DE1767653C3

DE1767653C3 - Verfahren zur Erzeugung von Isoamylase

Info

Publication number: DE1767653C3
Application number: DE1767653A
Authority: DE
Inventors: Yoshinori Okayama Sato (Japan); Kaname Sugimoto; Yasuyuki Saika Osaka Yokobayashi
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 1967-06-02
Filing date: 1968-05-31
Publication date: 1979-02-22
Also published as: NL6807782A; NL160032C; NL160032B; CH508724A; US3560345A; GB1233744A; FR1569378A; DE1767653A1; DE1767653B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung hochaktiver Isoamylase.

Isoamylase spaltet bekanntlich spezifisch die glukosidische Alpha-1,6-Bindung am Ansatzpunkt der Verzweigung der Polysaccharide vom Stärketyp. Das Enzym wurde zuerst von Kobayashi und Maruo aus Hefe gewonnen (vgl. Bunji Maruo und Tsuneo Kobayashi: »Studies on the Enzymic Formation and Degradation of Starch«, Journal Agricult. Chem. Sve. Japan, 23,1949, Seiten 115 bis 123). St. Pea t, P. N. H ο b s ο η und W. J. W h e 1 a η fanden das Enzym in Bohnen und Kartoffeln (vgl. Journal of Chemical Society [1951], Seiten 1451 bis 1459). H. Bender und K. W a 11 e η f e 1 s stellten fest, daß das Pullulan zerlegende Enzym, nämlich Pullulanase. das aus Aerobacter aerogenes gewinnbar ist. ähnliche Wirkungen wie Isoamylase hat (vgl. Biochemische Zeitschrift, 334. [1961]. Seiten 79 bis 95).

Die Bakterien der Gattungen Aerobacter und Pscudomonas sind nicht sporenbildende gramnegative Stäbchen. Jedoch bestehen zwischen beiden Gattungen deutlich abgegrenzte taxonomische Unterschiede, und zwar in der Hinsicht, daß die erstgenannten Arten der Gattung peritrich, während jene der letztgenannten Gattung polar begeißell sind. Die erstere Gattung zerlegt verschiedene Zucker aerobisch und anaerobisch, während die letztgenannte Gattung die Zucker nur aerobisch zerlegt.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht in der Entwicklung eines einfachen und wirksamen Verfahrens zur Erzeugung hochaktiver Isoamyb^e mit hoher Ausbeute. Zur Lösung dieser Aufgabe dient ein Verfahren, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Kulturmedium, das Quellen für Kohlehydrate und Stickstoff enthält, auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt wird, wonach diese¹; Kulturmedium mit dem Stamm Pseudomonas amyloderamosa SB-15 (ATCC 21 262) inokuliert wird und dieses Gemisch unter Rütteln oder Bewegen und Belüftung bei 20 bis 30⁰C kultiviert wird.

Pseudomonas amyloderamosa unterscheide! sich deutlich in verschiedener Hinsicht von den Arten der Gattung Aerobacter und den übrigen Gattungen der Familie Enterobacteriaceae. Ein wesentlicher Unterschied ist auch in den Eigenschaften zwischen der erfindungsgemäß gewonnenen Pseudomonas-Isoamylase i^nd der i'ekannieri Aerorvctcr- Isoamylase, nämlich ,ι, ,,, p,· ym Piillijlanase, festzustellen. Beispiels*·, eise ist ii. iH"*irna!e pH-Wert Für die Wirkung des Enzyms P''üuli-.'vr.-ί· κ11-ιt_-H (\ wäbr-rd der für die Wirkung des Fn/\!^T'^{L !)}:-i'udor'i"'i;(':"l·, ■ 'hiylasc von 2.5 bis. 3,5 reicht.

