CN1215429A - 酶多聚体及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

提供了由很多单体单元构成的酶多聚体,它包括具有酶活性的第一种单体单元和具有酶活性的第二种单体单元,其中第一种单体单元和第二种单体单元中的每种都包括半胱氨酸残基,并且各种单体单元的半胱氨酸残基通过二硫键而相互以共价键结合,致使第一种单体单元与第二种单体单元以共价键连接。

Description

酶多聚体及其生产方法
本发明涉及具有改善的性能和应用特性的酶聚集体的生产。更具体地说，本发明涉及酶多聚体，它包括相互以共价键结合的同源的或异源的单体单元。本发明的酶多聚体具有这样的优点，例如在活性、变应原性或酶-底物相互作用方面具有改善了的性能。
已有人建议利用多酶聚集体通过增大它们的尺寸以减小成分酶的变应原性。例如，PCT公开No.94/10191公开了比单体亲代蛋白质显示更低变应原性的低聚蛋白质并提出了增大亲代酶尺寸的几种基本方法。此外，酶聚集体在分离的环境下表现出改善的特性。例如Naka等在化学通讯(Chem.Lett.),vol.8,pp.1303-1306(1991)中公开了辣根过氧化物酶聚集体，它是通过2-丁基-2-噁唑啉和2-甲基-2-噁唑啉之间经由2步嵌段共聚形成嵌段共聚物而制备的。该聚集体在水饱和的氯仿中的活性比天然酶高200倍以上。
已有人建议把通过添加戊二醛制备的交联酶作为稳定酶的方法。然而，交联通常导致与天然酶相比活性的降低。例如，Khare等在生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng),vol.35,no.1,pp.94-98(1990)中公开了用戊二醛生产的大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶的聚集体。该酶聚集体虽然在55℃下表现出热稳定性的改善，但活性只有天然酶活性的70.8％，然而它被认为在交联后可良好地保持活性。
如从上述理解的那样，本领域技术人员研究出了几种备择方法，试图为了减小变应原性或改变活性参数而生产聚集的酶。然而，这些方法的每一种中常见的问题是，当按这些现有技术的启示制备聚集的酶时，认为不容易预测某些酶呈聚集形式时将表现如何。此外，按这些现有技术的启示形成酶聚集体是高度依赖于偶然性的不严格科学，因此构成对制备具有预定活性的多酶聚集体的重大障碍。
为了克服这些问题，研究者们开发了包括预定的融合蛋白的酶聚集体。在典型的融合蛋白中，将一种蛋白质的基因与第二种蛋白质的基因融合，所得复合酶作为整体单元表达。这类应用于酶的融合蛋白，虽然从提供结合多种酶活性的单一蛋白质方面来看具有重要的优势，但从在合适的宿主细胞中表达和/或分泌方面来看尚有问题。例如，产生于或由于大小或三级结构引起的蛋白酶解、细胞内不适当的折叠和分泌问题反映了融合酶技术的重大缺点。
因此，希望开发一种制备适用于医疗、诊断或工业用途的多酶系统的新方法，就包括的酶活性和那些酶的相互位置关系而论本方法是专用的，可使特定应用的动力学达最大值。还希望开发一种制备在融合蛋白的表达和分泌特性中没问题的多酶系统的新方法，并且它能灵活地测定生成的多酶的构象。然而，现有技术不能提供一种生产具有这些特性的多酶系统的方法。
本发明的一个目的是提供一种酶多聚体，它具有改变了的活性、改变了的活性曲线图、改变了的环境要求或其它改变了的性能特征。
本发明的一个目的是提供一种酶多聚体，它可被容易地生产并被结合入现存的方法和产物中。
本发明的一个目的是提供一种可具有很多种酶活性的酶多聚体。
本发明的一个目的是提供一种可具有改善了的变应原性特征的酶活性。
按本发明，提供了由很多单体单元构成的酶多聚体，它包括具有酶活性的第一种单体单元和具有酶活性的第二种单体单元，其中所述第一种单体单元和第二种单体单元中的每种都包括半胱氨酸残基，并且所述半胱氨酸残基通过硫间接的键相互以共价键结合，致使所述第一种单体单元与第二种单体单元以共价键连接。
图1说明了从GG36单体单元的实际晶体结构测量结果推定的二聚体的三级结构模型。该单体单元的活性位点称为“A”区，钙离子称为“B”区，引入的半胱氨酸和硫间接的共价键位置称为“C”区。
图2说明了在DTT存在下S24C(单体)和GG36(单体)在4ppm和8ppm下的脱脂奶蛋白质水解活性结果比较。
图3说明了GG36-S24C二聚体和GG36(单体)在4ppm和8ppm下的脱脂奶蛋白质水解活性结果比较。
图4说明了用S24C(二聚体)和GG36(单体)在8ppm下使角蛋白水解120分钟的时间过程。
图5说明了120分钟后S24C(二聚体)和GG36(单体)在0～8ppm下对角蛋白的活性。
本发明提供了由很多单体单元构成的酶多聚体，它包括具有酶活性的第一种单体单元和具有酶活性的第二种单体单元，其中第一种单体单元和第二种单体单元中的每种都包括半胱氨酸残基，并且各种单体单元的半胱氨酸残基通过二硫键而相互以共价键结合，致使第一种单体单元与第二种单体单元以共价键连接。意外地，申请人发现本发明的酶多聚体显示提高了的活性。
“酶多聚体”表示由以共价键结合在一起的至少两种酶构成的单一蛋白质分子。因此，本发明的酶多聚体将具有至少两个能催化化学反应的不同位点，即至少两个活性位点。在本文称为“单体单元”的单独的酶可以包括具有酶活性的任意蛋白质或肽，且不限于已知的或现有的酶。合适的单体单元包括：水解酶如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、酯酶、脂肪酶或半纤维素酶；催化氧化还原反应的酶(氧化还原酶)如过氧化物酶、微过氧化物酶、漆酶、木质素酶、氧化酶、NADH还原酶、2,5DKG还原酶；转移酶；异构酶如葡糖异构酶或木糖异构酶；裂合酶；或者连接酶或合成酶。预计该多聚酶的单体单元可能是相同的酶，得自不同酶蛋白的相同活性，或完全不同的酶。所以，单体单元可以是“同源的”或“异源的”。在一个优选的实施方案中，单体单元包括细菌蛋白酶或淀粉酶，更优选是得自芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌蛋白酶或淀粉酶，最优选得自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
本文应用的“同源蛋白”或“同源酶”表示得自分类学上相同的有机体的或具有相同性能的两种或多种蛋白质或酶。例如，得自芽孢杆菌属特定菌株的两种相同的纤维素酶应是同源的。反之，本文应用的“异源蛋白”或“异源酶”表示得自分类学上不同的有机体的两种或多种蛋白质或酶。例如，得自不同属如大肠杆菌和地衣芽孢杆菌的蛋白质在本文被认为是异源的。此外，本发明认为得自分类学上不同的种如解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的蛋白质是异源的。正如本文应用的，得自相同微生物的两种不同酶例如得自T.longibrachiatum的EGⅠ纤维素酶和EGⅡ纤维素酶被认为是异源的。
预计同源多聚体可能适合于这类目的，例如与单独的前体酶相比改善催化活性或效率或者减小变应原性。例如，在从两种同源蛋白酶生产的酶二聚体中，所得蛋白酶二聚体可表现出比起蛋白酶单体来说改善了的活性或减小了的变应原性。另外，可能生成这种多聚体，即其中一种单体单元表现出不同于第二种单体单元的酶特性，但它们以互补的方式起作用。例如，在美国专利No.4,933,279中，据称得自地衣芽孢杆菌的野生型淀粉酶和得自解淀粉芽孢杆菌的野生型淀粉酶的混合物提供的效能有利于淀粉的液化。因此，预计包括得自地衣芽孢杆菌淀粉酶的第一种单体单元和得自嗜热脂肪芽孢杆菌的第二种单体单元的酶二聚体应具有特殊的价值。类似地，得自前体脂肪酶的第一种单体单元和得自前体蛋白酶的第二种单体单元应在洗衣洗涤剂中具有特别的益处，这是因为它们对包括蛋白质/脂质基质的污斑具有期望的互补活性。
本发明的多聚酶不同于包括两种或数种亚单位的天然酶。这些天然酶通常特征在于，为产生酶活性所有亚单位必须呈特定取向并且在亚单位复合体中只含一个活性位点。事实上，有些酶的活性取决于呈多聚形式的酶，因为构成多聚体的单体本身不具有酶活性。构成该多聚体的特定单体通常通过离子相互作用或疏水相互作用保持在一起，而不是通过如本发明中的共价二硫化物分子间相互作用或经由半胱氨酸硫反应间接的其它化学键而保持在一起。此外，本发明预计通过二硫键结合不同的酶单元(本文称为单体单元)从而形成具有多个活性位点的多聚酶。
在一个优选的实施方案中，该酶多聚体包括第一种单体单元，该单体单元已从相应的前体酶修饰以包括处于适当位置上的半胱氨酸残基。优选地，该第一种单体单元是前体酶的衍生物且因其中的位点特异性取代或添加至少一个半胱氨酸残基而不同。“衍生物”表示该前体包括已从其祖代或亲代序列修饰的氨基酸序列，通过生化的、基因的或化学的方法而实现一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。属于该定义范围的“衍生物”应具有一定程度的在天然或亲代形式中观察到的所需酶性能以致该衍生物适用于同前体一样的用途。前体酶可以是具有所需酶活性的任意酶或其变体。
应这样选择酶中添加的或取代的半胱氨酸残基所处的位置：保证不干扰活性位点的反应机制。因此，在一个优选的实施方案中，所选择的添加或取代的半胱氨酸残基的位置不能紧邻活性位点上的残基或对于底物结合很重要的残基，更优选地，就总的分子尺寸来说，添加的或取代的半胱氨酸在离活性位点和/或底物结合位点较大的表面位移处。因此，在一个实施方案中，二硫键将包括处于或接近该单体单元表面的两个半胱氨酸残基，这两个残基沿该蛋白质表面的位移相对于活性位点残基或底物结合残基的位置达最大值。不同的酶将具有不同的三级结构，这将改变添加或取代半胱氨酸的最适距离以便限制催化或底物结合干扰。然而，对于酶例如得自迟缓芽孢杆菌、一般尺寸为45×45×45的蛋白酶，应能在至少为10埃、优选为15埃且最优选为20埃的距离处放置一个添加的或取代的半胱氨酸。虽然通过X射线结晶学显示的三级结构的存在将有助于选择对于添加的或取代的半胱氨酸的位置，但有可能不用这些资料而获得这种位置信息。例如，可以通过交联或其它技术认可的方法如酪氨酸修饰随后进行活性测定而描绘活性位点或底物结合位点的位置，如Svendsen,Carlsberg Res.Communication,vol.41,no.5,pp.237-291(1976)中描述的那样。从该资料，将可能选择蛋白质表面上的已知非活性位点氨基酸。
通常，需要增大的活性时，单体单元的活性位点应以适当的方式排列以允许单体单元的活性位点最大程度地接触底物。例如，打算作用于高分子量或扩散性差的底物如角蛋白的多聚蛋白酶应优选产生使得单体单元的活性位点同样地排列以便最大程度地对平底物暴露活性位点。同样，预计当活性位点排成得能接触同一底物表面时，多聚的α淀酚酶对淀粉、纤维素酶对纤维素或半纤维素酶对木浆的活性将会增强。可被包括于多聚酶内的多种活性具有协同的或互补的效用。例如，用于洗涤剂、包括过氧化物酶和纤维素酶的多聚酶将适用于双重用途即用纤维素酶处理纤维素织物并应用过氧化物酶的漂白活性防止从纤维素除去染料而发生的染料转移。在该情况下，最好这样定位过氧化物酶活性位点：由纤维素酶从织物释出的染料通过过氧化物酶漂白。
通过特定的实例，本发明人发现通过将迟缓芽孢杆菌GG36蛋白酶分子中位置+24上的丝氨酸残基变成半胱氨酸，有可能改善该蛋白酶的活性分布曲线。参照图1，显然引入的半胱氨酸残基的位置是这样的，即相对于催化位点的位置它位于该分子的背面。
从单个的单体单元形成多聚酶可在便于两个半胱氨酸残基间形成硫间接的键的、本领域中已知的氧化条件下进行。一般地，二硫键将在熟知的适当条件(例如与氧或空气接触)下自发地形成，此时各单体单元上取代的或添加的半胱氨酸能形成二硫键。属于本发明的其它硫间接的键包括N-乙基马来酰亚胺、N,N′-对亚苯基二马来酰亚胺或双马来酰亚氨基己烷产生的连接基的应用。
预计本发明的多聚酶将适用于应用酶的任意用途。例如，多聚酶会适用于任意公认的酶应用中。例如，降解纤维素或淀粉而成寡糖或葡萄糖，用于清洁的洗涤剂，纺织品的制造和洗涤，烘烤，动物饲料添加剂以及纸浆和纸的制造，这些都是酶在其中有应用价值的工业上重要生产方法和产品的熟知实例，因此，本发明会给它们提供优势。
本发明的特别意外的结果在于，特定的一种或多种酶的活性可通过形成包括所需的一种或多种活性的多聚酶而提高。如下述实施例中所示，按本发明的启示有可能与相等浓度的单体酶活性位点相比就反应速度而论生产具有改善了的活性的多聚酶。同样，预计同单体单元酶或衍生它的前体酶相比，多聚酶的整体活性、半寿命以及性能特征如pH和温度依赖性可被改变。
如下实施例旨在阐述本发明但不能认为是限定本发明的范围。
                   实施例
                   实施例1
            蛋白酶二聚体GG36的制备
用于表达得自迟缓芽孢杆菌的枯草蛋白酶基因(GG36)的克隆和构建方法基本上如美国专利No.5,185,258中所述，该公开并入本文作参考。GG36的S24C变体的构建是按描述于美国专利No.5,185,258和PCT公开No.WO95/10615(Genencor International,Inc．)中的标准寡核苷酸指导的诱变进行的，它应用寡核苷酸引物
         5′CGTGGATTGACCGGTTGTGGTGTAAAAGTT3′来产生成熟枯草蛋白酶序列的位置24上Ser到Cys的变化。下划线的C残基产生限制酶Agel的识别序列，而下划线的G表示从TCT(Ser)密码子到TGT(cys)密码子的变化。制备突变型酶和野生型酶的发酵条件如US5,185,258中所述。然后使上述制备的GG36-S24C突变体接触空气以形成二聚化突变体。
                   实施例2
             蛋白酶GG36二聚体的纯化
将实施例1中制备并用DTT处理过的GG36-S24C发酵液的超滤液浓缩物脱盐(G-25柱)，再在pH8.0下通过阳离子交换色谱(BioCadHS/M柱)。SDS-Phast凝胶系统的分析揭示了一个级分含有分子量大约是野生型单体GG36蛋白酶的2倍的二聚化酶，它指示GG36-S24C的二聚化形式的存在。在阳离子交换色谱之后，充分分离发酵液中的二聚体与任何非二聚化蛋白酶以致在天然凝胶和SDS凝胶上只提供单一条带。
                   实施例3
蛋白酶二聚体、突变型单体和野生型酶在脱脂奶水解中的比较
酪蛋白是脱脂奶中约占总蛋白质的80％的主要蛋白质。脱脂奶的水解是定量分析蛋白酶活性的极好方法，因为脱脂奶中除了酪蛋白外还存在很多种蛋白质。在酪蛋白水解分析中测试实施例1和2中获得和纯化的GG36-S24C二聚体并与GG36单体比较。分别制备同样浓度(通过蛋白酶活性测定)的野生型GG36和GG36-S24C，并在4℃下将各溶液与50mM DTT在100mM Tris-HCl(pH8.6)中混合。将不含酶而含有50mM DTT的10mM Tris-HCl(pH8.6)用作对照物。应用DTT分裂GG36-S24C二聚体中存在的任何二硫键。
用NaOH将脱脂奶调节到pH为10～10.3，取180μl等分样与20μl适当的酶溶液(加有或未加DTT的GG36以及加有或未加DTT的GG36-S24C)组合至浓度为2、4或8ppm。也应用加有和未加DTT的对照物。然后将这些混合物置于96孔微量滴定板中并在37℃下振荡。在动态微量板读数仪(Molecular Devices,Inc.Mountain View,CA)中在650nm处每15分钟测一次溶液的浊度达1小时。浊度的降低指示脱脂奶中蛋白质的水解。
结果示于图2和3。图2说明S24C单体的性能等于GC36单体的性能。这是必要的，因为在相同条件下即两种情况下不存在或存在DTT时，不可能对S24C二聚体测试S24L单体。因此，如图3中所示，当不存在DTT时，将S24C二聚体与GC36单体比较。在实验过程中GG36-S24C二聚体的性能一直优于GG36单体。尤其值得注意的是将该二聚体达到特定的浊度降低程度所需时间与GG36野生型达到相同的浊度降低程度所需时间进行比较。例如，图3中在15分钟时，2ppm浓度的GG36-S24C二聚体导致浊度降低约20％。GG36野生型酶达到浊度降低20％所需的时间大约是它的2倍，例如约30分钟。该对脱脂奶的效应持续见于该二聚体和野生型单体的比较。
                    实施例4
蛋白酶二聚体、突变型单体和野生型酶在角蛋白水解中的比较
在角蛋白水解分析中测试实施例1和2中获得和纯化的GG36-S24C二聚体并与GG36单体比较。制备同样浓度的野生型GG36和GG36-S24C，并在4℃下与50mM DTT在100mM Tris-HCl(pH8.6)中组合。将不含酶而含有50mM DTT的10mM Tris-HCl(pH8.6)用作对照物。
将牛蹄和角的角蛋白粉(ICN Biomedicals Inc.,Cat#90211)悬浮于100mM pH10.3的碳酸钠缓冲液并强烈搅拌15分钟。在24孔板的各孔中放入1.5ml角蛋白溶液，添加15μl不同浓度(0.8,0.4,0.2,0.1或0.0mg酶/ml)的酶溶液至最终浓度8、4、2和0ppm蛋白质。在室温下振荡该混合物，在2小时期间每30分钟从各孔取两份15μl的等分样。将各等分样放入96孔微量滴定板上的15μl试剂A(20∶1的0.25M硼酸盐和2.5M NaOH)，并与15μl浓度为3.5mg/ml的TNBS混合。在室温下振荡该微量滴定板达10分钟，再添加230μl试剂B(105.52mg Na2SO3于200ml pH4.0的0.212M磷酸盐中)。在动态微量板读数仪(MolecularDevices,Inc.,Mountain View,CA)上读取405nm处的吸光度以测定每孔中通过角蛋白水解而释放的游离氨基的量。
结果示于图4和5。

Claims (21)

1．由很多单体单元构成的酶多聚体，它包括具有酶活性的第一种单体单元和具有酶活性的第二种单体单元，其中所述第一种单体单元和所述第二种单体单元中的每种都包括半胱氨酸残基，并且所述半胱氨酸残基通过二硫键相互以共价键结合，致使所述第一种单体单元与所述第二种单体单元以共价键连接。
2．权利要求1的酶多聚体，其中所述酶多聚体中所述第一种单体单元和第二种单体单元得自具有酶活性的前体酶。
3．权利要求2的酶多聚体，其中所述第一种或第二种单体单元与其相应的前体酶的不同之处在于其中取代或添加一个半胱氨酸残基。
4．权利要求2的酶多聚体，其中所述前体酶包括水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂合酶或连接酶。
5．权利要求4的酶多聚体，其中所述第一种或第二种单体包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、纤维素酶、乳糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β-葡糖淀粉酶、酯酶或半纤维素酶。
6．权利要求4的酶多聚体，其中所述第一种或第二种单体包括过氧化物酶、氧化酶、漆酶、葡糖氧化酶或木质素酶。
7．权利要求4的酶多聚体，其中所述第一种或第二种单体包括NADH还原酶或2,5DKG还原酶。
8．权利要求1的酶多聚体，其中所述第一种或第二种单体包括得自芽孢杆菌属的蛋白酶。
9．权利要求1的酶多聚体，其中所述芽孢杆菌属包括迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
10．权利要求3的酶多聚体，其中所述前体酶包括得自芽孢杆菌属的蛋白酶。
11．权利要求10的酶多聚体，其中所述芽孢杆菌属包括迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
12．生产酶多聚体的方法，它包括：
(a)通过在前体酶中添加或取代一个半胱氨酸残基而制备突变型酶；
(b)制备包括半胱氨酸残基的第二种酶；以及
(c)将步骤(a)的突变型酶与步骤(b)的所述第二种酶在一定条件下混合，在这种条件下能在所述突变型酶的添加的或取代的半胱氨酸残基与所述第二种酶中的所述半胱氨酸残基之间形成二硫键。
13．权利要求11的组合物，其中所述单体包括蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、酯酶、半纤维素酶、氧化还原酶、水解酶、氧化还原酶(anoxid-redactase)、转移酶、裂合酶或连接酶。
14．权利要求12的组合物，其中所述单体包括蛋白酶。
15．权利要求13的组合物，其中所述单体包括得自芽孢杆菌属的蛋白酶。
16．权利要求14的组合物，其中所述芽孢杆菌属包括迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
17．包括权利要求1的多聚酶的洗涤剂组合物。
18．权利要求16的洗涤剂组合物，其中所述多聚酶包括蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶或其混合物。
19．处理织物的方法，它包括将合适的织物组分与包括α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶或酯酶的权利要求1的多聚酶接触。
20．液化淀粉的方法，它包括将权利要求1的多聚酶组分与淀粉溶液接触，其中所述多聚酶包括α-淀粉酶、纤维素酶、酯酶或半纤维素酶。
21．处理纸浆和纸的方法，它包括将权利要求1的多聚酶组分与纸浆混合物接触，其中所述多聚酶包括纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶或酯酶。
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