo
Vorzugsweise sollen zum Enthaaren nach dem erfindungsgemässen Verfahren ein oder mehrere Enzyme von der Art 1 verwendet werden ; jedoch können auch die Enzyme der Art 2 verwendet werden.
Auf dem Fachgebiet ist es bekannt, dass Kalziumionen der Aktivität der meisten proteolytischen Enzyme stabilisieren. Die neuartigen Enzyme, die von den in Tabelle I aufgezählten und in Tabelle II in Arten und Abarten aufgeteilten Bakterien erzeugt wurden, wurden in bezug auf die stabilisierende Wirkung von Kalziumionen in einer Konzentration von 0,01 M bei einem pH-Wert von 10,5 bis 11 untersucht, und die Stabilisierung wurde in Prozent der Restaktivität ausgedrückt, nachdem man das Material 30 min bei 500C stehengelassen hatte.
Die Ergebnisse der Untersuchung auf Enzymarten und die Stabilisierungswirkung der Kalziumionen sind in Tabelle V zusammengefasst, in der "plus" bedeutet, dass die proteolytische Restaktivität beim Fehlen von Kalziumionen unter 8 Wo der entsprechenden Aktivität der Kontrollprobe in Anwesenheit von Kalziumionen liegt, und "minus" bedeutet, dass die proteolytische Restaktivität beim Fehlen von Kalziumionen über 805to der entsprechenden Aktivität der Kontrollprobe in Anwesenheit von Kalziumionen liegt.
Tabelle V
EMI7.2
<tb>
<tb> Arten <SEP> Abarten <SEP> Stämme <SEP> Enzymart <SEP> Ca-Stabilisierung
<tb> a <SEP> C <SEP> 300, <SEP> C <SEP> 301, <SEP> C <SEP> 360, <SEP> 1 <SEP> +++++
<tb> C372, <SEP> C374 <SEP>
<tb> b <SEP> C <SEP> 302, <SEP> C <SEP> 334 <SEP> l-w <SEP>
<tb> c <SEP> C <SEP> 323, <SEP> C <SEP> 339, <SEP> C <SEP> 352, <SEP> 2 <SEP> 8+++
<tb> C369
<tb> d <SEP> C <SEP> 304, <SEP> C <SEP> 311, <SEP> C <SEP> 336 <SEP> 1 <SEP> +++
<tb> II <SEP> C <SEP> 335, <SEP> C <SEP> 341 <SEP> 2 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 303, <SEP> C <SEP> 354, <SEP> C <SEP> 357' <SEP> -l-- <SEP>
<tb> C <SEP> 366, <SEP> C <SEP> 367, <SEP> C <SEP> 371,
<tb> IV <SEP> C <SEP> 375, <SEP> C <SEP> 378 <SEP>
<tb> b <SEP> C <SEP> 351, <SEP> C <SEP> 356, <SEP> C <SEP> 364) <SEP> 1 <SEP> -8---+
<tb> C <SEP> 376, <SEP> C <SEP> 377, <SEP> C <SEP> 41IJ <SEP>
<tb> c <SEP> C <SEP> 358,
<SEP> C <SEP> 410 <SEP> 1 <SEP> -+
<tb>
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Tabelle V (Fortsetzung)
EMI8.1
<tb>
<tb> Arten <SEP> Abarten <SEP> Stämme <SEP> Enzymart <SEP> Ca-Stabilisierung
<tb> V <SEP> C <SEP> 365, <SEP> C <SEP> 412 <SEP> 1 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 373 <SEP> 1... <SEP>
<tb> b <SEP> ba <SEP> C <SEP> 325, <SEP> C <SEP> 413 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> ? <SEP>
<tb> VII <SEP> C370 <SEP> l <SEP>
<tb>
EMI8.2
nur bei PH 12 geprüft, sondern auch bei niedrigeren pH-Werten, um einen detaillierten Eindruck von der proteolytischen Aktivität bei verschiedenen pH-Werten und mehr Informationen über die Aktivität der drei Enzymarten zu gewinnen.
Zum besseren Verständnis verweisen wir auf Fig. 1, die die proteolytische Aktivität des von dem Stamm C 311 erzeugten Enzyms zeigt ; besagtes Enzym gehört zur Art l : Fig. 2, die in gleicher Weise die Aktivität des von dem Stamm C 335 erzeugten Enzyms zeigt ; besagtes Enzym gehört zur Art 2.
Man sollte verstehen, dass der Zweck der Aktivitätskurven, die in den Figuren gezeigt werden, darin besteht, die Unterschiede der Aktivität der drei Arten proteolytischer Enzyme prinzipiell bei unterschiedlichen pH-Werten zu zeigen, und dass die Aktivitätskurve für jede Art sich etwas ändern kann, ohne jedoch ihr charakteristisches Aussehen zu verlieren. Dass es von grossem Nutzen ist, wenn die neuartigen Enzyme in Enthaarungsmittelzusammensetzungen enthalten sind, ist aus den folgenden Prüfungen ersichtlich : a) Stabilität gegenüber Schaumerzeugern
Die Stabilität der das Enzym und verschiedene Schaumerzeuger enthaltenden Lösung wurde bestimmt, wobei drei typische Schaumerzeuger in Konzentrationen verwendet wurden, die den in der Waschlösung verwendeten Konzentration entsprechen.
EMI8.3
<tb>
<tb>
1, <SEP> Seife <SEP> 0,25 <SEP> g/l
<tb> 2, <SEP> DBS <SEP> - <SEP> ein <SEP> Alkyl-Aryl-Sulfonat <SEP>
<tb> (500/0) <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> 3, <SEP> TAS-Talg-Alkohol-Sulfat
<tb> (250/0) <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb>
Die Enzymkonzentration betrug C, 1 Anson-Einheit/1. Die Untersuchungsbedingungen waren 30 min bei 50 C und PH 10, das Analysenverfahren war das Nitro-Kasein-Verfahren, s. E. v. Pechmann, Biochemische Zeitschrift, Bd. 321 (195), S. 248 bis 260.
Die Ergebnisse sind in rabelle VI zusammengefasst, wobei die Zahlen folgendermassen zu verstehen sind :
Die Zahl über dem Strich ist der Prozentsatz Restaktivität, wenn man die Analyse sofort nach der Zugabe des Schaumerzeugers durchführt, d. h. diese Zahl zeigt die Anfangsgeschwindigkeit der Inaktivierung an.