Pi" \ ennzeif !mcnden '■ !erkmrile von Pseudomonas

1) Form

2) Größe

3) Sporen

4) Geißeln

5) Gram-Färbung

6) Säurefestigkeit

7) Agar-Streifenkultur

8) Agar-Plattenkultur

9) Agar-Stichkultur

10) Bouillonkultur

11) Gelatine-Stichkultur

Stäbchen

0,4-0,6 μ χ 1.2-4,5 μ
keine
polar
negativ
negativ

glatte, glänzende Oberfläche, gelbliche Zellen
runde, zusammenfließende, glatte, glänzende Oberfläche, leicht gehoben, gelblich und opak
lineares gutes Wachstum nahe der Oberfläche
wird trübe, leichte Fällung, Bildung sehr dünner Oberflächenhaut
langsame Verflüssigung in Krater-Form

(Kulturen 7) bis 10) wurden mit Bouillon von 30⁰C, Kultur 11) mit Bouillon von 20°C durchgeführt.)

12)	Kartoffelnährboden	bräunlich, glänzend,
		feucht
13)	Lackmusmilch	wird alkalisch, aber keine
		Änderung der Milch
14)	Pigmentbildung	keine wasserlöslichen Pig
		mente; die Zellen werden
		aber leicht gelblich
15)	Ammoniakbildung	positiv
16)	Schwefel-Wasserstoff-
	Bildung	negativ
17)	Indol-Bildung	negativ
18)	Nitrat-Reduktion	negativ
19)	Bildung von Acetyl-
	methyl-carbinol	negativ
20)	Katalase-Nachweis	positiv
21)	Harnstoff-Spaltung	positiv
22)	Verwertung
	von Kohlenhydraten
	und Säurebiidung	Säuren aerobisch aus

Arabinose, Glukose, Mannose und Maltose (aber keine Gasbildung); Fruktose, Galaktose, Laktose. Cellobiose, Rohrzucker. Trehalose, Salicin, a-Methylglukosid, Dextrin und Stärke aerobisch als Kohlenstoffquelle verwertet (aber keine Säurebildung); Xylose, Rhamnose, Cellulose, Dextran und Inulin nicht verwertet

23) Verwertung von Sorhit,
Mannit, Inosil und

Glycerin negativ

24) Verwertung von Bcn/.oc ,
P Oxybenzoc und
Salicylsäure oder
sonstigen arom.i'ischei'
Verbindung^ negativ

25) Verwertung von
Ammoniumsalzen und
Nitraten als
Stickstoffquellen

nur in Gegenwart

organischer

Stickstoffverbindungen

(Glutaminsäure,

Asparaginsäure,

Aminosäurehydrolysate)

26) optimale Wachstumstemperatur 25—30° C (kein Wachstum bei 37 ⁰C)

27) optimales Wachs-

tums-pH 6,5-7,5

28) Lethaltemperatur 70° C (in 10 min)

29) Sauerstoffbedarf aerobisch (anaerob kein

Wachstum).

Es ergab sich, daß der untersuchte Bakterien-Stamm zur Gattung Pseudomonas gehört, denn er ist ein aerobes, nicht sporenbildendes Gram-negatives Stäbchen mit einer einzigen polaren Geißel. Er ähnelt in der farbstoffbildenden Pseudomonas-Gruppe der Pseudomonas ochracea, indem er Gelatine verflüssigt, Nitrate nicht reduziert und Milch alkalisch macht.

Dennoch unterscheidet er sich von Pseudomonas ochracea in folgenden Eigenschaften: letztere erzeugt Indol und Schwefelwasserstoff, Pseudomonas amyloderamosa dagegen tut dies nicht. Bei Pseudomonas ochracea liegt die optimale Wachstumstemperatur bei 35° C, wächst auch noch bei 37⁰C. Bei Pseudomonas amyloderamosa liegt die optimale Wachstumstemperatur zwischen 25 und 30° C; bei 37° C erfolgt kein Wachstum. Ferner verwertet P. ochracea Xylose, nicht aber Rohrzucker und Laktose, während P. amyloderamosa Rohrzucker und Laktose, aber keine Xylose verwertet. Hinzu kommt, daß erstere Salicyl-, Benzoe- und p-Oxybenzoesäure verwerten kann; dies kann P. amyloderamosa jedoch nicht.

Aufgrund dieser Ergebnisse stellte man fest, daß das erfindungsgemäß benutzte Bakterium eine neue Art ist, die Pseudomonas amyloderamosa SB-15 genannt wurde.

