MXPA01010896A

MXPA01010896A - Antagonistas cataliticos especificamente dirigidos al objetivo y usos de los mismos.

Info

Publication number: MXPA01010896A
Application number: MXPA01010896A
Authority: MX
Inventors: Richard R Bott
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1999-04-28
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2003-06-24
Also published as: WO2000064485A3; US20040170618A1; WO2000064485A9; JP5180417B2; KR20020057797A; WO2000064485A8; US8431121B2; WO2000064485A2; JP2002542303A; AU781451B2; EP1185302B1; EP1185302A2; US20110262419A1; CA2368213A1; AU4659500A; CA2368213C

Abstract

La invencion proporciona moleculas quimericas que son antagonistas cataliticos de una molecula objetivo. Los antagonistas cataliticos de esta invencion comprenden preferentemente una porcion dirigida al objetivo unida a una enzima que degrada la molecula especificamente enlazada por la porcion dirigida al objetivo. Los antagonistas cataliticos de esta invencion se enlazan asi a un objetivo reconocido por la porcion dirigida al objetivo (e.g. un receptor) el componente de enzima de la quimera degrada entonces todo o parte del objetivo. Esto da como resultado tipicamente una reduccion o perdida de la actividad del objetivo y libera la molecula quimerica. La molecula quimerica se encuentra entonces libre para atacar y degradar otras moleculas objetivo.

Description

ANTAGONISTAS CATALÍTICOS ESPECÍFICAMENTE DIRIGIDOS AL OBJETIVO Y USOS DE LOS MISMOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica prioridad y beneficio de la USSN 60/131,362, presentada el 28 de abril de 1999, como se proporciona bajo 35 U.S.C. §119 y/o 35 U.S.C. §120, según sea apropiado. La USSN 60/131,362 se incorpora en la presente para referencia íntegramente para todos los propósitos. DECLARACIÓN EN CUANTO A DERECHOS A INVENCIONES HECHAS BAJO INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO PATROCINADO FEDERALMENTE [No Aplicable] CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de las moléculas quiméricas. En particular, esta invención proporciona moléculas quiméricas novedosas que actúan como antagonistas catalíticos de objetivos (e.g. receptores, enzimas, lectinas, etc . ) . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En una molécula quimérica, dos o más moléculas que existen separadamente en su estado natural son unidas para formar una sola molécula que tiene la funcionalidad deseada de todas sus moléculas constituyentes. Frecuentemente, una de las moléculas constituyentes de una molécula quimérica es una "molécula dirigida al objetivo". La molécula dirigida al objetivo es una molécula tal como un anticuerpo que se une específicamente a su objetivo correspondiente y, en virtud de la molécula dirigida al objetivo, la molécula quimérica se unirá específicamente a células y tejidos objetivo que llevan el objetivo (e.g. el epitope) al cual se dirige la molécula dirigida al objetivo. Otro constituyente de la molécula quimérica puede ser una "molécula efectora" . La molécula efectora se refiere a una molécula que va a ser transportada específicamente al objetivo al cual la molécula quimérica está dirigida específicamente . Las moléculas quiméricas que comprenden una porción dirigida al objetivo unida a una porción efectora han sido usadas en una amplia variedad de contextos. Así, por ejemplo, las moléculas quiméricas que comprenden una porción dirigida al objetivo unida a una "molécula efectora" citotóxica han sido usadas frecuentemente para objetivar y eliminar células de tumor (ver, e.g., Pastan et al., Ann. Rev. Biochem., 61:331-354 (1992). Otras moléculas quiméricas que comprenden una porción dirigida al objetivo unida a inhibidores de angiogenesis han sido usadas para inhibir el crecimiento y/o proliferación de tumores. A la inversa, se han propuesto inductores de angiogenesis para el tratamiento de ateroesclerosis. Otros usos de las moléculas quiméricas han involucrado el suministro de intracuerpos, anticuerpos expresados intracelularmente que se unen entonces a una proteína intracelular, el suministro específico de vectores (e.g. para terapia génica), o la creación de liposomas específicos de tejidos. Típicamente, el objetivo reconocido por la porción dirigida al objetivo no es el sitio de acción deseado de la molécula efectora. Así, por ejemplo, en el caso de citotoxinas quiméricas usadas para tratar el cáncer (e.g. IL4-PE, BlFvPE38, etc., ver, e.g. Benhar & Pastan (1995) Clin. Canc. Res., 1:1023-1029, Thrush et al. (1996) Ann. Rev. Immunol . , 14:49-71, etc.) la porción dirigida al objetivo se une específicamente a un objetivo sobre la superficie de la célula. La molécula quimérica es entonces internalizada en la célula y la molécula efectora (e.g. ricina, abrina, toxina de Difteria, exotoxina de Pseudomonas) es transportada al citosol de la célula, en donde ejerce su actividad característica (e.g. ribosilación de ADP en el caso de exotoxina de Pseudomonas) . De forma similar, los liposomas dirigidos al objetivo son típicamente internalizados a través de un proceso mediado por receptores, o a través de la acción del lípido. Los intracuerpos dirigidos al objetivo y los vectores de la terapia génica son también internalizados para su expresión dentro de la célula. Además, una meta común en el diseño de moléculas quiméricas buscadas ha sido el incremento de la especificidad y afinidad de unión. Por lo general se cree que, incrementando la afinidad y la especificidad, la concentración de la molécula quimérica para lograr un resultado dado disminuirá. Así, la liberación de la molécula quimérica de su objetivo es visto por lo general como indeseable. Debido a que la molécula quimérica es típicamente internalizada (en el caso de células dirigidas al objetivo) y la actividad de las moléculas efectoras está dirigida a una molécula diferente del objetivo reconocido específicamente, las moléculas quiméricas típicamente actúan de una manera "estequiométrica". Esto es, cada molécula quimérica es consumida esencialmente en su interacción con su "sustrato" , y la actividad de la molécula quimérica ya no está disponible para reacciones subsecuentes. Como una consecuencia las moléculas quiméricas deben ser mantenidas en una concentración relativamente alta para tener eficacia, y un problema recurrente de las porciones quiméricas, particularmente en aplicaciones in vivo es la incapacidad de mantener concentraciones elevadas en suero de la molécula quimérica durante periodos de tiempo terapéuticamente significativos y la toxicidad incrementada (e.g. no específica) provocada por las altas dosificaciones que deben ser utilizadas.

Los intentos para resolver este problema se han enfocado en reducir la inmunogenicidad de la quimera (e.g. usando anticuerpos humanizados, fragmentos de anticuerpo, proteínas de fusión pequeñas, etc.) o "enmascarando" la molécula quimérica (e.g. liposomas "furtivas"). En particular, el ímpetu para reducir la inmunogenicidad, penetración mejorada en el tumor, y similares, ha dado lugar al uso incrementado de proteínas de fusión en vez de porciones acopladas químicamente en moléculas quiméricas (ver, e.g. Pastan (1992) Ann. Rev. Biochem., 61:331-354; Thrush (1996) Ann. Rev. Immunol . , 14:49-71; Brinkmann y Pastan (1994) Biochem. Biophys. Acta, 1198:27-45, etc.), pero no han consignado la estequiometría real o la cinética de la quimera . SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona un enfoque novedoso al diseño de moléculas quiméricas. En una modalidad, las moléculas de esta invención se unen específicamente a una molécula objetivo y degradan esa molécula unida. En las modalidades preferidas, esto resulta en una pérdida de actividad (e.g. actividad biológica) de la molécula objetivo, y también resulta en la liberación de la molécula quimérica, de modo que es libre de encontrar y degradar otro objetivo. De esta manera la molécula quimérica es "regenerada" y esencialmente catalítica. Debido a que una sola molécula quimérica puede atacar y degradar un número esencialmente ilimitado de objetivos, los así llamados "antagonistas catalíticos" de esta invención son altamente efectivos en dosis relativamente bajas. Así, en una modalidad, esta invención proporciona un antagonista catalítico de una molécula objetivo (e.g. una enzima, un receptor, etc.). El antagonista comprende una porción dirigida al objetivo que se une específicamente a la molécula objetivo, y la porción dirigida al objetivo está unida a una enzima que degrada la molécula objetivo para reducir la unión de la molécula objetivo a su ligando análogo. En modalidades particularmente preferidas, la degradación de la molécula objetivo también reduce la unión del antagonista a la molécula objetivo. Así, en estas modalidades, el antagonista es liberado del objetivo, permitiendo por medio de esto que el antagonista se una y degrade otra molécula objetivo. En modalidades particularmente preferidas, la porción dirigida al objetivo está unida a la enzima a través del grupo sulfuro sobre una cisteína, y la cisteína es una cisteína que existe naturalmente en la enzima, o una cisteína introducida en la enzima (e.g. substituida por un amino ácido natural diferente de la cisteína en la enzima) . En ciertas modalidades preferidas, la cisteína es una cisteína que es substituida por un amino ácido natural diferente de la cisteína en o cerca de un subsitio que comprende un sitio que se une al substrato de la enzima. En algunas modalidades, la cisteína es una cisteína que es substituida por un amino ácido que forma un sitio que se une al substrato. Las enzimas preferidas incluyen, pero no están limitadas a una proteasa, una esterasa, una amidasa, una peptidasa, una lactamasa, una celulasa, una oxidasa, una oxidorreductasa, una reductasa, una transferasa, una hidrolasa, una isomerasa, una ligasa, una lipasa, una fosfolipasa, una fosfatasa, una cinasa, una sulfatasa, una lisosimasa, una glicosidasa, una nucleasa, una aldolasa, una cetolasa, una liasa, una ciclasa, una transcriptasa inversa, una hialuronidasa, una amilasa, una cerebrosidasa, y una quitinasa. En una modalidad particularmente preferida, la enzima es una serina hidrolasa. En una modalidad aun más preferida, la enzima es una serina hidrolasa de tipo subtilisina (e.g. una subtilisina de Bacillus lentus) y la cisteína es substituida por un amino ácido en o cerca del subsitio seleccionado del grupo que consiste de un subsitio Sl, un subsitio SI', y un subsitio S2. En una modalidad particularmente preferida, la enzima es una subtilisina de Bacillus lentus. En modalidades preferidas, la cisteína es substituida por un amino ácido en una subtilisina, en donde el amino ácido corresponde a aun residuo de referencia en una subtilisina de Bacillus lentus, en donde el residuo de referencia está en o cerca de un residuo seleccionado del grupo que consiste del residuo 156, el residuo 166, el residuo 217, el residuo 222, el residuo 62, el residuo 96, el residuo 104, el residuo 107, el residuo 189, y el residuo 209. En otra modalidad, la enzima es una proteasa de serina de tipo quimiotripsina, y la cisteína es substituida por el amino ácido que corresponde a un residuo de referencia en una tripsina madura (Protein Data Bank entrada 1TPP) , en donde el residuo de referencia está en o cerca de un residuo seleccionado del grupo que consiste de Tyr94, Leu99, Gln75, Aspl89, Serl90, Glnl92, Phe41, Lys60, Tyrl51, Ser214, y Lys224. En todavía otra modalidad, la enzima es una serina hidrolasa de tipo alfa/beta, y la cisteína es substituida por el amino ácido que corresponde a un residuo de referencia en una lipasa de Candida antartica (Protein Data Bank entrada 1TCA) , en donde el residuo de referencia está en o cerca de un residuo seleccionado del grupo que consiste de Trpl04, Leul40, Leul44, Vall54, Glul88, Ala225, Leu278 e Ile285. En todavía otra modalidad la enzima es una aspartil proteasa. Más preferiblemente, la enzima es una proteasa de tipo pepsina, y la cisteína es substituida por el amino ácido que corresponde a un residuo de referencia en una pepsina humana madura (Protein Data Bank entrada 1PSN) , en donde el residuo de referencia está en o cerca de un residuo seleccionado del grupo que consiste de Tyr9, Met12, Glul3, Gly76, Thr77, Phelll, Phell7, Ilel28, Serl30, Tyrl89, Ile213, Glu239, Met245, Gln287, Met289, Leu291, y Glu294. En todavía otra modalidad, la enzima es una cisteína proteasa. Más preferiblemente, la enzima es una papaína, y la cisteína es substituida por el amino ácido que corresponde a un residuo de referencia en una papaína madura (Protein Data Bank entrada 1BQI) , en donde el residuo de referencia está en o cerca de un residuo seleccionado del grupo que consiste de Asnl8, Ser21, Asn64, Tyr67, Trp69, Glnll2, Glnl42, Aspl58, Trpl77, y Phe207. En ciertas modalidades, la enzima es una metaloproteasa, y la cisteína es substituida por el amino ácido que corresponde a un residuo de referencia en una metaloproteasa de matriz humana madura (Protein Data Bank entrada 83OC) , en donde el residuo de referencia está en o cerca de un residuo seleccionado del grupo que consiste de Leulll, Phel75, Tyrl76, Serl82, Leul84, Phel89, Tyr214, Asp231, Lys234, e Ile243. En ciertas modalidades la porción dirigida al objetivo antagonista catalítico está dirigida contra un objetivo en donde el objetivo es una molécula presente sobre la superficie de la célula (e.g., una molécula que forma un receptor, un ligando, un componente de la pared de una célula, un componente de la membrana de una célula, etc.). en ciertas modalidades la porción dirigida al objetivo incluye, pero no está limitada a un antígeno, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un complejo de coordinación, un azúcar, una vitamina, un dendrímero, y un éter corona. En una modalidad particularmente preferida la porción dirigida al objetivo es un ligando análogo para un receptor o una enzima. En otra modalidad particularmente preferida la porción dirigida al objetivo es un inhibidor para un receptor o una enzima. En ciertas modalidades preferidas, la enzima es una proteasa (e.g. una papaina, una subtilisina, una pepsina, una tripsina, una metaloproteasa, etc.) y la porción dirigida al objetivo es un ligando seleccionado del grupo que consiste de un carbohidrato, una vitamina o análogo de vitamina, un inhibidor de enzima, un péptido, un compuesto farmacéutico que es una molécula orgánica pequeña, y biotina. En otra modalidad la enzima es una proteasa, y la porción dirigida al objetivo es un receptor. En ciertas modalidades preferidas, la enzima es una proteasa (e.g. una papaína, una subtilisina, una pepsina, una tripsina, una metaloproteasa, etc.) y la porción dirigida al objetivo es un inhibidor de enzima que es un pirazol, una biotina, un ligando que se une a una lectina (e.g. una concavalina A), un carbohidrato (e.g. tioetil D-manopiranósido) . En una modalidad particularmente preferida la porción dirigida al objetivo se une específicamente a una mancha, y la enzima degrada un componente de la mancha. En otra modalidad esta invención proporciona un método para degradar una molécula objetivo. El método involucra poner en contacto la molécula objetivo con un antagonista catalítico que comprende una porción dirigida al objetivo que se une específicamente a la molécula objetivo, la porción dirigida al objetivo está unida a una enzima que degrada la molécula objetivo. En una modalidad preferida la degradación de la molécula objetivo libera el antagonista, permitiendo por medio de esto que el antagonista se una y degrade otra molécula objetivo. En modalidades preferidas, la porción dirigida al objetivo está unida a la enzima a través del grupo sulfuro sobre una cisteína. Las moléculas antagonistas preferidas incluyen, pero no están limitadas a las moléculas antagonistas catalíticas descritas arriba. En todavía otra modalidad, esta invención proporciona una enzima que tiene una especificidad de substrato alterada (es decir, una "enzima redirigida") . La enzima preferiblemente comprende una porción dirigida al objetivo unida a un subsitio que comprende el sitio de unión al substrato de la enzima. En modalidades preferidas, la porción dirigida al objetivo está acoplada a la enzima a través de un azufre de una cisteína en el subsitio de la enzima. La cisteína puede ser una cisteína natural, o una cisteína es substituida por un amino ácido natural que no es cisteína en el subsitio de la enzima. Las enzimas preferidas incluyen, pero no están limitadas a una proteasa, una esterasa, una amidasa, una peptidasa, una lactamasa, una celulasa, una oxidasa, una oxidorreductasa, una reductasa, una transferasa, una hidrolasa, una isomerasa, una ligasa, una lipasa, una fosfolipasa, una fosfatasa, una cinasa, una sulfatasa, una lisosima, una glicosidasa, una glicosiltransferasa, una nucleasa, una aldolasa, una cetolasa, una liasa, una ciclasa, una transcriptasa inversa, una hialuronidasa, una amilasa, una cerebrosidasa y una quitinasa. En modalidades particularmente preferidas, la enzima es una serina hidrolasa (e.g. una subtilisina) . En una subtilisina, la cisteína es preferiblemente subsitiada para amino ácidos en o cerca de un subsitio seleccionado del grupo que consiste de un subsitio Sl, un subsitio SI', y un subsitio S2. Los sitios particularmente preferidos para la substitución de la cisteína en varias enzimas incluyen, pero no están limitados a aquellos identificados arriba. De forma similar, los objetivos y las porciones dirigidas al objetivo particularmente preferidos incluyen auquellos identificados arriba. En ciertas modalidades las porción dirigida al objetivo es un inhibidor para un receptor o una enzima, en otras modalidades la porción dirigida al objetivo se selecciona del grupo que consiste de un factor de crecimiento, una citocina, y un ligando de receptor. En ciertas modalidades, la enzima es una proteasa, y la porción dirigida al objetivo es un ligando seleccionado del grupo que consiste de un carbohidrato, una vitamina o análogo de vitamina, un inhibidor de enzima, un péptido, un compuesto farmacéutico que es una molécula orgánica pequeña, y biotina. En una modalidad particularmente preferida, la enzima es una proteasa (e.g. una papaína, una subtilisina, una pepsina, etc.) y la porción dirigida al objetivo es un receptor, inhibidor de enzima que es un pirazol, una biotina, un ligando que se une a una lectina (e.g. una concavalina A), o un carbohidrato (e.g. tioetil D-manopiranósido) . En una modalidad la porción dirigida al objetivo se une específicamente a una mancha, y la enzima degrada un componente de la mancha. En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para dirigir la actividad de una enzima a un objetivo específico. Los métodos comprenden proporcionar una enzima que tiene una especificidad de substrato alterada, la enzima comprende una porción dirigida al objetivo unida a un subsitio dentro de la región que se une al substrato de la enzima, y poner en contacto el objetivo con la enzima, por medio de lo cual la enzima se une específicamente al objetivo, localizando con esto la actividad de la enzima en el objetivo. Las enzimas preferidas incluyen, pero no están limitadas a, las enzimas "redirigidas" descritas arriba. La presente invención también proporciona métodos para mejorar la actividad de una droga que actúa como un inhibidor de un receptor o una enzima. Los métodos involucran acoplar una hidrolasa a la droga, de tal manera que cuando la droga se une al receptor o enzima, la hidrolasa degrada el receptor o enzima. En modalidades preferidas, el método incrementa la ventana terapéutica de dosificación de la droga. En una modalidad particularmente preferida la hidrolasa es una serina hidrolasa (e.g. subtilisina). En ciertas modalidades preferidas, la hidrolasa es una metaloproteasa, una cisteína proteasa, una aspartil proteasa, y similares. Esta invención también proporciona un método para inhibir una enzima o un receptor. El método comprende poner en contacto la enzima o receptor con una molécula quimérica que comprende un ligando que se une a la enzima o receptor unido a una enzima que degrada el ligando análogo de la enzima o receptor. La enzima así llega a estar unida a la enzima o receptor, en donde es libre para degradar el ligando análogo, previniendo con esto que el ligando análogo active el receptor, o actúe como un substrato para la enzima. En una modalidad preferida la molécula quimérica comprende una hidrolasa (e.g. una proteasa) unida a un inhibidor de la enzima o receptor. Las hidrolasas preferidas incluyen, pero no están limitadas a una proteasa de serina, una cisteína proteasa, una aspartil proteasa, una proteasa de tipo pepsina, y una metaloproteasa. En ciertas modalidades, esta invención no incluye anticuerpos catalíticos, por ejemplo, como los descritos por Hifumi et al., (1999), J. Bioscience and Bioengineering, 88:323. Definiciones . El término "antagonista catalítico" como se usa en la presente se refiere a una enzima que puede inhibir la actividad de una molécula que tiene una actividad biológica particular y/o simplemente degrada una molécula que no tiene una actividad biológica particular. La inhibición puede ser un bloqueo o destrucción de la función de la molécula "objetivo". En modalidades preferidas, la inhibición o bloqueo es por degradación parcial o completa de la molécula objetivo. El "antagonista catalítico" es catalítico por virtud del hecho de que el antagonista no es consumido en si mismo o alterado significativamente (es decir, cambiado de forma permanente) por su interacción con la molécula objetivo. Así, en modalidades preferidas, la degradación de la molécula objetivo resulta finalmente en la liberación del antagonista catalítico, de modo que es libre para atacar otra molécula objetivo. La reacción es preferiblemente sub-estequiométrica (la relación de antagonista catalítico a objetivo es menor de 1) y un solo antagonista catalítico es libre para degradar cualquier número de moléculas objetivo. Una "molécula objetivo" se refiere a una molécula que es unida específicamente por el antagonista catalítico, o enzimas dirigidas específicamente descritas en la presente. Cuando un antagonista catalítico es empleado, la molécula objetivo es parcialmente o completamente degradada por este antagonista. Una "porción dirigida al objetivo" se refiere a una porción en la molécula quimérica que se une específicamente a la molécula objetivo. Antes del acoplamiento de la porción dirigida al objetivo a la enzima, la porción dirigida al objetivo es una molécula que elige un objetivo. En modalidades preferidas, la porción dirigida al objetivo es una de un par de asociados que se unen a un análogo. El término "se une específicamente" cuando se refiere a la interacción de una porción dirigida al objetivo y su asociado que se une al análogo se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la porción dirigida al objetivo o la molécula de análogo en presencia de una población heterogénea de moléculas (e.g., proteínas y otros compuestos biológicos) . Así, por ejemplo, en el caso de un par de unión receptor/ligando el ligando seleccionaría específicamente y/o preferiblemente su receptor de una mezcla compleja de moléculas, o viceversa. La unión puede ser por uno o más de una variedad de mecanismos que incluyen, pero no están limitados aa interacciones iónicas, interacciones covalentes, interacciones hidrofóbicas, interacciones de van der Waals, etc. Los términos "asociado de unión" , o un miembro de un "par de unión" , o "ligando análogo" se refieren a moléculas que se unen específicamente a otras moléculas para formar un complejo de unión tal como anticuerpo/antígeno, lectina/carbohidrato, ácido nucleico/ácido nucleico, receptor/ligando de receptor (e.g. receptor de IL-4 e IL-4) , avidina/biotina, etc. El término ligando se usa para referirse a una molécula que se une específicamente a otra molécula. Comúnmente un ligando es una molécula soluble, e.g. una hormona o citocina, que se une a un receptor. La decisión en cuanto a que miembro de un par de unión es el ligando y cual el "receptor" es frecuentemente un poco arbitrario cuando se usa el sentido más amplio de receptor (e.g. cuando no hay implicación de transducción de señal) . En estos casos, típicamente el más pequeño de los dos miembros del par de unión es llamado el ligando. Así, en la interacción lectina-azúcar, el azúcar sería el ligando (aun si está unido a una molécula mucho más grande, el reconocimiento es del sacárido) . Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" son usados de forma intercambiable en la presente para referirse a un polímero de residuos de amino ácido. Los términos se aplican a polímeros de amino ácidos en los cuales uno o más residuos de amino ácidos es un análogo químico artificial de un amino ácido correspondiente que existe naturalmente, así como también a polímeros de amino ácidos que existen naturalmente. El término también incluye variantes sobre el enlace peptídico que une los amino ácidos que componen el polímero. Las proteínas también incluyen glicoproteíneas (e.g. glicoproteína rica en histidina HRG) , antígeno Y de Lewis (Le?) , y similares) . Los términos "ácido nucleico" u "oligonucleótido" o equivalentes gramaticales en la presente se refieren al menos a dos nucleótidos unidos covalentemente. Un ácido nucleico de la presente invención es preferiblemente de una hebra o de dos hebras, y por lo general contendrá uniones de fosfodiéster, aunque algunos casos, como se explica abajo, análogos de ácido nucleico están incluido que pueden tener estructuras principales alternas, que comprenden, e.g., fosforamida (Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10): 1925) y referencias contenidas en la misma; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl y colab (1977) Eur J. Biochem. 81:579; Letsinger et al. (1986), Nucí. Acids Res. 14:3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lette . 805, Letsinger et al. (1988), J. Am. Chem. Soc. 110:4470; y Puwels et al. (1986), Chemical Scripta 26:1419), fosforotioato (Mag et al. (1991) Nucleic Acids res. 19:1437; y Patente de E.U.A. No. 5,644,048), fosforoditioato (Briu et al. (1989), J. Am. Chem. Soc. 111: 2321, enlaces de O-metilfosforamidita (ver Eckstein, Oligonucleotides and analogous : A Practical Approach, Oxford Uiversity Press) , y estructuras principales y enlaces de ácidos nucleicos de péptidos (ver Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 3:1008; Nielsen (1993) Nature, 365:566; Carlsson et al. (1996) Nature 380:207), Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con estructuras principales positivas (Denpcy et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:6097; estructuras principales no iónicas (Patentes de EUA Nos. 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216,141 y 4,469,863; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; capítulos 2 y 3, ACS Symposium Series 580, "Modificaciones de carbohidratos en Investigación de Antisentido", Ed. Y. S. Sanghui y P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y estructuras principales de no ribosa, que incluyen aquellas descritas en las patentes de USA Nos. 5,235,033 y 5,034,506, y los capítulos 6 y 7, ACS Symposium Series 580, "Modificaciones de carbohidratos en Investigación de Antisentido", Ed. Y. S. Sanghui y P. Dan Cook. Ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicas están también incluidas dentro de la definición de ácidos nucleicos (ver Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev. Páginas 169-176) . Varios análogos de ácidos nucleicos están descritos en Rawis, C & E News del 2 de junio de 1997, página 35. Estas modificaciones de la estructura principal de ribosa-fosfato pueden ser hechas para facilitar la adición de porciones adicionales tales como etiquetas o marcas, o para incrementar la estabilidad y la vida media de tales moléculas en ambientes fisiológicos. El término "residuo" como se usa en la presente se refiere a amino ácidos naturales, sintéticos o modificados. El término enzima incluye proteínas que son capaces de catalizar cambios químicos en otras substancias sin ser ellas cambiadas en si mismas. Las enzimas pueden ser enzimas de tipo natural o enzimas variantes. Las enzimas dentro del alcance de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, proteasas, esterasas, amidasas, peptidasas, lactamasas, celulasas, oxidasas, oxidorreductasas, reductasas, transferasas, hidrolasas, isomerasas, ligasas, lipasas, fosfolipasas, fosfatasas, cinasas, sulfatasas, lisosimasas, glicosidasas, nucleasas, aldolasas, cetolasas, liasas, ciclasas, transcriptazas reversas, hialuronidasas, amilasas, cerebrosidasas, quitinazas, y similares. Una "enzima mutante" es una enzima que ha sido cambiada reemplazando un residuo de amino ácido con una cisteína u otro residuo. Una enzima "modificada químicamente" es una enzima que ha sido derivatizada para que lleve un substituyente que normalmente no se encuentra en ese sitio en la enzima. La derivatización típicamente es de una modificación post translacional, ocasionalmente realizada in vivo, pero más típicamente realizada ex vivo. Una "enzima mutante modificada químicamente" o "CMM" es una enzima en la cual un residuo de amino ácido ha sido reemplazado con otro residuo de amino ácido (preferiblemente una cisteína) y el residuo de reemplazo está derivatizado químicamente para que lleve un substituyente que no se encuentra normalmente en ese residuo. El término "grupo de cadena lateral de tiol" , "grupo que contiene tiol", y "cadena lateral de tiol" son términos que pueden ser usados de forma intercambiable, e incluyen grupos que son usados para reemplazar el hidrógeno del tiol de una cisteína. Comúnmente el grupo de cadena lateral de tiol incluye un átomo de azufre a través del cual el grupo de cadena lateral de tiol que está unido al azufre del tiol de la cisteína. El "substituyente" típicamente se refiere al grupo que permanece unido a la cisteína a través de un enlace de disulfuro formado haciendo reaccionar la cisteína con un reactivo de metansulfonato como se describe en la presente. Mientras que el término substituyente se refiere preferiblemente solo al grupo que permanece unido (excluyendo su grupo tiol) , el substituyente también puede referirse al grupo de cadena lateral de tiol completo. La diferencia será clara del contexto. El "sitio de unión de una enzima" consiste de una serie de subsitios a través de la superficie de unión al substrato de la enzima (Berger & Schechter (1970) Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. B 257:249-264). Los residuos del substrato que corresponden a los subsitios están marcados P, y los subsitios están marcados S. Por convención, los subsitios están marcados Si, S2, S3, S4, Si' , y S2' . Una exposición de los subsitios puede ser encontrada en Siezen et al. (1991) Protein Engineering, 4:719-737, y Fersht (1985) Enzyme Structure and Mechanisms, 2a Ed. Freeman, New York, 29-30. Los subsitios preferidos incluyen Sx, Si', y S2. La frase "amino ácido ##" o "amino ácido ## en el subsitio XX" se propone para incluir el amino ácido en la posición citada (e.g. amino ácido 156 de subtilisina de B. lentus que está en el subsitio Si) y los amino ácidos en la posición correspondiente (homologas) en enzimas relacionadas. Un residuo (amino ácido) de una enzima es equivalente a un residuo de una enzima citada (e.g. subtilisina de B. amyloliquefaciens) si es ya sea homologa (es decir, que corresponde en posición en cualquiera de la estructura primaria o terciaria) o análoga a un residuo específico o porción de ese residuo en subtilisina de B. amyloliquefaciens (es decir, que tiene la misma o similar capacidad funcional para combinarse, reaccionar, o interactuar químicamente) . Para establecer homología a estructura primaria, la secuencia de amino ácidos de la enzima objeto (e.g. una serina hidrolasa, cisteína proteasa, aspartil proteasa, metaloproteasa, etc.) es comparada directamente a una enzima de referencia (e.g. subtilisina de B. amyloliquefaciens en el caso de una proteasa de serina de tipo subtilisina) secuencia primaria y particularmente a un conjunto de residuos que se sabe que son invariantes en todas las enzimas de esa familia (e.g. subtilisina) para la cual se conoce la secuencia.

Después de alinear los residuos conservados, que permiten las inserciones y supresiones necesarias para mantener la alineación (es decir, evitando la eliminación de residuos conservados a través de supresión e inserción arbitraria) , los residuos equivalentes a amino ácidos particulares en la secuencia primaria de la enzima de referencia (e.g. subtilisina de B. amyloliquefaciens) son definidos. La alineación de los residuos conservados preferiblemente debe conservar 100 % de tales residuos. Sin embargo, la alineación mayor de 75 % o tan pequeña como 50 % de residuos conservados es también adecuada para definir residuos equivalentes. La conservación de la tríada catalítica (e.g. Asp32/His64/Ser221) debe ser mantenida para las hidrolasas de serina. Los residuos conservados pueden ser usados para definir los residuos de amino ácidos equivalentes correspondientes en otras enzimas relacionadas. Por ejemplo, las dos secuencias (de referencia y "objetivo") son alineadas para producir la máxima homología de residuos conservados. Puede haber un número de inserciones y supresiones en la secuencia "objetivo", comparadas a la secuencia de referencia. Así, por ejemplo, un número de supresiones se ve en la secuencia de termitasa comparada a la subtilisina de B. amyloliquefaciens (ver, e.g., la patente de EUA No. 5,972,682) . Así, el amino ácido equivalente de Tyr217 en la subtilisina de B. amyloliquefaciens en la termitasa es la lisina particular mostrada bajo Tyr217 en la Figura 5B-2 de la patente No. 5,972,682. Los residuos "equivalentes" particulares pueden ser substituidos por un amino ácido diferente para producir una carbonil hidrolasa mutante puesto que son equivalentes en la estructura primaria. Residuos equivalentes homólogos en el nivel de la estructura terciaria para una enzima particular cuya estructura terciaria ha sido determinada por cristalografía de rayos X, son definidos como aquellos para los cuales las coordenadas atómicas de 2 o más de los átomos de la cadena principal de un residuo de amino ácido particular de la secuencia de referencia (e.g. subtilisina de B. amyloliquefaciens) y la secuencia en cuestión (secuencia objetivo) (N sobre N, CA sobre CA, C sobre C, y O sobre O) están dentro de 0.13 nm, y preferiblemente 0.1 nm después de alineación. La alineación se logra después de que el mejor modelo ha sido orientado y posicionado para dar la máxima superposición de coordenadas atómicas de átomos de la proteína que no son hidrógeno de la enzima en cuestión, a la secuencia de referencia. El mejor modelo es el modelo cristalográfico que da el menor factor R para datos de difracción experimental en la máxima resolución disponible. h Los residuos equivalentes que son funcionalmente análogos al residuo específico de una secuencia de referencia (e.g. subtilisina de B. amyloliquefaciens) están definidos como aquella secuencia de amino ácidos en cuestión (e.g. subtilisina relacionada) que pueden adoptar una conformación tal que alterará, modificará o contribuirá a la estructura de la proteína, unión al substrato o catálisis de una manera definida y atribuida a un residuo específico de la secuencia de referencia como se describe en la presente. Además, son aquellos residuos de la secuencia en cuestión (para la cual una estructura terciaria ha sido obtenida por cristalografía de rayos X) , que ocupa una posición análoga al grado de que, aunque los átomos de la cadena principal del residuo dado no pueden satisfacer el criterio de equivalencia sobre la base de ocupar una posición homologa, las coordenadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena lateral del residuo corresponden con 0.13 nm de la cadena lateral correspondiente del (de los) residuo (s) de la secuencia de referencia. Las estructuras tridimensionales estarían alineadas como se expone arriba. Para una ilustración de este procedimiento, ver la patente de EUA No. 5,972,682. Un "residuo de referencia" se refiere a un residuo que está especificado en una enzima particular, y que sirve como un "punto de referencia" para identificar, e.g. como se describe arriba, residuos equivalentes en otros miembros de la familia de la cual la enzima de referencia es un miembro. Así, la frase "el amino ácido que corresponde a un residuo de referencia en la proteína X humana madura" se refiere a residuos equivalentes (u homólogos) al residuo de referencia de la proteína X en otros miembros de la misma familia de proteína. Además, cuando la proteína objeto es la proteína X, la frase se refiere al residuo de referencia mismo. Una "serina hidrolasa" es una enzima hidrolítica que utiliza una cadena lateral de serina activa para que sirva como un nucleófilo en una reacción hidrolítica. Este término incluye serina hidrolasas naturales y sintéticas así como enzimas diseñadas para realizar la reacción inversa, e.g. para propósitos sintéticos. La familia de serina peptidasas está caracterizada porBartlett y Rawlings (1994) Meth. Enzymol. 244:19-61, Academic Press, S.D. Las "serina hidrolasas alfa/beta" son una familia de serina hidrolasas basada en la homología estructural a enzimas que incluye serina acarboxipeptidasas II de germen de trigo (ver, e.g., Liam et al. (1992) Biochemistry 31:9796-9812; Ollis et al. (1992) Protein Engineering, 5:197-211). El término "aspartil proteasas" también conocidas como aspártico proteasas, son proteasas que son directamente dependientes de residuos de ácido aspártico para su actividad catalítica. La familia de aspartil proteasas está caracterizada en un número de publicaciones conocida para aquellos expertos en la técnica (ver, e.g., Rawlings y Barrett, (1995) Meth. Enzymology, 248:105-120, Academic Press, S.D. ) . El término "cisteína proteasas" es usado en la presente consistentemente con el uso convencional de aquellos expertos en la técnica. La familia de cisteína proteasas está caracterizada en un número de publicaciones conocida para aquellos expertos en la técnica (ver, e.g., Rawlings y Barrett, (1995) Meth. Enzymology, 224:461-486, Academic Press, S.D. ) . El término "metaloproteasas" es usado en la presente consistentemente con el uso convencional de aquellos expertos en la técnica. La familia de metaloproteasas está caracterizada en un número de publicaciones conocida para aquellos expertos en la técnica (ver, e.g., Rawlings y Barrett, (1995) Meth. Enzymology, 248:105-120, Academic Press, S.D. ) . Las "serina proteasas de tipo subtilisina" se refieren a una familia de serina hidrolasas basada en homología estructural a enzimas derivadas de Bacillus subtilis, incluyendo la subtilisina BPN' (Bott et al., (1988) J. Biol.. Chem. 263:7895-706; Siezen y Louise (1997) Protein Science 6:501-523; Bartlett y Raewlings (1994) Meth. Enzymol. 244:19-61, Academic Press, S.D. Las subtilisinas son proteasas bacterianas o fúngicas que por lo general actúan para hidrolizar uniones péptídicas de proteínas o péptidos. Como se usa en la presente, "subtilisina" significa una subtilisina que existe naturalmente, a subtilisina recombinante. Se sabe que una serie de subtilisinas que existen naturalmente es producida y frecuentemente segregada por varias especies microbianas. Las secuencias de amino ácidos de los miembros de esta serie no son enteramente homologas. Sin embargo, las subtilisinas en esta serie exhiben el mismo o similar tipo de actividad proteolítica. Esta clase de proteasas de serina comparten una secuencia común de amino ácidos que define una triada catalíticaa que las distingue de la clase relacionada a quimiotripsina de proteasas de serina. Las subtilisinas y proteasas de serina relacionadas a quimiotripsina tienen auana triada catalítica que comprende aspartato, histidina y serina. En las proteasas relacionadas a subtilisina el orden relativo de estos amino ácidos, leyendo desde el terminal amino a carboxi, es aspartato-histidina-serina. En las proteasas relacionadas a quimiotripsina, el orden relativo, sin embargo, es histidina-aspartato-serina . Así, la subtilisina en la presente se refiere a una proteasa de serina que tiene la trada catalítica de las proteasas relacionadas a subtilisna . La "familia de proteasas de seriana de quimiotripsina" se refiere a una familia de serina hidrolasas basada en homología estructural a enzimas que incluyen la gamma quimiotripsina (Birktoft y Blow (1972) J. Molecular Biology 68:187-240) . Un "polímero dendrítico" es un polímero que exhibe ramificación dendrítica regular, formada por la adición secuencial o generacional de capas ramificadas a o desde un núcleo. El término polímero dendrítico incluye "dendrímeros", que están caracterizados por un núcleo, al menos una capa ramificada interior, y una capa ramificada superficial (ver, e.g., Petar et al. Páginas 641-645 en Chem. Un Britain (Agosto de 1994) . Un "dendron" es una especie de dendrímero que tiene ramificaciones que emanan de un punto focal que está o puede estar unidoa un núcleo, ya sea directamente o a través de una porción de unión para formar un dendrímero . Muchos dendrímeros comprenden dos o más dendrones unidos a un núcleo común. Sin embargo, el término dendrímero es usado ampliamente para incluir un solo dendron. Los polímeros dendríticos incluyen, pero no están limitados a, dendrímeros que se ramifican simétricos o asimétricos, moléculas en cascada, arboroles, polímeros de estrella densa, y similares. Los dendrímeros de estrella densa de PAMAM (descritos en la patente de EUA No. 5,714,166) son simétricos, porque los brazos de ramificaciones son de longitud igual. La ramificación ocurre en el átomo de nitrógeno de un grupo amina terminal sobre una rama de la generación precedente. Los dendrímeros basados en lisina son asimétricos, porque las ramas de las ramificaciones son de una longitud diferente. Una rama existe en el nitrógeno epsilon de la molécula de lisina, mientras que otra rama existe en el nitrógeno alfa, adyacente al grupo carboxi reactivo, que une la rama a una rama de la generación previa.