Die Zahl unter dem Strich ist der Unterschied zwischen dieser Anfangsrestaktivität und dem prozentualen Anteil der Restaktivität nach 30 min. b) Enzymart
Man hat festgestellt, dass alle Enzympräparate zeitweise oder vollständig durch Phenylmethylsulphonyl - fluorid inhibiert werden, was bedeutet, dass alle Enzyme im aktiven Zentrum Serin haben. c) pH-Stabilität
Mit fünf Enzympräparaten wurde die Stabilität bei verschiedenen pH-Werten unter den folgenden Bedingungen bestimmt :
EMI8.4
<tb>
<tb> Stehenlassen <SEP> : <SEP> 24 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 250C
<tb> pH-Werte <SEP> : <SEP> 5-7-8-10-12 <SEP>
<tb> Enzymkonzentration <SEP> :
<SEP> 0,2 <SEP> Anson-Einheiten/l
<tb>
In Tabelle VI ist der pH-Bereich gegeben, in dem eine Restaktivität von 80 bis 10010 festgestellt wurde.
Die Untersuchung der von den Stämmen C 303 und C 347 erzeugten Enzympräparate gegenüber Natriumsulfat zeigte, dass das Enzym gegenüber diesem Reduktionsmittel nicht empfindlich ist. Das könnte darauf hinweisen, dass die S-S-Brücken für die tertiäre Struktur nicht wesentlich sind.
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Tabelle VI
EMI9.1
<tb>
<tb> Stamm <SEP> Enzympräparat <SEP> Aktivität <SEP> Anson-Ein- <SEP> Enzymart
<tb> in <SEP> Pulverform <SEP> heiten/g <SEP> bei <SEP> PH
<tb> g
<tb> C300 <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> (10) <SEP> 1 <SEP>
<tb> C <SEP> 301 <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> (10) <SEP> 1 <SEP>
<tb> C <SEP> 302 <SEP> 3 <SEP> 0,7 <SEP> (10) <SEP> 1
<tb> C303 <SEP> 600 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 304 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 334 <SEP> 1500 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> (7, <SEP> 5)
<SEP> 1
<tb> C351 <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 354 <SEP> 42 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 360 <SEP> 117 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 364 <SEP> 456 <SEP> 0,9 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 365 <SEP> 2000 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 366 <SEP> 26 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 367 <SEP> 500 <SEP> 2,2 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 370 <SEP> 3000 <SEP> 0,6 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C371 <SEP> 50 <SEP> 1,0 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 372 <SEP> 430 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 376 <SEP> 17 <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1 <SEP>
<tb> C <SEP> 377 <SEP> 213 <SEP> 1,9 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 335 <SEP> 1500 <SEP> 0,3 <SEP> (7,5) <SEP> 2
<tb> C <SEP> 339 <SEP> 217 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> (7, <SEP> 5)
<SEP> 2
<tb> C <SEP> 369 <SEP> 7,2 <SEP> 1,4 <SEP> (7,5) <SEP> 2
<tb>
Tabelle VI (Fortsetzung)
EMI9.2
<tb>
<tb> Stamm <SEP> Stabilität <SEP> Serin <SEP> pH-Stabilität
<tb> Schaumerzeuger
<tb> Seife <SEP> DBS <SEP> TAS <SEP>
<tb> C <SEP> 300 <SEP> 82/71 <SEP> 56/48 <SEP> 7/6 <SEP> + <SEP>
<tb> C301 <SEP> 50/47 <SEP> 35/31 <SEP> 4/2 <SEP> + <SEP>
<tb> C302 <SEP> 59/56 <SEP> 60/- <SEP> 3/1 <SEP> +
<tb> C <SEP> 303 <SEP> 85/50 <SEP> 40/30 <SEP> 23/18 <SEP> + <SEP> 6, <SEP> 0-10,
<SEP> 5 <SEP>
<tb> C304 <SEP> 57/56 <SEP> 34/31 <SEP> 3/0 <SEP> +
<tb> C <SEP> 334 <SEP> 100/83 <SEP> 90/27 <SEP> 93/73 <SEP> +
<tb> C <SEP> 351 <SEP> 93/67 <SEP> 67/50 <SEP> 53/45 <SEP> +
<tb> C <SEP> 354 <SEP> 77/33 <SEP> 60/38 <SEP> 60/53 <SEP> +
<tb> C <SEP> 360 <SEP> 97/94 <SEP> 76/70 <SEP> 75/75 <SEP> +
<tb> C364 <SEP> 81/31 <SEP> 27/11 <SEP> 16/8 <SEP> +
<tb> C <SEP> 365 <SEP> 100/0 <SEP> 72/30 <SEP> 92/48 <SEP> +
<tb> C <SEP> 366 <SEP> 92/42 <SEP> 67/14 <SEP> 68/61 <SEP> +
<tb> C <SEP> 367 <SEP> 88/2 <SEP> 58/34 <SEP> 71/52 <SEP> + <SEP> 5, <SEP> 0-11, <SEP> 0
<tb> C <SEP> 370 <SEP> 94/4 <SEP> 33/15 <SEP> 67/30 <SEP> +
<tb> C371 <SEP> 97/60 <SEP> 70/44 <SEP> 93/57 <SEP> +
<tb> C <SEP> 372 <SEP> 98/95 <SEP> 75/68 <SEP> 87/85 <SEP> + <SEP> 6, <SEP> 0-10,
<SEP> 5
<tb> C <SEP> 376 <SEP> 66/42 <SEP> 25/10 <SEP> 15/12 <SEP> +
<tb> C377 <SEP> 100/10 <SEP> 59/27 <SEP> 74/59 <SEP> +
<tb> C <SEP> 335 <SEP> 95/51 <SEP> 40/32 <SEP> 78/71 <SEP> + <SEP>
<tb> C <SEP> 339 <SEP> 89/10 <SEP> 75/57 <SEP> 83/62 <SEP> + <SEP> 6, <SEP> 3-10, <SEP> 3 <SEP>
<tb> C <SEP> 369 <SEP> 28/28 <SEP> 6/6 <SEP> 0/0 <SEP> +
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Aus Tabelle VI geht hervor, dass eine Anzahl Enzympräparate erstaunliche Stabilitätseigenschaften aufwei- sen.
Im allgemeinen sind die proteolytischen Enzyme in dem Enthaarungsverfahren in Form eines festen oder flüssigen Gemisches der proteolytischen Enzyme und anderer als Träger wirkender Bestandteile enthalten. Wenn die Enzympräparate oder -zusammensetzungen in fester Form vorliegen, können sie aus Körnchen bestehen, in denen die Enzyme, z. B. mit ändern Enzymen oder Substanzen zusammen, die andere für die Nützlichkeit der Enthaarungsmittelzusammensetzungen wertvolle Aktivitäten haben, enthalten sind. Wenn die Enzyme nicht in kristalliner Form verwendet werden, können sie Verunreinigungen organischer Art, z. B. Proteine und Kohlehydrate aus dem Züchtungsmedium, aufweisen.