Isoamylase wird erfindungsgemäß induktiv erzeugt.

Das Kulturmedium kann als Kohlenhydratquelle enthalten: Stärke, lösliche Stärke, Dextrin, Säure- und En/ymhydrolysate von Stärke, Maltose und andere Stoffe mit glukosidischer Alpha-1,4- oder Alpha-1,6-Bindung.

Als Stickstoffqueller! können dienen: Ammoniumsalze, Nitrate und Harnstoff mit Glutaminsäure, Asparaginsäure und andere organische Stickstoffverbindungen wie Pepton, Maisaufquellungen, Hefeextrakte und Proteinhydrolysate. Die organischen Stickstoffverbindungen lassen sich für sich allein als Stickstoffquelle verwenden. Reine Naturstoffe, die im wesentlichen aus Reis- oder Süßkartoffelpulver bestehen und mit denen die Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen in geeigneter Weise vermengt sind, lassen sich ebenfalls anwenden. In jedem Fall muß die Menge der benutzten Stickstoffverbindung so gewählt sein, daß es ein optimales Ergebnis ergibt, da die Anwesenheit einer zu großen Menge an Stickstoffverbindungen für die Erzeugung der Isoamylase nich¹ günstig ist. In synthetischen Medien sollten anorganische Salze zusätzlich zu den genannten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zugesetzt werden.

F.rfinriungsgemäß werden folgende Kullurbedingungen eingehalten:

Das angewandte Kulturmedium wird auf pH 6 bis 8 eingestellt und mit P. amyloderamosa SB-15 inokuliert; danach wird unter Rütteln ode; Bewegen durch

ϊ Belüftung bei 20 bis 30° C 1 bis 5 Tage lang kultiviert. Wenn der pH-Wert während der Inkubationszeit in alkalisch umschlägt, sollten saure Bedingungen eingehalten werden, um eine hohe Isoamylase-Ausbeule zu erhalten. Nach der Inkubation werden die Zellen von

ίο der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt. Kalt gelagert ist die überstehende unreine Enzymlösung ziemlich stabil.

Aus dieser Enzymlösung können durch Lösungsmittelfällung, Aussalzen, Adsorption, Konzentrieren oder

I) andere Verfahren Isoamylasezubereitungen mit höherer Zahl an Einheiten erhalten werden; sowie durch Trocknen Isoamylase in Pulverform. Der optimale pH-Wert für die Reaktion dieses rohen Enzyms liegt bei etwa 3,0; das Enzym ist innerhalb des Bereiches der pH 3 bis 6 stabil.

Die erfindungsgemäß gewonnene Isoamylase kann beispielsweise zur Erzeugung von Amylose aus Stärke sowie von Maltose aus Stärke verwendet werden, indem Stärke der gleichzeitigen Einwirkung von Isoamylase und Beta-Amylase unterworfen wird.

Die Bestimmung der Isoamylase-Aktivität erfolgte im wesentlichen nach der von Maruo und Kobayashi im »Journal Agricult. Chem. Sve. Japan«, 23, 115 — 120 (1949) beschriebenen Methode, und zwar in folgender

in Weise:

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus

5,0 ml einer 1,0% löslichen klebrigen Reisstärkelösung 1,0 ml einer0,5 N-Essigsäure-Pufferlösung(pH4,0)und 1,0 ml Enzymlösung,

wird bei 40⁰C in geeigneten Zeitabschnitten inkubiert. Zu 1 ml des inkubierten Gemisches setzt man 1 ml einer 0,01 N-Jodkalium-Jodid-Lösung zu, verdünnt mit Wasser auf 25 ml und läßt 15 min stehen. Sodann wird 4(1 der Extinktionskoeffizient der Lösung bei 610 ιημ unter Anwendung einer Einzentimeterzelle bestimmt, wobei die Enzymmenge, die die Zunahme des Extinktionskoeffizienten um 0,1 in der Stunde bewirkt, als 10 Einheiten gewertet wird.