Aunque no formada por adición secuencial regular de capas ramificadas, los polímeros hiperramificados, e.g. los polioles hiperramificados, pueden ser equivalentes a un polímero dendrítico en donde el patrón de ramificación exhibe un grado de regularidad que se aproxima a aquel de un dendrímero . Como se usa en la presente, un "anticuerpo" se refiere a una proteína o glicoproteína que consiste de uno o más polipéptidos substancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon, y mu, así como genes de región variable de inmunoglobulina de miríada. Las cadenas ligeras son clasificadas ya sea como kappa o lambda. Las cadenas pesadas son clasificadas como gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, lo cual a su vez define las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e igE, respectivamente. Se sabe que una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica comprende aun tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par tiene una cadena "ligera" (alrededor de 25 kD) y una "pesada" (alrededor de 50-70 kD) . La N-terminal de cada cadena define una región variable de alrededor de 100 a 110 o más amino ácidos primariamente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas, o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con varias peptidasas. Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de (es decir, hacia el dominio Fc) las uniones disulfuro en la región de la articulación para producir F(ab)2, un dímero de Fab que el mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace disulfuro. El F(ab)2 puede ser reducido bajo condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de la articulación, convirtiendo por medio de esto el dímero F(ab)2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región de articulación (ver paúl (1993) Fundamental Immunology, Raven Press, N.Y. para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo) . Mientras que varios fragmentos de anticuerpo están definidos en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos pueden ser sintetizados de novo ya sea químicamente, utilizando la metodología del ADN recombinante, o por métodos de "exhibición de fago" (ver, e.g., Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnology, 14(3): 309-314, y PCT/US96/10287) . Los anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos de cadena única, e.g. anticuerpos Fv (scFv) de cadena única en los cuales una cadena pesada variable y una cadena ligera variable están unidas (directamente o a través de un enlazador peptídico) para formar un polipéptido continuo. El término "carbohidrato" incluye mono-, oligo- y poli-sacáridos, así como substancias derivadas de monosacáridos por reducción del grupo carbonilo (alditoles) , por oxidación de uno o más grupos terminales a ácidos carboxílicos, o por reemplazo de uno o más grupos hidroxi por un átomo de hidrógeno, un grupo amino, un grupo tiol o grupos heteroatómicos similares. También incluye derivados de estos compuestos. El término "azúcar" es frecuentemente aplicado a monosacáridos y oligosacáridos inferiores. Los monosacáridos padres son polihidroxi aldehidos H- [CHOH] n-CHO o polihidroxi cetonas H- [CHOH] n-C0- [CHOH] m-H con tres o más átomos de carbono. El término genérico "monosacárido" (opuesto a oligosacárido o polisacárido) denota una sola unidad, sin conexiones glicosídicas a otras unidades. También incluye aldosas, dialdosas, aldecetosas, cetosas y dicetosas, así como desoxi azúcares y amino azúcares, y sus derivados, siempre y cuando el compuesto padre tenga un grupo carbonilo (potencial) (ver, e.g., McNaught (1996) Puré Appl. Chem. 68:1919-2008)] . Los más pequeños son monosacáridos como la glucosa, ribosa y terrosa. Los carbohidratos también incluyen, pero no están limitados a, oligosacáridos y polisacáridos (e.g. almidón, celulosa, glicógeno) y análogos de carbohidratos (e.g. aquellos en donde el OH ha sido reemplazado por H, F, NH2 o HNC(0)CH3) . El término "suciedad" o "mancha" se refiere a la acumulación de material extraño sobre un sustrato de interés (e.g. un textil) . "La suciedad" o "mancha" puede no tener actividad biológica, pero puede servir para decolorar, y/o degradar el substrato subyacente. "La suciedad" no necesita ser visible a simple vista. La deposición de materiales extraños que, mientras que no son visibles a simple vista, pero que crean olores o soporte para el crecimiento bacteriano también son considerados "suciedades" en el contexto de esta solicitud. Las manchas o suelos típicos incluyen, pero no están limitados a manchas de grasa, manchas de sangre, manchas de leche, huevo, clara de huevo, y similares. El término "molécula orgánica pequeña" se refiere a una molécula de un tamaño comparable a aquellas moléculas orgánicas usadas generalmente en productos farmacéuticos. El término excluye macromoléculas biológicas (e.g. proteínas, ácidos nucleicos, etc.). Las moléculas orgánicas pequeñas preferidas están en el intervalo en tamaño hasta alrededor de 5,000 Da, más preferiblemente hasta 2,000 Da, y más preferiblemente hasta alrededor de 1,000 Da. El término "cerca" o "adyacente a", cuando se usa para indicar un sitio con respecto a un residuo de amino ácido particular (e.g. "adyacente al residuo 149") se refiere a un residuo unido covalentemente al "residuo de referencia", ya sea que precede o sigue a ese residuo, o en contacto de van der Waals con el residuo de referencia. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra una variedad de moléculas quiméricas de esta invención que utilizan dendrímeros como porciones dirigidas al objetivo. La Figura 2 ilustra SBL que elige una enzima con un inhibidor. La Figura 3 ilustra el esquema 11 para la síntesis de MTS-pirazol-4. La Figura 4 ilustra los resultados del ensayo de elección de HLADH para moléculas quiméricas de SBL-pirazol La Figura 5A, la Figura 5B, la Figura 5C, y la Figura 5D ilustran resultados del ensayo de degradación de HLADH para moléculas quiméricas de SBL-pirazol . La Figura 6 muestra la actividad de HLADH para mezclas de HLADH/AP con y sin S166C-pirazol . La Figura 7 muestra la actividad de AP para mezclas de HLADH/AP con y sin S166C-pirazol . La Figura 8 muestra la actividad de HLADH para mezclas de HLADH/AP con y sin S166C-pirazol . La Figura 9 muestra la actividad de AP para mezclas de HLADH/AP con y sin S166C-pirazol . La Figura 10 muestra la degradación de HLADH por pirazol-CMMs subestequiométrico. La Figura 11 muestra la degradación de HLADH por pirazol -CMMs en presencia de fosfatasa alcalina. La Figura 12 ilustra la degradación de fosfatasa alcalina por pirazol -CMMs en presencia de HLADH. La Figura 13 muestra 11 metantiosulfonatos de mono-y disacáridos que se prepararon. La Figura 14A, la Figura 14B, y la Figura 14C ilustran la degradación selectiva de lectina por GG36-WT modificado por azúcar. La Figura 15A, la Figura 15B, la Figura 15C, y la Figura 15D ilustran gráficas del curso de tiempo de la formación de fragmentos de proteína < 3,000 MW durante un ensayo de lectina. La Figura 16 ilustra el esquema 7 de síntesis para la síntesis del reactivo 1 de biotina-MTS. La Figura 17 ilustra una técnica de ensayo de inmunosorbente unido a enzima estándar (ELISA) para ensayar la elección de CMS biotinilado a anti-biotina. La Figura 18 ilustra un ensayo de elección de objetivo para anti-biotina usando subtilisinas modificadas con hapteno en una placa de 96 pozos. La Figura 19 es una gráfica de la degradación de anti-biotina por biotina-CMM como una función del tiempo. DESCRIPCIÓN DETALLADA I. Antagonistas catalíticos Esta invención proporciona moléculas quiméricas novedosas que explotan un modo de actividad fundamentalmente diferente para evitar problemas de dosificación, actividad y problemas de persistencia frecuentemente asociados con la actividad de moléculas quiméricas. En una modalidad, las moléculas quiméricas son antagonistas catalíticos de una molécula objetivo. Los antagonistas catalíticos de esta invención preferiblemente comprenden una porción dirigida al objetivo unida a una enzima que degrada la molécula unida específicamente por la porción dirigida al objetivo. Los antagonistas catalíticos de esta invención se unen así a un objetivo reconocido por la porción dirigida al objetivo (e.g. un receptor) el componente de enzima de la quimera que degrada todo o parte del objetivo. Esto preferiblemente resulta en una reducción o pérdida de actividad del objetivo, y la liberación de la molécula quimérica. La molécula quimérica es entonces libre para atacar y degradar otra molécula objetivo. Así, a diferencia de las moléculas quiméricas típicas, en las cuales la molécula quimérica es efectiva solamente una vez (e.g. debido al desgaste de la actividad efectora, y/o internalización y/o lisis de la quimera) una molécula quimérica de esta invención es libre de atacar y degradar esencialmente un número ilimitado de objetivos. En modalidades preferidas, los antagonistas de esta invención son así catalíticos en naturaleza, siendo efectivamente regenerados (vueltos disponibles de nuevo) después de degradar cada molécula de substrato (objetivo) . La actividad de los antagonistas catalíticas de esta invención es así esencialmente sub-estequiométrico . Como consecuencia, los antagonistas catalíticos de esta invención son efectivos en concentraciones mucho menores que las moléculas quiméricas o los inhibidores tradicionales . Consecuentemente las formulaciones (e.g. detergentes) que comprenden los inhibidores catalíticos de esta invención pueden utilizar concentraciones significativamente menores de inhibidor, y pueden ser fabricadas a un costo menor. En aplicaciones in vivo, los inhibidores catalíticos de esta invención, debido a que ofrecen una mayor actividad en menos concentración, se espera que muestren una vida media en suero efectiva más prolongada y menores toxicidades que las moléculas quiméricas "tradicionales" . Los antagonistas catalíticos de esta invención son útiles en una amplia variedad de contextos, en donde se desea degradar una molécula objetivo y/o inhibir la actividad de esa molécula objetivo. Así, por ejemplo, en aplicaciones ex vivo, los antagonistas catalíticos pueden ser usados para elegir y degradar específicamente una molécula particular. Así, por ejemplo, en operaciones de limpieza, las moléculas quiméricas de esta invención pueden ser utilizadas para elegir y degradar específicamente un componente de un suelo (e.g. un componente de proteína, un componente de lípido, etc.). En procesos sintéticos químicos, o procesos sintéticos bioquímicos (e.g. en preparaciones analíticas industriales, en biorreactores, etc.) para degradar específicamente moléculas preseleccionadas particulares. Así, por ejemplo, cuando se desea eliminar una actividad enzimática particular en un biorreactor (e.g. una glicosilación) el antagonista catalítico de esta invención comprende, como una porción dirigida al objetivo, un sustrato para la enzima que media la actividad (e.g. una glicosiltransferasa) . La enzima (receptor) en el reactor se une a la porción dirigida al objetivo y el componente enzimático de la quimera (e.g. una hidrolasa) degrada la enzima, reduciendo o eliminando su actividad y también liberándose a si misma del sitio de unión a la enzima, por lo cual es libre para atacar otra enzima objetivo. Las moléculas quiméricas de esta invención que tienen, e.g. porciones dirigidas al objetivo dirigidas contra lectinas presentes sobre superficies bacterianas unidas a, e.g. lipasas, o hidrolasas, son agentes antimicrobianos efectivos, y pueden ser usados en una amplia variedad de desinfectantes . En sistemas biológicos (e.g. in vitro in vivo) las moléculas quiméricas de esta invención pueden ser usadas para unir y antagonizar/inhibir una amplia variedad de receptores y/o enzimas, y/o moléculas de señalización intermedias. Una amplia variedad de drogas actúa inhibiendo la actividad de receptores celulares. Así, por ejemplo, los antiestrógenos (e.g. tamoxifeno) se une y bloquea receptores de estrógenos, bloqueadores beta (e.g. digoxina) son usados en el manejo de la hipertensión y post infarto al miocardio, antagonistas del receptor H2 de histamina (5-HT) inhibidores de recaptación (e.g. Prozac, Zoloft, Paxil, etc.) son usados en el tratamiento de la depresión, etcétera. Los antagonistas catalíticos quiméricos de esta invención comprenden, e.g. aun ligando análogo unido por el receptor del objetivo o un ligando que no es análogo (e.g., un compuesto mimético o droga unido por el receptor) , como porción dirigida al objetivo unida a una enzima que puede degradar el receptor actúan como antagonistas efectivos del receptor. Al diferencia de un inhibidor competitivo simple que bloquea "temporalmente" el (los) receptor (es) objetivo, los antagonistas catalíticos de esta invención degradan efectivamente el receptor. Así, una vez unido y degradado, es improbable que el receptor funcione de nuevo, si no existe algún mecanismo de reparación. Así, en concentraciones iguales, los antagonistas catalíticos de esta invención producirán un grado mucho mayor de actividad y/o duración de actividad que los inhibidores competitivos "tradicionales" . Se apreciará que, en este contexto, una enzima (e.g. una enzima intracelular) también puede ser considerada como un receptor para su substrato de análogo. Así, los antagonistas catalíticos de esta invención pueden ser usados para degradar enzimas objetivo también. En este caso, es preferible usar, como la porción dirigida al objetivo, una molécula que no es degradada o alterada por la enzima objetivo. Los inhibidores competitivos conocidos de enzimas hacen buenas porciones que eligen objetivos en este contexto. En todavía otra modalidad, esta invención incluye antagonistas químicos (e.g. de receptores y/o enzimas) que comprenden una porción dirigida al objetivo que se une al receptor o enzima unida a la enzima que degrada el ligando análogo que se une a esa enzima y/o receptor. El inhibidor de la enzima o receptor se une y ancla la enzima que comprende la molécula quimérica a la enzima o receptor objetivo. Cuando el ligando análogo del receptor o enzima se aproxima, la enzima degrada al ligando, y por medio de esto bloquea su actividad sobre el receptor. De nuevo, el proceso es "catalítico" sin cambio permanente a la molécula quimérica. En modalidades preferidas, los antagonistas catalíticos de esta invención son moléculas quiméricas acopladas químicamente. La porción dirigida al objetivo preferiblemente acoplada, directamente o a través de un enlazador, a cualquier terminal de la enzima (la terminal amino o carboxilo o a través de un grupo R del amino ácido terminal) , o más preferiblemente, está acoplado, directamente o a través de un enlazador, a un amino ácido no terminal en la enzima. En ciertas modalidades particularmente preferidas, los antagonistas catalíticos de esta invención comprenden una enzima mutante modificada químicamente (CMM) . Una enzima mutante modificada químicamente es una enzima en la cual un residuo de amino ácido natural es reemplazado con un residuo de amino ácido diferente (e.g. cisteína, proporcionando un sitio reactivo adecuado para acoplar la porción dirigida al objetivo. Así, las moléculas quiméricas preferidas de esta invención son moléculas acopladas químicamente más que proteínas de fusión. El uso de porciones dirigidas al objetivo acopladas químicamente en esta invención proporciona un número de ventajas. La porción dirigida al objetivo no está limitada a un péptido o proteína, sino más bien puede ser cualquiera de un número de ligandos que incluye, pero no está limitado a, drogas conocidas, vitaminas, carbohidratos, lectinas, y similares. Debido a que las porciones que eligen objetivo son típicamente más pequeñas que las proteínas, son menos inmunogénicas, y muestran una mayor penetración del tejido. Además, debido a que las porciones que eligen objetivo son frecuentemente varias moléculas orgánicas pequeñas, retienen su conformación y especificidad en un contexto fisiológico, y están típicamente menos sujetas a degradación in vivo. Las moléculas quiméricas de esta invención ofrecen un número de otras ventajas. Debido a que son conjugadas químicamente usando una química "estándar", son más fáciles de hacer y variar. Además, las moléculas son más pequeñas que las proteínas de fusión "terapéuticas" típicas (e.g. inmunotoxinas) y se espera que tengan una vida media en suero incrementada. Además, debido a que, en ciertas modalidades, las moléculas actualmente destruyen/ degradan receptores y/o enzimas existentes, una sola dosificación se espera que tenga un efecto más prolongado, puesto que los organismos sujeto deben reemplazar realmente el receptor y/o enzima para restaurar esa funcionalidad. II. Redirigiendo la actividad enzimática En muchas aplicaciones, los antagonistas catalíticos de esta invención pueden ser considerados como enzimas que han sido "redirigidas" , de modo que ya sea que actúan sobre un substrato no natural (para el componente enzimático) o, más típicamente, de modo que la actividad enzimática está localizada en el sitio de la molécula objetivo. Así, en algunas modalidades, esta invención proporciona una enzima que tiene una especificidad de sustrato alterada cuando la enzima es un componente de una molécula quimérica que comprende una porción dirigida al objetivo unida a un subsitio que comprende el sitio de unión al sustrato de la enzima. Las moléculas quiméricas tradicionalmente dirigidas son diseñadas para situar la porción dirigida al objetivo/dominio alguna distancia alejada de los sitios activos de interés en la porción efectora. Por lo general se creía que una porción dirigida al objetivo situada demasiado cerca de un sitio activo de la porción efectora interferiría con el funcionamiento apropiado del efector (e.g. vía impedimento estérico) . Fue un descubrimiento sorprendente de esta invención que las porciones dirigidas al objetivo que comprenden las moléculas quiméricas de esta invención pueden ser acopladas a residuos de amino ácidos que comprenden un sitio de unión a substrato de la enzima. Por otro lado, la unión de la porción dirigida al objetivo a un residuo de amino ácido en el sitio de unión al substrato de la enzima resulta en que el sitio de unión al substrato está yuxtapuesto cercanamente al objetivo unido por la porción dirigida al objetivo. Usar mutantes conjugados químicamente de acuerdo a los métodos de esta invención, proporciona un método versátil de dirigir una sola enzima a cualquier objetivo, simplemente cambiando la porción química. Esto es una ventaja substancial sobre los métodos tradicionales en donde se requerían modificaciones extensivas (e.g. por técnicas de mutagénesis) para hacer una enzima específica de un objetivo particular. La actividad de la enzima es así "redirigida" en una o ambas de dos maneras: primero la actividad de la enzima puede ser "localizada espacialmente" por unión de la porción dirigida al objetivo a un objetivo preseleccionado particular. Así, la enzima puede ser dirigida específicamente a un tipo de célula particular, una enzima particular, un receptor particular, etc. Segundo, por virtud de alteraciones en la enzima producidas por la presencia de una molécula que elige un objetivo y/o por virtud del hecho de que La molécula dirigida al objetivo lleva al sitio de unión al substrato en proximidad cercana al objetivo, la enzima puede mostrar una actividad significativa contra un objetivo que no es el substrato usual. Las enzimas redirigidas son útiles en una amplia variedad de contextos. Por ejemplo, la porción dirigida al objetivo puede ser seleccionada para redirigir/localizar la enzima a un objetivo particular para degradación selectiva. Por ejemplo, en el caso de un detergente, la porción dirigida al objetivo puede ser seleccionada para que se una específicamente a una clase particular de "suelo" (e.g. huevo) y por medio de esto dirigir y localizar apropiadamente la enzima degradante (e.g. una proteasa) a ese substrato. En aplicaciones farmacéuticas, en algunas modalidades, la enzima redirigida puede comprender una porción dirigida al objetivo que dirige la enzima a una célula objetivo particular (e.g. una célula de tumor) en donde la enzima redirigida (e.g. una timidina cinasa (tk) ) activa una droga particular (e.g. citotoxina tal como ganclovir) . En otras modalidades la enzima puede ser redirigida a una célula que contiene una sobreabundancia de un metabolito particular (e.g. como en enfermedades de almacenamiento tal como la enfermedad de Tay Sachs) . En el nuevo sitio, la enzima redirigida proporciona la actividad enzimática "ausente" , tratando por medio de esto la condición. Estos ejemplos son meramente ilustrativos, y junto con otros son discutidos en mayor detalle abajo. Se apreciará, en vista de las enseñanzas proporcionadas en la presente que los antagonistas catalíticos pueden ser enzimas redirigidas, pero no son necesariamente así. A la inversa, las enzimas redirigidas pueden actuar como antagonistas catalíticos, pero existen enzimas redirigidas que no son necesariamente antagonistas catalíticos . En cualquier caso, en las modalidades preferidas, las enzimas redirigidas y los antagonistas catalíticos son creados seleccionando una porción dirigida al objetivo, seleccionando una enzima (una porción efectora) y conjugando químicamente las dos para formar una molécula quimérica. La selección de porciones dirigidas al objetivo, enzimas y la conjugación de las mismas se describe en detalle abajo. II. Selección de objetivos y porciones dirigidas al objetivo En modalidades preferidas, virtualmente cualquier asociado de unión a análogo de un objetivo (e.g. un receptor y/o una enzima y/o una lectina) puede ser usado como una porción dirigida al objetivo en las moléculas de la invención. Además, moléculas que no son asociados de unión a análogo, pero que son unidas específicamente por las moléculas objetivo (e.g. receptores o enzimas) también pueden ser usadas como porciones dirigidas al objetivo en las moléculas quiméricas de esta invención. La selección de la porción dirigida al objetivo depende de la aplicación para la cual va a ser utilizada la molécula quimérica (e.g. antagonista catalítico). Las porciones dirigidas al objetivo pueden ser agrupadas y/o identificadas de acuerdo a una amplia variedad de esquemas de clasificación. Así, por ejemplo pueden ser agrupadas de acuerdo al tipo de molécula, e.g. un péptido, un oligopéptido, un peptidomimético, un anticuerpo, un hapteno, un epitope, un carbohidrato, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, un glicomimético, un ácido nucleico, un gen, un lípido, un complejo de coordinación, un metal, un azúcar, una enzima, un cimógeno, una coenzima, un cofactor, aun análogo de coenzima, un análogo de cofactor, una vitamina, un análogo de vitamina, un éter de corona, un análogo de éter de corona, ligandos mono- y policíclicos, ligandos heterocíclicos, ligandos quirales, ligandos enriquecidos enantioméricamente, y cualquier variación multivalente o dendrimérica de los de arriba o, alternativamente, pueden ser agrupados de acuerdo a la naturaleza del objetivo. Los objetivos preferidos incluyen, pero no se limitan a receptores, enzimas, y lectinas. En algunos casos es simple referirse a la porción dirigida al objetivo que se une a uno de estos objetivos. Así, por ejemplo la serotonina o un análogo de la serotonina puede ser una porción dirigida al objetivo. De forma similar las porciones dirigidas al objetivo pueden ser referidas/ identificadas por el objetivo al cual se unen. Así, un análogo de serotonina como porción dirigida al objetivo es incluido por una droga o compuesto que se une específicamente a un receptor de serotonina. A manera de ilustración, algunos objetivos preferidos en las categorías de arriba están discutidos abajo. Las modalidades descritas, sin embargo, son de naturaleza ilustrativa y no se propone que sean limitantes. A) Porciones dirigidas al objetivo para receptores Los receptores proporcionan objetivos altamente efectivos, particularmente para los antagonistas catalíticos de esta invención. Los receptores típicamente se unen específicamente a un ligando análogo, y están involucrados en una amplia variedad de procesos biológicos. Típicamente, los receptores median la señalización o el influjo o eflujo de moléculas de una célula. Particularmente como transductores de señales, los receptores están involucrados en una amplia variedad de procesos que incluyen, pero no están limitados a la regulación del crecimiento y morfología/diferenciación, expresión de genes y producción de moléculas particulares, proliferación de células, elementos de la respuesta inmune, varias cascadas biológicas (e.g. la respuesta inflamatoria, la respuesta de coagulación, etc.) y similares. Como consecuencia, los receptores han sido reconocidos por mucho tiempo como buenos objetivos para drogas, y una amplia variedad de drogas son agonistas y/o antagonistas de una actividad del receptor particular (ver, e.g. la Tabla 1) . Típicamente estas drogas son moléculas orgánicas relativamente pequeñas y, como tales, son buenos candidatos como porciones dirigidas al objetivo para las moléculas quiméricas de esta invención.

Tabla 1. Agentes farmacológicos típicos y su modo de actividad. Tales agentes farmacéuticos forman porciones útiles que eligen un objetivo para dirigir específicamente un antagonista catalítico de esta invención a un receptor objetivo .

La porción dirigida al objetivo, sin embargo, no necesita ser un agente farmacéutico conocido. Existe un número de receptores para los cuales se conocen inhibidores o agonistas, en donde los inhibidores o agonistas no son agentes farmacéuticos aprobados. Hasta ahora, no existe una clasificación uniforme para los receptores. Sin embargo, como se indica arriba, muchos receptores son receptores de transducción de señales, y dentro de este grupo los receptores de transducción de señales caen en tres clases generales: La primera clase incluye receptores que penetran la membrana plasmática y tienen actividad enzimática intrínseca.

Tales receptores incluyen, pero no están limitados a, aquellos que son tirosina cinasas (e.g. receptores de PDGF, insulina, EGF y FGF) , tirosina fosfatasas (e.g. CD45 [determinante de cluster-45] proteína de células T y macrófagos), guanilato ciclasas (e.g. receptores del péptido natriurético), y serina/treonina cinasas (e.g. son proteína cinasa dependiente de cAMP (PKA) , proteína cinasa C (PKC) , MAP cinasas, activina y receptores de TGF-ß) . Adicionalmente, varias familias de receptores carecen de actividad enzimática intrínseca, y aun están acopladas a tirosina cinasas intracelulares por interacciones directas proteína-proteína . Las proteínas que codifican tirosina cinasas de receptor (RTKs) típicamente contienen cuatro dominios principales: un dominio que se une a un ligando extracelular, un dominio de tirosina cinasa intracelular, un dominio regulador intracelular, y un dominio transmembrana. Las secuencias de amino ácidos de los dominios de tirosina cinasa de los RTKs están altamente conservados con aquellos de proteína cinasa dependiente de cAMP (PKA) dentro de las regiones e unión a ATP y de unión al substrato . Algunos RTKs tienen una inserción de amino ácidos del dominio que no es cinasa en el dominio de cinasa llamado el inserto de cinasa. Las proteínas de RTK están clasificadas en familias basadas en aspectos estructurales en sus porciones extraceluiares (así como la presencia o ausencia de un inserto de cinasa) que incluyen los dominios ricos en cisteína, dominios semejantes a innumoglobulina, dominios ricos en leucina, dominios de Kringle, dominios de cadherinaa, unidades repetidas de fibronectina tipo III, dominios semejantes a discoidina I, dominios ácidos, dominios semejantes a EGF. Basados en la presencia de estos diversos dominios extraceluiares, los RTKs han sido subdivididos en al menos 14 familias diferentes. Los RTKs representativos incluyen, pero no están limitados al receptor I EGF, NEU/HER2 , HER3 , receptor de insulina, receptor IGF-I, receptores de PDGF, c-Kit, receptores de FGF, receptor del factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) , receptores del factor de crecimiento del hepatocito (HGF) y del factor de dispersión (SC) , la familia de receptores de nerotrofina (trkA, trkB, trkC) y el receptor de NGF, y similares. La segunda clase incluye receptores que están acoplados, dentro de la célula, a proteínas que se unen a GTP e hidrolizantes (llamadas proteínas G) . Los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs) son una superfamilia de proteínas integrales de membrana que típicamente están caracterizadas por siete dominios hidrofóbicos que son de una longitud suficiente (típicamente 20-28 residuos de amino ácidos) para llegar de una lado a otro de la membrana plasmática. Los ejemplos de esta clase incluyen, pero no están limitados a los receptores adrenérgicos, receptores odorantes y receptores para hormonas péptídicas (e.g. glucagon, angiotensina, vasopresina y bradicinina) . La tercera clase incluye receptores que se encuentran intracelularmente y que, con la unión al ligando, migran al núcleo, en donde el complejo ligando-receptor afecta directamente la transcripción genética. Estos receptores incluyen, pero no están limitados a la superfamilia de receptores esteroide/hormona tiroidea (e.g. receptores de glucocorticoide, vitamina D, ácido retinoico y hormona tiroidea) . Esta es una clase de proteínas que reside en el citoplasma, y se une a las hormonas esteroidales/tiroideas lipofílicas. Con la unión del ligando el complejo de hormona-receptor se transloca al núcleo y se une a secuencias de ADN específicas llamadas elementos de respuesta a hormona (HREs) . La unión del complejo a un HRE resulta en proporciones de transcripción alteradas del gen asociado. Los ligandos que se unen a tales receptores son muy conocidos para aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no están limitados a, agonistas del receptor de A2 (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,026,317), agonistas o antagonistas del receptor de 5HT1 (ver e.g. las Patentes de EUA Nos. 6,025,374 y 6,025,367), bloqueadores del receptor de N-metil -D-aspartato (NMDA) para la prevención de aterosclerosis (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,025,369), moduladores del receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,022,897), antagonistas del receptor de endotelina (ver e.g. las Patentes de EUA Nos. 6,022,886, 6,020,348), variantes de la hormona de crecimiento humano que tienen afinidad incrementada por el receptor de la hormona del crecimiento humano en el sitio 1 (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,022,711), antagonistas del receptor de acetilcolina nicotínico neuronal humano (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,020,335), antagonistas del receptor GPIIb/IIIa de plaqueta (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,022,523), agonistas del receptor de adenosina (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,020,321), antagonistas del receptor de interleucina (e.g. IL-2R, IL-4R, I-6R, IL-8R, IL-10R, IL-13R, etc.), agentes de unión específicos para el receptor del factor de crecimiento (e.g. EGF, TGF y análogos o imitadores de los mismos), agentes de unión específicos para el receptor de IgA (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,018,031), agonistas del sitio modulador de glicina insensible a estricnina del complejo de receptor de N-metil -D-aspartato (ver e.g. 'la Patente de EUA No. 6,017,957), antagonistas del receptor de integrina (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,017,926), compuestos moduladores del receptor de andrógeno (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,017,924), ligandos del receptor de PCP (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,017,910), peptidomiméticos de azol como antagonistas del receptor de trombina (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,017,890), agonistas del receptor NPY Y2 (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,017,879), activadores de receptor de NF-kB (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,017,729), antagonistas del receptor de TNF, agentes que se unen al receptor de somatostatina (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,017,509), receptor H2 de histamina humana, agentes que se unen a bradicinina (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,015,812), antagonistas del receptor de glutamato (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,015,800), receptores de imidazol, receptores de transferrina, agentes que se unen al receptor de benzodiazepina (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,015,544), ligandos del receptor de cerebro gaba (ver e.g. la Patente de EUA No. 6,013,799), receptores de neurotensina NT1 y NT2 , receptores de CXCR2 , receptores de CCR5 , receptores de mañosa de macrófago, y similares. Otros receptores que proporcionan buenos objetivos para las moléculas quiméricas de esta invención incluyen, pero no están limitados a, receptor de SP-K, receptores de la substancia K, receptores de tachycinina 2, al-adrenoceptores subtipo A, al-adrenoceptores subtipo B, a2-adrenoceptores subtipo A, receptores d de ßl-, ß2-, ß3-adrenoceptores, receptores K, receptores µ, receptores de ACTH, receptores de angiotensina, receptores de adenosina, receptores de bo besina, receptores del péptido que libera gastrina, receptores de bradicinaina, receptores de C5a, receptores del péptido relacionado al gen de calcitonina, receptores de calcitonaina, receptores de CCK-A, receptores del factor que libera corticotropina, receptores de dopamina, receptores de EP2, receptores de EP3 , receptores de ETA, receptores de ETB, receptores de FSH, receptores de GABA, receptores de galanina, receptores de glucagón, receptores del péptido 1 semejante a glucagón, receptores de gonadotropina, receptores de la hormona que libera la hormona de crecimiento, receptores de histamina Hl, receptores de histamina H2 , receptores de leucotrieno B4 , receptores de melatonina, receptores de MSH, receptores de Ml, M2 , M3 , y M4 muscarínicos, receptores de neurotensina, receptores de hormona paratiroidea, receptores del polipéptido que activa la adenilato ciclasa de la pituitaria, receptores del factor que activa plaquetas, receptores de prostaciclina, purinorreceptores de P2U, purinorreceptores de P2Y, rodopsinas, receptores de secretina, receptores de somatostatina, receptores de VIP, receptores de vasopresina, receptores de estrógeno, receptores de neuropéptido, receptores de célula T, y similares. B) Porciones dirigidas al objetivo para enzimas y anticuerpos En otras modalidades, las porciones dirigidas al objetivo usadas en las moléculas quiméricas de esta invención son porciones que se unen específicamente por enzimas o anticuerpos. Una amplia variedad de enzimas, sus substratos e inhibidores competitivos de las mismas son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por otro lado, muchas de estas enzimas proporcionan buenos objetivos para drogas en una amplia variedad de patologías. Por ejemplo, las caspasas son una red notable y regulada intrincadamente de enzimas que pueden desencadenar el suicidio de células en animales, de levaduras y gusanos a humanos. Se sabe que las caspasas median la muerte celular programada en un número de enfermedades, incluyendo lesión cerebral isquémica, o apoplejía. Se cree que la muerte de células cardiacas que ocurre durante un "ataque" cardiaco es provocada por activación de varias caspasas. Además, se ha demostrado que la administración de un inhibidor experimental de caspasa conocido como YVAD-cmk bloquea esta cascada bioquímica y también protege el tejido cardiaco, reduciendo dramáticamente la cantidad de muertes cardiacas por más del 30 por ciento. Los antagonistas catalíticos de esta invención que comprenden agentes específicos de caspasa como porciones dirigidas al objetivo unidas a una proteasa (enzima) pueden buscar y degradar específicamente la caspasa. Se espera que esto ofrecerá protección del tejido cardiaco durante y después del infarto al miocardio, y al tejido cerebral durante y después de la apoplejía. Los agentes que se unen específicamente a las caspazas (e.g. YVAD-cmk, y varios substratos de caspasa protegidos) son conocidos para aquellos expertos en la técnica. En otro ejemplo, la enzima GARFT (Clicinamida Ribonucleótido Formil Transferasa) es una enzima en una trayectoria bioquímica a través de la cual la células de tumor sintetizan purinas, componentes esenciales del ADN. Bloqueando la acción de GARFT se inhibe la síntesis de purinas, y la construcción subsecuente de la molécula de ADN del tumor. Con la excepción de células de hígado, todos los tejidos humanos normales pueden obtener purinas a través de una trayectoria alternativa (trayectoria de salvamento de purina) . Los inhibidores de GARFT mostrarán selectividad por células de tumor, y menos toxicidad significativa a la médula ósea que otros agentes quimioterapéuticos. Un antagonista catalítico de esta invención que comprende una porción dirigida al objetivo de GARFT unida a una proteasa capaz de degradar GARFT se espera que muestre una selectividad similar a los tumores. Una porción dirigida al objetivo adecuada es AG2037 (producido por Agouron) que está en estudios preclínicos. AG2037 ha sido diseñado usando un diseño basado en la estructura para que exhiba una inhibición potente y selectiva de GARFT, pero que evite unirse a mFBP, una proteína de membrana que se cree que es importante en los efectos secundarios de los inhibidores de GARFT anteriores. AG2037 es bien tolerado en una variedad de modelos de cáncer de ratón, y demuestra una eficacia antitumor de espectro amplio, al menos igual a aquella del paclitaxel, cuando se estudia en los mismos tumores cultivados en ratones. En todavía otro ejemplo, la enzima intracelular, dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH) proporciona un buen objetivo. La DHODH es la cuarta enzima secuencial involucrada en la biosíntesis de novo de uridilato (UMP) . Puesto que las células T activadas requieren una biosíntesis de pirimidina de novo rápida, esta enzima se sabe que es crítica para la activación de la respuesta inmune, haciéndola un buen objetivo para la intervención en transplantes y enfermedades autoinmunes. Un compuesto dirigido a esta enzima, la leflunomida (Hoechst) ha sido aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) de EUA para el tratamiento de la artritis reumatoide activa en leflunomida de adultos, o pueden ser usados agentes específicos de DHODH relacionados como una porción dirigida al objetivo unida a una enzima que degrada la enzima DHODH y proporciona un resultado terapéutico similar. Otro inhibidor conocido, Brequinar sodium, ha mostrado eficacia en muchos modelos animales de inmunosupresión, pero no fue exitoso en pruebas clínicas para transplante, aparentemente debido a una ventana terapéutica estrecha. Cuando se usó como una porción dirigida al objetivo en un antagonista catalítico de esta invención, se espera que la ventana terapéutica se mejore debido a que la molécula será efectiva en dosis más bajas. En general, se cree que la conversión de drogas que actúan como inhibidores competitivos en antagonistas catalíticos de acuerdo con esta invención mostrarán una ventana terapéutica mejorada debido a su mayor eficacia en una concentración menor. En todavía otro ejemplo, los antagonistas catalíticos de esta invención son útiles en el tratamiento del enfisema hereditario. La forma heredada del enfisema es llamada deficiencia del inhibidor de la proteinasa alfa-1 o "alfa-uno" por brevedad. Las personas con esta enfermedad tienen una deficiencia en una proteína principal, inhibidor de proteinasa alfa-1. El inhibidor de proteinasa alfa-1 es una proteína principal en la sangre, y es producida primariamente en las células del hígado, pero también por algunas células sanguíneas blancas. Protege los pulmones bloqueando los efectos de enzimas poderosas llamadas elastasas. La elastasa es normalmente llevada en células blancas sanguíneas, y protege el tejido delicado de los pulmones matando bacterias y neutralizando partículas pequeñas inhaladas a los pulmones. Una vez que se termina el trabajo protector de esta enzima, su acción adicional es bloqueada por el inhibidor de proteasa alfa-1. Sin inhibidor de proteinasa alfa-1, la elastasa puede destruir los sacos aéreos de los pulmones . Así, los antagonistas catalíticos de esta invención que comprenden una porción que se une a proteinasa alfa-1 unida (e.g. la droga llamada Prolastina) a, e.g. una proteasa, degradarán la proteinasa alfa-1, proporcionando un beneficio terapéutico similar o mejor. Los anticuerpos también proporcionan objetivos útiles para los antagonistas catalíticos de esta invención. Así, por ejemplo, un antagonista catalítico que elige y antagoniza (e.g. degrada) anticuerpos específicos del epitope a-Gal se espera que reduzca significativamente una respuesta inmune (e.g. a un xenoinjerto) . En una modalidad, entonces, el epitope de a-Gal puede ser usado como una porción dirigida al objetivo en una quimera de esta invención. Puede ser unido a una proteasa (e.g. una subtilisina, una pepsina, etc.) y cuando se une al anticuerpo, degradará ese anticuerpo, inhibiendo por medio de esto la respuesta inmune mediada por el anticuerpo. De forma similar, particularmente cuando el xenotransplante es de una especie diferente, el antagonista catalítico puede usar como una porción dirigida al objetivo el MHC (o un componente del mismo) del xenotransplante. Si el componente enzimático es una hidrolasa (e.g. una proteasa) , el inhibidor catalítico digerirá específicamente el receptor sobre células efectoras del sistema inmune (e.g. linfocitos T citotóxicos (CTLs) solamente sobre aquella células dirigidas específicamente contra el xenotransplante. Los antagonistas catalíticos conferirán así una tolerancia específica al xenoinjerto sin comprometer por lo general el sistema inmune del huésped. Otros anticuerpos que son buenos objetivos para los inhibidores catalíticos de esta invención son anticuerpos producidos en respuestas auto-inmunes y/o otras respuestas alérgicas. En estos casos, la porción dirigida al objetivo es una molécula que lleva un epitope reconocido por los anticuerpos que median la respuesta autoinmune o alérgica. La degradación del anticuerpo e.g. por una hidrolasa unida a la porción dirigida al objetivo reducirá los síntomas patológicos asociados con la respuesta autoinmune. Los alérgenos y substratos específicos reconocidos por anticuerpos en varias respuestas autoinmunes son muy conocidas por aquellos expertos en el técnica, y pueden fácilmente ser incorporados en las moléculas quiméricas de esta invención. Mientras que las ilustraciones proporcionadas arriba están dirigidas a aplicaciones in vivo, la invención no está limitada de esta manera. Está bien reconocido que es deseable inhibir enzimas y/o anticuerpos en una amplia variedad de aplicaciones ex vivo. Estas incluyen, pero no están limitadas a varios cultivos de células, biorreactores o sistemas de fermentación, o varios procesos sintéticos ex vivo (e.g. procesos de laboratorio y/o procesos comerciales), antimicrobianos/desinfectantes, y similares. C) Porciones dirigidas al objetivo para lectinas y azúcares . En todavía otras modalidades, se seleccionan porciones dirigidas al objetivo que se unen a lectinas particulares. Las lectinas son proteínas obtenidas de muchas fuentes vegetales, animales, y bacterianas que tienen sitios de unión para mono u oligosacáridos específicos. Las lectinas tales como concanavalina A y aglutinina de germen de trigo son ampliamente usadas como agentes analíticos y preparativos en el estudio de glicoproteínas. Las lectinas también están presentes sobre la superficie de células eucarióticas y bacterianas. En células eucarióticas, las lectinas frecuentemente están involucradas en interacciones célula-célula. En células bacterianas, las lectinas frecuentemente median la adhesión de la bacteria a su objetivo/ huésped y, en muchos casos, tal adhesión es requerida para que la bacteria infecte la célula huésped.

Además, la adhesión bacteriana y la contaminación de superficies no biológicas son problemas serios en los campos médico, dental y de la ciencia de alimentos. Los efectos más perjudiciales son encontrados en medicina, en donde la falla de dispositivos médicos implantados o transdérmicos resulta primariamente de infecciones bacterianas asociadas a superficie. La interacción/ adhesión bacteriana a una superficie es frecuentemente mediada por lectinas (frecuentemente referidas como adhesinas) . Las bacterias que se adhieren sobre una superficie frecuentemente segregan una matriz de exopolisacárido para unirse a la superficie. Esta capa viscosa de bacterias incrustadas en una matriz de polisacárido es conocida como biopelícula. En el presente, no existe una cura para infecciones de biopelícula in vivo, debido a que las bacterias son resistentes a cualquier tratamiento anti-microbiano o antibiótico. La formación de la biopelícula es también problemática en una amplia variedad de sistemas sintéticos comerciales. Frecuentemente los reactores de fermentación y otros biorreactores están contaminados por biopelículas . Las biopelículas también crecen y contaminan aparatos usados para muchos procesos químicos, particularmente aquellos que involucran reactivos orgánicos "digeribles". Así, las biopelículas frecuentemente contaminan filtros, conductos, separadores y otros dispositivos. En ciertas modalidades, los antagonistas catalíticos de esta invención pueden ser usados para inhibir/degradar varias lectinas. Así, por ejemplo, un antagonista catalítico que comprende un azúcar u oligosacárido unido a una hidrolasa elegirá y degradará específicamente una lectina que se une a la molécula objetivo. Tal antagonista catalítico está ilustrado en los ejemplos . La degradación de lectinas/adhesinas sobre una superficie bacteriana interferirá con la capacidad de la bacteria de unirse a la superficie y por medio de esto prevenir que la bacteria entre a una célula huésped o que forme una biopelícula. En una modalidad relacionada, se sabe que muchas bacterias y toxinas bacterianas se unen a un gangliósido, un glicoesfingolípido ácido e invaden células huésped. El mejor conocido de éstos es la toxina del cólera, una enterotoxina producida por Vibrio cholerae, que se sabe que se une al gangliósido GM1. Otras toxinas bacterianas que se unen a gangliósido incluyen la toxina de Tetanus (GDlb) , toxinas de botulinum (GTlb y GQlb) y la delta toxina producida por Clostridium perfringens (GM2) . La toxina de Shiga producida por Shigella dysenteriae y la vero toxina producida por E. coli enterohemorrágica se unen a glicoesfingolípidos neutros que tienen una porción alfa-1, 4 galabiosa en la cadena de azúcar, tal como galabiósido (Ga2Cer) y ceramida trihexosido (Gg3Cer) . Muchas bacterias patogénicas también se unen a glicoesfingolípidos de la superficie de la célula huésped para la colonización e infección. Así, la E. coli uropatogénica, que provoca infecciones del tracto urinario puede unirse a glicoesfingolípidos que tienen una porción alfa-1, 4 galabiosa en el extremo no reductor de la cadena de azúcar (Gb3Cer, etc.). La E. coli uropatogénica también puede unirse al globósido (Gb4Cer) y el glicolípido de Foressman, ambos de los cuales tienen una porción de alfa-1, 4 galabiosa internamente en una cadena de azúcar. E. coli se une a glicoesfingolípidos por cilios que existen sobre la superficie de la célula bacteriana, y son similares a fibras o pelos. Sobre la parte superior de los cilios, existe una adhesina caracterizada como una lectina. Varios tipos de adhesinas, con respecto a su especificidad de azúcar, han sido identificados. Son la adhesina de tipo 1 de E . coli que es específica de mañosa, adhesina de tipo P, también de E. coli, específica para la porción de alfa-1, 4 galabiosa, y adhesina de tipo S de E. coli, específica para la porción de sialilgalactosa . Se reportó que la secuencia de amino ácidos de la adhesina P es similar a aquella de la toxina de Siga, debido a que ambas reconocen la porción de alfa-1, 4 galabiosa del glicoesfingolípido . Propionibacterium, que provoca enfermedades de la piel, reconoce la porción de lactosilo de glicoesfingolípidos como un epitope de unión. Estas bacterias pueden unirse fuertemente a lactosilceramida, y también se unen a isorreceptores tales como asíalo GM1 (GA1) y asíalo GM2 (GA2) . Debido a que casi todos los glicoesfingolípidos contienen una porción de lactosilo común, puede asumirse que Propionibacterium se une a casi todos los glicoesfingolípidos . Sin embargo, las bacterias no pueden unirse a cualquier glicoesfingolípido compuesto de una base de dihidroxi y un ácido monohidroxi graso en ceramida, aun cuando estos contengan una porción de lactosilo. Este hecho indica que el epitope de unión de la bacteria también depende de la estructura de la ceramida además de la porción de lactosilo en la cadena de azúcar. Neisseria gonorrhoae, que provoca la gonorrea, también se une a glicoesfingolípidos que tienen una porción de lactosilo. En vista de lo anterior, los antagonistas catalíticos que tienen porciones dirigidas al objetivo que se unen específicamente a varios glicoesfingolípidos y/o varias adhesinas (e.g. adhesina tipo 1 específica de mañosa de E. coli, adhesina de tipo P de E . coli, específica para la alfa-1,4 galabiosa, y adhesina de tipo S de E. coli sialilgalactosa) unidas a enzimas que degradan los glicoesfingolípidos (e.g. glicosidasas, cerebrosidasas, etc.) actuarán para prevenir infecciones bacterianas y se espera que proporcionen efectos terapéuticos efectivos pata bloquear los efectos agudos de toxinas producidas por bacterias (e.g. toxina del cólera) . Las lectinas, particularmente las glicoproteínas de membrana, están también implicadas en varios procesos inflamatorios (e.g. procesos inflamatorios asociados con la artritis reumatoide, artritis, choque séptico, infarto al miocardio, etc.). Por ejemplo, las Lec-CAMs o selectinas son expresadas sobre la superficie del endotelio, leucocitos y plaquetas, e influencian la adhesión endotelial de leucocitos en sitios de inflamación. La GMP-140 (selectina P) almacenada en cuerpos de Weibel-Palade de células endoteliales y en granulos de plaquetas, cuando es estimulada por TNF-a/IL-1 es transportada en minutos a la superficie celular, y participa en interacciones entre endotelio, plaquetas, y neutrófilos. La ELAM-1 (selectina E) es sintetizada de novo por el endotelio estimulado e.g. por TNF-a/lL-1, y mejora el reclutamiento posterior de leucocitos. La LAM-1 (selectina L) regula la unión de los leucocitos a vénulas de nodulos linfáticos endoteliales superiores, la superficie de neutrófilos y linfocitos para localizar estas células en lesiones. Además, las integrinas, una familia de moléculas de adhesión compuestas de heterodímeros de subunidades a y ß; actúan en la regulación de la adhesión célula-matriz y célula-célula. Estas moléculas son de estructura transmembrana, uniendo así o "integrando" el estímulo exterior/superficie al citoesqueleto interno de la célula. Integrinas ß2 : también conocidas como moléculas CD11/CD18 confieren especificidad de adhesión, median la activación de células fagocíticas por estímulo quimiotáctico. La expresión superficial de integrinas, e.g. MO-1, antígeno-1 de función de leucocito (LFA-1) y gpl50,95; asisten en la localización de fagocitos a sitios de lesión; los estados de deficiencia resultan en una susceptibilidad incrementada a la infección bacteriana. La molécula- 1 de adhesión intracelular (ICAM-1) : asiste en la localización de leucocitos a lesiones de tejidos; expresada sobre la superficie de endotelio estimulado por citocina y leucocitos; se une a LFA-1 y MO-1 presentes sobre membranas celulares de neutrófilos y macrófagos. La molécula- 1 de adhesión células vascular (VCAM-1) : se une al receptor VLA-4 de leucocitos sobre linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos. Todas estas moléculas también ofrecen objetivos adecuados para los antagonistas catalíticos de esta invención. Las ilustraciones anteriores de antagonistas catalíticos dirigidos a lectinas de esta invención se propone que sean ilustrativos y no limitantes. Otros numerosos objetivos de lectinas serán conocidos por aquellos expertos en la técnica. Se apreciará que el objetivo y las porciones dirigidas al objetivo descritas en la presente (y otros) pueden ser invertidos. Así, en vez de un azúcar, la porción dirigida al objetivo puede ser una lectina que dirigirá específicamente el antagonista catalítico (o enzima redirigida) a un azúcar u objetivo que lleva un azúcar. Así, las moléculas pueden se dirigidas a los azúcares presentes sobre y características de bacterias particulares. En una modalidad, el antagonista catalítico dirigido al azúcar hará un microbicida efectivo. Como se indicó arriba, tales moléculas pueden ser dirigidas usando azúcares simples, u oligosacáridos y similares como porciones dirigidas al objetivo en las moléculas quiméricas de esta invención. Además, también pueden ser usados dendrímeros como porciones dirigidas al objetivo. Así, la funcionalización múltiple de la enzima (e.g. cualquiera de un antagonista catalítico o una enzima redirigida) puede ser lograda usando porciones dirigidas al objetivo dendrimérico, por medio del cual pueden ser empleadas estructuras de unión ramificadas múltiples para crear una enzima polifuncionalizada (molécula quimérica) . Por ejemplo, puede ser creada la glicosilación múltiple, que incluye quimeras múltiples que contienen mañosa y porciones variadas de azúcar. Esto podría conferir el beneficio de una afinidad incrementada por, y una afinidad de unión incrementada entre, lectinas y la enzima buscada (e.g. una hidrolasa) . Esto permitiría también la dirección múltiple concurrente de sitios, por ejemplo, incorporando múltiples moléculas de biotina en una porción dirigida al objetivo que provocaría múltiples interacciones de biotina-avidina concurrentes. Las porciones dirigidas al objetivo de dendrímero (antes del acoplamiento a la enzima) preferiblemente incluirían metantiosulfonatos con ramificación simple tales como: derivadas del pentaeritritol, a reactivos de dendrímeros ramificados muy complejos como los ilustrados en la Figura 1. Las moléculas altamente ramificadas o dendrímeros fueron sintetizadas primero por Vogtle en 1978 (Buhleier et al. (1978) Síntesis, 178) . La unión de bloques de construcción idénticos que contienen sitios de ramificación a un núcleo central puede ser lograda con un alto grado de homogeneidad y control. Cada rama contiene un grupo funcional que, después de la alteración química, puede ser conectado todavía a otro bloque de construcción. De esta manera, capa tras capa de ramificación genera rápidamente moléculas altamente funcionalizadas (Bosman et al. (1999) Chem. Rev. 99:1665:1688) . D) Objetivando otros "ligandos misceláneos" Usando las enseñanzas proporcionadas en la presente, una amplia variedad de otras porciones para dirigir las moléculas quiméricas de esta invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las enzimas redirigidas descritas en la presente pueden ser usadas en una variedad de estrategias de suministro de drogas. La porción dirigida al objetivo puede ser dirigida para que se una específicamente a un tipo de célula particular o tejido (e.g. una célula de tumor). El componente enzimático puede ser seleccionado para una actividad que convierte (e.g. una prodroga no tóxica) a una forma activa (e.g. una citotoxina). La enzima redirigida de esta invención localiza así la actividad de la prodroga7droagaa a las células que se unen por la molécula quimérica. Numerosos marcadores específicos de células son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no están limitados al antígeno Y de Lewis (células de tumor) , el antígeno G250 (células de carcinoma de células renales) , el receptor IL-3 (células de tumor) y similares. Un ejemplo de una enzima adecuada para usarse en esta aplicación es una timidina cinasa (e.g. timidina cinasa de Herpes simples (HSVTK) o la timidina cinasa de Varicella zoster (VZVTK) ) . La timidina cinasa ayuda a metabolizar análogos de nucleósidos antivirales a su forma activa, y son por lo tanto útiles para activar precursores de análogos de nucleósidos (e.g. AZT o ddC) a su forma activa. Además, las células que contienen tk se eliminan cuando se ponen en contacto con ganclovir. Así, en una modalidad, la enzima redirigida de esta invención puede ser una timidina cinasa dirigida, e.g. a una célula que expresa un receptor CCR5 y/o CCR3 (y de aquí es probable que sea susceptible a invención por el VIH) . La tk redirigida a estas células puede activar los precursores de AZT o ddC a su forma activa. En otra modalidad, la enzima tk puede ser dirigida a una célula de tumor (e.g. vía un antígeno específico de tumor) . El tratamiento con ganclovir resulta entonces en la muerte de la célula de tumor. Otros ejemplos de prodrogas que pueden ser convertidas a su forma activa usando las enzimas redirigidas de esta invención incluyen, pero no están limitados a, prodrogas de 5 -FU o inhibidores de dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) (GW 776C85) .

Todavía otro ejemplo es la prodroga fosfenitoina, una prodroga relativamente soluble que es convertida por la fosfatasa a fenitoina relativamente insoluble, a un anticonvulsivante activo. De forma similar, la depivefrina es convertida por la esterasa a epinefrina, un adrenérgico, útil en el tratamiento de glaucoma. Las enzimas redirigidas de esta invención también pueden actuar como polipéptidos "auto-protegidos", particularmente cuando se utilizan como agentes terapéuticos in vivo. En tal modalidad, la molécula orgánica (e.g. la porción dirigida al objetivo) componente de la molécula quimérica puede proteger estéricamente y proteger el componente efector (enzima) de la molécula quimérica. La idea de esto es que los grupos voluminosos unidos cerca de posiciones clave sobre la molécula quimérica impedirían el ataque de otro reactivo sobre, e.g. los sitios de clivado en lo restante de la quimera, y por lo tanto prolongarían si vida. Por ejemplo, azúcares sobre proteínas incrementan su estabilidad a proteinazas, es decir la proteinasa no puede llegar a clivar su enlace de amida preferido debido a que un azúcar está bloqueándolo (ver, e.g. Rudd et al. (1994) Biochemistry, 3:17-22) . En ciertas modalidades, la molécula orgánica puede realizar una "doble tarea", proporcionando ambos, una funcionalidad que elige un objetivo así como una función protectora.

En todavía otra modalidad, las enzimas redirigidas de esta invención pueden ser utilizadas en terapia de reemplazo de enzimas, particularmente en el tratamiento de enfermedades de almacenamiento . Las enfermedades de almacenamiento son provocadas por la acumulación incrementada de productos metabólicos (e.g. lípidos, proteínas, y carbohidratos complejos) debido ya sea a la inactividad de una enzima que degrada los productos, o la hiperactividad de una enzima que crea los productos. Las enfermedades de almacenamiento incluyen, pero no están limitadas a enfermedad I de almacenamiento de glicógeno, gangliósidos, MPS IV B (Morquio B) , gangliósidos GM2 (variantes 0, B, AB, Bl) , enfermedad de Niemann-Pick (A, B y C) , leucodistrofia metacromática (arilsulfatasa A y SAPtl deficiente) , enfermedad de Krabbe, enfermedad de Fabry, enfermedad de Farber, enfermedad de Wolman (enfermedad de almacenamiento de éster de colesterol) , MPS I (síndromes de Hurler y Scheie) , MPS II (síndrome de Hunter) , MPS III A, B, C y D (Sanfilippo A, C y D) , PS III B (Sanfilippo B) , MPS IV A (Morquio A) , MPS VI (Síndrome de Maroteaux-Lamy) , MPS VII (deficienciaa de beta-glucoronidasa) , deficiencia múltiple de sulfatasa) , Mucolipidosis I (Sialidosis) , Mucolipidosis II & III, alfa-Mannosidosis, beta-Mannosidosis, Fucosidosis, enfermedad de almacenamiento de ácido siálico, Galactosialidosis, Aspatilglucosaminuia, Cistinosis. Las enfemedades de almacenamiento pueden ser tratadas suplementando la actividad enzimática "faltante" . Por ejemplo, la enfermedad de Gaucher puede ser tratada por el uso de una glucocerebrosidasa dirigida a células del bazo. De forma similar, la superóxido dismutasa puede ser dirigida al hígado como un antioxidante, y así sucesivamente . III. Selección de enzimas (molécula efectoras) Virtualmente cualquier enzima puede ser utilizada en las moléculas quiméricas de esta invención. Cuando la molécula quiméricaa es un antagonista catalítico, se seleccionan enzimas que son capaces de degradar el substrato específicamente unido por la porción dirigida al objetivo. Tales enzimas incluyen, pero no están limitadas a proteasas, celulasas, nucleasas (exo- y endo-), amilasas, lipasas, aldolasas, cetolasas, glicosidasas, y similares. Cuando la molécula quimérica es una enzima cuya actividad está dirigida a un nuevo sitio y/o substrato, la enzima puede ser, pero no necesariamente ser una enzima que degrada su substrato. Así, además de proteasas, celulasas, nucleasas (exo- y endo-) , amilasas, lipasas, aldolasas, cetolasas, glicosidasas, y similares, las enzimas redirigidas también pueden incluir enzimas tales como isomerasas, oxidasas, oxidorreductasas, ligasas, transferasas, y similares.

Las enzimas preferidas para usarse en los antagonistas catalíticos de esta invención son las hidrolasas. Las enzimas particularmente preferidas para usarse en los antagonistas catalíticos de esta invención son las serina hidrolasas. Las serina hidrolasas son una clase de enzimas hidrolíticas caracterizadas por unas enzimas hidrolíticas que poseen una tríada catalítica compuesta de una serina, una histidina y un amino ácido de carboxilato (ya sea ácido aspártico o glutámico) , y que cataliza la hidrólisis, y reacciones inversas microscópicas de la misma, de derivados de ácidos carboxílicos que incluyen, pero no están limitados a, esteres, péptidos y amidas. Las serina hidrolasas preferidas que comprenden esta invención incluyen las tripsina-quimiotripsina proteasas, las subtilisina proteasas, y las alfa/beta hidrolasas. En una modalidad particularmente preferida, la enzima es proteasa, más preferiblemente una subtilisina (e.g. una subtilisina de Bacillus lentis) . La subtilisina es una serina endoproteasa (PM ~ 27,500) que es segregada en grandes cantidades de una amplia variedad de especies de Bacillus. La secuencia de proteína de la subtilisina ha sido determinada de al menos cuatro diferentes especies de Bacillus (ver, e.g., Markland et al. (1971) páginas 561-608 en: The Encimes, ed. Boyer P. D., Acad. Press, New York, Vol III, páginas; Nedkov et al. (1983) Hoppe-Seyler' s Z. Physiol.

Chem. 364: 1537-1540). La estructuraa cristalográfica tridimensional de la subtilisina BPN' (de B. amyloligoefaciens) a 2.5 Á de resolución también ha sido reportada (Wright et al. (1969) Nature 221, 235-242; Drenth et al. (1972) Eur. J. Biochem. 26: 177-181). Estos estudios indican que aunque la subtilisina no está relacionada genéticamente a las proteasas de serina de los mamíferos, tiene una estructura de sitio activo similar. Las estructuras cristalinas por rayos X de la subtilisina que contiene inhibidores de péptido unidos covalentemente (Robertus, et al. (1972) Biochemistry 11: 2439-2449), complejos de productos (Robertus, et al. (1972) Biochemistry 11: 4293-4303), y análogos de estadod e transición (Matthews et al. (1975) J. Biol. Chem. 250: 7120-7126; Poulos y colab (1976) J. Biol.. Chem. 251, 1097-1103), que han sido reportados también han proporcionado información con respecto al sitio activo, y la fisura de unión al substrato putativo de la subtilisina. Además, un gran número de estudios de modificación cinética y química han sido reportados para la subtilisina (Phillip et al. (1983) Mol. Cell. Biochem. 51: 5-32; Svendsen (1976) Carlsbera res. Comm. 41: 237-291; Markland, Id.) así como al menos un reporte en donde la cadena lateral de metionina en el residuo 222 de la subtilisina se convirtió por peróxido de hidrógeno a sulfóxidod e metionina (Stauffer et al. (1965) J. Biol. Chem. 244: 5333-5338) . Otras hidrolasas particularmente preferidas para usarse en esta invención incluyen, pero no están limitados a a/ß hidrolasas, familias de tripsina/quimiotripsina de enzimas de serina hidrolasa, aspartil proteasas, cisteína proteasas, metaloproteasas, lisozimas y otras glicosidasas, etc . IV. Construcción de moléculas quiméricas En modalidades preferidas, los antagonistas catalíticos quiméricos y/o enzimas redirigidas de esta invención son hechas conjugando químicamente la enzima deseada (directamente o a través de un enlazador) a la porción dirigida al objetivo. Mientras que muchas estrategias son conocidas para preparar moléculas quiméricas conjugadas químicamente (ver, e.g., la Solicitud de Patente Europea No. 188,256; las patentes de EUA Nos. 4,671,958; 4,414,148; 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; 4,589,071; 4,545,985 y 4,894,443; Borlinghaus et al. (1987) Cáncer Res. 47: 4071-4075; Torpe et al. (1991) Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet, Torpe et al. (1982) Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, páginas 168-190; Waldman (1991) Science, 252: 1657, y similares) , en una modalidad preferida, la porción dirigida al objetivo es derivatizada/funcionalizada con un grupo reactivo que puede reaccionar con un grupo R disponible (e.g.

NH2, N, NH, OH, COOH, SH, etc.) sobre un residuo de amino ácido que comprende la enzima. En modalidades particularmente preferidas, la porción dirigida al objetivo es derivatizada como un reactivo de metantiosulfonato que puede entonces reaccionar con el -SH en una cisteína para proporcionar la porción dirigida al objetivo acoplada en lugar del hidrógeno del tiol sobre la cisteína. El acoplamiento puede ser directo o a través de un enlazador. En ciertas modalidades, la cisteína a la cual está unida la porción dirigida al objetivo es una cisteína natural en la enzima, sin embargo, en modalidades preferidas la cisteína es una cisteína substituida por un residuo de amino ácido natural diferente en la enzima. La enzima modificada de esta manera es, opcionalmente, referida como una enzima mutante. Las moléculas quiméricas de esta invención en las cuales la molécula dirigida al objetivo está acoplada químicamente a una enzima mutante son, opcionalmente referidas como Mutantes Modificados Químicamente (CMS) . Típicamente, una vez que son seleccionados la porción dirigida al objetivo y la enzima que van a ser acoplados, e.g. como se describe arriba, es identificada la ubicación (residuo) en la enzima para la unión de la porción dirigida al objetivo. Cuando este residuo no es ya una cisteína, una cisteína es substituida por el residuo natural. La porción dirigida al objetivo, o un enlazador unido al mismos, es derivatizado como un metantiosulfonato, que puede entonces ser hecho reaccionar con el grupo -SH de las cisteínas como se describe en la presente. Los protocolos detallados para la preparación de las enzimas mutantes y el acoplamiento de una porción dirigida al objetivo se proporcionan abajo y en los ejemplos. A) Producción de enzimas mutantes para modificación química. 1) Selección de residuos para modificación. En general, virtualmente cualquier residuo de la enzima puede ser seleccionado para la mutagénesis (e.g. la substitución de una cisteína) y la modificación química para introducir una porción dirigida al objetivo, siempre y cuando la modificación retenga el nivel de actividad deseado de la enzima sujeto. Típicamente esto se logra haciendo la substitución en un sitio que no bloquee interacciones críticas con el substrato, o altere drásticamente el plegado/conformación de la enzima objetivo. Los sitios adecuados para la introducción de una porción dirigida al objetivo pueden ser determinados substituyendo cisteína, y opcionalmente una porción dirigida al objetivo unida, y ensayando las enzimas para determinar la actividad deseada. Con los avances actuales en química combinatorial y sistemas de selección de alto rendimiento, tales modificaciones y la selección pueden ser logrados con solamente experimentación de rutina. En una modalidad preferida, sin embargo, los residuos para modificación/substitución en la enzima (e.g. serina hidrolasa) son seleccionados racionalmente. Los sitios preferidos incluyen sitios que no están en regiones que determinan la conformación crítica, y sitios dispuestos fuera de el (los) subsitio (s) de la enzima. Sin embargo, en otras modalidades preferidas, particularmente cuando se desea mejorar, o alterar de otra manera, la especificidad y/o actividad del substrato, los residuos de amino ácido preferidos seleccionados para modificación incluyen residuos que se espera que sean sitios discriminatorios importantes cerca, adyacentes o dentro de la región de unión al substrato de la enzima. Tales residuos son determinados de experimentos de mutagénesis, en donde los residuos del subsitio son sistemáticamente sometidos a mutagénesis, y se determina el efecto de tales mutagénesis sobre la especificidad de unión y/o actividad enzimática. Además, pueden ser identificados residuos importantes de la inspección de las estructuras cristalinas de las enzimas solas o en complejo con un substrato, análogos del substrato o inhibidores, y/o de plegado de la proteína predicho, o interacciones proteína-proteína determinadas usando software de modelado de proteínas (e.g. Quanta, Cerius, Insight (Molecular Simulations Inc.) y Frodo (Academic Software).

Las cadenas laterales situadas para alterar la interacción en subsitios definidos por Berger y Schechter pueden ser seleccionadas basados en los modelos critalográficos de las enzimas, y extrapolados a enzimas homologas si es necesario si no está disponible la información estructural sobre una enzima específica. En los sitios de la subtilisina de B. lentus 62, 156, 166, 217 y 222 son sitios que determinan especificidad de substrato importantes. Sitios relacionados adicionales incluyen las posiciones 96, 104, 107, 189 y 209 en subtilisina y posiciones homologas en enzimas relacionadas. En modalidades preferidas, tales residuos típicamente caen en los subsitios Sl, S2 , S4 , SI', S2 ' , o S3', aunque se apreciará que en ciertos casos, la alteración de residuos en otros subsitios también puede producir efectos dramáticos. En una modalidad particularmente preferida, cuando la serina hidrolasa es una serina hidrolasa de tipo subtilisina, los residuos preferidos para la mutación incluyen, pero no están limitados a residuos en o cerca de los residuos 156 y 166 en el subsitio Sl, residuos 217 y 222 en el subsitio SI', residuo 62 en el subsitio S2 , y Leu96, Vall04, Ilel07, Phel89 y Tyr209 o residuos en o cerca de posiciones homologas otras serina proteasas de tipo subtilisina (preferiblemente posiciones dentro de subsitios) . En otra modalidad preferida, cuando la serina hidrolasa es una serina hidrolasa de tipo tripsina-quimiotripsina, los residuos preferidos para la mutación incluyen, pero no están limitados a, residuos en o cerca de los residuos Tyr94, Leu99, Glnl75, Aspl89, Serl90, Glnl92, Leulll, Phel75, Tyrl76, Serl82, Leul84, Phel89, Tyr214, Asp231, Lys234, e Ile243 de tripsina (Protein DataBank Entrada 1TPP) o residuos en o cerca de posiciones homologas de otras serina proteasas de tipo quimiotripsina (tipo tripsina-quimiotripsina) (preferiblemente posiciones dentro de subsitios) . En todavía otra modalidad preferida, cuando la serina hidrolasa es una serina hidrolasa alfa7beta, los residuos preferidos para la mutación incluyen, pero no están limitados a, residuos en o cerca de los residuos Trpl04, Thrl38, Leul44, Vall54, Ilel89, Ala225, Leu278 e Ilel85, cuando estos son residuos de lipasa de Candida antartica (Protein DataBase entrada ltca) o residuos en posiciones homologas de otras serina hidrolasas de tipo alfa/beta (preferiblemente posiciones dentro de subsitios) . Preferiblemente los amino ácidos reemplazados en la enzima por cisteínas son seleccionados del grupo que consiste de asparagina, leucina, metionina, o serina. Más preferiblemente el amino ácido a ser reemplazado está situado en o cerca de un subsitio de la enzima, preferiblemente los subsitios Sl, SI' o S2. Más preferiblemente, en una subtilisina los amino ácidos a ser reemplazados son N62, L217, M222, S156, S166, sitio 104, sitio 107 (S4), sitio 96 (S2) , sitio 189 (S2'), y sitio 209 (S1/S3') o sus homólogos cuando la posición numerada corresponde a subtilisina que existe naturalmente de Bacillus amyloliquefaciens, o a residuos de amino ácidos equivalentes en otras subtilisinas tales como la subtilisina de Bacillus lentus. Las moléculas quiméricas de esta invención no están limitadas a serina hidrolasas. Además de otras enzimas, en modalidades particularmente preferidas, esta invención incluye otras proteasas quiméricas. Tales proteasas incluyen, pero no están limitadas a, aspartil proteasas, cisteína proteasas, metaloproteasas, y similares. Cuando la proteasa es aspartil proteasa tal como pepsina, los residuos preferidos para la mutación incluyen, pero no están limitados a amino ácido (s) que corresponde (n) (e.g. en una posición homologa) a un residuo en o cerca de los siguientes residuos: Tyr9, Met12, Glnl3, Gly76, Thr77, Phelll, Phell7, Serl27, Ilel28, Serl30, Tyrl89, Ile213, Glu239, Met245, Gln287, Met289, Asn290, Leu291, y Glu294, cuando estos residuos de "referencia" son residuos en la pepsina humana madura (Protein DataBase entrada 1PSN) . Cuando la proteasa es cisteína proteasa, los residuos preferidos para la mutación incluyen, pero no están limitados a amino ácido (s) que corresponde (n) (e.g. en una posición homologa) a un residuo en o cerca de los siguientes residuos: Asnld, Ser21, Asn64 , Tyr67, Trp69, Glnll2, Glnl42, Aspl58, Trpl77, y Phe207, cuando estos residuos de referencia son residuos en la papaína madura (Protein DataBase entrada 1BQI) . Cuando la proteasa es metaloproteasa, los residuos preferidos para la mutación incluyen, pero no están limitados a amino ácido (s) que corresponde (n) (e.g. en una posición homologa) a un residuo en o cerca de los siguientes residuos: Leulll, Phel75, Tyrl76, Serl82, Leul84, Phel89, Tyr214, Asp231, Lys234, e Ile243, cuando estos residuos de referencia son residuos en la metaloproteasa de matriz humana madura (Protein DataBase entrada 830C) . 2) Introducción de cisteína. La substitución de una cisteína por uno o más residuo (s) naturales en la enzima (e.g. serina hidrolasa) puede ser lograda usando métodos de rutina muy conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad preferida, los mutantes descritos en la presente son preparados más eficientemente por mutagénesis sitio-dirigida del ADN que codifica la enzima de tipo natural de interés (e.g. subtilisina de Bacillus subtilis) . Las técnicas para realizar la mutagénesis sitio-dirigida o mutagénesis no aleatoria son conocidas en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells (1989) Science, 244, 1081-1085) , mutagénesis mediada por oligonucleótidos (Adellman et al. (1983) DNA, 2, 183), mutagénesis de cásete (Wells et al. (1985) Gene, 344: 315) y mutagénesis de unión (Ladner et al. WO 88/06630) . En una modalidad de la presente invención, el residuo de amino ácido substituto (e.g. cisteína) es introducido en la posición seleccionada por mutagénesis mediada por oligonucleótido usando la técnica de reacción en cadena de Polimerasa. En este enfoque, el gen que codifica la enzima natural deseada (e.g. subtilisina) es transportado por un plásmido adecuado. Más preferiblemente, el plásmido es un vector de expresión, e.g. un plásmido de la serie pBR, pUC, pUB, pET o pHY4. El plásmido puede ser seleccionado por personas expertas en la técnica por conveniencia, o como se desee . Para la mutagénesis sitio-dirigida, el fragmento que contiene el sitio de mutación seleccionado es clivado del gen que codifica la enzima sujeto por endonucleasas de restricción, y es usado como la plantilla en una técnica de PCR modificada (ver, e.g., Higuchi et al. (1988) Nucleic Acid Res. 16, 7351-7367). Por cada substitución objetivo, un oligonucleótido que contiene la mutación deseada es usado como un iniciador de desajuste para iniciar la extensión de cadena entre los iniciadores que flanquean el PCR 5' y 3. El proceso incluye dos reacciones de PCR. En la primera PCR, el iniciador de desajuste y el iniciador de 5' son usados para generar un fragmento de ADN que contiene la substitución de base deseada. El fragmento es separado de los iniciadores por electroforesis. Después de purificación, se usa entonces como el nuevo iniciador 5' en una segunda PCR con el iniciador 3' para generar el fragmento completo que contiene la substitución de base deseada. Después de la confirmación de la mutación por determinación de secuencia, el fragmento mutante es entonces insertado de regreso a la posición del fragmento original . En otro enfoque, puede ser usado un método de mutagénesis de cásete para facilitar la construcción e identificación de los mutantes de cisteína de la presente invención. Primero, el gen que codifica la serina hidrolasa es obtenido y se le determina la secuencia en su totalidad o en parte. Luego se identifica (n) el (los) punto (s) en los cuales se desea hacer una mutación de uno o más amino ácidos en las enzimas expresadas. Las secuencias que flanquean estos puntos son evaluadas para determinar la presencia de sitios de restricción para reemplazar un segmento corto del gen con un oligonucleótido que cuando se expresa, codificará los mutantes deseados. Tales sitios de restricción son preferiblemente sitios únicos dentro del gen de la serina hidrolasa, para facilitar el reemplazo del segmento de gen.

Sin embargo, cualquier sitio de restricción conveniente que no es excesivamente redundante en el gen de hidrolasa puede ser usado, siempre y cuando los fragmentos de gen generados por la digestión de restricción puedan ser reensamblados en una secuencia apropiada. Si no están presentes sitios de restricción en sitios dentro de una distancia conveniente del punto seleccionado (e.g., desde 10 a 15 nucleótidos), tales sitios son generados substituyendo nucleótidos en el gen de tal manera que ni el marco de lectura ni los amino ácidos codificados son cambiados en la construcción final. La tarea de localizar regiones de flanqueo adecuadas y evaluar los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de sitios de restricción convenientes se hace rutina por la redundancia del código genético, un mapa de la enzima de restricción del gen y el gran número de diferentes enzimas de restricción. Si está disponible un sitio de restricción que flanquea conveniente, el método de arriba necesita ser usado solamente en conexión con la región de flanqueo que no contiene un sitio. La mutación del gen para cambiar su secuencia para ajustaría a la secuencia deseada es lograda e.g. por extensión del iniciador M13 de acuerdo con métodos generalmente conocidos. Una vez que es clonado el gen, los sitios de restricción que flanquean la secuencia a ser mutada son digeridos con las enzimas de restricción de análogo, y el (los) cásete (s) de oligonucleótido complementarios de la terminal de extremo es (son) ligado (s) en el gen. La mutagénesis se simplifica enormemente mediante este método debido a que todos los oligonucleótidos pueden sintetizarse a fin de que tengan los mismos sitios de restricción y no sean necesario enlaces sintéticos para crear los sitios de restricción. Un programa de búsqueda por computadora de la secuencia de ADN adecuada simplifica la tarea de encontrar los sitios potenciales convenientes que flanquean 3' y 5'. En las modalidades preferidas, cualquier mutación introducida en la creación del (de los) sitio (s) de restricción son silentes para el aminoácido de construcción final que codifica la secuencia. Para un sitio de restricción candidato 5' para el codón objetivo existe preferentemente una secuencia en el gen que contiene al menos todos los nucleótidos pero para uno en la secuencia de restricción 5' para el corte de la enzima candidato. Por ejemplo, la enzima de corte truncado Smal (CCC/GGG) sería un buen candidato 5' si una secuencia cercana 5 'contiene NCC, CNC o CCN. Además, si N necesita alterarse a C esta alteración preferentemente deja intacto el aminoácido que codifica la secuencia. En casos donde es necesaria una mutación silente permanente para introducir un sitio de restricción uno puede querer evitar la introducción de un codón raramente utilizado. Una situación similar de Smal podría aplicarse para los sitios que flanquean 3' excepto que debe existir la secuencia NGG, GNG o GGN. El criterio para localizar las enzimas candidatas son más relajados para las enzimas de corte truncado y más restringidos para las 4 enzimas de base pendiente. En general se encuentran disponibles muchos sitios candidatos. Una particularmente preferida del método de introducir un mutante de cisteína en la enzima de interés se ilustra con respecto al gen de subtilisina del Bacillus lentus ("SBL") . En una modalidad preferida, el gen para SBL se clona en un vector bacteriófago (e.g. vector M13mpl9) para mutagénesis (ver, e . g. la Patente de E.U. 5,185,258). La mutagénesis dirigida por oligonucleótidos se realiza de acuerdo al método descrito por Zoller et al . , (1983) Meth. Enzymol., 100:468-500. La secuencia mutada se clona entonces, se corta y se reintroduce en un plásmido de expresión ( e . g. plásmido GG274) en el huésped B . subtilis . Se agrega PEG (50%) como ubn estabilizador. El concentrado de proteína cruda así obtenido se purifica al pasar primero a través de una matriz de desalinización Sephadex™ G-25 con un amortiguador de pH 5.2 (e.g. acetato de sodio 20 mM,CaCl 5 mM) para retirar contaminantes de pequeño peso molecular. Las fracciones agrupadas de la columa de desalinización se aplican entonces a una columna fuerte de intercambio catiónico (e.g. SP Sepharosa™ FF) en el amortiguador de acetato de sodio descrito anteriormente y el SBL se eluye con un gradiente de una etapa de amortiguador de acetato de NaCl 0-200 mM, pH 5.2. El polvo de enxima libre de sal se obtiene después déla diálisis del eluyente contra agua purificada Millipore y la liofilización subsecuente. La pureza del mutante y de las enzimas tipo silvestre que se desnaturalizan por incubación con HCl 0.1 M a 0°C durante 30 minutos se verifica por SDS-PAGE en geles homogéneos (e.g*. que utilizan el sistema Phast™ de Pharmacia, Uppsala. Suecia) . La concentración de SBL se determina utilizando el equipo de reactivos de tinta Bio-Rad (Hercules, CA) que se basa en el método de Bradford (1976) Anal . Biochem. , 72:248-254). La actividad específica de las enzimas se determina como se describe más adelante en los ejemplos . Alguien de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que el protocolo descrito anteriormente puede modificarse rutinariamente, si es necesario, para utilizarse con otras enzimas. Otros protocolos para la modificación de la proteína dirigida a un sitio se conoce bien por aquellos expertos en la materia y pueden encontrarse, e.g., en la Patente de E.U. 5,932,419 y 5,789,166; 5,705,479; 5,635,475; 5,556,747; 5,354,670; 5,352,779; 5284 , 760 y 5 , 071 , 743. Además, los equipos para mutagénesis dirigida a un sitio se encuentran comercialmente disponibles (ver e.g. Equipo de Mutagénesis Dirigida a unn Sitio Transfomer™ disponible de Toyobo) . 3) Optimización del sitio de acoplamiento. En la presente se indica un número de sitios particularmente preferidos para la introducción de la cisteína y del acoplamiento de la porción objetivo. Se indican las posiciones con respecto a una enzima de "referencia" y pueden determinarse los sitios "homólogos" en las enzimas relacionadas en la misma familia, e,g, como se describe en la presente. Sin embargo, puede ser deseable optimizar, los sitios de acoplamiento para una combinación de porción objetivo de enzima particular. Debido a que esta invención utiliza porciones objetivo químicamente acopladas esta puede realizarse con relativa facilidad y, a lo más, experimentación rutinaria. Las cisteínas pueden introducirse, e . g. en las posiciones cerca del sitio de interés de referencia, y entonces la porción objetivo puede fácilmente conjugarse como se describe en la presente. La quimera resultante puede probarse entonces para la actividad deseada. La proteína completa no necesita ser re-diseñada para cada variación y, debido a que los sitios particularmente preferidos ya se han mostrado en la presente, solo unas relativamente pocas posiciones necesitan explorarse para optimizar cualquier molécula quimérica particular. 4). Otras estrategias de acoplamiento. En las modalidades preferidas, el acoplamiento químico de la porción objetivo es a una cisteína, ya sea que ocurra de manera natural en la enzima sujeto o introducida (e.g. a través de mutagénesis dirigida al sitio) . Sin embargo, las moléculas quiméricas de la invención no necesitan limitarse a moléculas conjugadas a través de la cisteína. En ciertas modalidades la conjugación puede ser a través de virtualmente cualquier otro aminoácido ( e . g. , una serina, una glicina, una tirosina, etc.). La conjugación puede ser a través del grupo R existente (utilizando otras químicas de acoplamiento) , o alternativamente puede o introducirse un grupo sulfidrilo (SH) (enlazado) al grupo R y puede acoplarse la porción objetivo, derivada como un reactivo metanotiosulfonato, e . g. como se ilustra en los ejemplos . 5. Expresión de la enzima mutada En una modalidad preferida, la enzima mutada se expresa a partir de un ácido nucleico heterólogo en la célula huésped. La enzima expresada se aisla entonces y, si es necesario se purifica. la selección de la célula y los vectores de expresión dependerá en alto grado de la enzima de selección y sus fuentes. Un vector de expresión útil contiene un elemento que permite la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en una célula huésped independiente del genoma de la célula huésped, y preferentemente uno o más marcadores fenotípicos que permitan la fácil selección de las células huésped transformadas. El vector de expresión también puede incluir las secuencias de control que codifican un promotor, un sitio de enlace de ribosoma, una señal de inicio de translación y opcionalmente un gen represor, un marcador seleccionable o varios genes activadores. Para permitir la secreción de la proteína expresada, pueden insertarse los nucleótidos que codifican una secuencia de señal antes de la secuencia de codificación del gen. Para la expresión bajo la dirección de las secuencias de control, puede utilizarse un gen o ADNc que codifica una enzima mutada que de acuerdo a la invención se enlaza operablemente a las secuencias de control en la estructura de lectura apropiada. Los vectores que contienen los genes mutantes obtenidos por mutagénesis dirigida al sitio se utilizan entonces respectivamente para transformar las células huésped adecuadas y se expresan. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias tal como E. coli o Bacillus, levaduras tal como S. cerevisiae. células de mamífero tal como células de fibroblasto de ratón, o células de insecto. De preferencia se utiliza el sistema de expresión bacterial. Más dependiendo del uso deseado de la enzima. Como se indica adicionalmente arriba, las porciones objetivo adecuadas incluyen, pero no se limita a, porciones que se unen mediante receptores, porciones objetivo que se unen mediante anticuerpos y enzimas, porciones objetivo que se unen mediante lectinas, y varias otras porciones objetivo. En ciertas modalidades particularmente preferidas, las porciones objetivo son drogas o prodrogas que se unen específicamente a un receptor y/o una enzima. 2. Acoplamiento de porciones objetivo a la cisteína El grupo R en las cisteínas proporciona un grupo tiol reactivo relativamente conveniente (-SH) que puede explotarse para acoplar una porción dirigida al objetivo deseada para la cisteína. En una modalidad preferida, se proporciona la porción dirigida al objetivo de interés, derivada como un reactivo de metanotiosulfonato que, cuando reacciona con la cisteína, da como resultado el substituyente de interés acoplado de manera covalente a la cisteína mediante un enlace de disulfuro (-S-S-) . En una modalidad preferida, la modificación química con el (los reactivo (s) de metanotiosulfonato se llevan a cabo como se describió por Berglund et al . , (1997) J. Am . Chem . Soc . 119: 5265-5255 y DeSantis et al . , (1998) Biochemistry, 37: 5968-5973. Brevemente, 200 µl de una solución 1 M del - reactivo de metanotiosulfonato (MTS) se agrega a una solución (5-10 mg/ml, 3.5 ml) de la cisteína mutante en CHES 70 mM, MES 5 mM, CaCl2 2 mM, pH 9.5. El reactivo MTS se agrega en dos porciones durante 30 minutos. Las mezclas de reacción se mantienen a 20 °C con mezclado continuo de extremo a extremo. Las reacciones se monitorean al seguir la actividad específica (e.g. con suc-AAPF-pNA) y mediante pruebas para el tiol libre residual (e.g. con el reactivo de Ellman) . Una vez que la reacción se completa, la mezcla de reacción se carga a una columna Sephadex™ PD-10 G25 con MES 5 mM y CaCl2 2 mM, pH 6.5. la porción de proteína se dializa entonces contra CaC12 1 mM y el dializado se liofiliza. En una modalidad particularmente preferida la fracción se dializa contra MES pH 6.5 congelando rápidamente después. En ciertos casos, cuando la porción dirigida al objetivo que se va a acoplar a la cisteína, lleva grupos reactivos, pueden derivarse los grupos reactivos con los grupos de bloqueo/protección apropiados para evitar las acciones indeseables durante el acoplamiento. De manera similar, cuando pueden reemplazarse con otros aminoácidos (e.g. a través de mutagénesis dirigida a un sitio) y/o el (los) grupo (s) tiol en estas cisteínas, pueden derivarse con los grupos de protección apropiados (e.g (e.g. bencilo. tritilo, tert-butilo. MOM, acetilo, tiocarbonato, tiocarbamato y otros) . El uso de los grupos de - bloqueo/protección es bien conocido por aquellos e experiencia en la materia (ver, e.g. Protective Groups in Organic Synthesis" Theodora W. Greene y Peter G.M. Wuts, tercera Edición, Wiley- Interscience, Toronto, (1999) , pp454-493) . Aunque en las modalidades particularmente preferidas, se introduce/substituye una cisteína en la enzima, en ciertas modalidades, pueden introducirse otros aminoácidos (e.g. lisina. histidina. etc.), y en ciertas modalidades, ella porción dirigida al objetivo puede acoplarse a estos residuos. La derivación de varias de las porciones objetivo y su acoplamiento a enzimas mutantes se ilustra en los ejemplos proporcionados en la presente. C) Moléculas quiméricas químicamente seleccionadas para la actividad deseada. Las moléculas quiméricas de esta invención se seleccionan típicamente para la actividad o actividades de interés. La actividad de interés depende del uso deseado de la molécula quimérica. Así, por ejemplo, en el caso de los antagonistas catalíticos de esta invención, la molécula quimérica puede ensayarse para dos propiedades: 1) La capacidad de reducir o eliminar la actividad del objetivo, e.g., cuando el objetivo es biológicamente activo o degrada simple, parcial o totalmente el objetivo, e.g. cuando el objetivo no es biológicamente activo; y 2) la capacidad de liberarse del objetivo después de que se degrada el objetivo y enlaza y degrada otro objetivo. De manera alternativa, la molécula quimérica puede ensayarse simplemente para la actividad (e.g. la capacidad para realizar degradaciones) de una manera subestequiométrica. Los detalles del ensayo particular, variarán con el objetivo de la molécula quimérica. Muchos ensayos para la degradación de varias moléculas (e.g. proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos, etc.) y/o la inhibición de varios receptores y/o anticuerpos se conocen bien por aquellos de experiencia en la materia. Por ejemplo, en una modalidad, la actividad de una molécula en un receptor de superficie células puede determinarse al proporcionar una célula que expresa el receptor y mide la actividad del receptor en la presencia o ausencia de la molécula quimérica. Los ensayos del receptor se llevan a cabo comúnmente en oocitos (e.g. oocitos Xenopus) en los cuales se inserta un ARN que codifica al receptor objetivo. La actividad del receptor se monitorea al medir la actividad electroquímica (e.g. a través de patch clams, etc.), absorción de los substratos del receptor, y lo similar. Tales métodos se conocen por aquellos de experiencia en la materia y se describen en detalle, en por ejemplo, Racke et al . , (1993) FEBS Letters 333 (1, 2) : 1342-136. Los ensayos para el enlaza de ligandos, alteración de la actividad enzimática y lo similar, t5ambién son bien conocidos por aquellos de experiencia en la materia. Además, varios de los ensayos adecuados se proporcionan en los ejemplos. V. Usos ilustrativos de antagonistas catalíticos y/o enzimas redirigidas. A partir de la exposición anterior serán aparentes innumerables aplicaciones/usos de las moléculas quiméricas de la invención para alguien de experiencia en la materia. Además, varias de las modalidades y aplicaciones específicas se describen en la discusión de las porciones objetivo. Sin embargo a manera de ilustración adicional, a continuación se tratan varias de las modalidades específicas particularmente preferidas . A. bases terapéuticas en la Destrucción del Objetivo Como se indica anteriormente, loa antagonistas catalíticos de la invención pueden utilizarse como terapéuticos en un amplio número de patologías incluyendo, pero sin limitarse a inhibidores de infección viral y/o replicación, inhibidores de infección bacterial y/o formación de biopelícula, moduladores de una respuesta inmune, inhibidores de una respuesta inflamatoria, y lo similar. De manera más general, como se indica arriba, los antagonistas catalíticos de esta invención pueden utilizarse para reemplazar los farmacéuticos existentes donde actúan los farmacéuticos al inhibir y/o antagonizar un receptor.

- Se explicó anteriormente que una amplia variedad de farmacéutica actúa como antagonista de los receptores o receptor que media la actividad. Estos farmacéuticos típicamente se enlazan de manera específica a un receptor y o enzima particular. El uso de tales farmacéuticos como porciones objetivo en antagonistas catalíticos de esta invención en donde ellos se unen a una enzima (e.g. una serina hidrolasa) que degrada el receptor y/o enzima objetivo esencialmente vuelve la droga catalítica. Así, en lugar de actuar de manera estequiométrica (una- sola molécula de droga bloque/antagoniza un solo receptor) , cuando se convierte en antagonista catalítico, la nueva droga actúa de manera subestequiométrica (una sola molécula puede antagonizar esencialmente un número ilimitado de receptores) . Además en contraste a la droga sola (donde el receptor con frecuencia recupera la actividad cuando se libera la droga) , el receptor unido mediante un antagonista catalítico de la invención se degrada ( liberando mediante esto el antagonista catalítico para actuar en otro receptor) . Debido a que el receptor se degrada no recupera su actividad. Los antagonistas catalíticos se espera así que proporcionen mayor eficacia a una dosis menor y proporcione actividad más larga en una dosis particular. Así, en una modalidad, esta invención proporciona métodos para mejorar la actividad de una droga. Los métodos incluyen unir la droga a una enzima capaz de degradar el objetivo (e.g. receptor) al cual se enlaza la droga. Las enzimas preferidas en este contexto incluyen hidrolasas y aún más preferentemente incluyen proteasas (e.g. serina proteasas, metaloproteasas, cisteína proteasas, aspartilo proteasas, etc.). Sin embargo, se explicó anteriormente, que las porciones objetivo no necesitan limitarse a drogas. Una amplia variedad de otras porciones objetivo también son adecuadas y proporcionan antagonistas catalíticos útiles en una amplia variedad de contextos terapéuticos. Así, por ejemplo, en una modalidad, la porción dirigida al objetivo puede ser una molécula que se enlace específicamente a los receptores CCR5 y/o CXCR2 , encontrados comúnmente en los linfocitos (e.g células T) . los receptores CCR5 y CXCR2 se encuentran implicados en la infección de una célula por VIH y las personas defectuosas en uno o más de estos receptores típicamente demuestran resistencia a la infección de VIH. La destrucción/inhibición objetivo de cada uno o ambos de estos receptores e.g. mediante un antagonista catalítico que comprende un agente objetivo específico CCR5 y/o CXCR" unido a una hidrolasa adecuada (e.g subtilisina) incrementará la resistencia de la célula objetivo para la infección de VIH. En otra modalidad las glicosilasas involucradas en la glicosilación de la proteína pueden unirse de manera - específica (e.g. utilizando una porción dirigida al objetivo Aza-azúcar) a una hidrolasa adecuada (e.g. subtilisina, pepsina, etc.). Tal antagonista catalítico será de uso en el tratamiento de VIH, herpes, otros virus, y varios cánceres. Los antagonistas catalíticos que comprenden una porción dirigida al objetivo de azúcar unida a una hidrolasa adecuada (e.g. subtilisina, pepsina, etc.) será útil en el tratamiento de una amplia variedad de condiciones, incluyendo respuestas inflamatorias (e.g. asociadas con artritis, choque séptico, infarto del miocardio, etc.) bacterias que se unen a células e infección subsecuente (e.g. infección de H. pylori asociada con úlceras) . Cuando la porción dirigida al objetivo es un E. coli patogénico Gala (1,4) Gal las infecciones pueden bloquearse. Además, los antagonistas catalíticos dirigidos a la lectina pueden utilizarse para inhibir la formación de biopelícula in vivo o ex vivo. En todavía otra modalidad la porción dirigida al objetivo puede ser un azúcar de ácido siálico (o miméticos tal como Rilenza (Glaxo-Wellcome) o lo similar) . Cuando se une a una hidrolasa adecuada (e.g. subtilisina) el antagonista catalítico puede dirigirse específicamente a la actividad sialidasa del virus tal como influenza. El antagonista catalítico quimérico de esta invención también puede utilizarse para dirigirse específicamente a las células hiperproliferativas y/o - invasivas (e.g. células metastáticas). Varias enzimas (e.g. específicamente metaloproteasas de matriz) se conocen por se altamente activas en células invasivas. Estas enzimas pueden dirigirse específicamente utilizando varias de las porciones objetivo (e.g. éteres de corona) . Cuando se unen a la hidrolasa adecuada (e.g. una subtilisina) el antagonista catalítico degradará la enzima objetivo (e.g. metaloproteasa) e interferirá mediante esto con o eliminará la capacidad de la célula para invadir, e.g. una membrana basal, retardando mediante esto la progresión del cáncer. Los antagonistas catalíticos de esta invención también pueden utilizarse para dirigir y alterar una variedad de procesos inmunes. Así, por ejemplo, al utidlizar un objetivo dirigido a un receptor de célula T, e.g. al utilizar un complejo MHC a partir de un xenotransplante, es posible inhibir las células inmunes que montan una respuesta inmune dirigida contra ese antígeno. En una modalidad relacionada puede utilizarse el disacárido del epítope alfa-Gal (Gala (1, 3) Gal) como una porción dirigida al objetivo y (e.g. cuando se une a una subtilisina) puede unirse e inhibir específicamente los anticuerpos específicos del epítope alfa-Gal mitigando mediante esto la reyección del huésped de un xenoinjerto. De manera similar, los alérgenos conocidos (e.g. varios polen o epítopes presentes en tales alérgenos) pueden utilizarse como porciones objetivo hacia el objetivo e inhibir las células T y/o los anticuerpos que reconocen específicamente tales antígenos. Así, mitigarán las reacciones alérgicas contra t5ales alérgenos. B. Estrategias de Suministro de Drogas Como se indicó arriba, las moléculas quiméricas pueden utilizarse en varias estrategias de suministro de drogas para dirigir específicamente una actividad terapéutica a una célula, órgano o tejido de interés. En ciertas modalidades, como se describió arriba, las enzimas capaces de convertir las prodrogas a su forma activa se unen a una porción dirigida al objetivo (e.g. una porción específica de células de tumor) que las localiza en el sitio de actividad deseada (e.g. una célula de tumor), varias prodrogas se conocen por aquellos de experiencia en la materia e incluyen, pero no se limitan a ganciclovir activado por timidina quinasa, fosfenitoina convertida a fenitoina mediante una fosfatasa, depivefrina se convierte a epinefrina mediante una estearasa, y lo similar. Otro ejemplo de una estrategia de "suministro de droga" utiliza la molécula quimérica objetivo para suministrar una enzima que tiene una actividad que complementa un ausente, típicamente de actividad endógena. Así, por ejemplo, los glucocerebrósidos pueden dirigirse, e.g. a células del bazo en el tratamiento de la enfermedad de Gaucher o de Tay-Sachs. De manera similar la superóxido dismutasa puede unirse a porciones objetivo específicas de células del hígado a fin de que se dirijan al tejido del hígado donde pueden proporcionar actividad anti -oxidante . C. Otras modalidades En otras modalidades particularmente preferidas, las moléculas quiméricas de esta invención pueden utilizarse y destruir las moléculas particulares preseleccionadas ya sea o no que tengan una actividad biológica. Así, por ejemplo, los componentes de varios suelos o colorantes (e.g. leche, sangre, huevo, colorantes de suelo, colorantes de aceite, etc.) pueden dirigirse específicamente. Por ejemplo, proteína avidina/huevo puede dirigirse específicamente al utilizar una biotina como una porción dirigida al objetivo para dirigirla específicamente, e.g. una proteasa al sitio. El colorante se degrada/digiere y se libera mediante esto del substrato subyacente. Tales quimeras específicamente dirigidas se encuentran particularmente en varias composiciones de limpieza. VI . Formulaciones farmacéuticas . Las moléculas quiméricas terapéuticas de esta invención, (e.g. los antagonistas catalíticos terapéuticos son útiles para la administración intravenosa, parenteral, tópica, oral o local (e.g. transdérmicamente o por aerosol) . Los modos particularmente preferidos de administración incluyen la inyección intra-arterial , más preferentemente intra-peritoneal, inyección de arteria intra-hepática o, donde se desee para ¡suministrar una composición al cerebro, (e.g., para el tratamiento de tumores cerebrales) una arteria carótida o una arteria del sistema de arterias carotídeo (e.g. arteria occipital, arteria auricular, arteria temporal, arteria cerebral, arteria maxilar, etc.). Las moléculas quiméricas típicamente se combinan con un vehículo farmacéuticamente aceptable (excipiente) para formar una composición farmacéutica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúe. por ejemplo, para estabilizar la composición o para aumentar o disminuir la absorción del agente. Los compuestos fisiológicamente aceptables pueden incluir por ejemplo, carbohidratos, tal como glucosa, sacarosa, o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutationa, agentes quelantes proteínas de bajo peso molecular, composiciones que reducen la depuración o hidrólisis de los agentes anti-oxidantes o excipientes u otros estabilizadores y/o amortiguadores. Otros compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsificantes, agentes dispersantes o conservadores que son particularmente útiles para evitar el crecimiento o acción de microorganismos. Varios conservadores son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. Un experto en la materia apreciará que la selección de un vehículo farmacéuticamente aceptable que incluye un compuesto fisiológicamente aceptable depende, por ejemplo, de la ruta de administración, de la molécula quimérica y de las características físico-químicas del agente . Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una variedad de formas de dosis unitarias dependiendo del método de administración. Por ejemplo, Las formad de dosis unitarias adecuadas para la administración oral incluyen polvos, tabletas, pastillas, cápsulas, y grageas. Se reconoce que las moléculas quiméricas, cuando se administran oralmente se encuentran particularmente protegidas para la digestión. Esto se realiza típicamente ya sea al hacer el complejo de la molécula sujeto con una composición para volverla resistente a la hidrólisis acídica y enzimática o al empaquetar el agente de la molécula quimérica en un vehículo apropiadamente resistente tal como un liposoma. Los medios para proteger los compuestos de la digestión son bien conocidos en la materia (ver e.g., la Patente de E.U. 5,391,377 que describe las composiciones de lípidos para el suministro oral de los agentes terapéuticos. Ciertas moléculas quiméricas de esta invención pueden ser solo marginalmente solubles en soluciones acuosas. En una modalidad preferida, estas composiciones se suministran ya sea directamente en el sitio deseado (e.g. por inyección, canulización o aplicación directa durante un procedimiento quirúrgico) o se solubilizan en un excipiente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de esta invención son útiles para la administración tópica e.g. en heridas quirúrgicas que tratan tumores incipientes, neoplasias y células metastáticas y sus precursores. En otra modalidad las composiciones son útiles para la administración parenteral, tal como la administración intravenosa o la administración en una cavidad corporal o lumen de un órgano. Las composiciones para la administración comprenderán comúnmente una solución del agente de la molécula quimérica disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente un vehículo acuoso para moléculas quiméricas solubles en agua. Pueden utilizarse una variedad de vehículos, e.g. salina amortiguada y lo similar. Estas soluciones son estériles y en general libres de materia indeseable. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas convencionales bien conocidas de esterilización. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiere para las condiciones aproximadamente fisiológicas tal como ajustar el pH y agentes de amortiguamiento, agentes de ajuste de toxicidad y lo similar, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y lo similar.

Las concentraciones de la molécula quimérica en estas formulaciones pueden variar ampliamente, y se seleccionarán principalmente en base de volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y lo similar de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado para las necesidades del paciente. Los métodos actuales para preparar las composiciones administrables serán conocidas o aparentes para aquellos de experiencia en la materia y se describen en más detalle en tales publicaciones como Remington's Pharmaceutical Science, 15a. De, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Las dosis para los quimioterapéuticos típicos se conocen bien por aquellos de experiencia en la materia. Además, tales dosis se pueden prever en la naturaleza y pueden ajustarse dependiendo del contexto terapéutico particular, tolerancia del paciente, etc. Las administraciones simples o múltiples de las composiciones pueden administrarse dependiendo de la dosis y frecuencia a medida que se requiere y se tolera por el paciente. En cualquier caso, la composición debe proporcionarse en suficiente cantidad de las proteínas de la invención para tratar efectivamente al paciente. En el caso de dosis de moléculas quiméricas terapéuticas para una composición farmacéutica típica para la administración intravenosa sería de aproximadamente 0.01 por paciente por día. Pueden utilizarse dosis de 0.1 hasta aproximadamente 1000 mg por paciente por día, particularmente cuando la droga se administra en una sitio apartado y no en la corriente sanguínea, tal como en una cavidad corporal o en el lumen de un órgano. VII. Equipos En ciertas modalidades, esta invención proporciona equipos para la creación y/o uso de las moléculas quiméricas de esta invención. En una modalidad los equipos comprenden uno o más recipientes que contienen una o más porciones objetivo derivadas como metanosulfonatos para acopla una cisteína a una enzima. Además o de manera alternativa los equipos pueden comprender una o más enzimas, más preferentemente enzimas mutantes que tienen una cisteína ya insertada para acoplarse a una porción dirigida al objetivo derivada de un metanosulfonato. Cuando se proporciona de esta manera, el equipo permite a alguien de experiencia en la materia ensamblar la molécula quimérica deseada para un uso particular. Así, por ejemplo, un equipo típico puede incluir una multiplicidad de porciones objetivo derivada de metanosulfonato y una o más enzimas adecuadas para acoplarse. La enzima deseada se hace reaccionar entonces (como se describe en la presente) con la porción dirigida al objetivo deseada para producir la molécula quimérica deseada. Tal equipo puede comprender adicionalmente uno o más de los - reactivos utilizados en una reacción típica de acoplamiento. En otra modalidad, esta invención proporciona una o más moléculas quiméricas (e.g. antagonistas catalíticos y/o enzimas re-dirigidas) de esta invención. Las moléculas quiméricas pueden proporcionarse secas (e.g. polvo liofilizado) o en solución y/o como una emulsión. En ciertas modalidades las moléculas quiméricas se proporcionan en, o junto con un excipiente farmacéutico y, opcionalmente, pueden proporcionarse en un formato de dosis unitaria. Los equipos pueden incluir opcionalmente cualquier reactivo y/o aparato para facilitar el uso descrito en la presente. Tales reactivos incluyen, pero no se limitan a amortiguadores, solventes orgánicos, etiquetas, anticuerpos etiquetados, bioreactores, células, etc. Además, los equipos pueden incluir materiales instruccionales que contiene direcciones (e.i. protocolos) para el ensamble de las moléculas quiméricas de esta invención y/o para el uso de las mismas. Aunque los materiales instruccionales típicamente comprenden materiales escritos e impresos ellos no se limitan a tales. Se contempla por esta invención cualquier medio capaz de almacenar tal información y comunicarla a un usuario final. Tal medio incluye pero no se limita a medio de almacenaje electrónico (e.g. discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medio óptico (e.g CD ROM), y lo similar. Tal medio puede incluir direcciones para sitios de internet que proporcionen tales materiales instruccionales. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada. Los siguientes ejemplos detallan la construcción y evaluación de varias moléculas quiméricas de esta invención. En particular, Los Ejemplos 1-4 demuestran la alta selectividad específica de un antagonista catalítico de esta invención en la cual la porción dirigida al objetivo es un inhibidor de enzima conocido. Los Ejemplos 5 a 7 detallan la construcción y evaluación de las moléculas quiméricas en las cuales las moléculas quiméricas se dirigen a la proteína de la lectina concavalina A. Los Ejemplos 8 a 10 detallan la construcción y evaluación de las moléculas quiméricas en las cuales las moléculas quiméricas se dirigen a la proteína de enlace avidina. Los Ejemplos 11 y 12 detallan la construcción y evaluación de las moléculas quiméricas en las cuales las moléculas quiméricas se dirigen a un anticuerpo monoclonal IgG anti-biotina. El Ejemplo 13 detalla la respectiva estequiometría de estos ejemplos. Ejemplo 1 Enzimas Objetivo con Inhibidores; Síntesis y Unión de un Inhibidor HLADH para SBL y Caracterización de la SBL-S-pirazol CMMs Resultante Con objeto de dirigir la SBL hacia varios objetivos de enzimas para su degradación y unión a sus inhibidores específicos para aquellas enzimas a SBL mediante nuestro enfoque combinado de modificación química de mutagénesis dirigida al sitio (CMM) Figura 2. En una modalidad preferida el (los) inhibidor (es) que se seleccionan como porciones objetivo para este enfoque son inhibidor (es) /degradadores fuertes de las enzimas objetivo pero son pobres inhibidores de la CMM. En este ejemplo, la alcohol deshidrogenasa (ADH) , que se inhibe fuertemente por los derivados de 4 -pirazol, se selecciona como la enzima objetivo y los inhibidores se seleccionan como los objetivos que fueron pirazols conocidos por inhibir la ADH. La CMM modificada en este caso fueron una subtilisina (SBL)s. En una modalidad, la alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HLADH) se seleccionó como la enzima objetivo. Se describen varios pirazols 4-substutuídos como los inhibidores razonablemente seleccionados de la HLADH (Theorell y Yonetani (1963) Biochem. Z . , 388:537-553; Theorell et al . , (1969) Acta Chem. Scand. , 23: 255-260; Tolf et al . , (1979) Acta Chem. Scand. B. 33: 483-487; Tolf et al . , (1982) Acta Chem . Scand. B. 36: 101-107). Los derivados de pirazol con grandes substituyentes alcalino hidrofóbicos en la posición 4 inhiben fuertemente de manera específica la actividad de la HLADH. La afinidad de enlace de este substituyente y en consecuencia la energía inhibidora del 4-pirazol se incrementa a medida que la larga cadena alcalina se incrementa hasta seis átomos de carbono. Se conoce la 4-hexilpirazol por inhibir la alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo LADH) con ^=0.5 nm. Por lo tanto, decidimos sintetizar un reactivo de pirazol -MTS que porta una cadena lateral de metanosulfonil -hexil en la posición 4. La síntesis del reactivo MTS-pirazol se ilustra en el esquema 11 (Figura 3) . Síntesis de la MTS-Pirazol El intercambio halógeno-metal de 4-yodopirazol (1) con n-BuLi, y el acoplamiento subsecuente con un exceso de 1, 6-dibromohexano (2) proporciona 4- (6-bromo) -hexilpirazol (3) . Los intentos para purificar el compuesto 3 solo fueron parcialmente exitosos. La reacción del bromuro crudo 3 con metanotiosulfonato de sodio proporciona el MTS-pirazol 4 en rendimiento total del 16%. Aunque el rendimiento total fue bajo, ningún intento hacia la optimización habría requerido probablemente del uso de grupos de protección. Por lo tanto, el MTS-pirazol 4 puede sintetizarse en una secuencia de reacción directa de dos etapas como se delinea en el esquema 11 (Figura 3) . Inhibición de SBL-WT mediante Pirazol Para determinar cuanta modificación con pirazol influenciará la actividad catalítica de SBL, levamos a cabo mediciones de KS para SBL-WT utilizando el método de Waley (Waley (1982) Biochem. J. , 205: 631) con nuestro substrato estándar suc-AAPFpNA y condiciones estándar (pH 8.6, 0.1 M Tris con Tween 80 al 0.005%, DMSO al 1%). El pirazol no substituido no inhibió significativamente SBL-WT (KM 0.73±0.05 mM, kcat =153±4 s"1, kcat/KM = 209±15 mM s"1, KS = 97.2±7.2 mM) . Los intentos para utilizar el mismo método para la determinación de KS de SBL-WT con MTS-pirazol 4 fallaron debido a la insolubilidad del compuesto de pirazol. Modificación y Caracterización del Pirazol-CMMs Los mutantes N62C, L217C, S166C y S156C se modificaron con el reactivo MTS-pirazol 4 mediante la reacción a pH 9.5 seguido por el protocolo estándar. En todos los casos las enzimas resultantes se activaron después de la modificación y los datos para las cinéticas de la amidasa (substrato suc-AAPFpNA) y ESMS se muestran el la Tabla 2. Tabla 2. Constantes cinéticas v para pirazol-CMMs Pirazol- Cinéticas de la Amidasa ESMS CMM K-cat K-M kcat/K-M Cale. Encontrado S166C 10.4±0.2 0.46±0.03 22.7±1.4 26896 26900 S156C 59.8±1.5 0.65±0.05 92.2±7.2 26896 26897 N62C 97.9±2.3 0.90±0.05 109±6.6 26869 26868 L217C 61.3±1.0 0.87±0.04 70.2+3.1 26870 ???-a GG36-WT 153±4 0.73±0.05 209±15 26698 26694 a Pudo no obtenerse hasta ahora debido a los problemas de medición. Constantes Cinéticas determinadas por duplicado por el método de tasas de inicio en amortiguador TRIS 0.1 M, pH 8.6, Tween 80 0.005%, DMSO 1%. [S]=0.125 M a 3 mM, [E] = 1.5 x 108 M a 9.0 x 10"8 M.

Aunque tiene el valor más pequeño de KM entre todos los pirazol-CMMs, el 3166C-S-Pirazol CMM muestra el más bajo kcat/KM; aproximadamente 9 veces más pequeño que para SBL-WT. El kcat de S156- y L217C-S-Pirazol CMM fueron tanto muy similares como aproximadamente 2.5 veces más pequeños que para la enzima WT. Sin embargo, sus propiedades de unión al substrato, fueron claramente diferentes: S156C-S-Pirazol se une mejor que SBL-WT considerando que el KM del L217C-S-Pirazol es mayor que el de la enzima WT. N62C-S-Pirazol es ligeramente más activo que las otras CMMs pirazol y su kcat es solo 1.5 veces más pequeño comparado a SBL-WT. Sin embargo, teniendo el mayor KM entre todas las pirazol-CMMs y sus kcat/KM fueron aproximadamente 2 veces más pequeños comparados a SBL-WT. Detalles Experimentales 4- (6 -Metanotiosulfonil) hexilpirazol (MTS-Pirazol) (4) Se agregó n-Butil litio (2.5 M solución en hexanos, 12.4 ml, 30.9 mmol) gota a gota a una solución de 4-yodopirazol (1) (2.00 g, 10.3 mmol) en THF (40 ml) a 78 °C bajo N2. Después de 0.5 horas se agregó lentamente una solución de 1, 6-dibromohexano (2) (5.03 g, 20.6 mmol) en THF (40 ml) . Cuando se completó la adición, a la mezcla de reacción se le permitió calentarse hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se agregó agua (50 ml) , las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con AcOEt (4 x 50 ml) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 ml) y se secaron (MgS0) . La evaporación del solvente y el subsecuente secado bajo vacío proporcionó 5.03 g de producto crudo como un aceite café. La separación mediante cromatografía rápida (gel de sílice, hexanos: AcOEt, elución de gradiente, 95: 5 a 55: 45) proporcionó 0.810 g (34%) de 4- (6 -bromo) hexilpirazol (3) como un aceite amarillo; XH NMR (CDC13, 300 MHz) d 1.35-1.48 (m, 4H) , 1.51-1.63 (m, 2H) , 1.79-1.90 (m, 2H) , 2.50 (t, Ji-,2' 7.5 Hz, 2H, H-l'), 3.40 (t, JB-,6' 7.0 Hz, 2H, H-6'), 7.42 (s, 2H, H-3, H-5) , 11.5 (s, 1H, NH) ; 13C NMR (CDC13, 75.5 MHz) d 23.9, 28.0, 28.4, 30.8, 32.8, 34.1 [(CH2)6], 120.9 (C-4), 132.6* (C-3, C-5),* la señal tiene doble intensidad. Ambos espectros NMR contienen señales adicionales debido a impurezas. El compuesto de bromo 3 no se purificó y caracterizó adicionalmente. Además se pudo re-aislar 2.41 g (48%) de dibromuro .2. Se agregó NaSS02Me (0.319 g, 2.38 mmol) a una solución de bromuro crudo 2 (0.400 g max. 1.73 mmol) en DMF (10 ml) y la solución resultante se calentó bajo nitrógeno a 50 °C. Después de 16 horas se agregó agua (10 ml) y AcOEt (10 ml) , las capas se separaron y se extrajo la capa acuosa con AcOEt (4 x 10 ml) . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (10 ml) y se secaron (MgS04) . La evaporación del solvente y el subsecuente secado bajo vacío proporcionó 0.350 g de producto crudo como un aceite amarillo. La separación por cromatografía rápida (gel de sílice, hexanos: AcOEt, elución de gradiente, 8:2 a 0:1) proporcionó 0.215 g (16% durante las dos etapas) 4- (6-metanotiosulfonil) -hexilpirazol (4) como un sólido sin color, mp 68-70; IR (KBr) 3170, 3165 (NH) , 3065, 3024 (arC-H) , 2932, 2854 (C-H), 1306, 1122 (S-S02) cm"1; XH NMR (CDC13 300 MHz) d 1.35-1.47 (m, 4H) , 1.52-1.62 (m, 2H) , 1.70-1.79 (m, 2H) , 2.48 (t, Ji-f2' 7.5 Hz, 2H, H-l'), 3.14 (t, J5.?6' 7.5 Hz, 2H, H-6'), 3.30 (s, 3H, CH3S02) , 7.40 (s, 2H, H-3, H-5) ; 11.5 (s, 1H, NH) ; 13C NMR (CDC13; 75.5 MHz) d 23.6, 28.0, 28.2, 30.4, 36.1, [(CH2)5], 50.3 (CH3S02) , 120.4 (C-4), 132.3* (C-3, C-5),* la señal tuvo doble intensidad; HRMS m/z (El) Encontró 263.0882 (M+H+) ; C?0H?9N2O2S2 requiere 263.0888. Protocolo de Modificación Estándar Procedimiento general para la modificación de los mutantes de SBL almacenados como soluciones rápidamente congeladas : Una alícuota de 1.25 ml congelada de la enzima mutante (N62C, L217C o S166C) que contiene aproximadamente 25 mg de enzima se congeló y se agregó a 1.25 ml de Amortiguador de Modificación (ver abajo) en un tubo de prueba de polipropileno. A esta solución se agregó 100 µl de una solución de reactivo MTS 0.2 M. La mezcla se selló, se agitó y se colocó en un rotor de extremo a extremo a temperatura ambiente. Cuando se completó la modificación (determinada por un ensayo de actividad específica, utilizando succinil-AlaAlaProPhe-p-nitroanilida [e4i0 = 8800 M"1 cm"1] (Bonneau et al . , (1991) J. Am. Chem . Soc . 119:1026-1030) como substrato en amortiguador Tris-HCl 0.1 M que contiene 0.05% de Tween 80, 1% de DMSO, pH 8.6 que muestra actividad constante y titulación con el reactivo de Ellman (Ellman et al . , (1961) Biochem . Pharmacol . 7:88-95) ( eil2 = 13600 M"1 cm"1) que muestra que no se encuentra presente tiol libre en la solución) , se agrega un adicional de 50 µl de una solución del reactivo de modificación y la mezcla se regresa al rotor de extremo a extremo durante 10 minutos adicionales. La reacción se vació en una columna Sephadex® PD10 pre-empaquetada, pre-equilibrada y se eluyó con 3.5 ml de Amortiguador de Templado (ver abajo) . El eluente se dializó a 4°C contra MES 10 mM, CaCl2 1 mM pH 5.8 (2_1L, 2_45min) . El dializado resultante se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -18°C.

Amortiguador de: pH 9.5: 140 mM CHES, 2 mM CaCl2 Modificación pH 7.5: 140 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 5.5: 140 mM MES, 2 mM CaCl2 Amortiguador de: Reacciones a pH 7.5-9.5: 5 mM MES 1 mM CaCl2 Templado pH 6.5 Reacciones a pH 5.5: 5 mM MES 1 mM CaCl2 pH 5.5 El contenido de tiol libre de todas las CMMs, se determinó espectrofotométricamente mediante titulación con el reactivo de Ellman en amortiguador de fosfato 0.25 M, pH 8.0. En todos los casos no se detectó tiol libre. Las enzimas modificadas se analizaron mediante geles de gradiente no desnaturalizado (8-25%) a pH 4.2, corriendo hacia el cátodo, en el sistema Pharmacia Phast y apareció como una sola banda. Antes del análisis ES-MS las CMMs se purificaron mediante FPLC (BioRad, Biologic System) en una matriz Source 15 RPC (17-0727-20 de Pharmacia) con 5% de acetonitrilo, 0.01% de TFA como el amortiguador de funcionamiento y se eluyó con 80% de acetonitrilo, 0.01% TFA en un gradiente de una etapa. Procedimiento general para la modificación de los mutantes de SBL almacenados como polvos liof ilizados : Este procedimiento solo se utiliza con S156C, que se almacena como un polvo liofilizado para evitar la dimerización. En un tubo de prueba de polipropileno se pesaron aproximadamente 25-30 mg del S156C liofilizado. Esto se disolvió en el siguiente amortiguador de modificación (2.5 ml) : pH 9.5: 70 mM CHES, 2 mM CaCl2 pH 7.5: 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2 pH 5.5: 70 mM MES, 2 mM CaCl2 Se agregó el reactivo MTS y la reacción se procedió entonces como para las soluciones mutantes rápidamente congeladas, utilizando el amortiguador de templado apropiado. Método General para el Análisis de Cinéticas de Amidas de los Conjugados SBL Se midieron las constantes Michaelis-Menten a 25(±0.2)°C mediante el ajuste de la curva (GraFit®3.03) de los datos de tasa inicial determinados a nueve concentraciones (0.25 mM-3.0 mM) de substrato succinil-AAPF-pNA en amortiguador Tris-HCl 0.1 M que contiene 0.005% de Tween 80, 1% de DMSO, pH 8.6 (e4?0 = 8800 M"1 cm"1) (Bonneau et al . , (1991) J.A . Chem . Soc . 119 : 1026-1030). Método General para el Análisis de las Cinéticas de Estearasa de los Conjugados de SBL Se midieron las constantes específicas determinadas utilizando la aproximación del substrato bajo utilizando indirectamente el reactivo de Ellman (e4i2 = 13600 M"1 cm"1) utilizando 15 o 30 µM de succinil-AAPF-SBn como el substrato en Tris-HCl 0.1 M que contenía 0.005 vol% de Tween-80, 1 vol% 37.5 mM del reactivo de Ellman en DMSO, pH 8.6. Se midieron las constantes Michaelis-Menten a 25 °C mediante el ajuste de la curva (GraFit®3.03) de los datos de tasa inicial determinados a ocho concentraciones (31.25 µM-2.0 mM) de substrato succinil-AAPF-SBn seguido indirectamente utilizando el reactivo de Ellman en Tris-HCl 0.1 M que contenía 0.005 vol% de Tween-80, 1 vol% 37.5 mM del reactivo de Ellman en DMSO pH 8.6. Ejemplo 2 Ensayo Objetivo de HLADH Inicial: Ensayando la Dirección de HLADH mediante pirazol-CMMs supraestequiómetricas y después la Degradación Dirigir pirazol-CMMs a HLADH será evidente para la reducción en la actividad debido a la inhibición por las porciones de pirazol de CMM. En consecuencia, se investigó la actividad catalítica de HLADH en ausencia y presencia de pirazol-CMMs.

Los controles se llevaron a cabo con SBL-WT. La cantidad de CMM y WT utilizados se calculó para igualar las cantidades de enzima activa como se determinó por titulación PMSF. Se utilizaron ciclohexanos como el substrato de HLADH y NAD+ como cofactor. La figura 4 muestra los resultados de este "Ensayo de Objetivo". Como se esperaba, SBL-WT no influenció la actividad de HLADH significativamente, considerando que todas las pirazol-CMMs inhibieron HLADH. La inhibición más eficiente se ocasionó por S156C-S-Pirazol, la única CMM con cadena lateral de superficie expuesta. N62C-S-Pirazol y L217C-S-Pirazol demostraron energía de inhibición muy similar. Sorpresivamente, S166C-S-Pirazol inhibió HLADH bastante fuerte, aún cuando su cadena lateral modificada se enterró en la cavidad Si. Esto puede razonarse en términos de la porción de pirazol que adopta una conformación donde se dobla fuera de la cavidad de enlace. Estos resultados demuestran claramente la capacidad de nuestras enzimas modificadas para dirigir otras enzimas a través de un inhibidor. La asociación dirigida de CMMs con HLADH a través del inhibidor de pirazol conduce a la hidrólisis selectiva. Si toma lugar la hidrólisis de HLADH, la actividad de la oxidoreductasa de la HLADH debe disminuirse o erradicarse después de cierto tiempo de incubación con nuestras CMMs. Para demostrar esto, el "Ensayo de Objetivo" como se describió anteriormente se lleva a cabo de nuevo después de 4 horas de incubación. La actividad de la HLADH restante se determinó por la adición de ciciohexanol como substrato. Los resultados se muestran en la Figura 5. Ensayo Experimental para HLADH de Objetivo Se llenaron seis cubetas como se muestra Tabla 3.

Tabla 3 Establecimiento para el ensayo dirigido al objetivo HLADH. Cubeta Amortiguador3/ Ciclohexano NAD+c/µl HLADH Inhibidor-Enzimae/µl No. µl /µl d/µl 1 2535 300 150 15 100 de SBL-WTf (1.072 2 2435 300 150 15 mg/ml,64% 100 de S156C-S- 3 2435 300 150 15 Pirazol(0.686 mg/ml) 39.0 de S166C-S-Pirazol 4 2496 300 150 15 (1.76 mg/ml) 27.2 de N62C-S-Pirazol 2508 300 150 15 (2.52 mg/ml) 52.0 de L217C-S-Pirazol 6 2483 300 150 15 (1.32 mg/ml) a Amortiguador de ensayo: Glicina-NaOH 0.1 M, pH 9.0 b Solución (10 mg/ml) .en amortiguador de ensayo c Solución (32.2 mg/ml) en amortiguador de ensayo. d Solución (10 mg/ml, actividad del 52.4%) en amortiguador TRIS-HC1 (TRIS 0.05M, pH 7.4). e las cantidades se calculan para concentraciones iguales de enzima activa (como se determinó por cinéticas de la tasa inicial con succ-AAPFpNA) . f Enzima liofilizada disuelta en amortiguador MES, (MES 10 mM, CaCl2 1 mM, pH 5.8) Antes de la adición de HLADH la cubeta se equilibro en el espectrofotómetro durante dos minutos. Se agrego HLADH y se midió A340 cada 20 segundos durante un periodo de 300 segundos. Las mediciones se llevaron a cabo por duplicado.

Los resultados se muestran en la Tabla 4. Tabla 4. Resultados del ensayo dirigido al objetivo HLADH Tiempo [s] control SBL-WT S156CMM S166CMM N62CMM L217CMM 0.058 0.053 0.050 0.046 0.055 0.050 0.150 0.145 0.121 0.122 0.145 0.138 50 0.239 0.234 0.185 0.191 0.230 0.221 70 0.326 0.320 0.242 0.254 0.311 0.300 90 0.409 0.403 0.294 0.314 0.389 0.377 110 0.489 0.483 0.343 0.370 0.463 0.450 130 0.567 0.561 0.388 0.423 0.535 0.520 150 0.642 0.636 0.431 0.474 0.604 0.588 170 0.716 0.709 0.472 0.522 0.671 0.654 190 0.787 0.780 0.511 0.569 0.736 0.717 210 0.856 0.849 0.547 0.614 0.799 0.779 230 0.924 0.916 0.583 0.658 0.860 0.839 250 0.990 0.982 0.617 0.700 0.919 0.898 270 1.054 1.046 0.650 0.741 0.977 0.955 290 1.117 1.108 0.681 0.781 1.034 1.011 310 1.178 1.169 0.712 0.821 1.089 1.065 Experimental para el ensayo objetivo de HLADH Se llenaron seis viales eppendorf como se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5. Establecimiento para el ensayo dirigido al objetivo de HLADH. Número Amortigua NAD+b HLADH Simuladad Inhibidor-Enzimae/µl de Viale dora/µl /µl µl 1 535 150 15 2 435 150 15 100 4 335 150 15 100 100deSBLrWl l- 72mg?,64%) 5 435 150 15 100 de S 156C-S-Pirazol(0.686 mg/ml) 6 335 150 15 100 100 de S156C-S-Pirazol(0.686 mg/ml) 7 496 150 15 39.0 de S166C-S-Pirazol(l .76 mg/ml) 8 396 150 15 100 39.0 de S166C-S-Pirazol(1.76 mg/ml) 9 508 150 15 27.2 de N62C-S-Pirazol(2.52 mg/ml) 408 150 15 100 27.2 de N62C-S-Pirazol(2.52 mg/ml) 11 483 150 15 52.0 de L217C-S-Pirazol(l .32 mg/ml) 12 383 150 15 100 52.0 de L217C-S-Pirazol(1.32 mg/ml) a Amortiguador de ensayo: Glicina-NaOH 0.1 mM, pH 9.0 b Solución (33.2 mg/ml) en amortiguador de ensayo c Solución (10 mg/ml) en amortiguador TRIS-HC1 (TRIS 0.05 M, pH 7.4). d 0.05 mg/ml solución de Ribonucleasa A con Enlaces de Disulfuro Mezclados (Sigma) en agua Milli-Q e Las cantidades se calculan para concentraciones iguales de enzima activa (como se determinó por titulación de PMSF) . f Enzima liofilizada disuelta en amortiguador MES, (MES 10 mM, CaCl2 1 mM, pH 5.8) Estas soluciones se incubaron a 35°C en un baño de agua controlado por termostato durante 4 horas. Se mezclaron 650 µl en cada vial eppendorf con 2 ml del amortiguador de Ensayo en una cubeta. Después de dos minutos de equilibrio en el espectrofotómetro y autoajuste se agregó ciciohexano (300 µl) y se midió A340 cada 20 segundos durante un periodo de 300 segundos. Las mediciones se llevaron a cabo por duplicado y se muestran en la Tabla 6. a Promedio de las mediciones de control sin y con la proteína simulada b sin la proteína simulada c Con la proteína simulada Ejemplo 3 Dirigir y destruir HLADH en la Presencia de Fosfatasa Alcalina Con el fin de dirigir las subtilisinas (e.g. SBL) hacia varios objetivos de enzima para su degradación, decidimos unir los inhibidores específicos para aquellas enzimas a la subtilisina mediante nuestra modificación química de mutagénesis dirigida al sitio combinada (CMM) propuesta como se ilustra en la Figura 3. Nuestro objetivo preliminar ha sido HLADH que se inhibe mediante los pirazoles. También se exploró la capacidad de las pirazol-CMMs para destruir selectivamente HLADH en la presencia, y en la ausencia, de la proteína simulada, confunde la RNasa A (ver los ejemplos de abajo. Estos ejemplos describen los experimentos adicionales en la presencia de una enzima activa, fosfatasa - alcalina (AP) como una proteína simulada potencial. Esto imita la situación in vivo donde varias enzimas se encuentran presentes en la célula, y a donde dirigimos la destrucción de una enzima (HLADH) aunque dejamos las otras (e.g. AP) no infectadas. Los experimentos de digestión se realizaron utilizando S166C-pirazol como una CMM representativa. Las concentraciones de especiales en las mezclas de digestión (cuando se presentaron) fueron: HLADH 2.62µM(1.0 igual a los sitios activos*) AP 2.74µM(1.05 igual a los sitios activos*) S166C-pirazol 3.40µM(1.3 igual a los sitios activo) Se observa que HLADH y AP ambos son dímeros . MWs : HLADH: 39492 Da/subunidad AP: 57099 Da/subunidad] . La actividad de HLADH se monitoreo mediante la extracción periódica de una porción de la mezcla de digestión, y se valoró la capacidad de la alícuota para oxidizar el ciciohexanol a ciclohexanona. El curso de la reacción se monitoreo al observar el cambio de NAD+ a NADH en 340nm a medida que el ciciohexanol se oxidizó. La actividad de la fosfatasa alcalina (AP) se monitoreo al extraer periódicamente una porción de la mezcla de digestión, y valorar la capacidad de la alícuota para hidrolizar p-nitrofenil fosfato a fosfato inorgánico y p-nitrofenolato. El curso de reacción se monitoreo al observar la apariencia de p-nitrofenolato en 405nm. Resultados Se prepararon seis viales que contenían S166C- pirazol, Ap y/o HLADH. Las actividades de HLADH (Tabla 7) y AP (Tabla 8) de cada vial (cuando fue aplicable) se valoraron periódicamente (ver el experimental) .

Tabla 7. Actividad de HLADH después de la incubación con relación a la actividad inicial * La actividad de HLADH se valoró al monitorear la conversión de NAD+ a NADH en 340 nm a medida que se oxidizó el ciciohexanol (ver experimental). Incubación a 35°C.

Tabla 8. Actividad de la fosfatasa alcalina después de la incubación con relación al valor inicial * La actividad de AP se valoró al monitorear p-nitrofenolato liberado de p-nitrofenil fosfato en 405 nm (ver experimental) . Incubación a 35°C. Los experimentos # AP y AP + S166C-pirazol no se realizaron en los puntos de tiempo 3 h y 72 h. Los datos también se representan gráficamente en la Figura 6, Figura 7, Figura 8 y Figura 9. Los datos (Tabla 7) , Figura 6 y Figura 8 muestran que la actividad de HLADH permanece constante cuando se valora sola o en la presencia de AP. También, la actividad de AP no se afecta básicamente en la presencia de S166C. pirazol CMM (como se predijo; Tabla 2, Figura 3 y Figura 5) . Pero la actividad de HLADH en la presencia se S166C-pirazol CMM se pierde rápida y totalmente (Tabla 1 - - Figura 2 y Figura 4) . Además, AP y HLADH no interfieren con otras actividades o funciones catalítica (Tabla 7, Tabla 8, Figura 6, Figura 7, Figura 8 y Figura 9) . Detalles experimentales. Materiales/ Amortiguador de glicina-NaOH 0.1 M pH 9.0 con Mg2+lmM y Zn2+ 0. l M (amortiguador de ensayo pH 9.0) ; Se disolvió glicina (0.1 mol) en agua ( ca . 800 ml) , y se agregó MgCl2 lml de una solución 1M en agua MQ) y ZnCl2 (lml de una solución 0.1 M en agua MQ) . El pH se ajustó a 9.0 con una solución de NaOH ca . 5 M, y la mezcla se llenó a 1 litro. Amortiguador TRIS-HC1 0.05 M pH 7.4 (pH 7.4 TRIS): Se neutralizó una solución de TRIS a pH 7.4, y se diluyó entonces a 0.05 M Amortiguador Trietanolamina-HCl 0.05 M pH 7.8 con NaCl 3 M, Mg+ 0.1 mM y Zn2+ 0.01 mM (amortiguador pH 7.8) : Se disolvió Trietanolamina (0.05 moles, 7.5 g ), NaCl (3 moles, 175.5 g) , MgCl2 (0.1 ml de una solución 1 M) y ZnCl2 (0.1 ml de una solución 1 M) en agua MQ ( ca . 900 ml) . El pH se ajustó a 7.4 con HCl ca. 2N y la solución resultante se llenó a 1 litro.

Amortiguador TRIS-HCl ca.0.1 M pH 8.6 con Tween 0.05%, Mg2* lmM y Zn2* 0. lmM (Amortiguador pH 8.6); Se agregó MgCl2 (0.1 ml de una solución 1 M en agua MQ) y ZnCl (0.1 ml de una solución 0.1 M en agua MQ) a un matraz volumétrico de 100 ml y el matraz se llenó hasta la marca con amortiguador TRIS-HC1 0.1 M pH 8.6 que contenía 0.05% de Tween. Solución HLADH; Se disolvió alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (Sigma) A-9589, ECl.1.1.1.1, 8mg de ca. 50% peso/peso de proteína) en TRIS (0.8ML) pH 7.4 para dar una solución de 10 mg/ml. Solución de fosfatasa alcalina (AP) : Se diluyó fosfatasa alcalina (Boehringer Mannhein 713 023, EC 3.1.3.1., ca . 950µl según se recibió en glicerol 50% peso/vol.: amortiguador) con amortiguador pH 7.8 ( ca . 15 ml) y se concentró a 4°C a 10-20% de su volumen original utilizando un concentrador Centripep. Se agregó un adicional de 15 ml de amortiguador de pH 7.8, y la muestra se concentró una vez más . Este proceso se repitió tres veces más utilizando amortiguador de ensayo de pH 9.0. Después de la tercera concentración el concentrado se recolecto ( ca . 1.85 ml) y se almacenó en hielo. Este procedimiento fue necesario para retirar el glicerol, que es un substrato para HLADH.

Solución NAD* Se disolvieron 33.2 mg/ml de NAD+ en amortiguador de ensayo de pH 9.0. Solución de ciciohexanol : 10 mg/ml de ciciohexanol en amortiguador de ensayo de pH 9.0. Solución de p-Nitrofenil fosfato (solución PNP) : Se disolvió una tableta que contenía 20 mg de p-nitrofenil fosfato (Sigma N-2765) en amortiguador (20 ml) de pH 8.6) . Pirazol-CMM: sl66C-pirazol (1.76 mg/ml) en amortiguador de almacenaje MES (MES 10 mM pH 5.8,CaCl2 2mM) . Valorando la actividad de HLADH Se llenaron seis viales eppendorf como se muestra en la Tabla 9: Tabla 9. Establecimiento para el ensayo de actividad de HLADH. vial Nivel de Contenidos Amortiguador NAD+/µl HLADL/µl AP/µl pirazol- de ensayo/µl CMM/µl 1 AP + HLADL no CMM 100 150 15 435 0.0 2 AP + HLADH + CMM 61 150 15 435 39.0 3 AP sola 26.5 0 0 43.5 0.0 4 HLADH sola 535 150 15 0 0.0 - HLADH + CMM 496 150 15 0 39.0 6 AP + CMM 22.6 0 0 43.5 39.0 CMM fue S166C-pirazol Los viales se incubaron a 35°C durante los tiempos indicados en las tablas de abajo. La alícuotas se extrajeron periódicamente con el fin de ensayar las actividades de la HLADH y la fosfatasa alcalina a medida que progresó el tiempo. Se extrajo una porción de la solución (65µl) a partir de un vial de incubación y se inyectó entonces en una micro-cubeta que contenía amortiguador de ensayo de pH 9.0 (200µl) . La cubeta se incubó a 25°C durante dos minutos, y entonces se agregó la solución de ciciohexanol (30µl) . Se monitoreo entonces la absorbencia en 340 nm durante 300 segundos, y se registro el cambio O.D. por segundo hasta 0.2 unidades de absorbencia. Valorando la actividad de fosfatasa alcalina; Se extrajo una porción (20µl) de un vial de incubación y se inyectó entonces en un amortiguador de pH 8.6 (980 µl) . La mezcla se agitó. Se retiraron 10 µl de la mezcla, y se inyectó en una cubeta que contenía 990 µl de solución de PNP incubada a 25°C. Se monitoreo el cambio de absorbencia en 405 nm durante 150 segundos, y se registró el cambio O.D. por segundo hasta 1 unidad de absorbencia.

Ej emplo 4 Dirigiendo HLADH con Pirazol-CMMs subestequiométrica Estequiometría Se realizaron experimentos utilizando 2 dímeros de HLADH eq . (4 sitios activos eq . ) para un pirazol -CMM eq . o WT-SBL como se ilustra en la Tabla 10 .

Tabla 10 . Estequiometría HLADH (ca. 79 kD para el dímero SBL o pirazol-CMM (ca. 27 kD) 2 dímeros eq. (4 sitios activos eq.) 1 eq. (SBL/CMM es un monómero) dímero de 1.42 µM (sitios activos de 2.84 µM) 0.71 µM (SBL/CMM es un monómero) Condiciones: La reacciones se realizaron a pH 9.0, glicina-NaOH 0.1 M con 0.005% de Tween 80, 35°C. Resultados: Las soluciones de HLADH se incubaron en la presencia de WT-SBL, S166C-pirazol o S156C-pirazol . Se realizó un experimento control en ausencia de cualquier enzima basada en SBL (HLADH sola) . Las actividades de HLADH de las cuatro mezclas se valoraron periódicamente (ver experimental)- ver Tabla 11.

Tabla 11. Actividades de HLADH después de la incubación con o sin pirazol-CMMs. % de actividad de HLADH comparada al valor inicial de "HLADH sola"* tiempo/h HLADH sola HLADH + WT HLADH +S166C- HLADH+S156C- SBL pirazol pirazol 0 100 97 89 67 1 99 89 65 21 3 98 82 49 12 20 93 70 17 5 * Se ensayó la actividad de HLADH al monitorear la conversión de NAD+ a NADH en 340 nm según se oxidi zó el ciciohexano a 25 °C , pH 9 . 0 (ver experimental ) .

Discusión : La caída inicial en la actividad de HLADH causada en la adición de la pirazol-CMMs refleja la capacidad de la CMMs al objetivo e inhibe así la HLADH. S156C-pirazol y hasta un grado menor, S166C-pirazol claramente causa reducciones dramáticas en la actividad o incubación de HLADH. La pirazol-CMMs se utilizó en menos de las cantidades estequiométricas con respecto a la HLADH —4 sitios activos de HLADH eq. : 1 pirazol— CMM eq. pero causaron rápidamente una disminución mayor de 25% de la actividad de HLADH. En realidad, en el caso de S156C-pirazol , la actividad de HLADH se observa que cae de 67% A 5% durante 20 horas representando una reducción de 13.5 veces la actividad de HLADH sobre y por arriba del máximo efecto inhibidor de la porción de pirazol .

WT-SBL causa una reducción de solo 1.4 veces de la actividad de HLADH, durante el mismo periodo de 20 horas, a pesar de su actividad específica de amidasa mejorada cuando se compara a pirazol-CMMs . Sumario Pirazol-CMMs se observa hacia el objetivo y hacia destruir catalíticamente HLADH. Materiales Experimentales : Amoriguador Glicina- NaOH 0.1 M pH 9.0 con 0.005% de Tween 80 (amortiguador de ensayo pH 9.0): Se disolvió glicina (0.1 mol) en agua (ca. 800 ml) , Se agregó una solución de Tween 80 (50 ml de un 1% de v/v en agua MQ) , y el pH se ajustó a 9.0 con solución de NaOH ca. 5M. La mezcla se llegó hasta 1 litro con agua MQ. Amortiguador TRIS-HC1 0.05 M pH (TRIS pH 7.4): Se disolvió TRIS (302.9 mg 2.5 m mol) en agua MQ (ca. 40 ml) . El pH se ajustó a 7.4 con solución de HCl ca . 1 M, y el volumen de la mezcla se llenó hasta 50 ml con agua MQ. Solución de HLADH: Se disolvió alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (Sigma) A-9589, Lot58H7004, EC1.1.1.1. , 8.45 mg de proteína al 52.4% peso/peso —de acuerdo a la titulación de Biuret del fabricante) en TRIS (0.845 ml) pH 7.4 para dar una solución de 5.24 mg/ml de proteína activa. Verificación de la concentración de la HLADH: Se agregó una solución de HLADH (50µl) a TRIS (450 µl) pH 7.4 para dar una solución 10 veces diluida. La determinación de proteína Bradford (Bio-Rad) se realizó en esta muestra diluida, y produjo una concentración de proteína de 0.616 mg/ml. Esto se traduce a una concentración de 6.16 mg/ml en el provisión original de HLADH. Suponemos que el valor más bajo de 5.24 mg/ml es el correcto a fin de asegurar que la concentración de proteína se encuentre más probablemente baja- en lugar de sobreestimada. Solución de NAD*: Se disolvió NAD+ (332 mg) en amortiguador de ensayo (10 ml) de pH 9.0 para dar una solución de 33.2 mg/ml. Solución de ciciohexanol: Se disolvió ciciohexanol (100 mg) en amortiguador de ensayo (10 ml) de pH 9.0 para dar una solución de 10 mg/ml . Soluciones subtilisina: Se disolvió WT-SBL (1.88mg de polvo seco, 73% de proteína activa peso/peso) en MES 10 mM, pH 5.8, CaCl2 2mM "amortiguador de almacenaje" (500 µl) para dar una solución de 2.74 mg/ml de WT-SBL activo. Se titularon previamente S156C-pirazol y S166C-pirazol con PMSF: sus concentraciones fueron 2.5 mg/ml y 3.62 mg/ml respectivamente. Detalles experimentales : Ensayo de hidrólisis de HLADH: Se llenaron cuatro tubos Falcon de 5 ml de acuerdo a la Tabla 12 Tabla 12. Preparación de mezclas de reacción Tubo No. Amortiguador de NAD+ soluciónb HLADH solución0 SBL/CMMd ensayo" (µl) pH 9.0 (µl) (µl) 1 2140 600 60 no agregado 2 2120 600 60 WT-SBL 19.52 µl 3 2125 600 60 S166C-pirazol 14.80 µl 4 2119 600 60 S156C-pirazol 21.4 µl a Glicina-NaOH 0.1 M con Tween 80 al 0.005% b 33.2 mg/ml en amortiguador de ensayo pH 9.0 c HLADH activo 5.24 mg/ml d Concentraciones: WT-SBL, 2.74 mg/ml; S166C-pirazol , 3.62 mg/ml; S156C-pirazol , 2.5 mg/ml.

Los tubos se mantuvieron en hielo hasta que la actividad de HLADH de cada tubo se había valorado con el fin de dar un valor de "tiempo cero" para cada tubo (ver abajo el protocolo de ensayo) . Los tubos se incubaron entonces en un baño de agua a 35°C. Periódicamente se extrajeron 700µl de la mezcla de reacción de cada tubo falcon, las alícuotas se colocaron en tubos eppendorf individuales, y los tubos eppendorf se almacenaron en hielo. El contenido de cada tubo eppendorf se valoró entonces para la actividad de HLADH (ver a continuación) . Valoración de la actividad de HLADH: Se inyectó una porción de la mezcla de reacción (650µl) en una cubeta que contenía amortiguador de ensayo (2.00 ml) de pH 9.0. La cubeta se incubó a 25°C durante 2 minutos y después se agregó solución de ciciohexanol (300 µl) . Después de un retraso de 10 segundos, se monitoreo la absorbencia en 340 nm durante 300 segundos. Se utilizó el cambio o punto de punto por segundo hasta 0.2 unidades de absorbencia para calcular una tasa inicial . Resultados. Los resultados se resumen en la Tabla 13 Tabla 13. Actividades de HLADH durante el experimento de hidrólisis de HLADH (datos de origen) . (inclinación a 340 nm en unidades de unidades O.D. por segundo) x 1000* Tiempo de HLADH sola HLADH + WT- HLADH +S166C- HLADH+S156C Incubación/h. (tubo 1) SBL (tubo 2) pirazol (tubo 3) -pirazol (tubo 4) 0 5.14 4.99 4.56 3.43 1 5.07 4.56 3.36 1.05 3 5.05 4.22 2.53 0.61 4.76 3.58 088 0.26 *E1 cambio de O.D. hasta 0.2 unidades de absorbencia se utilizó para calcular estos números Ej emplo 5 HLADH objetivo en la presencia de la fosfatasa alcalina utilizando S156C- y S166C-Pirazol-CMMs en niveles subestequiométricos de CMMs Estequiometría Se realizaron experimentos utilizando 2 dímeros de HLADH eq. (4 sitios activos eq.) para 1 pirazol-CMM o WT-SBL eq.; se utilizó fosfatasa alcalina de intestino de becerro como una proteína simulada "enzima activa" en todos los experimentos. La fosfatasa alcalina de intestino de becerro esta compuesta de dos isozimas de pesos moleculares 66 y 68 kD por subunidad. Ambas isozimas son dímeros, así suponemos un peso molecular aproximado de 134 kD para cada dímero en nuestros cálculos. Las estequiometrías utilizadas se muestran en la Tabla 14. Tabla 14. Estequiometrías utilizadas en el ensayo de objetivo HLADH HLADH (ca. 79 kD para el Fosfatasa Alcalina (AP) (ca. WT-SBL o Pirazol-CMM dímero) 134 kD para cada dímero) (ca. 27 kD) 2 dímeros eq. (4 sitios 2 dímeros eq. (4 sitios 1 eq. (SBL/CMM es un activos eq.) activos eq.) monómero) dímero de 1.42 µM (sitios dímero de 1.42 µM (sitios 0.71 µM (SBL/CMM es un activos de 2.84 µM) activos de 2.84 µM) monómero) Condiciones pH 9.0, glicina-NaOH 0.1 M con 0.005% de Tween 80, MgCl2 lmM y Zn Cl2 O.lmM, 35°C. Se realizaron simultáneamente cuatro experimentos: los cuatro experimentos se realizaron con HLADH y AP presentes en cada uno de los cuatro viales (i.e. se encuentran en competencia directa como substratos para la hidrólisis). Además, cada vial contiene uno de: amortiguador (sin SBL agregado), WT-SBL, S156C-pirazol o S166C-pirazol . Resultados : Los viales que contenían cada uno una mezcla de HLADH y fosfatasa alcalina se incubaron en presencia de ) , WT-SBL, S156C-pirazol o S166C-pirazol . Se realizó un experimento de control en ausencia de cualquier enzima basada el SBL (sin SBL) . Se valoraron periódicamente las actividades de HLADH y fosfatasa alcalina de las cuatro mezclas, a fin de determinar la fidelidad de las CMS hacia HLADH vs . fosfatasa alcalina (ver experimental) —ver Tabla 15, Tabla 16, Figura 11 y Figura 12. (Los datos también se presentaron con relación a los valores "sin SBL agregada" tiempo=0h en el apéndice para demostrar los efectos inhibitorios de pirazol CMMs en HLADH) Tabla 15. Actividades de HLADH después de la incubación con o sin pirazol-CMMs. % de actividad de HLADH* comparado al valor detianpCF€hparai ;ada experimento derivado de SBL (si se agrega) Tiempo/h. sin SBL WT-SBL S166C-pirazol S156C-pirazol 100 100 100 100 1 109 103 45 93 3 112 99 33 46 19.5 95 79 2 41 * La actividad de HLADH se valoró al monitorear la conversión de NAD+ a NADH a 340 nm según se oxidizó el ciciohexano a 25°C, pH 9.0 (ver experimental) Tabla 16. Actividades de AP después de la incubación con o sin pirazol-CMMs. % de actividad de fosfatasa alcalina* comparado al valor de tiempo=0 h para cada experimento derivado de SBL (si se agrega) Tiempo/h. sin SBL WT-SBL S156C-pirazol S166C-pirazol 0 100 100 100 100 1 98 100 93 104 3 94 97 96 99 19.5 88 91 85 90 * La actividad de la fosfatasa alcalina se valoró al monitorear la liberación de p-nitrofenolato de p-nitrofenil fosfatasa a 45 nm (ver experimental) Discusión. La fosfatasa alcalina claramente no es muy susceptible a la hidrólisis por WT-SBL o Pirazol-CMMs. La actividad de HLADH no disminuyó significativamente en la incubación en ausencia de SBL o en la presencia de WT-SBL. Sin embargo, en la presencia de S156C-pirazol o S166C-pirazol la actividad de HLADH se observa que disminuye rápidamente. Sumario . Pirazol-CMMs se ve hacia el objetivo y destruye catalíticamente HLADH en la presencia de fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina no se afecta por la acción hidrolítica de WT-SBL y pirazol-CMMs. Experimento . Materiales Amortiguador de glicina -NaOH 0 .1 M , pH 9 .0 con 0.005% de Tween 80, Mg2* 1 mM y Zn2* 0. lmM (Amortiguador • de ensayo pH 9 .0 con Tween, Mg2 l+ Y Zn^*) : Se disolvió glicina (0.1 mol) en agua (ca. 800 ml) . Se agregó solución de cloruro de magnesio (1 ml de una solución 1 M) y solución de cloruro de zinc (1 ml de una solución 0.1 M) a la solución de glicina. Se agregó una solución de Tween 80 (50 ml de 0.1% v/v en agua MQ) a la mezcla, y se ajustó el pH a 9.0 con solución de NaOH ca. 5 M. La mezcla se llenó hasta 1 litro con agua MQ.

Amortiguador de glicina-NaOH 0.1 M, pH 9.0 con Mg2* 1 mM y Zn2* 0. lmM (Amortiguador de diálisis pH 9.0): Se disolvió glicina (0.1 mol) en agua (ca. 800 ml) . Se agregó solución de cloruro de magnesio (1 ml de una solución 1 M) y solución de cloruro de zinc (1 ml de una solución 0.1 M) a la solución de glicina, y se ajustó el pH de la mezcla a 9.0 con solución de NaOH ca. 5 M. La mezcla se llenó hasta 1 litro con agua MQ. Amortiguador de TRIS-HCl 0.05 M, pH 7.4 (TRIS pH 7.4) Se disolvió TRIS (302.9 mg, 2.5 mmol) en agua MQ (ca. 40 ml) . Se ajustó el pH a 7.4 con solución de HCl ca. 1 M y el volumen de la mezcla se llenó hasta 50 ml con agua MQ. Amortiguador de TRIS-HC1 0.05 M, pH 7.4 con Mg2* lmM y Zn2* 0. lmM (amortiguador de diálisis pH 7.4) Se disolvió TRIS (6.057 g, 0.05 mol) en agua MQ (ca. 800 ml) . Se agregó solución de cloruro de magnesio (1 ml de una solución 1 M) y solución de cloruro de zinc (1 ml de una solución 0.1 M) a la solución de TRIS y el pH de la mezcla se ajustó a 7.4 con solución de HCl ca. 1 M . La mezcla se llenó hasta 1 litro con agua MQ. Amortiguador de TRIS-HC1 ca. 0.01 M, pH 8.6 con 0.05% de Tween, Mg2* lmM y Zn2* 0. lmM (amortiguador pH 8.6) Se agregó MgCl2 (0.1 ml de una solución 1 M en agua MQ) y ZnCl2 (0.1 ml de una solución 0.1 M en agua MQ) a un matraz volumétrico de 100 ml , y el matraz se llenó hasta la marca con amortiguador de TRIS-HC1 0.1 M de pH 8.6 que contenía 0.05% de Tween (amortiguador de cinéticas amidasa estándar) . Solución de HLADH Se disolvió alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (Sigma) A-9589, Lot58H7004, EC1.1.1.1. , 3.77 mg de proteína al 52.4% peso/peso —de acuerdo a la titulación de Biuret del fabricante) en TRIS (0.377 ml) pH 7.4 para dar una solución de 5.24 mg/ml de proteína activa. Solución de NAD* Se disolvió NAD* (39.15 mg) en amortiguador de ensayo (1.179 ml) de pH 9.0 para dar una solución de 33.2 mg/ml. Solución de ciciohexanol : Se disolvió cicohexanol (100 mg) en amortiguador de ensayo (10 ml) de pH 9.0 para dar una solución de 10 mg/ml. Soluciones subtilisina: Se disolvió WT-SBL (1.88mg de polvo seco, 73% de proteína activa peso/peso) en MES 10 mM, pH 5.8, CaCl2 2mM "amortiguador de almacenaje" (500 µl) para dar una solución de 2.74 mg/ml de WT-SBL activo. Esta solución se diluyó cuatro veces con MES 10 mM de pH 5.8, CaCl2 2 mM "amortiguador de almacenaje" para dar una solución de 0.685 mg/ml . Se titularon previamente S156C-pirazol y S166C-pirazol con PMSF: sus concentraciones fueron 2.5 mg/ml y 3.62 mg/ml respectivamente. Estas soluciones de provisión se diluyeron cuatro veces con MES 10 mM de pH 5.8, CaCl2 2 mM "amortiguador de almacenaje" para dar soluciones de 0.63 mg/ml y 0.91 mg/ml de S156C-pirazol y S166C-pirazol , respectivamente . Solución de p-Nitrofenil fosfato (PNP) Se disolvieron dos tabletas, conteniendo cada una mg de p-nitrofenil fosfato (Sigma N-2765) , en amortiguador (40 ml) de pH 8.6. La solución se almacenó en hielo. Diálisis de fosfatasa alcalina Se mezclaron dos viales de fosfatasa alcalina de intestino de becerro (Sigma P-7923, Lotes 128H1210 y 17H0204) con amortiguador de diálisis (0.5 ml) de pH 7.4. La mezcla se dializó contra amortiguador de diálisis 2 x 500 ml pH 7.4 (1 x 4 h después 1 durante la noche) y después amortiguador de diálisis 2 x 500 ml pH 9.0 (2 x 2 h) . La concentración de proteína total se determinó entonces utilizando la técnica de Bradford (Bio-Rad) y se encontró ser de 2.36 mg/ml Detalles experimentales Se llenaron cuatro tubos Eppendorf de 1.5 ml de acuerdo a la Tabla 22.

Tabla 17. Preparación de mezclas de reacción. No. de Amortiguador NAD* solución" HLADH AP solución" SBL/CMMe —si Tubo de ensayoa (µl) solución0 (µl) (µl) se agrega (µl) pH 9.0 1 479 150 15 56.4 Nada se agrega 2 459 150 15 56.4 WT-SBL 19.52µl 3 457 150 15 56.4 S156C-pirazol 21.4µl 4 464 150 15 56.4 S166C-pirazol 14.80µl a glicina-NaOH 0.1 M con 0.005% Tween 80, MgCl2 1 mM y ZnCl2. 0.1 mM b 33.2 mg/ml en amortiguador de ensayo de pH 9.0 con Tween, Mg2* y Zn 2+ c 5.24 mg/ml de HLADH activa d 2.36 mg/ml de fosfatasa alcalina (Bradford) e Concentraciones: WT-SBL, 0.685 mg/ml; S166C- pirazol, 0.91 mg/ml; S156C-pirazol, 0.63 mg/ml Los tubos se mantuvieron en hielo hasta que las alícuotas se habían extraído de cada para establecer las actividades iniciales de HLADH y fosfatasa alcalina. Estas actividades se utilizaron para dar los valores de "tiempo cero" para cada tubo (ver a continuación los protocolos de ensayo) . Los tubos se incubaron entonces en un baño de agua a 35 °C. Se extrajeron periódicamente alícuotas de la mezcla de reacción a partir de cada tubo eppendorf con objeto de valorar las actividades de HLADH y fosfatasa alcalina. Valoración de la actividad de HLADH Se extrajo una porción de la solución (65 µl) a partir de un vial de incubación y se inyectó entonces en una micro-cubeta que contenía amortiguador de ensayo (200 µl) de pH 9.0. La cubeta se incubó a 25°C durante 2 minutos, y se agregó la solución de ciciohexanol (30 ml) . Se monitoreo entonces la absorbencia en 340 nm durante 120 segundos, y se registró el cambio O.D. por segundo hasta 0.2 unidades de absorbencia. Valorando la actividad de fosfatasa alcalina: Se extrajo una porción (lOµl) de un vial de incubación y se inyectó entonces en un amortiguador de pH 8.6 (490 µl) . La mezcla se agitó. Se retiraron 10 µl de la mezcla, y se inyectó en una cubeta que contenía 990 µl de solución de PNP incubada a 25 °C. Se monitoreo el cambio de absorbencia en 405 nm durante 120 segundos, y se registró el cambio O.D. por segundo hasta 1.0 unidades de absorbencia. Resultados Los resultados se ilustran en la Tabla 18 y Tabla 19.

Tabla 18. Actividades de HLADH durante los experimentos de hidrólisis competitiva de HLADH/fostatasa alcalina (datos en bruto) (inclinación a 340 nm en unidades de O.D. unidades por segundo) x 1000* Tiempo de sin SBL WT-SBL S156C-pirazol S166C-pirazol incubación/h. 0 5.13 5.09 2.76 4.58 1 5.57 5.25 1.25 4.25 3 5.73 5.05 0.90 2.09 19.5 4.88 4.01 0.06 1.88 * El cambio de O.D. hasta de 0.2 unidades de absorbencia se uso para calcular estos números.

Tabla 19. Actividades de la fosfatasa alcalina durante los experimentos de hidrólisis competitivos de HLADH/fostatasa alcalina (datos en bruto) (inclinación a 405 nm en unidades de O.D. unidades por segundo) x 1000* Tiempo de sin SBL WT-SBL S156C-pirazol S166C-pirazol incubación/h. 0 8.04 7.78 8.05 7.48 1 7.85 7.79 7.52 7.77 3 7.56 7.52 7.76 7.41 19.5 7.11 7.09 6.83 6.77 * El cambio de O.D. hasta de 1.0 unidades de absorbencia se uso para calcular estos números. Ejemplo 5 Síntesis de hidrolasas de cerina modificadas por carbohidratos La contaminación de la alimentación animal por ciertas lectinas reduce substancialmente su valor nutricional (Gatel (1994) Animal Feed Sci . Tech . 145: 317-348;, Mogridge et.al. (1996) J". Animal Sci . 74: 1897-1904; Puszati et.al. (1997) G. Bri t . J. Nutri tion 77, 933-945) . En la contaminación particular de alimentos a base de soya por lectinas unidas a mañosa se evita el uso efectivo de alimentos crudos sin purificación substancial. Con la finalidad de preparar CMMs glicocilados útiles hemos preparado los 11 mono y disacáridos metanotiosulfonatos (Figura 13) , portando diferentes carbohidratos que permiten la preparación de un gran número CMMs glicocilados para utilizarse e . g. como proteasas dirigidas a lectina. Un número de enzimas modificadas químicamente teniendo porciones de carbohidratos químicamente conjugadas se describen en la Solicitud del PCT WO 00001712 titulada " Proteínas químicamente modificadas con una porción de carbohidrato" . Ejemplo 6 Ensayo de Degradación de Lectina Objetivada Utilizando SBL Manosilado Este ejemplo describe un ensayo de lectina altamente efectiva que nos ha permitido iniciar una selección de la capacidad de los CMMs modificados por azúcar para degradar la Concavalina A de lectina en la manera mostrada esquemáticamente a continuación (Figura 14A, Figura 14B y Figura 14C) . Los CMMs de azúcar S156C que contienen grupos de superficie de azúcar expuestos se seleccionaron inicialmente. Para cada ensayo, se incubó lectina biotinilada con glico-CMM y se comparó con las muestras incubadas con GG36-WT. Para permitir la comparación, se utilizaron cantidades iguales de enzima activa. Estas muestras también se incubaron tanto con y sin la RNasa A mezclado de disulfuro de la proteína falsa, a fin de medir la selectividad de estas enzimas para la lectina a través del señuelo. Los pequeños fragmentos de proteína (<3000 Da) , los productos de la proteolisis, se separaron de las proteínas grandes utilizando una membrana de exclusión de tamaño. Estos fragmento de lectina se etiquetaron con biotina considerando que los fragmentos sin lectina no son etiquetados. Al monitorear tanto los niveles de fragmentos biotinilados liberados, utilizando una prueba de HABA/Avidina y concentración total de fragmentos de proteína, utilizando A2ßo podemos cualitativamente juzgar tanto la cantidad de degradación de lectina como la selectividad para la lectina a través del señuelo. Los resultados de las selecciones iniciales se muestran en la Figura 15A y la Figura 15B, la Figura 15C y la Figura 15D. Es claro que ambas GG36-WT y las dos CMMs S156C-S- EtMan (Figura 15A y Figura 15B y S156C-EtMan (Ac) 4 (Figura 15C y Figura 15D son capaces de degradar rápidamente la concavalina A de lectina. La mayor tasa de hidrólisis por GG36-WT es consistente con su mayor valor kcat/ KM hacia Suc-AAPF-pNA (kcat/KM para GG36 de 209 S^mM"1, en comparación con 112 y 85 s"1 mM"1 para S156C-S-Et-Man y S156C-S-EtMan (Ac) 4 respectivamente) . Un examen mas detallado de la Figura 15A-Figura 15D revela que a) Los niveles de Biotina liberados (que indican la degradación de la lectina) son similares entre si. La presencia del señuelo reduce ligeramente tanto el nivel de degradación GG36-WT como de S156C-S-EtMan. b) GG36-WT en la presencia de señuelo produce 18% mas proteína total después de 210 minutos que sin el. En contraste, S166C-S-EtMan en la presencia del señuelo produce solo7% más de proteína total, por consiguiente la mayor selectividad de S156C-S-EtMan reduce los cambios de absorción de proteína total al 11%. c) De nuevo, los niveles de Biotina liberados (indicando la degradación de lectina) son similares entre sí. d) Ambos GG36-WT y S156C-S-EtManAc producen más proteína total después de 210 min. en la presencia del señuelo que sin el (bajo estas condiciones, 7% más para WT y 5% más para S156C-S-EtManAc) . Estos niveles similares indican poca o ninguna selectividad de S156C-S-EtManAc para la Concavalina A. Esta ligera pero estimulante creación de selectividad de S156C-S-EtMan es consistente con la introducción de un grupo de mañosa no protegido - ya que este es el ligando natural de concavalina A. La baja/falta de selectividad mostrada por el S156C-S-EtMan (Ac) 4 completamente protegido es consistente con la importancia de los grupos hidroxilo no protegidos de mañosa para el reconocimiento correcto mediante lectinas. Experimentos Diez viales eppendorf desechables se llenaron como se muestra en la Tabla 20.

Tabla 20 . Di seño de ensayo lectina . Número de Vial Amortigua Concanavalina Ab Proteína0 Enzima/µl dora /µl de /µl Ensayo de Señuelo/µl Lectina 1 900 100 - - 2 890 100 10 - 3 900 100 - lO de glico-CMM 4 900 100 - 10 de glico-CMM 890 100 10 lO de glico-CMM 6 890 100 10 10 de glico-CMM 7 900 100 - 10deWTd 8 900 100 - 10 de WTd 9 890 100 10 10 de WTd 890 100 10 10deWTd a Amortiguador de Ensayo de lectina: 20mM Tris. HCl, 2mM CaCl2, pH 8.6 b 5 mg/ml de solución de Concanavalina A Biotinilada (Laboratorios Vector) en agua Milli Q. c 5 mg/ml de solución de Ribonucleasa A con Uniones de Disulfuro Mezcladas (Sigma) en agua Milli Q. d Solución de GG36-WT liofilizado diluido a la misma concentración como la glico-CMM (como se determinó por PMSF) en 20 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.5. Estas soluciones se calentaron a 35°C en un baño de agua caliente controlado por termostato. Después del tiempo de incubación indicado, los contenidos de los viales apropiados se colocaron cada uno en la parte superior de un Concentrador Centricon-SR3 (Amicon, MWCO 3000, previamente limpiado por 2 ml de agua Milli Q centrifugada a 3750 rpm durante 90 min) y se centrífugo a 3750 rpm durante 60 min.

Los filtrados resultantes se analizaron después como se muestra en la Tabla 21 y en la Tabla 22.

Tabla 21. Ensayo de filtrados para S156C-EtMan (Concentraciones de Enzimas 2 . 58 mg/ml ) No. de HABA/ HABA/ HABA/ Tiempo A280 Libera Proteína % de % de Vial Avidina Avidina Avidina de ción Total/Abs Biotina Protema Incub. de Max Total /min Biotin /Abs Max Antes3 Despuésb Dif./Abs a /Abs /Abs /Abs /Absd 1 1.006 0.726 0.28 60 0.003 - - - - 2 1.004 0.719 0.285 60 0.003 - - - - 3 1.012 0.665 0.347 60 0.033 0.062 0.03 45 54 4 1.009 0.597 0.412 210 0.042 0.127 0.039 93 70 1.01 0.662 0.348 60 0.022 0.063 0.019 46 34 6 1 0.6 0.4 210 0.046 0.115 0.043 84 77 7 1.014 0.649 0.365 60 0.028 0.08 0.025 58 45 8 0.998 0.576 0.422 210 0.049 0.137 0.046 100 82 9 1.012 0.659 0.353 60 0.035 0.068 0.032 50 57 1.007 0.591 0.416 210 0.059 0.131 0.056 96 100 a 800µl de Reactivo HABA/Avidina (Sigma) preparado con 1 ml de agua Milli Q. b Después de la adición de 200 µl de filtrado del ensayo de lectina. c Valor para 300 µl de filtrado del ensayo de lectina diluido con 700 µl de Milli Q en comparación con la pieza de agua Milli Q (1 ml) . d Calculado a partir de la diferencia entre la caída de HABA/Avidina en Abs. para la muestra y la caída Abs. causada por dilución sola (controles) . Tabla 22 Ensayo de filtrados para S156C-EtMan (Ac) 4 (Concentración de Enzimas 2.40 mg/ml) No. de HABA/ HABA HABA/ Tiempo A28oc Libera- Proteína % de % de Vial Avidina Avidina Avidina de ción de Total/ Abs Biotin Proteína Incub. Biotina Max Total /min /Abs" /Abs Max Antes3 Despuésb Dif. /Abs /Abs /Abs /Abs 1 0.983 0.717 0.266 60 0.002 - - - - 2 0.982 0.711 0.271 60 0.009 - - - - 3 0.98 0.633 0.347 60 0.027 0.079 0.021 35 31 4 1.002 0.559 0.443 210 0.06 0.175 0.054 78 79 0.991 0.628 0.363 60 0.034 0.095 0.028 42 41 6 1.004 0.548 0.456 210 0.063 0.188 0.057 84 84 7 0.998 0.606 0.392 60 0.041 0.124 0.035 55 51 8 1.003 0.511 0.492 210 0.069 0.224 0.063 100 93 9 1.001 0.651 0.35 60 0.038 0.082 0.032 37 47 1.013 0.54 0.473 210 0.074 0.205 0.068 92 100 a,b,c,d, como anteriormente. Ej emplo 7 Ensayo de Degradación de Lectina Utilizando Otros CMMs glicosilados y de SBL Manosilado con Concentraciones Más Elevadas de Proteína Simulada Además de S156C-S-EtMan y S156C-S-EtMan (Ac) 4 reportados anteriormente el ensayo de lectina se realizó para otros CMMs glicosilados. Además, se investigaron la selectividad de S156C-S-EtMan a niveles más elevados de proteína simulada. Los datos mostraron que como para S- EtManAc la otra glucosa de azúcares, la galactosa y la lactosa mostraron poca o ninguna selectividad. Al poner a prueba S156C-S-EtMan con niveles 5 veces más elevados de la proteína simulada la selectividad de esta CMM manosilada se disminuyó a aproximadamente una diferencia de aproximadamente 12% en niveles totales de proteína con y sin el señuelo. Experimentos : Método 1 de Ensayo de Lectina Se llenaron 10 viales eppendorf desechables como se muestra en la Tabla 23 : Tabla 23. Método 1 de ensayo de lectina. No. de Amortiguador3 Concanavalina Proteínac Enzima/µl Vial de Ensayo de Ab/µl Simulada/ Lectina/µl µl 1 900 100 2 890 100 10 3 900 100 - 10 de glico--CMM 4 900 100 - 10 de glico--CMM 890 100 10 10 de glico--CMM 6 890 100 10 10 de glico--CMM 7 900 100 - 10 de WTd 8 900 100 - 10 de WTd 9 890 100 10 10 de WTd 10 890 100 10 10 de WTd Amortiguador de Ensayo de lectina: 20 mM Tris. HCl, 2 mM CaCl2,pH 8.6 b 5 mg/ml de solución de Concanavalina A Biotinilada (Laboratorios Vector) en agua Milli Q. c 5 mg/ml de solución de Ribonucleasa A con Uniones de Disulfuro Mezcladas (Sigma) en agua Milli Q. d Solución de GG36-WT liofilizado diluido en la misma concentración como el glico-CMM (como se determinó por PMSF) en 20 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.5. Estas soluciones se calentaron a 35 °C en un baño de agua caliente controlado por termostato. Después del tiempo de incubación indicado, los contenidos de los viales apropiados se colocaron cada uno en la parte superior de un Concentrador Centricon-SR3 (Amicon, MWCO 3000, previamente limpiado por 2 ml de agua Milli Q centrifugada a 3750 rpm durante 90 min) y se centrífugo a 3750 rpm durante 60 min.

Los filtrados resultantes se analizaron después como se muestra en la Tabla 24, Tabla 25 y Tabla 26. Tabla 24. Ensayo de filtrado ( S156C-S-EtßGlc (Concentración de Enzima i 2 . 29 mg/ml ) ) No. de HABA/ HABA HABA/ Tiempo A280 Libera- Proteína % de % de Vial Avidina Avidina Avidina de ción de Total/Abs Biotina Proteína Incub. Biotina Max Total /min /Absd /Abs Max Antes3 Despuésb Dif. /Abs /Abs /Abs /Abs 1 0.989 0.779 0.21 60 0.003 - - - 2 1.011 0.789 0.222 60 0.009 - - - 3 0.992 0.637 0.355 60 0.025 0.14 0.019 53 29 - 4 1.024 0.545 0.479 210 0.068 0.264 0.062 100 95 1.011 0.63 0.381 60 0.038 0.166 0.032 63 49 6 0.995 0.566 0.429 210 0.068 0.214 0.062 81 95 7 0.999 0.604 0.395 60 0.036 0.18 0.03 68 46 8 1.003 0.554 0.449 210 0.062 0.234 0.056 89 86 9 1.037 0.648 0.389 60 0.042 0.174 0.036 66 55 0.996 0.568 0.428 210 0.071 0.213 0.065 81 100 a 800µl de Reactivo HABA/Avidina (Sigma) preparado con 1 ml de agua Milli Q. b Después de la adición de 200 µl de filtrado del ensayo de lectina. c Valor para 300µl del filtrado del ensayo de lectina diluido con 700 µl de Milli Q en comparación con el modelo de agua Milli Q (1 ml) . d Calculado a partir de la diferencia entre la caída de HABA/Avidina en Abs. para la muestra y la caída en Abs. causada por dilución sola (controles) . Tabla 25. Ensayo de filtrado ( S156C-S-EtGal (Concentración de Enzima i 1 . 73 mg/ml ) ) No. de HABA/ HABA HABA/ Tiempo A280 LiberaProtema % de % de Vial Avidina Avidina Avidina de ción de Total Biotina Protema Incub. Biotina /Abs Max Total /min /Absd /Abs Max Antes3 Despuésb Diff. /Abs /Abs /Abs /Abs 1 0.995 0.77 0.225 60 -0.004 - - - - 2 1.002 0.768 0.234 60 -0.007 - - - - 3 1.011 0.629 0.382 60 0.02 0.152 0.026 67 37 4 0.975 0.531 0.444 210 0.055 0.214 0.061 94 87 1.005 0.621 0.384 60 0.028 0.154 0.034 68 49 6 0.978 0.543 0.435 210 0.063 0.205 0.069 90 99 7 1.018 0.652 0.366 60 0.01 0.136 0.016 60 23 8 1.01 0.553 0.457 210 0.048 0.227 0.054 100 77 9 1.011 0.666 0.345 60 0.014 0.115 0.02 51 29 0.997 0.563 0.434 210 0.064 0.204 0.07 90 100 a,b. c.d, como anteriormente.

Tabla 26. Ensayo de filtrado S156C-S-EtLac (Concentración de Enzima 2 . 25 mg/ml ) ) No. de HABA/ HABA/ HABA Tiempo A280 LiberaProteína % de % de Vial Avidina Avidina Avidma de ción de Total Biotina Proteína Incub. Biotina /Abs Max Total /min /Absd /Abs Max Antes3 Despuésb Dif. /Abs /Abs /Abs /Abs 1 1.006 0.77 0.236 60 -0.006 - - - - 2 0.994 0.762 0.232 60 -0.002 - - - - 3 0.993 0.684 0.309 60 0.008 0.075 0.012 35 15 4 1.023 0.584 0.439 210 0.04 0.205 0.044 95 56 0.994 0.676 0.318 60 0.013 0.084 0.017 39 22 6 1 0.578 0.422 210 0.068 0.188 0.072 87 91 7 1.014 0.655 0.359 60 0.012 0.125 0.016 58 20 8 1.012 0.562 0.45 210 0.047 0.216 0.051 100 65 9 1.001 0.674 0.327 60 0.014 0.093 0.018 43 23 1.006 0.57 0.436 210 0.075 0.202 0.079 94 100 a,b, c,d, como anteriormente - Control sin Lectina El ensayo se realizó como para el método 1 excepto 100 µl de alícuotas de concavalina reemplazadas por 100 µl de agua Milli Q. Los resultados se muestran en la Tabla 27.

Tabla 27 . Ensayo de f iltrado . Control sin lectina No. de HABA/ HABA/ HABA/ Tiempo A280 LiberaProtema % de % de Vial Avidina Avidina Avidina de ción de Total Biotina Proteína Incub. Biotina /Abs Max Total /min /Absd /Abs Max Antes3 Despuésb Dif. /Abs /Abs /Abs /Abs 1 1.004 0.768 0.236 60 -0.005 - - - - 2 1 0.77 0.23 60 -0.008 - - - - 3 0.998 0.768 0.23 60 -0.008 -0.003 -0.001 -1 -1 4 1 0.774 0.226 210 -0.007 -0.007 0 -3 0 1.023 0.78 0.243 60 0.004 0.01 0.011 5 14 6 1.02 0.783 0.237 210 0.007 0.004 0.014 2 18 7 1.018 0.774 0.244 60 -0.005 0.011 0.002 5 3 8 1.001 0.774 0.227 210 -0.002 -0.006 0.005 -3 6 9 1.006 0.769 0.237 60 0.008 0.004 0.015 2 19 1.004 0.771 0.233 210 0.012 -2.8E-17 0.019 0 24 a,b,c,d, como anteriormente. Método 2 de Ensayo de Lectina Se llenaron diez viales eppendorf desechables como se muestra en la Tabla 28.

Tabla 28. Diseño del ensayo 2 de lectina.

No. de Amortiguador3 Concanavalina Proteínac Enzima/µl Vial del Ensayo de Ab/µl Simulada/ Lectina/µl µl 1 900 100 2 850 100 50 3 900 100 - 10 de glico--CMM 4 900 100 - 10 de glico--CMM 850 100 50 10 de glico--CMM 6 850 100 50 10 de glico--CMM 7 900 100 - 10 de WTd 8 900 100 - 10 de WTd 9 850 100 50 10 de WTd 850 100 50 10 de WTd a Amortiguador de Ensayo de Lectina: 20mM Tris. HCl, 2 mM CaCl2, pH 8.6 b 5 mg/ml de solución de Concanavalin A Biotinilada (Laboratorios Vector) en agua Milli Q. c 5 mg/ml de solución de Ribonucleasa A con Uniones de Disulfuro Mezcladas (Sigma) en agua Milli Q. d Solución de GG36-WT liofilizado diluido a la misma concentración como el glico-CMM (como se determinó por PMSF) en 20 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.5. Todas las determinaciones adicionales se llevaron a cabo como para el Método 1 y los resultados se muestran en la Tabla 29.

- - Tabla 29. Ensayo de filtrado S156C-S-EtMan (Concentración de Enzima 2 . 58 mg/ml ) No. de HABA/ HABA/ HABA/ Tiempo A28oc LiberaProtema % de % de Vial Avidina Avidina Avidina de ción de Total/Abs Biotina Proteína Incub. Biotina Max Total /min /Absd /Abs Max Antes3 Despuésb Dif. /Abs /Abs /Abs /Abs 1 0.969 0.76 0.209 60 -0.003 - - - - 2 0.982 0.756 0.226 60 0.005 - - - - 3 0.975 0.649 0.326 60 0.018 0.108 0.017 52 21 4 0.97 0.562 0.408 210 0.048 0.19 0.047 92 57 0.99 0.685 0.305 60 0.03 0.087 0.029 42 35 6 0.988 0.589 0.399 210 0.068 0.181 0.067 87 82 7 0.983 0.637 0.346 60 0.028 0.128 0.027 62 33 8 0.974 0.549 0.425 210 0.053 0.207 0.052 100 63 9 0.978 0.659 0.319 60 0.037 0.101 0.036 49 44 0.982 0.599 0.383 210 0.083 0.165 0.082 80 100 a,b,c,d, como para el Método 1. Ejemplo 8 Síntesis de Biotina-MTS Con objeto de explotar el poderoso enlace de la biotina a avidina como un sistema modelo para demostrar claramente la estrategia de objetivo se sintetizó el reactivo 1 biotina MTS. En la selección de la estrategia sintética (Figuras 16, esquema 7) seleccionamos el grupo del ácido carboxílico de la biotina como el punto en el cual introducir el metanotiosulfonato según estudios previos han mostrado que la funcionalidad de esta parte de la molécula preserva la afinidad de la avidina (Green (1975) Adv. Protein Chem. 29: 85-133; Green (1990) Meth . Enzimol . 184: 51-67). Los intentos iniciales para reducir el éster N-hidroxisuccinimida 3 utilizando NaBH (Islam et al . , (1994) J". Med. Chem. , 37:293-304), sintetizado a partir de (+) -biotina (2) en 61% de rendimiento de acuerdo a los métodos de la literatura (Chaturvedi et al . , (1984) ". Med. Chem. , 27: 1406-1410), da solo un pobre rendimiento de 15% de (+) -biotinol (4) . En contraste, la reducción directa de (+) -biotina (2) con LiAlH4 dio un rendimiento razonable 4 del 69% (Flaster y Kohn (1981) Heterocycl . Chem .18: 1425-1436). El uso de éter común solvente es crucial para el éxito de ésta reducción a medida que THF dio únicamente un muy bajo rendimiento de (+) -biotinol (4) . El biotinol (4) se elaboró de acuerdo a nuestro procedimiento preparativo establecido, para la biotina-MTS objetivo a través del mesilato y bromuro primario correspondiente. El uso de MsCl conduce a solo un rendimiento moderado del mesilato como resultado de la formación de competencia del cloruro primario. Consecuentemente, el biotinol (4) se trató con anhídrido mesílico en piridina/DCM, después LiBr en acetona de reflujo y finalmente NaSS02Me en DMF para dar la biotina-MTS 1 objetivo en 54% de rendimiento durante las 3 etapas (37% de rendimiento total a partir de (+) -biotina (2) . Los intentos para graduar esta síntesis dieron rendimientos reducidos. Experimentos : (+) -Biotinol (4_) a través del Ester Hidroxisuccinimida (3) . Se agregó 1, 1' -Dicarbonilimidazol (360 mg, 2.22 mmol) a una solución de agitación de (+) -biotina (2) (540mg, 2.2mmol) en DMF (10 ml) bajo N2 y la solución resultante se calentó hasta la evolución de C02 cesado (aproximadamente 30 min) . La solución se enfrió a temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas adicionales, tiempo durante el cual se precipitó un sólido blanco a partir de la solución. Se agregó una solución de N-hidroxisuccinimida (260mg, 2.26 mmol) en DMF (10 ml) y la mezcla se agitó. Después de 6 horas adicionales el solvente de reacción se retiró y el residuo se recristalizó primero a partir de propan-2-lo (mp 187-187°C) y después DMF/propan-2-lo para dar 3 (457mg, 61%) como un sólido blanco; mp 197-201°C (DMF/propan-2-ol) [lit., Becker et al . , (1971) Proc. Nati. Acd. Sci., USA, 68:2604-2607, mp 196-200°C; lit., Parameswaran (1990) Org. Prp. Proc. Intl. 22: 119-121, mp 210°C]; 1H NMR (d6-DMSO, 200 MHz) 1.43-1.70 (m. 4H) , 2.52-2.90 (m, 9H) , 3.07-3.14 (m, 4H, H-4), 4.17 (dd, J 6 Hz, J 4 Hz, 1H, H-3a) , 4.32 (dd, J 6 Hz, J 7 Hz, 1H, H-6a) , 6.39, 6.45 (s 2, 1H 2, H-l, H-3).

Se agregó NaBH4 (50 mg, 1.32 mmol) a una suspensión de 3 (170 mg, 0.5 mmol) agitada en THF/HMPA (40: 1, 41 ml) bajo nitrógeno. Después de 4.5 horas el volumen del solvente de reacción se redujo y el residuo resultante se templó con agua. El residuo se secó adicionalmente bajo vacío y se purificó mediante cromatografía rápida (MeOH: CHC13, 1: 19) para dar 4 (17 mg, 15%) como un sólido blanco. 5- ([3aS- (3aa/4ß/6aa)1-Hexahidro-2-oxo-lH-tienor3/4- d]imidazol-4-il)pentil metanotiosulfonato [(+)- Biotina MTSl (1) • Se disolvió (+) -Biotina (2) (196 mg, 0.8 mmol) en piridina (5 ml) al calentar cuidadosamente a 80°C bajo nitrógeno. La solución resultante se agregó gota a gota a una suspensión de LiAlH4 (196 mg, 5.15 mmol) en éter seco recientemente destilado (25 ml) bajo nitrógeno. Después de minutos la mezcla resultante se calentó a reflujo.

Después de 40 minutos adicionales, tic (MeOH : CHC13, 1:9) mostró la formación de un producto mayor (Rf 0.35) a partir del material de inicio (Rf 0.45) . La reacción se enfrió y permaneció LiAlH4 templada mediante la adición gota a gota de agua. Después que la efervescencia cesó se agregó más agua (100 ml) y el solvente se removió. El residuo se secó durante la noche bajo vacío y se purificó entonces por cromatografía rápida (MeOH : CHC13, 1:19 para dar (+) -biotinol [3aS- (3aa,4ß, 6aa) ]-Tetrahidro-4- (5-hidroxipentil) -1H- tieno[3,4-d]imidazol-2 (3H) -ona (4) (128 mg, 69%) [53906-36-8] como un sólido blanco; mp 168-172 [lit., Patente de E.U. 2,489,237, mp 174.5-175.5 (MeOH)]; [a]28D= + 91.2 (c 0.43, MeOH) [lit. , [a]25D=+84.7 (c 1, MeOH)]; H NMR (CD3OD,400 MHz) d 1.42-1.48 (m, 4H) , 1.52-1.63 (m, 3H) , 1.72-1.75 (m, 1H) , 2.71 (d, J"6.6' 12.6Hz, 1H, H-6) , 2.93 (dd, J"6.f6a 4.9 Hz, "6,6<12.8 Hz, 1H, H-6')3.22 (qu, J4.8 Hz, iH, H-4) , 3.52 (t, Jß .5 Hz, 2H, CH2OH) , 4.031 (dd, J3a,4 4.4 Hz cJ3a,6a 7.8 Hz, 1H, H-3a) , 4.51 (dd, J6'6a 4.9 Hz, J-3a,Sa 7.9 Hz, 1H, H-6a) . SE agregó Ms20 (78 mg, 0.45 mmol) a una solución de 4 (80 mg, 0.35 mmol) en piridina/DCM (1:1, 4 ml) bajo nitrógeno. Después de 14 horas se retiró el solvente. El residuo se disolvió en CHC13 (30 ml) , se lavó (agua (10 ml) , salmuera (10 ml) ) , se secó (MgS04) , se filtró y se removió el solvente. El residuo se purificó por cromatagraf ía rápida (MeOH:CHCl3, 1:50) para dar el mesilato [3aS- (3aa, 4ß, 6aa) ] -Tetrahidro-4- [5- (metanosulf onil) pentil] -lH-tieno [3,4, -d] imidasol-2 (3H) -ona (83mg, 77%) como un aceite amarillo; a mayor escala proporciona el mesilato como un sólido amarillo pálido; mp 134-136; IR (película) 3432 (NH) , 1702 (amida I), 1636(amida iDcm'1 ;XH NMR (CDC13 400 MHz)d 1.45-1.47 (m, 4H) ,1.67-1.79(m,4H) , 2.75 (d, J6?6, 12.8 Hz,lH,H-6), 2.92 (br d,J9.4Hz, lH,H-6' ) ,3.02 (s, 3H, CH3S02- ) , 3.15-3.19 (m, 1H, H-4 ) , 4.24 (t, J6.4Hz,2H,CH2OMs) , 4.32 (dd, J3a,4 4.8 , Hz, cJ3a,6a 7.3Hz, lH,H-3a) ,4.51 (m, lH,H-6a) ; 13C NMR(CDC13,50 MHz)d 25.4, 28.3, 28.5, 28.8, 37.4, 40.5, 55.5 ( (CH2) 4 , C-4 , C-6 , CH3S02- ) , 60.3 , 62.1 (C-3a,C-6a) , 70.1 (CH2OMs) , 163.6 (C-2) . Se agregó LiBr (80 mg, 0.92 mmol) a una solución de mesilato (40 mg, 0.13 mmol) en acetona (2 ml) bajo nitrógeno y la solución resultante se calentó bajo reflujo. Después de 14 horas, tic (MeOH : CHC13, 1:9) mostró la conversión del material de inicio (Rf0.3) al producto (RfO.45). El solvente se removió y el residuo se fraccionó entre el éter (30 ml) y el agua (10 ml) . La solución acuosa se extrajo con CHC13 (30 ml_2) en la cual el bromuro es más soluble. Las fracciones orgánicas se combinaron, se secaron (MgS04) , se filtraron y el solvente se retiró para dar el bromuro crudo ([3aS- (3aa,4ß, 6aa)]-Tetrahidro-4- (5-bromopentil) -lH-tieno[3 , 4-d] imidazol-2 (3H) -ona (28 mg, 74%) como un aceite amarillo, que se utilizó directamente en la siguiente etapa. Aumentando la escala se proporciona un sólido amarillo pálido; mp 157-159. Se agregó NaSS02Me (15mg, 0.11 mmol) a una solución de bromuro crudo (24 mg, 0.08 mmol) en DMF (2ml) y la solución resultante se calentó bajo nitrógeno a 50 °C. Después de 19 horas, tic (MeOH:CHCl3, 1 : 9) mostró la formación de un producto mayor (Rf0.35) a partir del material de inicio (Rf0.45) . El solvente se removió y el residuo se purificó por cromatografía rápida repetida (MeOH:CHCl3 1:19 después 3:97 para dar 1 (25 mg, 94%, 37% de (+) .biotina (2) ) como un sólido amorfo; a mayor escala proporciona 1 como un sólido - amarillo pálido; [a] D26+42.1 (c, 0.62 en CHC13) ; IR (película) 3215 (NH) , 1699 (C=0) , 1310 , 1129 (S-S02) cm"1; *H NMR (CDC13 400 MHz) d 1.45-1.47 (m, 4H) , 1.62-1.70 (m, 2H) , 1.72- 1.80 (m,2H) , 2.75(d,J6f6.13.0Hz, lH,H-6) , 2.93 (br d,J9.3Hz, 1H, H-6') , 3.13-3.19 (m, 3H, H-4, -CH2S-) , 3.34 (s, 3H, CH3S02-) , 4.33 (dd,J3a, 4.2, Hz, J3a,6a 7.1 Hz, 1H, H-3a) , 4.53 (dd,J6.,6a 4.9Hz, J"3a,6a 6.8Hz, 1H, H-6a) ; 13CNMR (CDCl3, 100 MHz) d 28.4, 28.5, 28.6, 29.4, 36.4, 40.6, 55.6 ((CH2)4, C-4, C-6, CH2S-) , 50.9 (CH3S02-) , 60.6, 62.4 (C-3a, C-6a) , 163.5 (C-2) ; HRMS m/z (FAB+) : Encontró 325.0755 (M+H+) ; CnH20N2O3S3 requiere 325.0714. Ejemplo 9 Precipitación y Caracterización de Biotina-CMMs Preparación de la Biotina-CMMs El reactivo biotina CMMs 1 se utilizó para preparar las CMMs biotiniladas de los mutantes N62C, L217C, S166C y S156C, mediante la reacción en pH 9.5 siguiendo el protocolo estándar. En todos los casos las enzimas resultantes se activan después de la modificación Cinéticas Amidasa de la Biotina-CMMs Los datos para las cinéticas de amidasa y ESMS se muestran en la Tabla 30.

Tabla 30. Constantes Cinéticas para Biotina-CMMs. (+)-Biotina- Cinéticas de Amidasa ESMS CMM K M, kca/K¡ M Cale. Encont.

S166C 56.3 1.4 1.00 0.05 56.1 3.3 26958 26967 S156C 75.4 2.2 0.83 0.06 91.1 7.2 26958 26968 N62C 122 1.8 1.06 0.04 115 4.4 26931 26936 L217C 60.3 0.8 0.72 0.02 83.4 3.1 26932 26936 GG36-WT 153 4 0.73 0.05 209 15 26698 26694 Constantes cinéticas determinadas por duplicado por el método de tasas iniciales en amortiguador TRIS 0.1 M, pH 8.6, 0.005% Tween 80, 1% DMSO. [S] =0.125 mM a 3 mM, [E]=1.4 10"8 M a 2.4 10"8 M. Todas las biotina-CMMs tienen una actividad catalítica más pequeña que SBL-WT (kcat/KM= 209 15) . Los valores para la S156C-S-Biotina CMM y la L127C-S-Biotina CMM fueron similares y mostraron un kcat disminuido comparado a SBL-WT, considerando que el cambio en KM es insignificante. La modificación del mutante S166C con el reactivo biotina-MTS dio, comparado a SBL-WT, cuatro veces menos kcat/ KM. También la S166C-S-Biotina CMM tuvo el kcat/KM más bajo de todas las CMMs biotiniladas . Ambos kcat y KM se alteran por este CMM. La N62C-S-Biotina CMM tuvo un kcat ligeramente disminuido comparado a SBL-WT y tuvo el mayor KM de todas las biotina-CMMs, sin embargo, fue aún el más activo de estas CMMs biotiniladas.

Cinéticas de la Esterasa de las Biotina-CMMs Las cinéticas de la esterasa se llevan a cabo por las biotina-CMMs de acuerdo al protocolo estándar con suc-AAPF-SBn como substrato. Los resultados se muestran en la Tabla 31. Tabla 31. Cinéticas de esterasa para Biotina-CMMs. (+)-Biotina- Cinéticas de Estearasa CMM S166C 489 41.0 0.59 0.14 830 212 S156C 825 42.7 0.68 0.10 1221 187 N62C 422 27.3 0.21 0.05 1973 497 L217C 432 52.5 0.35 0.15 1229 559 GG36-WT 1940 180 0.54 0.07 3560 540 Constantes cinéticas determinadas por duplicado por el método de tasas iniciales en amortiguador TRIS 0.1 M, pH 8.6, 0.005% Tween 80, 1% DMSO. [S] =0.015 mM a 3 M, [E]=0.8 x 10"9 M a 1.2 10~9 M. Los resultados para kcat/KM para la actividad de la esterasa siguen la misma tendencia comparados a las cinéticas de la amidasa. La S166C-S-Biotina CMM muestra el kcat/KM más pequeño que es aproximadamente cuatro veces más bajo que para SBL-WT. Las biotina-CMMs tienen un kcat/KM aproximadamente cuatro veces menor comparado a SBL-WT con la S156C-S-Biotina CMM como la única excepción. El kcat de la S156C-S-Biotina CMM es aproximadamente dos veces menor que para SBL-WT y por lo tanto dos veces mayor comparado a las otras biotina-CMMs. Sin embargo, S156C-S-Biotina CMM no es la más activa de todas las CMMs biotiniladas ya que tiene también el mayor valor de KM. El kcat/KM de S156C-S-Biotina CMM y L217C-S- Biotina CMM son muy similares, aproximadamente 3 veces más bajos que SBL-WT, aunque kcat y KM mostraron grandes diferencias. El valor de KM de las biotina-CMMs fue ligeramente mayor para la S166C-S-Biotina CMM y la S156C-S-Biotina CMM comparado a SBL-WT. Considerando que, los valores para N62C- S-Biotina CMM y L217C-S-Biotina CMM son aproximadamente dos veces más pequeños comparados a SBL-WT. La N62C-S-Biotina CMM tuvo el menor KM de todas las CMMs biotiniladas, y es 2.6 veces más pequeño que SBL-WT.

Aunque también tiene el menor kcat de todas las biotina CMMs, y tiene la mayor actividad catalítica, que es todavía 1.8 veces menor que SBL-WT. Ejemplo 10 Dirigir una Proteína de Enlace- Objetivar e Hidrólisis de Avidina con Biotina-CMMs Se conoce a partir de la literatura que las proteínas biotiniladas se enlazarán a la avidina solo cuando la biotina se encuentre separada de la superficie de la macromolécula a la cual se enlaza covalentemente mediante al menos cinco grupos metileno (Green (1970) Meth . Enzimol . 18A: 418-424). Wilchek et al . , observó que las enzimas proteolíticas no son capaces de dividir la avidina. Aún cuando las proteasas se biotinilizan, la avidina no se divide (Bayer et al. (1990) Biochemistry, 29:11274-11279). Nuestra meta en este proyecto no es únicamente establecer objetivos de nuestras nuevas biotina-CMMs para la avidina sino también demostrar que las CMMs son capaces de catalizar la proteolisis de la avidina. SBL-WT, que no es capaz de formar complejo con la avidina sino puede hidrolizar la avidina en un proceso no selectivo, se utiliza para la comparación. Se adaptó el método colorimétrico previamente utilizado para demostrar la degradación de lectina con CMMs glicosiladas, para valorar la capacidad de la biotina-CMMs sintetizada hacia la avidina objetivo. Medimos la liberación de HABA a partir del reactivo HABA/avidina que se detectó mediante un incremento de la absorbencia en 500 nm. Todas las CMMs biotiniladas se examinaron y la cantidad de CMM utilizada se corrigió para igualar la actividad catalítica comparada a otras en base a kcat/KM con suc-AAPF-pNA. Por lo tanto, pueden discutirse las diferencias entre la capacidad de nuestra biotina-CMMs hacia el objetivo avidina. Con objeto de investigar la capacidad de nuestra biotina-CMMs no solo para el objetivo avidina sino para la hidrolización, decidimos separar el ensayo para dirigir el objetivo y el ensayo para hidrólisis de la avidina con nuestras CMMs biotiniladas. Como ya se mencionó, dirigir el objetivo puede probarse claramente al medir HABA liberada a partir de la solución de HABA/avidina a 500 mm. Ya que nosotros ahora solo nos interesamos en utilizar este método como un ensayo de dirección de objetivo para la avidina medimos el HABA liberada durante un periodo de 5 min. A pesar del hecho de que solo para la S156C-S-Biotina la cadena lateral de la biotina introducida es la superficie expuesta y por lo tanto fácilmente accesible para enlazar a la avidina, sorpresivamente todas las biotina-CMMs causan la liberación inmediata de HABA cuando se agregan a una solución amortiguada de HABA/avidina. Debido a que su superficie expuesta S156C-S-Biotina da como resultado la mayor liberación de HABA comparada a otras CMMs. Controlamos el proceso de dirigir el objetivo mediante la comparación con soluciones de SBL-WT (concentración calculada para la misma actividad catalítica) y adición de (+) -biotina [diluida para la misma concentración como se esperó en cada una de las biotina-CMMs] (por determinación de PMSF-valor) Desde entonces, por razones estéricas, (+) -biotina debe estar más disponible para el enlace a la avidina que la - cadena lateral biotinilada de nuestras CMMs, esperamos una menor o en el mejor de los casos la misma liberación de HABA para todas las biotina-CMMs comparada a la mezcla de biotina/WT. S166C, N62C y L217C-S-Biotina confirmaron nuestras predicciones, sin embargo, la S156C CMM dio una liberación de HABA drásticamente más alta. Determinamos por lo tanto, la cantidad de proteína total de la solución de S156C-S-Biotina mediante liofilización y calculada la cantidad de biotina contra (B2a) . En este caso, la liberación de HABAS para una mezcla biotina/WT es mayor para la S156C CMM y sugerimos que pudiera ser inactiva la enzima que lleva el grupo biotina en la solución CMM que también enlaza a' la biotina y ocasiona por lo tanto la liberación adicional de HABA. Para la determinación de la hidrólisis de avidina catalizada por SBL-WT y la biotina-CMMs, respectivamente, adoptamos el método de ensayo de lectina y medimos A28o para los fragmentos de hidrólisis <3000 Da. El ensayo se llevó a cabo para S156C-S-Biotina ya que esta CMM probó ser la mejor enzima en el ensayo de dirección de objetivo. Para permitir la comparación y demostrar la hidrólisis no selectiva, se utilizó SBL-WT como una solución diluida para la misma actividad catalítica como la solución biotina-CMM. Las mediciones iniciales con HABA/avidina y la enzima reveló anormalidades presumiblemente causadas por HABA, por lo tanto decidimos hacer este ensayo solo con avidina. Para determinar la selectividad de la hidrólisis de avidina, se utilizó una proteína simulada, ARNasa A mezclada con disulfuro, similar al ensayo de lectina descrito anteriormente. Las soluciones se incubaron durante 1 hora y 4 horas respectivamente y los fragmentos pequeños de proteína (<3000 Da) , los productos de hidrólisis, se separaron utilizando una membrana de exclusión por tamaño. Las mediciones de A280 proporcionaron la concentración total de fragmentos de proteína y por lo tanto es un indicador de la hidrólisis de la avidina. Tanto la SBL-WT y S156C-S-Biotina son capaces de hidrolizar la avidina. Ya que las concentraciones de enzima se calcularon para igual actividad catalítica con el substrato estándar de amidas suc-AAPF-pNA pueden compararse directamente los valores de hidrólisis. Por lo tanto, somos capaces de demostrar no solo que la avidina se hidroliza por la SBL-proteasas sino también se hidroliza más eficientemente por una proteasa biotinilada. S156C-S-Biotina produce 45% más fragmentos de proteína después de 240 min que GG36-WT.

En la presencia de la proteína simulada [0.05 mg Simulada (1) ] la cantidad de proteína total producida incrementada drásticamente por la enzima WT (27% después de 240 min) considerando la producción de la proteína total no cambia significativamente de biotina-CMM. Sin embargo, un nivel 3 veces mayor de proteína simulada [0.15 mg, Simulada (2)] resultó también para S156C-S-Biotina en el incremento de producción de la proteína total (38% después de 240 min) que indica una selectividad disminuida para la avidina. En estudios corridos con controles para GG36-WT con cantidades diferentes de biotina agregada, las diferencias fueron claramente pequeñas . Experimentos : Ensayo de Dirección de Objetivo de Avidina (Desplazamiento de HABA) Se llenaron 12 cubetas desechables como se muestra en la Tabla 32 (medición adicional anterior de biotina y enzima de A50o) : Tabla 32. Ensayo de dirección de objetivo de avidina Número Amortiguador HABA/Avidina d-Biotina Enzima de a /µl /µl(conc.[mg/ml] /µl (conc.[mg/ml]) Cubeta /µl ) 1 400 400 2 400 400 3 400 400 4 390 400 10(0.060)d 5 400 400 200 de S156C-S-Biotina(0.329) 6 400 400 200 de S166C-S-Biotina(0.534) 7 400 400 200 de N62C-S-Biotina(0.260) - 8 400 400 - 200 de L217C-S-Biotina(0.359) 9 400 400 - 200 de WT (0.143)e 10 390 400 10(0.060)d 200 de WT (0.143)e 11 390 400 10(0.097/ 200 de WT (0.143)e 12 390 400 10(0.047) 200 de WT (0.143)e 13 390 400 10(0.065)h 200 de WT (0.143)e 14 390 400 10(0.649)* 200 de WT (0.143)e a Amortiguador de ensayo: 20mM Tris. HCl, 2 mM CaCl2, pH 8.6 b Reactivo HABA/avidina (Sigma) preparado con lOml de agua Milli-Q. c 200µl de amortiguador MES (10 mM MES, 1 M CaCl2, pH 5.8) . d Solución de d-biotina (Sigma) diluida a la misma concentración (en 10 µl) como en 200 µl de S156C-S-Biotina activa (0.329 mg/ml) en el Amortiguador de Ensayo. e Solución de GG36-WT liofilizado en 10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH .8 (PMSF corregido). £ Solución de d-biotina (Sigma) diluida a la misma concentración (en 10 µl) como en 200 µl de S166C-S-Biotina activa (0.534 mg/ml) en el Amortiguador de Ensayo. 9 Solución de d-biotina (Sigma) diluida a la misma concentración (en 10 µl) como en 200 µl de N62C-S-Biotina activa (0.260 mg/ml) en el Amortiguador de Ensayo. h Solución de d-biotina (Sigma) diluida a la misma concentración (en 10 µl) como en 200 µl de L217C-S-Biotina activa (0.359 mg/ml) en el Amortiguador de Ensayo. 1 Solución de d-biotina (Sigma) diluida a la misma concentración (en 10 µl) como para la cantidad de proteína de 200 µl de S156C-S-Biotina (como se determinó por liofilización) en el amortiguador de Ensayo. Antes de la adición de biotina y enzima, la cubeta se equilibró en el espectrofotómetro hasta estabilizarla a A50o (5-10 min) . Se agregaron la biotina y la enzima, respectivamente y se midió A50o durante un periodo de 5 min. La Tabla 33 muestra los resultados del ensayo: Tabla 33. Resultados del ensayo Número HABA/Avidina HABA/Avidina HABA/ Liberación de % de Liberación de Avidina HABA/ Max de HABAb Cubeta Antes" Despuésb Dif.b /Abs /Abs /Abs /Abs /Absb'c 1 0.535 0.382 0.153 - - 2 0.487 0.344 0.143 - - 3 0.482 0.353 0.129 - - 4 0.563 0.304 0.259 0.117 40 0.545 0.121 0.424 0.282 95 6 0.547 0.267 0.280 0.138 47 7 0.545 0.347 0.198 0.056 19 8 0.545 0.331 0.214 0.072 24 9 0.493 0.349 0.144 0.002 1 0.513 0.272 0.242 0.100 34 11 0.522 0.218 0.304 0.162 55 12 0.513 0.289 0.224 0.082 28 13 0.501 0.255 0.246 0.104 35 14 0.522 0.084 0.438 0.296 100 a Mezcla de HABA/avidina y amortiguador antes de agregar la enzima (y biotina) . b Valor 5 minutos después de agregar la enzima (y biotina) . c Calculo de la diferencia entre la caída de HABA/Avidina en Abs. por la muestra y la caída en Abs, causada por dilución sola (controles) . Ensayo de Hidrólisis de Avidina (a través de la medición A28o) -medida para S156C-Biotina sola Se llenaron 20 viales eppendorf desechables como se muestra en la Tabla 34. Tabla 34. Ensayo de hidrólisis de avidina Número de A -tiguado: ra Avidina Proteína Biotina Enzima Vial /µl /µl Simulada0 /µl /µl /µl 1 700 100 _d - -2 600 100 100 d -3 700 100 - - 200 de WTe 4 700 100 - - 200 de WTe 5 600 100 100 - 200 de WTe 6 600 100 100 - 200 de WTe 7 690 100 - 10f 200 de WTe 8 690 100 - 10f 200 de WTe 9 590 100 100 10f 200 de WTe 10 590 100 100 10f 200 de WTe 11 690 100 - 10g 200 de WTe 12 690 100 - 10g 200 de WTe 13 590 100 100 10g 200 de WTe 14 590 100 100 10g 200 de WTe 15 700 100 - - 200deS156CMM 16 700 100 - - 200deS156CMM 17 600 100 100 - 200deS156CMM 18 600 100 100 - 200deS156CMM 19 400 100 300 - 200deS156CMM 20 400 100 300 _ 200deS156CMM a Amortiguador de ensayo: 20mM Tris. HCl, 2 mM CaCl2, pH 8.6. b 5 mg/ml solución de avidina (Sigma) en agua Milli-Q. c 0.5 mg/ml solución de Ribonuclesa A con Enlaces de Disulfuro Mezclado (Sigma) en agua Milli-Q. d 200µl de amortiguador MES (10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.8) . e Solución de GG36-WT liofilizada diluida a la misma actividad catalítica como la biotina-CMM (como se determinó por las cinéticas de tasa inicial con sAAPFpNA) en 10 mM MES, lmM CaCl2, pH 5.8 f Solución de d-biotina (Sigma) diluida a la misma concentración (en 10 µl) como en 200 µl de S156C-S-Biotina activa (0.329 mg/ml) en el Amortiguador de Ensayo. 9 Solución de d-biotina (Sigma) diluida a la misma concentración (en 10 µl) como para la cantidad de proteína de 200 µl de S156C-S-Biotina (como se determinó por liofilización) en el Amortiguador de Ensayo. Estas soluciones se incubaron a 35°C en un baño de agua controlado por termostato por el tiempo indicado. Los contenidos de los viales apropiados se colocaron entonces cada uno en la parte superior de un Concentrador Centricon-SR3 (Amicon, MWCO 3000, previamente limpiado por 2 ml de agua Milli-Q centrifugada a 3750 rpm durante 90 min) y se centrífugo a 3750 rpm durante 60 min. Los filtrados resultantes se valoraron como se muestra en la Tabla 35.

Tabla 35. Ensayo. S156C-S-d-Biotina (0. 329MG/ml=2. 4/µM) Número de Tiempo de A28oa Proteína % de Proteína Vial Incub./min. Total/Abs Total Max /Abs 1 60 0.002 2 60 0.014 3 60 0.013 0.005 4 4 240 0.028 0.020 17 5 60 0.040 0.032 27 6 240 0.059 0.051 44 7 60 0.015 0.007 6 8 240 0.030 0.022 19 9 60 0.043 0.035 30 10 240 0.059 0.051 44 11 60 0.013 0.005 4 12 240 0.029 0.021 18 13 60 0.035 0.027 23 14 240 0.046 0.038 32 15 60 0.054 0.046 39 16 240 0.081 0.073 62 17 60 0.058 0.050 43 18 240 0.080 0.072 62 19 60 0.103 0.095 81 _20 240 0.125 0.117 100 a Valor por 700µl del filtrado de ensayo de Hidrólisis de Avidina , diluido con 300 µl de Milli -Q como se comparó con el modelo de agua Milli -Q ( 1 ml ) . Controles sin Avidina Ensayos realizados como Ensayos de Hidrólisis de Avidina excepto las alícuotas de avidina de 100 µl reemplazadas por 100 µl de agua Milli -Q; la medición para S156C-S-Biotina y una cantidad de proteína simulada mayor [0 . 15mg , Simulada (2 ) ] no se reportaron como control sin avidina (ver Tabla 36 ) . Tabla 36 . Ensayo de control de hidrólisis sin avidina Número Tiempo de A28oa Proteína % Max. Proteína Total-Abs de Vial Incub./min Total/ Abs 1 60 -0.001 - 2 60 0.018 - 3 60 0.000 -0.008 -7 4 240 0.009 0.001 0.9 5 60 0.020 0.012 10 6 240 0.035 0.027 23 7 60 0.003 -0.005 -4 8 240 0.010 0.002 2 9 60 0.024 0.016 14 10 240 0.029 0.021 18 11 60 0.001 -0.007 -6 12 240 0.012 0.004 3 13 60 0.026 0.018 15 14 240 0.029 0.021 18 15 60 0.028 0.020 17 16 240 0.024 0.016 14 17 60 0.039 0.031 26 18 240 0.052 0.044 38 a como arriba .

Ensayo de Hidrólisis de Avidina (medición a través de A280) utilizando S166C-biotina, L217C-biotina y N62C-biotina El Ensayo de Hidrólisis de Avidina se realizó también para N62C-S- Biotina y S166C-S-Biotina además de S156C-S-Biotina reportada anteriormente. Para comparación reportamos los resultados para la S156C CMM nuevamente. S156C-S-Biotina produce 72% más de fragmento de proteína después de 240 min. que SBL-WT. En la presencia de la proteína simulada [0.05mg] la cantidad de proteína total producida se incrementa drásticamente para la enzima WT (23% después de 240 min) considerando que la producción de proteína total no cambia significativamente para la biotina-CMM. N62C-S-Biotina proporciona aproximadamente la misma cantidad de fragmentos de proteína que SBL-WT después de 240 min. Sin embargo en la presencia de una simulada la N62C CMM da solo 5% mas de proteína liberada después de 240 min. y por lo tanto es claramente más selectiva que SBL-WT (23% mas de fragmentos de proteína después de 240 min) . Estos resultados sugieren que la cadena lateral de biotina de la N62C CMM se encuentra menos disponible ya que la hidrólisis de proteína total es menos efectiva para esta CMM comparada a S152C CMM que contiene una porción de botina de superficie expuesta. Sin embargo, ya que en la N62 CMM la cadena lateral de biotina se encuentra adyacente al centro catalítico su selectividad de hidrólisis de avidina es tan cercanamente efectiva como para la S156C-S-Biotina . La S166C CMM da un 7% mayor de proteína liberada comparada a SBL-WT pero es claramente no selectiva en la presencia de una proteína simulada [18% de fragmentos de proteína comparados a 23% para SBL-WT después de 240 min.] . Aunque esta enzima prueba ser la segunda mejor de las biotina- CMMs en el "Ensayo de Dirección de Objetivo de Avidina" , es menos selectiva que la N62C CMM con respecto al "Ensayo de Dirección de Avidina" . Presumiblemente la cadena lateral de biotina enterrada en la cavidad Si se encuentra disponible para la avidina de objetivo pero conformacionalmente no es muy favorable para la catálisis selectiva y efectiva de la hidrólisis de avidina. Experimento : Se llenaron catorce viales eppendorf desechables como se muestra en la Tabla 37.

Tabla 37 Establecimiento para el ensayo de la hidrólisis de avidina. Número Amortiguador3 Avidina" Proteína Biotina Enzima de Vial /µl /µl simulada c/µl /µl /µl 1 700 100 d - - 2 600 100 100 d - 3 700 100 - - 200 de WTe 4 700 100 - - 200 de WTe 600 100 100 - 200 de WTe 6 600 100 100 - 200 de WTe 7 700 100 - - 200 de biotina-CMMf 8 700 100 - - 200 de biotina-CMMf 9 600 100 100 - 200 de biotina-CMMf 600 100 100 - 200 de biotina-CMMf 11 690 100 - 10g 200 de WTe 12 690 100 _ 10g 200 de WTe 13 590 100 100 10g 200 de WTe 14 590 100 100 10g 200 de WTe a Amortiguador de Ensayo: 20 mM Tris. HCl, 2 mM CaCl2, pH 8.6 b 5 mg/ml de solución de avidina (Sigma) en agua Milli-Q. c 0.5 mg/ml de solución de Ribonucleasa A con Enlaces de Disulfuro Mezclados (Sigma) en agua Milli-Q. d 200 µl de amortiguador MES (10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.8). e Solución de GG36-WT liofilizada diluida a la misma actividad catalítica como la biotina-CMMs (como se determinó por las cinéticas de tasa inicial con succ-AAPF-pNA) en 10 mM MES, 1 mM CaCl , pH 5.8 (concentraciones de biotina-CMMs verf) . f S156C-S-Biotina (0.329 mg/ml), N62C-S-Biotina (0.260 mg/ml), S166C-S-Biotina (0.534 mg/ml); concentraciones de biotina-CMMs calculadas para la misma actividad catalítica (como se determinó por las cinéticas de tasa inicial con succ-AAPF-pNA) ; soluciones en 10 mM MES, 1 mM CaCl , pH 5.8. 9 Solución de d-biotina (Sigma) diluida a la misma concentración (en 10 µl) como en 200 µl de biotina-CMM activa (biotina 0.060 mg/ml para S156C-S-Biotina, biotina 0.047 mg/ml para N62C-S-Biotina, biotina 0.097 mg/ml para S166C-S-Biotina) o como la cantidad de proteína de 200 µl de S156C-S-Biotina (como se determinó por la liofilización; biotina 0.649 mg/ml) en el Amortiguador de Ensayo. Estas soluciones se incubaron a 35°C en un baño de agua controlado por termostato durante el tiempo indicado. Los contenidos de los viales apropiados se colocaron entonces cada uno en la parte superior de un Concentrador Centricon SR3 o Centricon YM-3 (Amicon, MWCO 3000, previamente limpiado con 2 ml de agua Milli-Q centrifugada a 3750 rpm durante 90 min.) y se centrífugo a 3750 rpm durante 60 min. Los filtrados resultantes se valoraron entonces y los resultados se muestran en: Tabla 38, Tabla 39, Tabla 40, Tabla 41 y Tabla 42.

Tabla 38 Resultados para el ensayo de hidrólisis de avidina para controles y WT Número Tiempo de A280a Proteína % Max.Proteína Total-Abs de Vial Incub./min Total/ Abs 1 60 0.004 - 2 60 0.013 - 3 60 0.023 0.014 19 4 240 0.029 0.020 28 5 60 0.035 0.026 36 6 240 0.046 0.037 51 a Valor determinado por triplicado para 700 µl del filtrado del Ensayo de Hidrólisis de Avidina diluido con 300 µl de Milli-Q según se compara con el modelo de agua Milli-Q (1 ml) .

Tabla 39 Resultados para el ensayo de hidrólisis de avidina para S156C-S-Biotina. Número Tiempo de A280 Proteína % Max.Proteína Total-Abs de Vial Incub./min Total/Abs 7 60 0.054 0.045 62 8 240 0.081 0.072 100 9 60 0.058 0.049 68 10 240 0.080 0.071 99 9b 60 0.103 0.094 131 10b 240 0.125 0.116 161 a Valor para 700 µl del filtrado del Ensayo de Hidrólisis de Avidina diluido con 300 µl de Milli-Q según se comparó con el modelo de agua Milli-Q (1 ml) . b 300 µl en vez de 100 µl de la proteína simulada utilizada.

Tabla 40 Resultados para el ensayo de hidrólisis de avidina para la N62C-S-Biotina . Número Tiempo de A280a Proteína % Max.Proteína Total-Abs de Vial Incub./min Total/Abs 7 60 0.018 0.009 12 8 240 0.032 0.023 32 9 60 0.029 0.020 28 10 240 0.036 0.027 37 a Como arriba Tabla 41 Resultados para el ensayo de hidrólisis de avidina para S166C-S-Biotina Número Tiempo de A28oa Proteína % Max.Proteína Total-Abs de Vial Incub./min Total/Abs 7 60 0.026 0.017 24 8 240 0.034 0.025 35 9 60 0.033 0.024 33 10 240 0.047 0.038 53 Como arriba Tabla 42 Controles de hidrólisis de avidina por SBL-WT con diferentes cantidades de biotina agregada. Número de Incub. A280a Proteína % Max.Proteína Total-Abs Vial Tiempo/min Total/Abs l lb 60 0.015 0.006 8 12b 240 0.030 0.021 29 13b 60 0.045 0.036 50 14b 240 O051 0.042 58 l lc 60 0.014 0.005 7 12c 240 0.026 0.017 24 13c 60 0.030 0.021 29 14c 240 0.039 0.030 42 l ld 60 0.021 0.012 17 12d 240 0.032 0.023 32 13d 60 0.036 0.027 37 14d 240 0.047 0.038 53 l le 60 0.013 0.004 5 12e 240 0.029 0.020 28 13e 60 0.035 0.026 36 14e 240 0.046 0.037 51 a Como arriba b Misma cantidad de biotina como en S156C-S-Biotina activa. c Misma cantidad de biotina como en N62C-S-Biotina activa. d Misma cantidad de biotina como en S166C-S-Biotina activa. e Misma cantidad de biotina como en S156C-S-Biotina calculada para la cantidad de proteína total (enzima activa e inactiva) . Ejemplo 11 Anticuerpos dirigidos al objetivo utilizando una Subtilisina Modificada por Hapteno Como una extensión de la degradación de enzima objetivo, nos hemos enfocado ahora en la degradación de anticuerpos dirigida por hapteno mediante SBL. Este ejemplo demuestra los anticuerpos dirigidos al objeto utilizando un sistema anticuerpo antibiotina/biotina . Preparación de biotina-MTS y CMMs biotiniladas A fin de dirigir la anti-biotina con SBL, hemos unido el reactivo biotina-MTS a nuestras enzimas mutantes.

La síntesis de la biotina-MTS se realizó como se representa en el Ejemplo 8. Cada una de las CMMs se preparó de acuerdo al protocolo estándar, e.g., según se describe en el Ejemplo 9. Todas la CMMs se caracterizaron utilizando la técnica MALDI que tiene un error dependiente del método en la magnitud de ± 0.2-0.5%. Los resultados se muestran en la Tabla 43 y la Tabla 44.

Tabla 43 MALDI-MS para CMMs biotiniladas Enzima Masa Calculada Encontrada % de error N62C-Biotina 26931 26943.7 0.04 S156C-Biotina 26958 26980.4 0.08 S166C-Biotina 26958 26977.5 0.07 L217C-Biotina 26932 26971.7 0.14 Las actividades de la amidasa de las nuevas CMMs biotiniladas se determinaron y mostraron la misma tendencia como se describió en el Ejemplo 9. Los resultados se muestran en la Tabla 36.

Tabla 44 Actividad de la Amidasa para las CMMs Biotiniladas Enzima Actividad de amidasa K Ml kcat' M WTa 153 0.73 209 N62C-Biotina 108.86 0.96 113.40 S156C-Biotina 59.46 0.78 76.46 S166C-Biotina 46.00 0.999 45.83 L217C-Biotina 55.35 1.07 51.73 Ensayo dirigido al objetivo para CMMs biotiniladas para la antibiotina Los anticuerpos para la biotina (anti-biotina) se encuentran comercialmente disponibles ya sea como anticuerpo libre o como un conjugado de enzimas. Seleccionados un conjugado de antibiotina para la fosfatasa alcalina como nuestro anticuerpo objetivo modelo. Utilizando el inmunoanálisis ligado a enzimas técnica- (ELISA) , podemos demostrar la habilidad de nuestras CMMs para dirigir el anticuerpo. El experimento se representa esquemáticamente en la Figura 17. Nuestra primera serie de ensayos se llevó a cabo utilizando la técnica-ELISA (Figura 17) con placas de poliestireno de 96 cavidades (Harlow y Lañe (1988) Antibodies : A laboratrory Manual : Cold Spring Habour Laboratory, USA, p 564-597) . La CMM se inmovilizó en la superficie de la placa durante la noche a 4°C [típicamente el enlace de proteína a una placa de poliestireno es aproximadamente de 100 ng/cavidad (300 ng/cm2) . En nuestro caso, unimos menos proteína a medida que no llenamos completamente cada cavidad con solución de enzima] . Después de bloquear los sitios de enlace restantes en la placa con BSA, la proteína no enlazada (anticuerpo y BSA sin unir) se lavó dos veces con salina amortiguada con fosfato que contenía Tween, pH 7.2 (PBST) . (El Tween se utilizó en este amortiguador para evitar la superficie no enlazada del poliestireno a partir de la unión del anticuerpo) . Entonces se agregó la antibiotina a cada cavidad y se incubó a 4°C durante 2 horas. La placa se lavó con PBST (4 veces) para retirar la proteína no unida, suelta, y después con amortiguador de glicina pH 10.4 (2 veces) para retirar el amortiguador de fosfato y optimizar el pH para la actividad de la fosfatasa alcalina. Para valorar el enlace biotina-CMM/anti -biotina se utilizó la actividad de la enzima anticuerpo-fosfatasa alcalina enlazada. El substrato de la fosfatasa [una solución de sal de p-nitrofenilfosfato disódica (PNP) en amortiguador de glicina pH 10.4] se lavó y la reacción se llevó a cabo a 4°C. Se determinó el nitrofenolato liberado utilizando visualmente una placa de 96 cavidades (Figura 17) . A partir de los resultados de las 96 cavidades, encontramos que la cantidad de substrato de PNP es muy importante para demostrar las diferencias de las capacidades de dirección de objetivo de nuestras biotina-CMMs hacia la antibiotina. Utilizando una gran cantidad de substrato no fuimos capaces de distinguir entre diferentes CMMs, como todos dio un color amarillo brillante dentro de los 30 minutos. Sin embargo, todavía fuimos capaces de discernir la localización de la S156C-biotina en las placas ya que el cambio de color fue extremadamente rápido en este caso. También llevamos a cabo una reacción de control utilizando PMSF como un inhibidor para WT- y CMM-SBL (como SBL puede hidrolizar la antibiotina conduce a un resultado negativo) . No pudo encontrarse diferencia entre las reacciones con y sin PMSF. Por lo tanto excluimos este reactivo de nuestros siguientes experimentos. Utilizando el mismo protocolo y condiciones como para los experimentos de placa de 96 cavidades, se llevaron a cabo experimentos posteriores en cubetas de poliestireno y se monitoreo espectrofotométricamente la absorción (A4os) del p-nitrofenolato liberado a partir de PNP (150 µl en 1 ml) (Tabla 45) . Debido a la alta dilución de PNP utilizada, la reacción tuvo que monitorearse por un largo tiempo. Se observará que los resultados del ensayo utilizando cubetas no siempre fue consistente como aquel de las placas de 96 cavidades. Esto se debió probablemente al hecho que las placas de 96 cavidades se habían desarrollado para la unión de proteínas. Los resultados del ensayo se muestran el la Tabla 37. Tabla 45 Ensayo A405 (liberación de p-nitrofenolato, baja concentración de PNPP) A405 tiempo (h) WT N62C-Biotina S156C-Biotina S166C-Biotina L217C-Biotina 18 0.145 1.018 1.111 0.483 0.292 24 0.173 1.191 1.322 0.569 0.348 27 0.222 1.522 1.689 0.736 0.451 0.259 1.739 1.915 1.065 0.526 Todas las CMMs ocasionaron una liberación mayor de p-nitrofenolato según se comparó a WT. Se encontró que S156C-biotina induce la mayor liberación de p-nitrofenolato (hasta de 86.5% mas que WT después de 30 h) que se muestra ser la CMM más eficiente para dirigir la IgG de la Antibiotina. Experimentos adicionales sugieren que la concentración de PNP puede incrementarse (300 µl en 1 ml) para cortar el tiempo de observación. La tendencia del p-nitrofenolato liberado es la misma como en el ensayo de baja concentración de PNP. Los resultados se muestran en la Tabla 46. Tabla 46 Ensayo A40s (liberación de p-nitrofenolato, alta concentración de PNPP) tiempo (h) WT N62C-Biotina S156C-Biotina S166C-Biotina L217C-Biotina 6 0.214 0.667 1.040 0.647 0.483 12 0.398 0.969 1.400 0.908 0.577 Todas las CMMs biotiniladas dieron una liberación de p-nitrof enolato incrementada comparada a WT . Por lo tanto debe haber ocurrido el enlace de la biotina-CMMs a la anti biotina . Los resultados del ensayo (Tablas 37 y 38 ) demuestran claramente la capacidad de nuestras CMMs biotiniladas para dirigir un anticuerpo-biotina Ensayo de "Hidrólisis" de la anti-biotina mediante CMMs biotiniladas A continuación, nos interesamos en demostrar la capacidad de nuestras CMMs para hidrolizar selectivamente la antibiotina. Adoptamos el enfoque utilizado exitosamente para monitorear la liberación de los fragmento de proteína durante la hidrólisis de avidina mediada por SBL. Debe observarse que se utilizaron concentraciones iguales de enzimas activas (como se determinó para la titulación de PMSF) en estos experimento. Las enzimas e IgG antibiotina se incubaron en amortiguador Tris (Tris HCl 20 mM, CaCl2 2mM, pH 8.6) a 35°C durante 60 y 240 min. Los fragmentos de proteína se separaron del hidrolisado crudo utilizando membranas de exclusión por tamaño según se reportó previamente. La medición de la absorción a 280 mM aforó la concentración de los fragmento de proteína liberados. Los resultados se muestran en la Tabla 47.

Tabla 47 Ensayo de hidrólisis de anti-biotina (A8o) Enzima A280 (60 min) A280 (240 min) anti-Biotina + Tris (modelo) 0.004 0.008 WT 0.086 0.087 N62C-Biotina 0.102 0.112 S156C-Biotina 0.140 0.177 S166C-Biotina 0.115 0.127 L217C-Biotina 0.069 0.125 Los resultados, excepto uno (L217C-Biotina ) , demostraron claramente que nuestras CMMs son capaces de hidrolizar la antibiotina mejor que WT. Estos resultados también corresponden a los resultados de dirección de objetivo (ensayo A40s para la liberación de p-nitrofenolato) que muestran que todas las CMMs biotiniladas se dirigen a la antibiotina y por lo tanto dan una liberación mayor de p-nitrofenolato que WT. Para determinar si o no la hidrólisis fue específicamente hacia la antibiotina, adoptamos de nuevo el experimento de ensayo de antibiotina que utiliza RNAasa como una proteína simulada. LOs resultados para cada hidrólisis de CMM comparados a WT se muestran en la Tabla 48, Tabla 49, Tabla 50 y Tabla 51.

Tabla 48 Ensayo (A280) para la hidrólisis selectiva de antibiotina por biotina-CMM N62C-biotina y por WTa tiempo A280 (min) WT WT+simulada diferencia N62C- N62C- Biotina Biotina+simulada diferencia 60 0.040 0.148 0.108 0.045 0.068 0.023 240 0.040 0.148 0.108 0.052 0.075 0.023 Tabla 49 Ensayo (A280) para la hidrólisis selectiva de antibiotina por biotina-CMM S156C-biotina y por WTa tiempo A2 80 (min) WT WT+simulada diferencia S156C- S156C- Biotina Biotina+simulada diferencia 60 0.040 0.148 0.108 0.110 0.112 0.002 240 0.040 0.148 0.108 0.134 0.148 0.014 Tabla 50 Ensayo (A 80) para la hidrólisis selectiva de anti biotina por biotina-CMM S166C-biotina y por WTa tiempo A280 (min) WT WT+simulada diferencia S166C- S166C- Biotina Biotina+simulada diferencia 60 0.040 0.148 0.108 0.074 0.085 0.011 240 0.040 0.148 0.108 0.087 0.090 0.003 Tabla 51 Ensayo (A280) para la hidrólisis selectiva de antibiotina por biotina-CMM L217C-biotina y por WTa tiempo A28o (min) WT WT+simulada diferencia L217C- L217C- Biotina Biotina+simulada diferencia 60 0.040 0.148 0.108 0.037 0.060 0.023 240 0.040 0.148 0.108 0.053 0.065 0.012 a Los números en la Tabla se corrigen con A280 de la reacción de fondo .

Los experimentos revelan que las diferencias en el grado de hidrólisis entre las reacciones llevadas a cabo en la presencia y ausencia de la proteína simulada para las reacciones catalizadas por CMMs son mucho mas pequeñas que para las reacciones catalizadas por WT. En consecuencia, como se esperaba, nuestras CMMs biotiniladas hidrolizan la anti-biotina mas específicamente que WT. Los experimentos de control se llevaron a cabo sin anti-biotina (solo SBL-CMM y RNAasa) así como con CMM y el amortiguador Tris solo (sin RNAasa y anti-biotina) . La absorción de fondo fue insignificante en todos los casos. Experimento : 5- ( [3aS- (3aa,4ß, 6aa) ] -Hexahidro-2-oxo-lH-tieno [3,4-] imidasol-4-il) pentil metanotiosulfonato [ (+) - Biotina-MTS] La biotina-MTS se preparó de acuerdo al procedimiento descrito en el Ejemplo 8. Materiales Se preparó solución salina amortiguada por fosfato (PBS) a partir de 8 g de NaCl , 0.2 g de KCl, 1.44 g de Na2HP04, 0.24 g de KH2P0 en un litro de agua pH ajustado a 7.2 con HCl ÍN y se almacenó a temperatura ambiente. Se preparó solución de azida de sodio al 10% a partir de 10 g de NaN3 en 100 ml de agua y se almacenó a temperatura ambiente.

Se preparó una solución de BSA al 3% en PBS a partir de 3 g de albúmina de suero bovino (fracción V) en 100 ml de agua, después se agregaron 0.2 ml de solución de NaN3 al 10% y se almacenó a 4°C. La solución amortiguada por fosfato con Tween (PBST) se preparó a partir de 0.5 ml de Tween 80 en un litro de solución de PBS. Se preparó solución de antibiotina (1:30,1000) a partir de 16.67 µl de anti-biotina (Sigma a-6561 clon BN-34, conc. 1.15 mg/ml) en 50 ml de BSA/PBS al 3% y se almacenó a 4°C. Se preparó solución de amortiguador de glicina 0.1 M pH 10.4 a partir de 7.51 g de glicina, 203 mg de MgCl2H20, 136 mg de ZnCl2 en un litro de agua. El pH se ajustó a 10.4 con NaOH 10 N. Se preparó solución de p-Nitrofenilfosfato lmg/ml a partir de 1 tableta de PNP (Sigma N-2765) (20 mg) en 20 ml de amortiguador de glicina 0.1 M y se almacenó a 4°C. Se preparó solución de PMSF 0.06 M a partir de 47.2 mg de atoluenosulfonil fluoruro (PMSF) en 449.2 µl de EtOH y se almacenó a 0°C. Se utilizaron las siguientes enzimas: WT(1 mg/ml), N62C-Biotina (0.97 mg/ml), S156C-Biotina (0.71 mg/ml), S16C-Biotina (1.09 mg/ml) y L217C-Biotina (1.0 mg/ml). Todas las enzimas se disolvieron en amortiguador MES (MES 20 mM, CaCl2, lmM, pH 5.8) . El amortiguador Tris 0.1 M pH 8.6 consistió de 1.21 mg de Tris en 100 ml de agua. El pH se ajustó a 8.6 con HCl concentrado. La ribonucleasa A, 5mg/ml consistió de 5 mg de ribonucleasa a (con enlace de disulfuro mezclados, Sigma R-2638) en 1 ml de agua. Ensayo dirigido al objetivo de CMM-SBL para Anti- Biotina utilizando placa de poliestireno de 96 cavidades Se agregaron 50 µl de cada solución de enzima a cada una de las cavidades de un placa de poliestireno de 96 cavidades como se muestra en la Figura 18. Todas las reacciones se condujeron dos veces para verificar la reproducibilidad de los resultados. La placa se incubó a 4°C durante la noche. Las soluciones de enzimas restantes se removieron utilizando una pipeta. Después se agregó BSA/PBS (3% 100 µl) a cada cavidad y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La solución de BSA se retiró y la placa se secó al oscilarla y sacudirla sobre capas de toallas de papel. Se agregó PMSF (10 µl) a las columnas 1,3,5,7,9,11, líneas A y B. Después de este procedimiento la placa se lavó con PBST (2x) y se secó como se describió previamente. La solución de antibiotina (30 µl se agregó a cada cavidad excepto para 1,3,5,7,9,11 C y D, y la placa se mantuvo durante dos horas a 4°C para minimizar la proteolisis del anticuerpo mediante las enzimas. La solución de anti-biotina se retiró, la placa se lavó con PBST (4x) para retirar el anticuerpo sin enlazar, y se secó a fin de retirar el anticuerpo sin enlazar. El amortiguador de fosfato se removió y el pH se ajustó para la actividad de la fosfatasa alcalina al lavar la placa con amortiguador de glicina (0.1 M, pH 10.4) (2x) y se secó de ahí en adelante. Después, el amortiguador de glicina y la solución de PNPP se agregaron a las cavidades de la siguiente manera : 1. Columna 1,3,5,7,9,11 línea A y B (ya tratada con solución PMSF 10 µl)se llenó con 40 µl 1 mg/ml de PNPP 2. Columna 2,4,6,8,10,12 línea A y B se llenó con 50 µl 1 mg/ml de PNPP 3 Columna 2,4,6,8,10,12 línea C y D se llenó con 25 µl 1 mg/ml de PNPP + 25 µl de amortiguador de glicina. 4 Columna 2,4,6,8,10,12 línea E y F se llenó con 12.5 µl 1 mg/ml de PNPP + 37.5 µl de amortiguador de glicina. 5 Columna 2,4,6,8,10,12 línea G y H se llenó con 6 µl 1 mg/ml de PNPP + 44 µl de amortiguador de glicina. 6. Columna 1,3,5,7,9,11 línea C y D se llenó con 50 µl 1 mg/ml de PNPP. Los resultados del ensayo se resumen como sigue: Las reacciones en las columnas 1, 2 y 3 cambiaron a color amarillo casi instantáneamente para todas las enzimas.

Después de 15 min, las reacciones en 4 para S156-Biotina se detuvieron para cambiar visiblemente su color a amarillo pálido. S166C- se detuvo cambiando el color después de 20 minutos. N62C- se detuvo cambiando el color después de 1 hora. Después de 1,5 horas, no hubo cambio de color para WT y L217C-. Las reacciones en 6 para S156C- dio un cambio de color después de 2 horas. Todas las reacciones tuvieron color amarillo fuerte después de la incubación durante la noche a 4°C.

Ensayo de dirección de objetivo de CMM-SBL a Anti- Biotina utilizando cubetas de poliestireno La inmovilización de las enzimas y la antibiotina y los procesos de lavado para las cubetas se condujeron de manera similar a la descrita para la placa de 96 cavidades. Se utilizaron dos diferentes concentraciones de PNPP. Los experimentos se llevaron a cabo por duplicado y los datos mostrados en la Tabla 52 de abajo son los resultados promedio : Tabla 52 Ensayo de dirección de objetivo en cubetas de poliestireno Enzima PNPP Amort.de -A405 Glicina tiempo (h) µl µl 6 12 18 24 27 30 WT 150 850 - - 0.145 0.173 0.222 0.259 N62C- 150 850 - - 1.108 1.191 1.522 1.739 S156C- 150 850 - - 1.111 1.322 1.689 1.915 S166C- 150 850 - - 0.483 0.569 0.736 1.065 L217C- 150 850 - - 0.292 0.348 0.451 0.526 WT 300 700 0.214 0.398 - - - N62C- 300 700 0.667 0.969 - - - S156C- 300 700 1.040 1.400 - - - S166C- 300 700 0.647 0.908 - - - L217C- 300 700 0.483 0.577 - - - a Se utilizó Amortiguador de glicina para poner a cero la absorción de fondo.

"Ensayo de Hidrólisis" de la Anti-Biotina con Biotina-CMMs y WT Se llenaron viales eppenforf de acuerdo a la Tabla 43. Los viales se incubaron entonces a 35°C en un baño de agua controlada por termostato durante 60 y 250 minutos. Los contenidos de cada vial se colocaron entonces en la parte superior de un filtro Centricon YM-3 (Amicon, MWCO 3000, pre-enjuagado con 2 ml de agua Milli-Q centrifugada a 3750 rpm durante 90 minutos) y se centrifugaron a 3750 rpm durante 60 minutos. Los filtrados se valoraron entonces al medir A28o (puestos a cero nuevamente con agua Milli-Q) . Los resultados son como se muestra en la Tabla 53. Tabla 53 Ensayo de hidrólisis de anti-biotina con biotina- CMMs y WT A28o Enzima2 Anti-Biotina Amort.Tris ARNasa tiempo (min) µl µl µl 60 240 - 50 940 - 0.004 0.008 - 50 930 10 0.005 0.007 WT - 990 - 0.046 0.050 N62C- - 990 - 0.057 0.060 S156C- - 990 - 0.028 0.029 S166C- - 990 - 0.041 0.040 L217C- - 990 - 0.072 0.072 WT - 980 10 0.025 0.036 N62C- - 980 10 0.055 0.060 S156C- - 980 10 0.045 0.054 S166C- - 980 10 0.040 0.045 L217C- - 980 10 0.051 0.059 WT 50 940 - 0.086 0.087 N62C- 50 940 - 0.102 0.112 S156C- 50 940 - 0.140 0.117 S166C- 50 940 - 0.115 0.177 L217C- 50 940 - 0.069 0.125 WT 50 930 10 0.173 0.184 N62C- 50 930 10 0.123 0.135 S156C- 50 930 10 0.155 0.188 S166C- 50 930 10 0.125 0.135 L217C- 50 930 10 0.114 0.124 a Se utilizó 1 mg de enzima activa para cada experimento (WT=11.5 µl, N62C-=11.8 µl, S156C-=16.2 µl, S166C-= 10.6 µl, L217C-=11.5 µl) . La concentración de cada enzima se describe como se determinó por la titulación de PMSF en la Sección de Materiales . b Los datos mostrados de la absorción actual (los datos se corrigieron al restar la absorción actual de la absorción de fondo correspondiente) . Ejemplo 12 Ensayo para las Capacidades de Enlace Residual de Anti-Biotina antes de la exposición a Biotinil-CMMs Degradación de Anti-Biotina La capacidad de S156C-biotina para destruir la IgG de anti-biotina se examinó utilizando experimentos de micro-división. También se realizaron dos experimentos control para validar los datos. Se extrajeron periódicamente alícuotas de una mezcla de anticuerpo-CMM (1:1, molécula :moécula) a partir de un vial incubado (pH 8.6, 35°C) , y la solución de biotina se agregó a la alícuota. Se anticipo que solo una molécula de CMM se uniría a cada molécula de anticuerpo, a medida que el volumen esférico de la CMM bloqueara la aproximación de una segunda molécula de CMM para el otro sitio de enlace disponible del anticuerpo. Sin embargo, la biotina molecular deberá ser suficientemente pequeña para permitir que se una al segundo sitio de enlace del anticuerpo. A medida que se degradan los sitios de enlace del anticuerpo, pocos sitios de enlace estarán disponibles dando como resultado mas biotina sin enlazar. Utilizando una membrana 3000 MWCO, la biotina sin enlazar se separa de las macromoléculas y la concentración de biotina se valora utilizando el sistema HABA/avidina . De manera adicional los experimentos de control se realizaron conteniendo únicamente conteniendo biotina (hapteno) . También se estudiaron los experimentos donde el anticuerpo se había pre-incubado con biotina (hapteno) antes de la adición con la CMM. La reducción en el valor observado de A50o corresponde a la disminución de la capacidad de enlace del anticuerpo (Figura 19) . Ensayo para Probar la Destrucción de los Sitios de Enlace de la Anti-Biotina Experimento : Se utilizó para los estudios, IgG de antibiotina monoclonal (clon BN-34, Sigma, concentración de inmunoglobulina 1.3 mg/ml) conjugada para la fosfatasa alcalina. El amortiguador TRIS empleado para estos estudios fue el amortiguador estándar empleado para nuestros estudios de cinética de amidasa (0.1 M, pH 8.6, 0.005% Tween). Se preparó una solución de biotina (1.94 mg/ml) en Tris (pH 8.6) . Se agregaron 10 µl de esta solución a 779.5 µl de TRIS (esta solución se referirá como B/70 a través de todo) . Se preparó un vial Eppendorf que contenía TRIS (700.5 µl) y anti-biotina (37.5 µl, 1.3 mg/ml de inmunoglobulina, fosfatasa alcalina etiquetada) . Se agregó al vial S156C-biotina (12.15 µl, 0.71 mg/ml). El vial se agitó, y se colocó en un baño de agua (35°C) . Se extrajeron periódicamente alícuotas (170 µl) del vial, se agregó B/79 (20 µl) a cada alícuota, y la mezcla se transfirió entonces a un filtro Centricon pre-enjuagado. Los filtros se centrifugaron (2x lh, 3750 rpm, 4°C) y el filtrado se recolectó. El filtrado se valoró para el contenido de biotina utilizando el sistema HABA/avidina: se agregaron 70 µl del filtrado a 70 µl del reactivo de HABA/avidina, y se observó la lectura A50o de la mezcla utilizando una cubeta de 130 µl . Los resultados se tabulan abajo en la tabla 54.

Tabla 54 Resultados de A50o del ensayo de degradación del sitio de enlace de anti-biotina . Tiempo de A500 incubación/h CMM, entonces hapteno 0 0.3172 1 0.31 2 0.2945 3 0.2907 Experimentos de control Se preparó una solución de biotina (1.94 mg/ml en TRIS (pH 8.6). La solución se diluyó 20 veces (referida a través de todo como B/20) . Los viales eppendorf se llenaron de acuerdo a la Tabla 55, y se incubaron por diferentes tiempos a 35°C Tabla 55 Volúmenes utilizados para los experimentos de control (cada uno preparado por cuadruplicado) Experimento Contenidos de cada vial para cada punto de tiempo TRIS anti-biotina S156C-Biotina B/20 (µl) (µl) (µl) (µl) Ab entonces B/20Incubado 693 37.5 0 20 Ab entonces B/20,entonces 681 37.5 12.15 20 CMM Incubado Después déla incubación, los contenidos de cada vial se transfirieron a un filtro Centricon pre-enjuagado (MWCO 3000) , y los filtros se centrifugaron. Los filtrados se valoraron espectrofotométricamente utilizando el reactivo HABA/avidina: se agregaron 500 µl del reactivo HABA/avidina, y se determinó el valor A50o utilizando una cubeta de 1 ml . Los resultados se muestran en la Tabla 56.

Tabla 56 Resultados de A50o para los experimentos de control Tiempo de incubaciónh hapteno entonces CMM solo hapten 0 0.252 0.2687 1 0.2466 0.2659 2 0.2531 0.2704 3 0.2517 0.2702 Ejemplo 13 Estequiometría de la Degradación Dirigida al objetivo de los Ejemplos Anteriores En varios experimentos se encontraron los siguientes antagonistas catalíticos para funcionar estequiométricamente: pirazol CMM-HLADH (Ejemplo 2), pirazol CMM-HLADH en la presencia de AP (Ejemplo3) , pirazol CMM-HLADH estequiométrico (Ejemplo4) , CMM biotinilada Con A de azúcar (Ejemplos 7 y 8) , biotina CMM-Avidina, y biotina CMM-IgG de anti-biotina. Se entenderá que los ejemplos y modalidades descritos en la presente son únicamente para propósitos ilustrativos y que sugerirán varias modificaciones o cambio a la luz de las mismas a personas de experiencia en la materia y se incluyen dentro del espíritu y campo de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan aquí para referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un antagonista catalítico de una molécula objetivo, comprendiendo dicho antagonista una porción dirigida al objetivo, que se enlaza específicamente a dicha molécula objetivo estando unida dicha porción dirigida al objetivo a una enzima que degrada dicha molécula objetivo para reducir el enlace de la molécula objetivo a su ligando análogo y a dicha porción dirigida al objetivo dando como resultado mediante esto la liberación de dicho antagonista permitiendo así que dicho antagonista se enlace y degrade otra molécula objetivo.
2. El antagonista de la reivindicación 1, en donde dicho porción dirigida al objetivo se une a dicha enzima a través del grupo sulfuro en una cisteína.
3. El antagonista de la reivindicación 2, en donde dicha cisteína es una cisteína que se substituye por un aminoácido nativo diferente a la cisteína en dicha enzima.
4. El antagonista de la reivindicación 3 , en donde dicha cisteína es una cisteína que se substituye por un aminoácido nativo diferente a la cisteína en o cerca de un subsitio que comprende un sitio de enlace de substrato de dicha enzima.
5. El antagonista de la reivindicación 4, en donde dicha cisteína es una cisteína que se substituye por un aminoácido que forma un sitio de enlace de substrato.
6. El antagonista de la reivindicación 3, en donde dicha enzima es una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste de una proteasa, una esterasa, una amidasa, una peptidasa, una lactamasa, una celulasa, una oxidasa, una óxidoreductasa, una reductasa, una transferasa, una hidrolasa, una isomerasa, una ligasa, una lipasa, una fosfolipasa, una fosfatasa, una quinasa, una sulfatasa, una lisozina, una glicosidasa, una nucleasa, una aldolasa, una quetolasa, una liasa, una ciclasa, una transcriptasa inversa, una hialuronidasa, una amilasa, una cerebrosidasa y una quitinasa.
7. El antagonista de la reivindicación 6, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa.
8. El antagonista de la reivindicación 5, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa tipo subtilisina y dicha cisteína se substituye por un aminoácido en o cerca de un subsitio seleccionado a partir del grupo que consiste de un subsitio Sl, un subsitio SI' y un subsitio S2.
9. El antagonista de la reivindicación 8, en donde dicha enzima es una subtilisina de Bacillus lentus .
10. El antagonista de la reivindicación 8, en donde dicha cisteína se substituye por un aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una subtilisina de Bacillus lentus, en donde dicho residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste del residuo 156, residuo 166, residuo 217, residuo 222, residuo 62, residuo 96, residuo 104, residuo 107, residuo 189 y residuo 209.
11. El antagonista de la reivindicación 6, en donde dicha enzima es una serina proteasa tipo quimiotripsina y dicha cisteína se substituye por un aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una tripsina madura (ingreso 1TPP del Protein Data Bank) , en donde dicho residuo de referencia se encuentra en o cerca del residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Tyr94, Leu99, Glnl75, Aspl89, Serl90, Glnl92, Phe41, Lys60, Tyrl51, Ser214 y Lys224.
12. El antagonista de la reivindicación 7, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa tipo alfa/beta y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una lipasa de Candida antartica (ingreso 1TCA del Protein Data Bank) , en donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Trpl04, Leul40, Leul44, Vall54, Glul88, Ala225, Leu278 e Ile285.
13. El antagonista de la reivindicación 7, en donde dicha enzima es una aspartilo proteasa.
14. El antagonista de la reivindicación 13, en donde dicha enzima es una proteasa tipo pepsina y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en la pepsina humana madura (ingreso 1PSN del Protein Data Bank) , en donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Tyr9, Met12, Glul3, Gly76, Thr77, Phelll, Phell7, Ilel28, Serl30, Tyrl89, Ile213, Glu239, Met245, Gln287, Met289, Leu291 y Glu294.
15. El antagonista de la reivindicación 6, en donde dicha enzima es una cisteína proteasa.
16. El antagonista de la reivindicación 15, en donde dicha enzima es una papaína y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde al residuo de referencia en una papaína madura (ingreso 1BQI del Protein Data Bank) , donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Asnl8, Ser21, Asn64, Tyr67, Trp69, Glnll2, Glnl42, Aspl58, Trpl77 y Phe207.
17. El antagonista de la reivindicación 6, en donde dicha enzima es una metaloproteasa.
18. El antagonista de la reivindicación 17, en donde dicha enzima es una metaloproteada y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en la metaloproteasa de matriz humana madura (ingreso 83OC del Protein Data Bank) , donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Leulll, Phel75, Tyrl76, Serl82, Leul84, Phel89, Tyr214, Asp231, Lys234 e Ile243.
19. El antagonista de la reivindicación 1, en donde dicho objetivo es una molécula presente en la superficie de una célula.
20. El antagonista de la reivindicación 19, en donde dicha molécula presente en la superficie de una célula es una molécula que forma un receptor.
21. El antagonista de la reivindicación 19, en donde dicha molécula presente en la superficie de una célula es un ligando.
22. El antagonista de la reivindicación 19, en donde dicha molécula presente en la superficie de una célula es un componente de una pared celular.
23. El antagonista de la reivindicación 19, en donde dicha molécula presente en la superficie de una célula es un componente de una membrana celular.
24. El antagonista de la reivindicación 1, en donde dicha porción dirigida al objetivo se selecciona a partir del grupo que consiste de una proteína, un antígeno, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un complejo de coordinación, un azúcar, una vitamina, un dendrímero y un éter de corona.
25. El antagonista de la reivindicación 24, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un ligando análogo para un receptor o una enzima.
26. El antagonista de la reivindicación 24, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un inhibidor para un receptor o una enzima .
27. El antagonista de la reivindicación 1, en donde dicha enzima es una proteasa y dicha porción dirigida al objetivo es un ligando seleccionado a partir del grupo que consiste de un carbohidrato, una vitamina, o análogo de vitamina, un inhibidor de enzima, un péptido, un compuesto farmacéutico que es una molécula orgánica pequeña, y biotina.
28. El antagonista de la reivindicación 1, en donde dicha enzima es una proteasa y dicha porción dirigida al objetivo es un receptor.
29. El antagonista de la reivindicación 27, en donde dicha enzima es una subtilisina.
30. El antagonista de la reivindicación 29, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un inhibidor de enzima que es un pirazol
31. El antagonista de la reivindicación 29, en donde dicha porción dirigida al objetivo es una biotina.
32. El antagonista de la reivindicación 29, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un ligando que enlaza una lectina.
33. El antagonista de la reivindicación 32, en donde dicha lectina es concavalina A.
34. El antagonista de la reivindicación 33, en donde la porción dirigida al objetivo es un carbohidrato.
35. El antagonista de la reivindicación 34, en donde dicha porción dirigida al objetivo es -tioetil D-manopiranosida.
36. El antagonista de la reivindicación 33, en donde dicha porción dirigida al objetivo se enlaza específicamente a una mancha y dicha enzima degrada un componente de dicha mancha.
37. Un método de degradar una molécula objetivo, dicho método comprende poner en contacto dicha molécula objetivo con un antagonista catalítico que comprende una porción dirigida al objetivo que se enlace específicamente a dicha molécula objetivo estando unida dicha porción dirigida al objetivo a una enzima que degrada dicha molécula objetivo que da como resultado la liberación de dicho antagonista permitiendo mediante esto que dicho antagonista se enlace y degrade otra molécula objetivo.
38. El método de la reivindicación 37, en donde dicha porción dirigida al objetivo se une a dicha enzima a través del grupo sulfuro en una cisteína.
39. El método de la reivindicación 38, en donde dicha cisteína es una cisteína que se substituye por un aminoácido nativo diferente de la cisteína en dicha enzima.
40. El método de la reivindicación 39, en donde dicha cisteína es una cisteína que se substituye por un aminoácido nativo diferente de la cisteína en o cerca de un subsitio que comprende un sitio de enlace de substrato de dicha enzima.
41. El método de la reivindicación 39, en donde dicha enzima es una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste de una proteasa, una esterasa, una amidasa, una peptidasa, una lactamasa, una celulasa, una oxidasa, una óxidoreductasa, una reductasa, una transferasa, una hidrolasa, una isomerasa, una ligasa, una lipasa, una fosfolipasa, una fosfatasa, una quinasa, una sulfatasa, una lisozina, una glicosidasa, una glicosiltransferasa, una nucleasa, una aldolasa, una quetolasa, una liasa, una ciclasa, una transcriptasa inversa, una hialuronidasa, una amilasa, una cerebrosidasa y una quitinasa.
42. El método de la reivindicación 41, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa.
43. El método de la reivindicación 42, en donde dicha enzima es una subtilisina
44. El antagonista de la reivindicación 39, en donde dicha cisteína es una cisteína que se substituye por un aminoácido que forma un sitio de enlace de substrato.
45. El método de la reivindicación 44, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa tipo subtilisina y dicha cisteína se substituye por un aminoácido en o cerca de un subsitio seleccionado a partir del grupo que consiste de un subsitio Sl, un subsitio SI' y un subsitio S2.
46. El método de la reivindicación 45, en donde dicha enzima es una subtilisina de Bacillus lentus .
47. El método de la reivindicación 45, en donde dicha cisteína se substituye por un aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una subtilisina de Bacillus lentus, en donde dicho residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste del residuo 156, residuo 166, residuo 217, residuo 222, residuo 62, residuo 96, residuo 104, residuo 107, residuo 189 y residuo 209.
48. El método de la reivindicación 41, en donde dicha enzima es una serina proteasa tipo quimiotripsina y dicha cisteína se substituye por un aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una tripsina madura (ingreso 1TPP del Protein Data Bank) , en donde dicho residuo de referencia se encuentra en o cerca del residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Tyr94 , Leu99, Glnl75, Aspl89, Serl90, Glnl92, Phe41, Lys60, Tyrl51, Ser214 y Lys224.
49. El método de la reivindicación 41, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa tipo alfa/beta y dicha cisteína se substituye por un aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una lipasa de Candida antartica (ingreso 1TCA del Protein Data Bank) , en donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Trpl04, Leul40, Leul44, Vall54, Glul88, Ala225, Leu278 e Ile285.
50. El método de la reivindicación 41, en donde dicha enzima es una aspartilo proteasa.
51. El método de la reivindicación 50, en donde dicha enzima es una proteasa tipo pepsina y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en la pepsina humana madura (ingreso 1PSN del Protein Data Bank) , en donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Tyr9, Met12, Glul3, Gly76, Thr77, Phelll, Phell7, Ilel28, Serl30, Tyrl89, Ile213, Glu239, Met245, Gln287, Met289, Leu291 y Glu294.
52. El método de la reivindicación 41, en donde dicha enzima es una cisteína proteasa.
53. El método de la reivindicación 52, en donde dicha enzima es una papaína y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una papaína madura (ingreso al Protein Data Bank, Asnl8, Ser21, Asn64 , Tyr67, Trp69, Glnll2, Glnl42, Aspl58, Trpl77 y Phe207.
54. El método de la reivindicación 41, en donde dicha enzima es una metaloproteasa.
55. El método de la reivindicación 54, en donde dicha enzima es una metaloproteada y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en la metaloproteasa de matriz humana madura (ingreso 83OC del Protein Data Bank) , donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Leulll, Phel75, Tyrl76, Serl82, Leul84, Phel89, Tyr214, Asp231, Lys234 e Ile243.
56. El método de la reivindicación 37, en donde dicho objetivo es una molécula presente en la superficie de una célula.
57. El método de la reivindicación 56, en donde dicha molécula presente en la superficie de una célula es una molécula que forma un receptor.
58. El método de la reivindicación 56, en donde dicha molécula presente en la superficie de una célula es un ligando.
59. El método de la reivindicación 56, en donde dicha molécula presente en la superficie de una célula es un componente de una pared celular.
60. El método de la reivindicación 56, en donde dicha molécula presente en la superficie de una célula es un componente de una membrana celular.
61. El método de la reivindicación 37, en donde dicha porción dirigida al objetivo se selecciona a partir del grupo que consiste de una proteína, un antígeno, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un complejo de coordinación, un azúcar, una vitamina, un dendrímero y un éter de corona.
62. El método de la reivindicación 61, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un ligando análogo para un receptor o una enzima.
63. El método de la reivindicación 61, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un inhibidor para un receptor o una enzima.
64. El método de la reivindicación 37, en donde dicha enzima es una proteasa y dicha porción dirigida al objetivo es un ligando seleccionado a partir del grupo que consiste de un carbohidrato, una vitamina, o análogo de vitamina, un inhibidor de enzima, un péptido, un compuesto farmacéutico que es una molécula orgánica pequeña, y biotina.
65. El antagonista de la reivindicación 37, en donde dicha enzima es una proteasa y dicha porción dirigida al objetivo es un receptor.
66. El método de la reivindicación 64, en donde dicha enzima es una subtilisina.
67. El método de la reivindicación 66, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un inhibidor de enzima que es un pirazol
68. El método de la reivindicación 66, en donde dicha porción dirigida al objetivo es una biotina.
69. El método de la reivindicación 66, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un ligando que enlaza una lectina.
70. El método de la reivindicación 69, en donde dicha lectina es concavalina A.
71. El método de la reivindicación 70, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un carbohidrato.
72. El método de la reivindicación 70, en donde dicha porción dirigida al objetivo es -tioetil D-manopiranosida .
73. El método de la reivindicación 66, en donde dicha porción dirigida al objetivo se enlaza específicamente a una mancha y dicha enzima degrada un componente de dicha mancha.
74. Una enzima que tiene la especificidad del substrato alterada comprendiendo dicha enzima una porción dirigida al objetivo unida a un subsitio que comprende el sitio de unión del substrato de dicha enzima.
75. La enzima de la reivindicación 74, en donde dicha porción dirigida al objetivo se acopla a dicha enzima a través de un azufre de una cisteína en dicho subsitio de dicha enzima.
76. La enzima de la reivindicación 75, en donde dicha cisteína se substituye por un aminoácido nativo que no es cisteína en dicho subsitio de dicha enzima.
77. La enzima de la reivindicación 75, en donde dicha enzima es una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste de una proteasa, una esterasa, una amidasa, una peptidasa, una lactamasa, una celulasa, una oxidasa, una óxidoreductasa, una reductasa, una transferasa, una hidrolasa, una isomerasa, una ligasa, una lipasa, una fosfolipasa, una fosfatasa, una quinasa, una sulfatasa, una lisozina, una glicosidasa, una glicosiltransferasa, una nucleasa, una aldolasa, una quetolasa, una liasa, una ciclasa, una transcriptasa inversa, una hialuronidasa, una amilasa, una cerebrosidasa y una quitinasa.
78. La enzima de la reivindicación 77, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa.
79. La enzima de la reivindicación 78, en donde dicha enzima es una subtilisina
80. La enzima de la reivindicación 76, en donde dicha cisteína es una cisteína que se substituye por un aminoácido que forma un sitio de enlace de substrato.
81. La enzima de la reivindicación 80, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa tipo subtilisina y dicha cisteína se substituye por un aminoácido en o cerca de un subsitio seleccionado a partir del grupo que consiste de un subsitio Sl, un subsitio SI' y un subsitio S2.
82. La enzima de la reivindicación 81, en donde dicha enzima es una subtilisina de Bacillus lentus .
83. La enzima de la reivindicación 81, en donde dicha cisteína se substituye por un aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una subtilisina de Bacillus lentus, en donde dicho residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste del residuo 156, residuo 166, residuo 217, residuo 222, residuo 62, residuo 96, residuo 104, residuo 107, residuo 189 y residuo 209.
84. La enzima de la reivindicación 77, en donde dicha enzima es una serina proteasa tipo quimiotripsina y dicha cisteína se substituye por un aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una tripsina madura (ingreso 1TPP del Protein Data Bank) , en donde dicho residuo de referencia se encuentra en o cerca del residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Tyr94, Leu99, Glnl75, Aspl89, Serl90, Glnl92, Phe41, Lys60, Tyrl51, Ser214 y Lys224.
85. La enzima de la reivindicación 77, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa tipo alfa/beta y dicha cisteína se substituye por un aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una lipasa de Candida antartica (ingreso 1TCA del Protein Data Bank) , en donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Trpl04, Leul40, Leul44, Vall54, Glul88, Ala225, Leu278 e Ile285.
86. La enzima de la reivindicación 77, en donde dicha enzima es una aspartilo proteasa.
87. La enzima de la reivindicación 86, en donde dicha enzima es una proteasa tipo pepsina y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en la pepsina humana madura (ingreso 1PSN del Protein Data Bank) , en donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Tyr9, Metl2, Glul3, Gly76, Thr77, Phelll, Phell7, Ilel28, Serl30, Tyrl89, Ile213, Glu239, Met245, Gln287, Met289, Leu291 y Glu294.
88. La enzima de la reivindicación 77, en donde dicha enzima es una cisteína proteasa.
89. La enzima de la reivindicación 88, en donde dicha enzima es una papaína y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una papaína madura (ingreso al Protein Data Bank, Asnld, Ser21, Asn64, Tyr67, Trp69, Glnll2, Glnl42, Aspl58, Trpl77 y Phe207.
90. La enzima de la reivindicación 77, en donde dicha enzima es una metaloproteasa.
91. La enzima de la reivindicación 90, en donde dicha enzima es una metaloproteada y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en la metaloproteasa de matriz humana madura (ingreso 83OC del Protein Data Bank) , donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Leulll, Phel75, Tyrl76, Serl82, Leul84, Phel89, Tyr214, Asp231, Lys234 e Ile243.
92. La enzima de la reivindicación 37, en donde dicho objetivo es una molécula presente en la superficie de una célula.
93. La enzima de la reivindicación 75, en donde dicha porción dirigida al objetivo se selecciona a partir del grupo que consiste de una proteína, un antígeno, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un complejo de coordinación, un azúcar, una vitamina, un dendrímero y un éter de corona.
94. La enzima de la reivindicación 75, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un ligando análogo para un receptor o una enzima.
95. La enzima de la reivindicación 75, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un inhibidor para un receptor o una enzima.
96. La enzima de la reivindicación 75, en donde dicha porción dirigida al objetivo se selecciona a partir del grupo que consiste de un factor de crecimiento, una citosina y un ligando receptor.
97. La enzima de la reivindicación 75, en donde - dicha enzima es una proteasa y dicha porción dirigida al objetivo es un ligando seleccionado a partir del grupo que consiste de un carbohidrato, una vitamina, o análogo de vitamina, un inhibidor de enzima, un péptido, un compuesto farmacéutico que es una molécula orgánica pequeña, y biotina.
98. La enzima de la reivindicación 75, en donde dicha enzima es una proteasa y dicha porción dirigida al objetivo es un receptor.
99. La enzima de la reivindicación 97, en donde dicha enzima es una subtilisina.
100. La enzima de la reivindicación 99, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un inhibidor de enzima que es un pirazol
101. La enzima de la reivindicación 99, en donde dicha porción dirigida al objetivo es una biotina.
102. La enzima de la reivindicación 99, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un ligando que enlaza una lectina.
103. La enzima de la reivindicación 102, en donde dicha lectina es concavalina A.
104. La enzima de la reivindicación 103, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un carbohidrato.
105. La enzima de la reivindicación 103, en donde dicha porción dirigida al objetivo es -tioetil D-manopiranosida.
106. La enzima de la reivindicación 99, en donde dicha porción dirigida al objetivo se enlaza específicamente a una mancha y dicha enzima degrada un componente de dicha mancha .
107. Un método para dirigir la actividad de una enzima para un objetivo específico, comprendiendo dicho método proporcionar una enzima que tiene la especificidad de substrato alterada comprendiendo dicha enzima una porción dirigida al objetivo unida a un subsitio dentro del substrato que enlaza la región de dicha enzima; y poner en contacto dicho objetivo con dicha enzima, según lo cual dicha enzima se enlaza específicamente a dicho objetivo localizando mediante esto la actividad de dicha enzima en dicho objetivo.
108. El método de la reivindicación 107, en donde dicha porción dirigida al objetivo se acopla a dicha enzima a través de un azufre de una cisteína en dicho subsitio de dicha enzima.
109. El método de la reivindicación 108, en donde dicha cisteína se substituye por un aminoácido nativo que no es cisteína en dicho subsitio de dicha enzima.
110. El método de la reivindicación 108, en donde dicho método comprende además sustituir un aminoácido en dicho subsitio con una cisteína y acoplar químicamente dicha porción dirigida al objetivo a dicha cisteína.
111. El método de la reivindicación 107, en donde dicha enzima es una enzima seleccionada a partir del grupo que consiste de una proteasa, una esterasa, una amidasa, una peptidasa, una lactamasa, una celulasa, una oxidasa, una óxidoreductasa, una reductasa, una transferasa, una hidrolasa, una isomerasa, una ligasa, una lipasa, una fosfolipasa, una fosfatasa, una quinasa, una sulfatasa, una lisozina, una glicosidasa, una glicosiltransferasa, una nucleasa, una aldolasa, una quetolasa, una liasa, una ciclasa, una transcriptasa inversa, una hialuronidasa, una amilasa, una cerebrosidasa y una quitinasa.
112. El método de la reivindicación 111, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa.
113. El método de la reivindicación 112, en donde dicha enzima es una subtilisina
114. El método de la reivindicación 109, en donde dicha cisteína es una cisteína que se substituye por un aminoácido que forma un sitio de enlace de substrato.
115. El método de la reivindicación 114, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa tipo subtilisina y dicha cisteína se substituye por un aminoácido en o cerca de un subsitio seleccionado a partir del grupo que consiste de un subsitio Sl, un subsitio SI' y un subsitio S2.
116. El método de la reivindicación 112, en donde dicha enzima es una subtilisina de Bacillus lentus .
117. El método de la reivindicación 112, en donde dicha cisteína se substituye por un aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una subtilisina de Bacillus lentus, en donde dicho residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste del residuo 156, residuo 166, residuo 217, residuo 222, residuo 62, residuo 96, residuo 104, residuo 107, residuo 189 y residuo 209.
118. El método de la reivindicación 111, en donde dicha enzima es una serina proteasa tipo quimiotripsina y dicha cisteína se substituye por un aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una tripsina madura (ingreso 1TPP del Protein Data Bank) , en donde dicho residuo de referencia se encuentra en o cerca del residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Tyr94 , Leu99, Glnl75, Aspl89, Serl90, Glnl92, Phe41, Lys60, Tyrl51, Ser214 y Lys224.
119. El método de la reivindicación 111, en donde dicha enzima es una serina hidrolasa tipo alfa/beta y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una lipasa de Candida antartica (ingreso 1TCA del Protein Data Bank) , en donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Trpl04, Leul40, Leul44, Vall54, Glul88, Ala225, Leu278 e Ile285.
120. El método de la reivindicación 111, en donde dicha enzima es una aspartilo proteasa.
121. El método de la reivindicación 120, en donde dicha enzima es una proteasa tipo pepsina y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en la pepsina humana madura (ingreso 1PSN del Protein Data Bank) , en donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Tyr9, Metl2, Glul3, Gly76, Thr77, Phelll, Phell7, Ilel28, Serl30, Tyrl89, Ile213, Glu239, Met245, Gln287, Met289, Leu291 y Glu294.
122. El método de la reivindicación 111, en donde dicha enzima es una cisteína proteasa.
123. El método de la reivindicación 122, en donde dicha enzima es una papaína y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en una papaína madura (ingreso 1BQI del Protein Data Bank) , donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Asnl8, Ser21, Asn64 , Tyr67, Trp69, Glnll2, Glnl42, Aspl58, Trpl77 y Phe207.
124. El método de la reivindicación 111, en donde dicha enzima es una metaloproteasa.
125. El método de la reivindicación 124, en donde dicha enzima es una metaloproteada y dicha cisteína se substituye por el aminoácido que corresponde a un residuo de referencia en la metaloproteasa de matriz humana madura (ingreso 83 OC del Protein Data Bank) , donde el residuo de referencia se encuentra en o cerca de un residuo seleccionado a partir del grupo que consiste de Leulll, Phel75, Tyrl76, Serl82, Leul84, Phel89, Tyr214, Asp231, Lys234 e Ile243.
126. El método de la reivindicación 75, en donde dicha porción dirigida al objetivo se selecciona a partir del grupo que consiste de una proteína, un antígeno, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un complejo de coordinación, un metal, un azúcar, una vitamina, un dendrímero y un éter de corona .
127. El método de la reivindicación 107, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un ligando análogo para un receptor o una enzima.
128. El método de la reivindicación 107, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un inhibidor para un receptor o una enzima.
129. El método de la reivindicación 107, en donde dicha porción dirigida al objetivo se selecciona a partir del grupo que consiste de un factor de crecimiento y una citosina.
130. El método de la reivindicación 107, en donde dicha enzima es una proteasa y dicha porción dirigida al objetivo es un ligando seleccionado a partir del grupo que consiste de un carbohidrato, una vitamina, o análogo de vitamina, un inhibidor de enzima, un péptido, un compuesto farmacéutico que es una molécula orgánica pequeña, y biotina.
131. El antagonista de la reivindicación 107, en donde dicha enzima es una proteasa y dicha porción dirigida al objetivo es un receptor.
132. El método de la reivindicación 130, en donde dicha enzima es una subtilisina.
133. El método de la reivindicación 132, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un inhibidor de enzima que es un pirazol
134. El método de la reivindicación 132, en donde dicha porción dirigida al objetivo es una biotina.
135. El método de la reivindicación 132, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un ligando que enlaza una lectina.
136. El método de la reivindicación 135, en donde dicha lectina es concavalina A.
137. El método de la reivindicación 136, en donde dicha porción dirigida al objetivo es un carbohidrato.
138. El método de la reivindicación 136, en donde dicha porción dirigida al objetivo es -tioetil D-manopiranosida .
139. El método de la reivindicación 132, en donde dicha porción dirigida al objetivo se enlaza específicamente a una mancha y dicha enzima degrada un componente de dicha mancha .
140. Un método para mejorar la actividad de una droga que actúa como un inhibidor de un receptor o una enzima, comprendiendo dicho método acoplar una serina hidrolasa a dicha droga de manera que cuando dicha droga se enlaza a dicho receptor o enzima, la serina hidrolasa degrada el receptor o enzima.
141. El método de la reivindicación 140, en donde dicho método incrementa la ventana terapéutica de la dosis de dicha droga.
142. El método de la reivindicación 140, en donde dicha serina hidrolasa es una subtilisina.
143. Un método para inhibir una enzima o un receptor, comprendiendo dicho método poner en contacto la enzima o receptor con una molécula quimérica que comprende un ligando que enlaza dicha enzima o receptor unido a una enzima que degrada el ligando análogo de dicha enzima o receptor.
144. El método de la reivindicación 143, en donde dicha molécula quimérica comprende una porteada unida a un inhibidor de dicha enzima o receptor.
145. El método de la reivindicación 144, en donde dicha proteasa se selecciona a partir del grupo que consiste de una serina proteasa, una cisteína proteasa, una aspartilo RESUMEN La invención proporciona moléculas quiméricas que son antagonistas catalíticos de una molécula objetivo. Los antagonistas catalíticos de esta invención comprenden preferentemente una porción dirigida al objetivo unida a una enzima que degrada la molécula específicamente enlazada por la porción dirigida al objetivo. Los antagonistas catalíticos de esta invención se enlazan así a un objetivo reconocido por la porción dirigida al objetivo (e.g. un receptor) el componente de enzima de la quimera degrada entonces todo o parte del objetivo. Esto da como resultado típicamente una reducción o pérdida de la actividad del objetivo y libera la molécula quimérica. La molécula quimérica se encuentra entonces libre para atacar y degradar otras moléculas objetivo. proteasa, una proteasa tipo pepsina y una metaloproteasa.