DieEnzymzusammensetzungen in flüssiger Form können Lösungen oder Suspensionen bilden, die, falls notwendig, Stabilisatoren enthalten können.
Gewöhnlich sind die neuartigen Enzyme in geringen Mengen enthalten. Deswegen weisen Enzympräparate oder -zusammensetzungen normalerweise einen Enzymgehalt von nicht mehr als 10 Gew. -0/0 auf.
Das folgende Experiment illustriert die Wirkung des Vorhandenseins einiger der neuartigen proteolytischen Enzyme in Enthaarungsmittelzusammensetzungen.
EMI10.1
1: Eine gesalzeneschnitten. Die Stücke werden 24 h lang eingeweicht, Fett und Fleisch werden abgekratzt. Dann werden die Hautstücke in 400 ml verschiedener Enzymlösungen, die sich in Gläsern mit einem Fassungsvermögen von 500 ml befinden, gelegt. Die Gläser werden 24 h lang bei 300e im Brutschrank aufbewahrt. Danach werden die Stücke aus den Lösungen herausgenommen, und die Haare werden mit einem Stück Plexiglas abgekratzt. Die Enthaarungswirkung wird an Hand der folgenden Skala eingeschätzt :
1. Leichte und vollständige Entfernung der Haare.
2. Leichte Entfernung der Haare, jedoch bleiben Haarflecken auf der Haut zurück.
3. Keine oder schwierige Entfernung der Haare.
Die verwendeten proteolytischen Enzymlösungen enthalten 1 g Kalziumhydroxyd pro 130 g Wasser. Die Enzymmenge geht aus der folgenden Tabelle VII hervor, die auch die pH-Werte zu Beginn und bei Abschluss des Enthaarungsverfahrens und dessen Ergebnisse enthält.
Tabelle VII
EMI10.2
<tb>
<tb> TS <SEP> ! <SEP> r. <SEP> l <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Enzym <SEP> vom <SEP> Stamm <SEP> Kontrolle <SEP> C <SEP> 303 <SEP> C <SEP> 367 <SEP> C <SEP> 372
<tb> Enzymmenge
<tb> Anson-Einheiten <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 0,5 <SEP> 5 <SEP> 0,5 <SEP> 5
<tb> Anfangs-pH-Wert <SEP> 11,9 <SEP> 11,9 <SEP> 11,9 <SEP> 11,9 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 12,0 <SEP> 11, <SEP> 9
<tb> End-pH-Wert <SEP> 11,9 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11,8 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11,9 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Ergebnis <SEP> der <SEP> Enthaarung <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 1
<tb>
Ausführungen zu den Beispielen 2 bis 4 :
10 x 10 cm Kuhhautstücke werden bei Raumtemperatur ohne Schütteln in gesättigter Kalklösung, die verschiedene Mengen von Enzymen enthält, stehengelassen.
In entsprechenden Abständen wird der Ablösungsgrad der Haare mit einer einfachen Kratztechnik und unter Abschätzung mit der folgenden willkürlichen Skala festgestellt :
1. vollständige Ablösung
2. stellenweise geringfügig festgehalten
3. ein wenig abgelöst
4. nirgendwo abgelöst.
Die Versuchsbedingungen waren folgende :
Temperatur : zwischen 16 und 250C (normaler Tag-Nacht-Wechsel)
PH-Wert : die gesättigte Kalklösung zeigte anfänglich einen pH-Wert von 12, 3, sank jedoch im Verlaufe des Versuches auf 11, 7 ab,
Zeit : die oben genannten Abschätzungen wurden in 24 h-Intervallen vorgenommen, und die Ablösung war nach etwa 48 bis 65 h vollständig. Die Versuche wurden nach 65 abgebrochen.
Wiederholung : Alle Versuche wurden zweimal wiederholt.
<Desc/Clms Page number 11>
Hinzugefügte Bakterizide : In Beispiel 2 bis4 wurden 0,002% des natriumsalzes der Äthyl-Quecksilbersulfidbenzoesäure als Bakterizid hinzugegeben.
Enzymkonzentration : 0,02, 0, 1 und 1, 0 Gel.-% ergibt den Bereich der Totalzahl von Anson-Einheiten in Lösungen wie folgt :
EMI11.1
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> - <SEP> 13, <SEP> 56
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 0, <SEP> 26-12, <SEP> 96
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 0, <SEP> 42-20, <SEP> 80 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 0, <SEP> 28-13, <SEP> 92
<tb>
Alcalase ist das Warenzeichen und die Handelsbezeichnung für ein proteolytisches Enzym, das durch Kultivierung von Bacillus subtilis Stämmen hergestellt worden ist.
Beispiel 2 :
EMI11.2
<tb>
<tb> Kuhhaut <SEP> : <SEP> Jersey <SEP> Enthaarungsabschätzung
<tb> Enzym <SEP> 0, <SEP> 02% <SEP> 0,1% <SEP> 1,0%
<tb> Alcalase <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kalk-Kontrolle <SEP> 4
<tb>
Bereich der Anson-Einheiten pro g Kuhhaut (xi03)
EMI11.3
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> - <SEP> 96
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 1, <SEP> 8-81
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 3, <SEP> 4-117
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 2, <SEP> 3-110
<tb>
Beispiel 3 :
EMI11.4
<tb>
<tb> Kuhhaut <SEP> : <SEP> Dänisch <SEP> schwarz <SEP> und <SEP> weiss <SEP> Enthaarungsabschätzung
<tb> Enzyme <SEP> 0, <SEP> 02% <SEP> 0,1% <SEP> 1,0%
<tb> Alcalase <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 1
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kalk-Kontrolle <SEP> 4
<tb>
EMI11.5
EMI11.6
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 1, <SEP> 4-69
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 1, <SEP> 5-74
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 150 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 79
<tb>
Beispiel 4 :
EMI11.7
<tb>
<tb> Kuhhaut <SEP> :
<SEP> Dänisch <SEP> rot <SEP> Enthaarungsabschätzung
<tb> Enzyme <SEP> 0, <SEP> 02% <SEP> 0,1% <SEP> 1,0%
<tb> Alcalase <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kalk-Kontrolle <SEP> 4
<tb>
Bereich der Anson-Einheiten pro g Kuhhaut (x103)
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 120 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 80 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> - <SEP> 140 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr.
<SEP> C <SEP> 372 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 110 <SEP>
<tb>
Zwei Punkte sind ganz klar ersichtlich aus den Resultaten.
1. Die Enzyme entsprechend der Erfindung sind wesentlich stabiler als die alkalische Protease (Bacillus sub- tilis - Art Protease), wenn sehr hohe pH-Werte angewandt werden, z. B. zirka 12, 3.
2. Die Enzyme in dem erfindungsgemässen Verfahren eignen sich ausgezeichnet als Enthaarungsmittel für Häute in einer Kombination mit dem Kalkprozess.
Das Flüssigkeit-pro-Haut-Verhältnis ist beträchtlich höher als es in der Praxis sein würde, aber es war bei der Art der Entwicklung notwendig, dies in den Beispielen so anzuwenden. Der Abfall in pH-Werten ist grösser als es erwartet wurde, und wahrscheinlich würde er praktisch über 12 bleiben.
Bei der industriellen Durchführung würde Gebrauch gemacht werden von der Temperatursteuerung und der Bewegung der Häute während der Enthaarung, wodurch die oben angeführten, in den Beispielen erhaltenen Ergebisse noch gesteigert werden können.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zum enzymatischen Enthaaren von geweichten Häuten mit proteolytischen Enzymen in alkali-
EMI12.2
Aktivität gegen Hämoglobin in Gegenwart von Harnstoff bei einem pH-Wert von mindestens 10 zeigen, behandelt werden.
<Desc / Clms Page number 1>
The invention relates to a method for enzymatic depilation of hides. In the old depilatory process, the skins were placed in a bath containing calcium hydroxide and sodium sulfide and having a pH of about 12. This depilatory procedure is harmful to hair, which may be of commercial value.
During the last few years, depilatory compositions containing proteolytic enzymes have been used and depilatory has been carried out at a lower pH of 7 to 10 at which the hair is not damaged. On the other hand, no significant swelling of the skins and hides is achieved, as was the case with the old dehairing process, which leads to difficulties in the further processing of the skins and hides.
The inventive method for enzymatic depilation of soaked hides with proteolytic enzymes in alkaline liquor is characterized in that the hides are treated with enzymes which show optimal proteolytic activity against hemoglobin in the presence of urea at a pH of at least 10.
These proteolytic enzymes are heretofore unknown and their presence in depilatory compositions represents a significant improvement in the art.
During the metabolism, a large number of previously unknown bacteria form proteolytic enzymes, which show an already mentioned optimal proteolytic activity.
From samples of soil, animal manure and a number of other naturally occurring sources, the inventors isolated about 100 strains of bacteria, carried out taxonomic studies, and found that all of the previously unknown bacteria belonged to the genus Bacillus, but none of them belonged to any belonged to a species known to the inventors and that, to the best of the inventors' knowledge, they did not belong to those species. In addition, in most cases there were different phyla and different varieties within the same species.
A novel procedure was used to isolate the previously unknown bacteria mentioned above.
The samples of soil, animal manure and other naturally occurring sources have been placed on nutrient media and at a high pH (9-11), and the bacteria that can grow in such alkaline conditions are then isolated and further investigated for the Species and subjected to enzyme production.
In most cases, a number of different enrichment methods are also used.
Enrichment methods are known to those skilled in the art. We can refer to Hayaishi in Methods in Enzymology, Vol. 1, pp. 126-131. One principle is to let a sample from nature grow on a nutrient medium with a specific and selected composition that favors the growth of a microorganism that produces metabolic products with the desired properties. Another principle is to use the sample coming from nature together with a compound, e.g. B. an inorganic salt, which favors the development of the desired microorganism, to store (see M. A. El-Nakeeb and H. A. Lechevalier, Appl.
Miorobiol., Vol. 11 [1963], p. 75, and then to apply the sample to a suitable nutrient medium, the pH of which is adjusted to values between 8 and 12.
Some of the previously unknown members of the genus Bacillus, which have been isolated and taxonomically examined for the production of proteolytic enzymes, are summarized in the accompanying Table I, in which the first column the reference number of the inventor, the second column the number under which the bacterium is at The National Collection of Industrial Bacteria, Terry Research Station, Aberdeen, Scotland, the third column contains the isolation source and the fourth column the enrichment method used,
<Desc / Clms Page number 2>
EMI2.1
EMI2.2
<Desc / Clms Page number 3>
EMI3.1
EMI3.2
<Desc / Clms Page number 4>
in Table 1 (continued)
EMI4.1
<tb>
<tb> reference no.
<SEP> NCIB isolation source <SEP> enrichment method
<tb> number
<tb> C <SEP> 413 <SEP> 10327 <SEP> clay <SEP> from <SEP> meadow, <SEP> starch enrichment <SEP> (pH <SEP> 11)
<tb> from <SEP> Ascheberg, <SEP> with <SEP> inorganic <SEP> nitrogen
<tb> Holstein
<tb>
Taxonomic studies of all of these members of the genus Bacillus were carried out using the methods described by Smith, Gordon & Clark in "Aerobic Spore-forming Bacteria", U.S. Department of Agr., Monograph No. 16 [1952].
So far these methods have been considered the most suitable, but given the fact that all nutrient media had to be adjusted to a pH much higher than the values reported by Smith, Gordon & Clark since the Bacillus species listed in Table I. grow at higher pH values, modified.
The bacteria can be divided fairly precisely into morphological groups. These groups differ from each other to such an extent that they actually represent separate species.
Fluctuations in biochemical reactions are found within the morphological groups.
Because of these fluctuations, the groups have been divided into varieties that are formed by one or more tribes.
The taxonomic studies are described in the description of the Austrian patent specification No. 299101.
Based on the inventors' taxonomic studies, the members of the genus Bacillus listed in Table I should be classified as shown in Table II.
Table II
EMI4.2
<tb>
<tb> species <SEP> variety <SEP> strains
<tb> a <SEP> C <SEP> 300, <SEP> C <SEP> 301, <SEP> C <SEP> 360
<tb> C <SEP> 372, <SEP> C <SEP> 374
<tb> b <SEP> C <SEP> 302, <SEP> C <SEP> 334 <SEP>
<tb> I.
<tb> c <SEP> C <SEP> 323, <SEP> C <SEP> 339, <SEP> C <SEP> 352 <SEP>
<tb> C <SEP> 369 <SEP>
<tb> d <SEP> C <SEP> 304, <SEP> C <SEP> 311, <SEP> C <SEP> 335 <SEP>
<tb>, <SEP> f.
<SEP>
<tb> n <SEP> C <SEP> 335, <SEP> C <SEP> 341 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 303, <SEP> C <SEP> 354, <SEP> C <SEP> 357 <SEP>
<tb> C <SEP> 366, <SEP> C <SEP> 367, <SEP> C <SEP> 371 <SEP>
<tb> C <SEP> 357, <SEP> C <SEP> 378 <SEP>
<tb> IV <SEP> b <SEP> C <SEP> 351, <SEP> C <SEP> 356, <SEP> C <SEP> 364 <SEP>
<tb> C376, <SEP> C377, <SEP> C411 <SEP>
<tb> c <SEP> C358, <SEP> C410 <SEP>
<tb> V <SEP> C <SEP> 365, <SEP> C <SEP> 412 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 373 <SEP>
<tb> VI
<tb> b <SEP> C <SEP> 325, <SEP> C <SEP> 413 <SEP>
<tb> VII <SEP> C <SEP> 370
<tb>
<Desc / Clms Page number 5>
The proteolytic enzymes used in the skin dehairing process of the present invention can be produced by aerobic cultivation of any of the species and strains listed in Tables I and II.
The cultivation is carried out in accordance with the principles known in the art, apart from the fact that the nutrient medium, which contains assimilable carbon and nitrogen sources, is kept at a higher pH value than before during the cultivation, and the like. between preferably between 7.5 and 10.5.
The yields obtained are calculated using the known Anson hemoglobin method, see Sect. Journal of General Physiology, Vol. 22 [1939] pp. 79-89. In this specification, an Anson unit means the amount of proteolytic enzyme that decomposes hemoglobin at a pH of 10.1 and a temperature of 250C during a reaction time of 10 minutes at such an initial rate that such an amount of not per minute Trichloroacetic acid to be precipitated cleavage products is formed that these cleavage products with a phenol reagent give the same color as a milliequivalent of tyrosine.
The nutrient medium is composed in accordance with principles known in the art
EMI5.1
Grain, malt, rice, sorghum flour, etc. The carbohydrate concentration can vary widely, i.e. H. from up to 25% down to 1 to 51o, but usually 8 to 10 are suitable, the percentage calculated on dextrose. It has been found that the presence of carbohydrates in the nutrient medium leads to the formation of acidic components, which results in a decrease in pH during cultivation. Since it is extremely important to maintain a pH value of the nutrient medium between 7 and 12 during the cultivation, measurements should be taken so that the pH value does not drop below 7 for a long time during the cultivation.
In order to keep the pH within the required range, a limited amount of carbohydrates can be used along with a buffer substance that can maintain the required pH. It has been found that carbonates, and particularly sesquicarbonates, used in the medium to a concentration of 0.2 M, can produce a pH of about 10.5 and 9.3, respectively.
Other buffer systems, such as phosphate buffers, can also be used.
It is also possible to start cultivation with a low carbohydrate content and add small amounts of carbohydrates one at a time during the cultivation.
A third possibility is to use the automatic pH control by adding various basic reacting substances that are used in this field.
The use of carbonates and sesquicarbonates as pH regulating substances is very useful, and it is surprising that during cultivation it is possible to use these compounds in the stated concentrations.
The nitrogen source in the nutrient medium can be inorganic and / or organic. Suitable inorganic nitrogen sources are sometimes nitrates and ammonium salts, and quite a few of the organic nitrogen sources are known for their use in fermentation processes and in the cultivation of bacteria. Illustrative examples are soy flour, cottonseed and peanut flour, casein, liquid used to swell corn, yeast extracts, urea, albumin, etc.
In addition, the nutrient medium should of course contain the usual trace substances.
The temperature at which the cultivation takes place is usually in the same range as that used for the cultivation of the known species of the genus Bacillus. A temperature between 25 and 550C is usually appropriate. Preferably the temperature is between 30 and 40oC.
Since the cultivation must be carried out under aerobic conditions, when using fermentation
EMI5.2
processing method is applied, similar.
In general, maximum yields of proteolytic enzymes will be obtained after a culture time of 1 to 5 days.
Illustrative examples of suitable cultivation media are the following:
1) Medium BPFA with the following composition:
EMI5.3
<tb>
<tb> Potato flour <SEP> 50 <SEP> g / l <SEP> tap water
<tb> sucrose <SEP> 50 <SEP> g / l <SEP> tap water
<tb> Barley flour <SEP> 50 <SEP> g / l <SEP> tap water
<tb> Soy flour <SEP> 20 <SEP> g / l <SEP> tap water
<tb> Sodium Caseinate <SEP> 10 <SEP> g / l <SEP> tap water
<tb> NaHPO. <SEP> IZHO <SEP> 9 <SEP> g / l <SEP> tap water
<tb> Polyoxypropylene glycol <SEP> (emulsifier) <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g / l <SEP> tap water
<tb>
<Desc / Clms Page number 6>
2) Medium BSX with the following composition:
EMI6.1
<tb>
<tb> Barley flour <SEP> 100 <SEP> g / l <SEP> tap water
<tb> soy flour <SEP> 30 <SEP> g / l <SEP> tap water
<tb> Polyoxypropylene glycol <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g / l <SEP> tap water
<tb>
These two media are adjusted to the desired pH by adding sesquicarbonate or baking soda under sterile conditions. Before the sterilization, the starch present is liquefied using Cl amylase.
The two culture media, BPFA and BSX, when grown underwater in artificial ventilation tanks using 550 liter stainless steel tanks, give the results summarized in Table III, which also contains information on the strains used and the culture conditions.
Table III
EMI6.2
<tb>
<tb> Trunk <SEP> C <SEP> 335 <SEP> C <SEP> 339 <SEP> C <SEP> 351 <SEP>
<tb> Medium <SEP> BPFA <SEP> BPFA <SEP> BSX
<tb> pH value <SEP> before
<tb> Inoculation <SEP> 10.2 <SEP> 10.5 <SEP> 10.2
<tb> Growing temperature <SEP> in
<tb> Degree <SEP> Celsius <SEP> 34 <SEP> 34 <SEP> 34
<tb> cm3 <SEP> air / min <SEP> 0.25 <SEP> 0.25 <SEP> 0.3
<tb> breeding time
<tb> in <SEP> hours <SEP> 84 <SEP> 97 <SEP> 83
<tb> Last <SEP> pH value <SEP> 9.2 <SEP> 9, <SEP> 1 <SEP> 9.35
<tb> Last <SEP> proteolytic
<tb> activity, expressed as <SEP>
<tb> in <SEP> Anson units
<tb> per <SEP> kg <SEP> substrate <SEP> 40 <SEP> 29 <SEP> 33
<tb>
With the strain C 303, the results summarized in the following Table IV were achieved in four runs under different conditions,
Table IV
EMI6.3
<tb>
<tb> Breeding <SEP> No.
<SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Barley flour <SEP> g / l <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 150 <SEP> 200
<tb> soy flour <SEP> g / l <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 45 <SEP> 60
<tb> polyoxypropylene glycol
<tb> ml / l <SEP> 0.03 <SEP> 0.03 <SEP> 0.03 <SEP> 0.03
<tb> Well. <SEP> CCL <SEP> (sterile <SEP> addition <SEP> before <SEP> the
<tb> Inoculation) <SEP> to <SEP> 0.2 <SEP> M <SEP> 0.2 <SEP> M <SEP> 0.2 <SEP> M <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP > M
<tb> pH <SEP> before <SEP> the <SEP> inoculation <SEP> 10.0 <SEP> 10.0 <SEP> 10.35 <SEP> 10.1
<tb> Growing temperature <SEP> oc <SEP> 34 <SEP> 34 <SEP> 34 <SEP> 34
<tb> m'air / min <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0.3 <SEP> 0.3 <SEP> 0.3
<tb>
<Desc / Clms Page number 7>
Table IV (continued)
EMI7.1
<tb>
<tb> Breeding <SEP> No.
<SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Breeding time <SEP> in <SEP> hours <SEP> 125 <SEP> 104 <SEP> 113 <SEP> 126
<tb> maximum <SEP> pH value <SEP> 9, <SEP> 3 <SEP> 9.3 <SEP> 9.6 <SEP> 9.3
<tb> Maximum <SEP> Anson units / kg
<tb> 67 <SEP> 80 <SEP> 77 <SEP> 66
<tb>
The proteolytic enzymes can be recovered from the culture broth by centrifuging the broth, precipitating the enzymes from the liquid thus obtained by adding Na30 or ethanol, separating the precipitate from the liquid by filtering it with kieselguhr as a filter medium and drying the precipitate to a powder which contains the active proteolytic enzymes.
More detailed information on the generation and recovery of the proteolytic enzymes which are used according to the invention for depilating hides can be found in the description of the Austrian.
Patent No. 299101.
Analysis of the proteolytic enzymes produced by the strains listed in Table II has shown that there are substantial differences between the enzymes in a number of properties.
With regard to proteolytic activity, it appears that the enzymes can be divided into two groups or types if the proteolytic activity is measured by Anson's method at pH 12 and expressed as a percentage of the maximum activity:
Type 1: 100 to 801o
Type 2: 80 to 5 Olo
One or more enzymes of type 1 should preferably be used for depilation according to the method according to the invention; however, the type 2 enzymes can also be used.
It is known in the art that calcium ions stabilize the activity of most proteolytic enzymes. The novel enzymes produced by the bacteria listed in Table I and classified into species and varieties in Table II were tested for the stabilizing effect of calcium ions at a concentration of 0.01 M at a pH of 10.5 to 11, and the stabilization was expressed as a percentage of the residual activity after the material had been left to stand at 50 ° C. for 30 minutes.
The results of the investigation for enzyme types and the stabilizing effect of calcium ions are summarized in Table V, in which "plus" means that the residual proteolytic activity in the absence of calcium ions is below 8 Wo of the corresponding activity of the control sample in the presence of calcium ions, and "minus" means that the proteolytic residual activity in the absence of calcium ions is over 805to the corresponding activity of the control sample in the presence of calcium ions.
Table V
EMI7.2
<tb>
<tb> species <SEP> varieties <SEP> strains <SEP> enzyme type <SEP> Ca stabilization
<tb> a <SEP> C <SEP> 300, <SEP> C <SEP> 301, <SEP> C <SEP> 360, <SEP> 1 <SEP> +++++
<tb> C372, <SEP> C374 <SEP>
<tb> b <SEP> C <SEP> 302, <SEP> C <SEP> 334 <SEP> l-w <SEP>
<tb> c <SEP> C <SEP> 323, <SEP> C <SEP> 339, <SEP> C <SEP> 352, <SEP> 2 <SEP> 8 +++
<tb> C369
<tb> d <SEP> C <SEP> 304, <SEP> C <SEP> 311, <SEP> C <SEP> 336 <SEP> 1 <SEP> +++
<tb> II <SEP> C <SEP> 335, <SEP> C <SEP> 341 <SEP> 2 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 303, <SEP> C <SEP> 354, <SEP> C <SEP> 357 '<SEP> -l-- <SEP>
<tb> C <SEP> 366, <SEP> C <SEP> 367, <SEP> C <SEP> 371,
<tb> IV <SEP> C <SEP> 375, <SEP> C <SEP> 378 <SEP>
<tb> b <SEP> C <SEP> 351, <SEP> C <SEP> 356, <SEP> C <SEP> 364) <SEP> 1 <SEP> -8 --- +
<tb> C <SEP> 376, <SEP> C <SEP> 377, <SEP> C <SEP> 41IJ <SEP>
<tb> c <SEP> C <SEP> 358,
<SEP> C <SEP> 410 <SEP> 1 <SEP> - +
<tb>
<Desc / Clms Page number 8>
Table V (continued)
EMI8.1
<tb>
<tb> species <SEP> varieties <SEP> strains <SEP> enzyme type <SEP> Ca stabilization
<tb> V <SEP> C <SEP> 365, <SEP> C <SEP> 412 <SEP> 1 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 373 <SEP> 1 ... <SEP>
<tb> b <SEP> ba <SEP> C <SEP> 325, <SEP> C <SEP> 413 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP>? <SEP>
<tb> VII <SEP> C370 <SEP> l <SEP>
<tb>
EMI8.2
only checked at PH 12, but also at lower pH values to get a detailed impression of the proteolytic activity at different pH values and more information about the activity of the three enzyme types.
For a better understanding, we refer to Fig. 1, which shows the proteolytic activity of the enzyme produced by strain C 311; said enzyme belongs to type 1: Fig. 2, which likewise shows the activity of the enzyme produced by the strain C 335; said enzyme belongs to type 2.
It should be understood that the purpose of the activity curves shown in the figures is to show the differences in the activity of the three types of proteolytic enzymes in principle at different pH values, and that the activity curve may change somewhat for each species, but without losing their characteristic appearance. The following tests show that it is of great benefit if the novel enzymes are contained in depilatory compositions: a) Stability towards foam generators
The stability of the solution containing the enzyme and various suds generators was determined using three typical suds generators at concentrations corresponding to the concentration used in the wash solution.
EMI8.3
<tb>
<tb>
1, <SEP> soap <SEP> 0.25 <SEP> g / l
<tb> 2, <SEP> DBS <SEP> - <SEP> a <SEP> alkyl aryl sulfonate <SEP>
<tb> (500/0) <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g / l <SEP>
<tb> 3, <SEP> TAS tallow alcohol sulfate
<tb> (250/0) <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g / l <SEP>
<tb>
The enzyme concentration was C.1 Anson unit / l. The test conditions were 30 min at 50 C and PH 10, the analytical method was the nitro-casein method, see p. E. v. Pechmann, Biochemische Zeitschrift, Vol. 321 (195), pp. 248 to 260.
The results are summarized in table VI, whereby the numbers are to be understood as follows:
The number above the bar is the percentage of residual activity if the analysis is carried out immediately after adding the foam generator; H. this number indicates the initial rate of inactivation.
The number below the line is the difference between this initial residual activity and the percentage of residual activity after 30 minutes. b) Type of enzyme
It has been found that all enzyme preparations are temporarily or completely inhibited by phenylmethylsulphonyl fluoride, which means that all enzymes have serine in the active center. c) pH stability
The stability at different pH values was determined with five enzyme preparations under the following conditions:
EMI8.4
<tb>
<tb> Leave <SEP>: <SEP> 24 <SEP> h <SEP> at <SEP> 250C
<tb> pH values <SEP>: <SEP> 5-7-8-10-12 <SEP>
<tb> Enzyme concentration <SEP>:
<SEP> 0.2 <SEP> Anson units / l
<tb>
Table VI gives the pH range in which a residual activity of 80 to 10010 was found.
The investigation of the enzyme preparations produced by the strains C 303 and C 347 against sodium sulfate showed that the enzyme is not sensitive to this reducing agent. This could indicate that the S-S bridges are not essential to the tertiary structure.
<Desc / Clms Page number 9>
Table VI
EMI9.1
<tb>
<tb> strain <SEP> enzyme preparation <SEP> activity <SEP> Anson-Ein <SEP> enzyme type
<tb> in <SEP> powder form <SEP> units / g <SEP> with <SEP> PH
<tb> g
<tb> C300 <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> (10) <SEP> 1 <SEP>
<tb> C <SEP> 301 <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> (10) <SEP> 1 <SEP>
<tb> C <SEP> 302 <SEP> 3 <SEP> 0.7 <SEP> (10) <SEP> 1
<tb> C303 <SEP> 600 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 304 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 334 <SEP> 1500 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> (7, <SEP> 5)
<SEP> 1
<tb> C351 <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> (7.5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 354 <SEP> 42 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 360 <SEP> 117 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 364 <SEP> 456 <SEP> 0.9 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 365 <SEP> 2000 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> (7.5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 366 <SEP> 26 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> (7.5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 367 <SEP> 500 <SEP> 2.2 <SEP> (7.5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 370 <SEP> 3000 <SEP> 0.6 <SEP> (7.5) <SEP> 1
<tb> C371 <SEP> 50 <SEP> 1.0 <SEP> (7.5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 372 <SEP> 430 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> (7.5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 376 <SEP> 17 <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1 <SEP>
<tb> C <SEP> 377 <SEP> 213 <SEP> 1.9 <SEP> (7.5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 335 <SEP> 1500 <SEP> 0.3 <SEP> (7.5) <SEP> 2
<tb> C <SEP> 339 <SEP> 217 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> (7, <SEP> 5)
<SEP> 2
<tb> C <SEP> 369 <SEP> 7.2 <SEP> 1.4 <SEP> (7.5) <SEP> 2
<tb>
Table VI (continued)
EMI9.2
<tb>
<tb> strain <SEP> stability <SEP> serine <SEP> pH stability
<tb> foam generator
<tb> Soap <SEP> DBS <SEP> TAS <SEP>
<tb> C <SEP> 300 <SEP> 82/71 <SEP> 56/48 <SEP> 7/6 <SEP> + <SEP>
<tb> C301 <SEP> 50/47 <SEP> 35/31 <SEP> 4/2 <SEP> + <SEP>
<tb> C302 <SEP> 59/56 <SEP> 60 / - <SEP> 3/1 <SEP> +
<tb> C <SEP> 303 <SEP> 85/50 <SEP> 40/30 <SEP> 23/18 <SEP> + <SEP> 6, <SEP> 0-10,
<SEP> 5 <SEP>
<tb> C304 <SEP> 57/56 <SEP> 34/31 <SEP> 3/0 <SEP> +
<tb> C <SEP> 334 <SEP> 100/83 <SEP> 90/27 <SEP> 93/73 <SEP> +
<tb> C <SEP> 351 <SEP> 93/67 <SEP> 67/50 <SEP> 53/45 <SEP> +
<tb> C <SEP> 354 <SEP> 77/33 <SEP> 60/38 <SEP> 60/53 <SEP> +
<tb> C <SEP> 360 <SEP> 97/94 <SEP> 76/70 <SEP> 75/75 <SEP> +
<tb> C364 <SEP> 81/31 <SEP> 27/11 <SEP> 16/8 <SEP> +
<tb> C <SEP> 365 <SEP> 100/0 <SEP> 72/30 <SEP> 92/48 <SEP> +
<tb> C <SEP> 366 <SEP> 92/42 <SEP> 67/14 <SEP> 68/61 <SEP> +
<tb> C <SEP> 367 <SEP> 88/2 <SEP> 58/34 <SEP> 71/52 <SEP> + <SEP> 5, <SEP> 0-11, <SEP> 0
<tb> C <SEP> 370 <SEP> 94/4 <SEP> 33/15 <SEP> 67/30 <SEP> +
<tb> C371 <SEP> 97/60 <SEP> 70/44 <SEP> 93/57 <SEP> +
<tb> C <SEP> 372 <SEP> 98/95 <SEP> 75/68 <SEP> 87/85 <SEP> + <SEP> 6, <SEP> 0-10,
<SEP> 5
<tb> C <SEP> 376 <SEP> 66/42 <SEP> 25/10 <SEP> 15/12 <SEP> +
<tb> C377 <SEP> 100/10 <SEP> 59/27 <SEP> 74/59 <SEP> +
<tb> C <SEP> 335 <SEP> 95/51 <SEP> 40/32 <SEP> 78/71 <SEP> + <SEP>
<tb> C <SEP> 339 <SEP> 89/10 <SEP> 75/57 <SEP> 83/62 <SEP> + <SEP> 6, <SEP> 3-10, <SEP> 3 <SEP>
<tb> C <SEP> 369 <SEP> 28/28 <SEP> 6/6 <SEP> 0/0 <SEP> +
<tb>
<Desc / Clms Page number 10>
From Table VI it can be seen that a number of enzyme preparations have amazing stability properties.
Generally, the proteolytic enzymes are included in the depilation process in the form of a solid or liquid mixture of the proteolytic enzymes and other carrier ingredients. When the enzyme preparations or compositions are in solid form, they may consist of granules in which the enzymes, e.g. With other enzymes or substances which have other activities valuable to the usefulness of the depilatory compositions. If the enzymes are not used in crystalline form, they can contain organic impurities, e.g. B. proteins and carbohydrates from the culture medium.
The enzyme compositions in liquid form can form solutions or suspensions which, if necessary, can contain stabilizers.
The novel enzymes are usually contained in small amounts. Therefore, enzyme preparations or compositions normally have an enzyme content of not more than 10% by weight.
The following experiment illustrates the effect of the presence of some of the novel proteolytic enzymes in depilatory compositions.
EMI10.1
1: A sliced salted. The pieces are soaked for 24 hours, fat and meat are scraped off. Then the pieces of skin are placed in 400 ml of different enzyme solutions, which are in jars with a capacity of 500 ml. The jars are kept in the incubator at 300e for 24 hours. After that, the pieces are removed from the solutions and the hair is scraped off with a piece of plexiglass. The depilatory effect is assessed using the following scale:
1. Easy and complete hair removal.
2. Easy removal of the hair, however hair spots remain on the skin.
3. No or difficult removal of hair.
The proteolytic enzyme solutions used contain 1 g calcium hydroxide per 130 g water. The amount of enzyme is shown in Table VII below, which also contains the pH values at the beginning and at the end of the depilation process and its results.
Table VII
EMI10.2
<tb>
<tb> TS <SEP>! <SEP> r. <SEP> l <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Enzyme <SEP> from the <SEP> strain <SEP> control <SEP> C <SEP> 303 <SEP> C <SEP> 367 <SEP> C <SEP> 372
<tb> amount of enzyme
<tb> Anson units <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 0.5 <SEP> 5 <SEP> 0.5 <SEP> 5
<tb> Initial pH value <SEP> 11.9 <SEP> 11.9 <SEP> 11.9 <SEP> 11.9 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 12.0 <SEP> 11, <SEP> 9
<tb> Final pH value <SEP> 11.9 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11.8 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11.9 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Result <SEP> of <SEP> depilation <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 1
<tb>
Comments on examples 2 to 4:
10 × 10 cm pieces of cow skin are left to stand at room temperature without shaking in a saturated lime solution which contains various amounts of enzymes.
At appropriate intervals, the degree of detachment of the hair is determined with a simple scratching technique and estimated using the following arbitrary scale:
1. Complete replacement
2. slightly recorded in places
3. a little detached
4. Nowhere detached.
The test conditions were as follows:
Temperature: between 16 and 250C (normal day-night change)
PH value: the saturated lime solution initially showed a pH value of 12.3, but fell to 11.7 in the course of the experiment,
Time: the above estimates were made at 24 hour intervals and the detachment was complete in approximately 48 to 65 hours. The experiments were stopped after 65.
Repetition: All experiments were repeated twice.
<Desc / Clms Page number 11>
Added bactericides: In Examples 2 to 4, 0.002% of the sodium salt of ethyl mercury sulfide benzoic acid was added as a bactericide.
Enzyme concentration: 0.02, 0, 1 and 1, 0 gel% gives the range of the total number of Anson units in solutions as follows:
EMI11.1
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> - <SEP> 13, <SEP> 56
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 0, <SEP> 26-12, <SEP> 96
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 0, <SEP> 42-20, <SEP> 80 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 0, <SEP> 28-13, <SEP> 92
<tb>
Alcalase is the trademark and the trade name for a proteolytic enzyme which has been produced by cultivating Bacillus subtilis strains.
Example 2:
EMI11.2
<tb>
<tb> Cow skin <SEP>: <SEP> Jersey <SEP> depilation assessment
<tb> Enzyme <SEP> 0, <SEP> 02% <SEP> 0.1% <SEP> 1.0%
<tb> Alcalase <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Limescale control <SEP> 4
<tb>
Range of Anson units per g cow hide (xi03)
EMI11.3
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> - <SEP> 96
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 1, <SEP> 8-81
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 3, <SEP> 4-117
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 2, <SEP> 3-110
<tb>
Example 3:
EMI11.4
<tb>
<tb> cow skin <SEP>: <SEP> Danish <SEP> black <SEP> and <SEP> white <SEP> depilation assessment
<tb> Enzyme <SEP> 0, <SEP> 02% <SEP> 0.1% <SEP> 1.0%
<tb> Alcalase <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 1
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Limescale control <SEP> 4
<tb>
EMI11.5
EMI11.6
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 1, <SEP> 4-69
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 1, <SEP> 5-74
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 150 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 79
<tb>
Example 4:
EMI11.7
<tb>
<tb> cow skin <SEP>:
<SEP> Danish <SEP> red <SEP> depilation estimation
<tb> Enzyme <SEP> 0, <SEP> 02% <SEP> 0.1% <SEP> 1.0%
<tb> Alcalase <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Limescale control <SEP> 4
<tb>
Range of Anson units per gram of cow hide (x103)
<Desc / Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 120 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 80 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> - <SEP> 140 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> from <SEP> code no.
<SEP> C <SEP> 372 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 110 <SEP>
<tb>
Two points are very clear from the results.
1. The enzymes according to the invention are much more stable than the alkaline protease (Bacillus subtilis - type protease) when very high pH values are used, e.g. B. about 12, 3.
2. The enzymes in the method according to the invention are extremely suitable as depilatory agents for hides in combination with the lime process.
The liquid-per-skin ratio is considerably higher than it would be in practice, but the nature of the development made it necessary to apply this in the examples. The drop in pH levels is greater than expected and it would likely stay above 12 practically.
In industrial practice, use would be made of the temperature control and the movement of the skins during depilation, whereby the above-mentioned results obtained in the examples can be further increased.
PATENT CLAIMS:
1. Process for enzymatic depilation of soaked hides with proteolytic enzymes in alkaline
EMI12.2
Show activity against hemoglobin in the presence of urea at a pH of at least 10.