Beispi e 1 1
Ein Kulturmedium der Zusammensetzung

2,0% Maltose
0,2% Natriumglutamat
'"' 0,3% (NH„):HPO₄
0,1 % KH₂PO₄
0,05% MgSO₄ · 7 H₂O,

das mit Leitungswasser von pH = 7 angesetzt wurde, .1 wird mit dem SB-15-Stamm von Pseudomonas amyloderamosa inokuliert und unter Rütteln bei 30⁰C 120 h kultiviert. Nach der Inkubation bestimmte man, wie oben angegeben, die Isoamylase-Aktivität. In der Kulturflüssigkeit werden Aktivitäten von 180 bis 220 W) Einheiten/ml entwickelt. Durch Zenti ifugieren mit 10 000 U/min werden in 10 min die Zellen abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit rein erhalten. Unter Kühlen und Rühren der Flüssigkeit setzt man kaltes Aceluii bis zu einer Konzentration von 75% mit den h> Ziel zu, eine Ausfällung des finzyms zu bewirken. D-. r abgeschleuderte Niederschlag wird gefriergetrocknet. Man erhält Isoamylase in Pulverform. Ausbeute 80 bis 90%. Die erhaltene Isoamylase ist bei Irockner

Lagerung hochstabil. Durch Kombination der obigen Arbeitsweise mit dem Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder einer anderen Behandlung kann die Amylase weiter gereinigt werden.

Beispiel 2

Ein mit auf pH 7 eingestellten Leitungswasser bereitetes Kulturmedium der Zusammensetzung

1,0%
0,3%
U,l%
0,1%
0,05%

löslicher Stärke
(NK₄J₂HPO₄
KH₂PO₄
Polypepton
MgSO₄ · 7 H₂O

wird mit dem P. amyloderamosa SB-15 inokuliert und unter Rütteln bei 30° C 72 h kultiviert Das erhaltene Kulturfiltrat, dessen Isoamylase-Aktivität 164 Einheiten beträgt, behandelt man gemäß Beispiel 1. Ausbeute an Isoamylase-Aktivität aus 100 ml Kulturf.üssigkeit 82%.

Beispiel 3

Es wird eine Reihe Kulturmedien zubereitet, auf pH 7 eingestellt und in 5 ml Anteilen in konische 30-ml-Kolben gegeben. Man inokuliert das Medium in jedem Kolben mit 0,1 ml der Suspension des P. amyloderamosü SB-15 und kultiviert unter Rütteln bei 30⁰C. Nach 4 Tagen werden die Zellen durch Zentrifugieren mit 10 000 U/min in 10 min ausgefällt und in der überstehenden Kulturflüssigkeit die IsoamyJase-Aktivität bestimmt. Die Zusammensetzung der Kulturmedien und die Ausbeute an Isoamylase sind in der Tabelle angegeben. Die Trübung war bei lOfacher Verdünnung mit einer Wellenlänge von 610 ιημ gemessen.

Tabelle

Kohlenhydrat	Salze	Trübung	End-pH	Isoamylase- Aktivitäi Einheit -/ml
1% Maltose	0,1% Mono-Naglutamat 0,15% (NH₄J₂ HPO₄ 0,1% KH₂PO₄ 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O	0,319	4,9	50
1% Isomaltose	desgl.	0.603	4,1	12
2% Malzextrakt	—	0,120	4.0	26
2% klebriges Reispulver		0,658	3.9	33

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Erzeugung von Isoamylase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kulturmedium, das Quellen für Kohlehydrate und Stickstoff enthält, auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt wird, wonach dieses Kulturmedium mit dem Stamm Pseudomonas amyloderamosa SB-15 (ATCC 21 262) inokuliert wird und dieses Gemisch unter Rütteln oder Bewegen und Belüftung bei 20 bis 30⁰C kultiviert wird.

amyloderamosa »SB-15« wurden nach den im Bergey: »Manuai of determinative Bacteriology«, 7. Aufl., sowie gemäß »Journal of Japan Agricultural Chemical Society«, 36, 663 — 674 (1962) angegebenen Methoden bestimmt Man erzielte folgende Ergebnisse: