DE2008990A1 - Vernetzte Polymerisate zur covalenten Bindung von Substanzen mit reaktionsfähi gen Gruppen - Google Patents

Vernetzte Polymerisate zur covalenten Bindung von Substanzen mit reaktionsfähi gen Gruppen

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DE2008990A1 DE19702008990 DE2008990A DE2008990A1 DE 2008990 A1 DE2008990 A1 DE 2008990A1 DE 19702008990 DE19702008990 DE 19702008990 DE 2008990 A DE2008990 A DE 2008990A DE 2008990 A1 DE2008990 A1 DE 2008990A1
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Description

Έ. M e r c k . „^ ~ ^ Ληηη
„ ' ^ , ^ 16. Februar 1970
Darmstadt
Vernetzte Polymerisate zur covalenten Bindung von Substanzen mit reaktionsfähigen Gruppen
Bekanntlich ist es in vielen Fällen von "Vorteil, bestimmte Verbindungen an Polymere zu fixieren. Insbesondere für Enzyme, andere Proteine und Peptide, aber auch für niedermolekulare Substanzen, z: B. Enzymsubstrate, haben/diese Verfahren Eingang gefunden. So ermöglichen z. B. polymer, gebundene Enzyme bei enzymatisch katalysierten Reaktionen eine enzymfreie Isolierung der Reaktionsprodukte durch einfache-Filtration. Außerdem können die polymer gebundenen Substanzen in diesen Fällen mehrfach verwendet werden.
Zur covalenten Bindung wurden bisher beispielsweise Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Äthylen verwendet, die jedoch kurz vor oder während der Umsetzung mit der zu fixierenden Verbindung noch vernetzt werden mußten, z. B. mit Hexamethylendiamin. Die Säureanhydridgruppen des Polymerisats reagieren bei diesen bekannten Polymerisaten beispielsweise mit den freien Aminogruppen der Enzyme und fixieren diese unter Ausbildung stabiler Säureamidgruppen. '
Diese bekannten Polymerisate zur covalenten Bindung von Enzymen besitzen jedoch den Nachteil, daß sie relativ schlecht filtrierbar sind und oft überhaupt nur durch Zentrifugieren aus der Suspension abgetrennt werden können. Ihre mechanische Widerstandsfähigkeit läßt zu wünschen übrig. Außerdem sind sie zum Teil wasserlöslich, wodurch die Ausbeute'herabgesetzt wird.
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" Es wurde nun gefunden» daß bestimmte, wasserunlösliche, jedoch gut benetzbare Polymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Divinyläthern, die zusätzlich auch noch Monovinyläther enthalten können, besonders geeignet sind zur covalenten Bindung von Verbindungen mit reaktionsfähigen Gruppen, insbesondere von Enzymen und Enzymsubstraten. Solche reaktionsfähigen Gruppen sind neben den wichtigen Aminogruppen insbesondere Hydroxylgruppen und/oder SH-Gruppen, die jeweils sowohl aliphatisch als auch aromatisch gebunden sein können. Bei der Fixierung reagieren die Säureanhydridgruppen der Polymerisate mit diesen reaktionsfähigen Gruppen unter Ausbildung stabiler Säurederivate, z. B. " von Amiden, Estern und/oder fhioestern.'
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Polymerisate besitzen hervorragende mechanische Eigenschaften. Sie lassen sich sehr gut filtrieren, so daß die Handhabung der fixierten Verbindungen wesentlich erleichtert wird. Bei der Fixierung von Enzymen erhält man darüberhinaus sehr hohe Enzymgehalte und äußerst günstige Enzymaktivitäten.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur covalenten Bindung von Substanzen mit reaktionsfähigen Gruppen an Maleinsäureanhydrid-Polymerisate, das darin besteht, daß man als Träger ein wasserunlösliches, jedoch gut benetzbares Copolymerisat aus Maleinsäureanhydrid und Vinyläthern verwendet, worin Maleinsäureanhydrid und Vinylgruppen etwa im Verhältnis 1 : 1 vorliegen und mindestens 5 i» der Vinylgruppen aus Divinyläthern stammen.
Vorzugsweise enthält das Polymerisat pro Mol Maleinsäureanhydrid etwa 0,025 - 0,5 Mol Divinylather und 0 bis etwa 0,95 Mol Monovinyläther.
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Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung von benetz-· baren, wasserunlöslichen.Polymerisaten, die aus Maleinsäureanhydrid und Vinyläthern erhalten worden sind, wobei Maleinsäureanhydrid und Vinylgruppen etwa im Verhältnis 1 : 1 vorliegen und mindestens 5 $> der Vinylgruppen aus Divinyläthern stammen, zur covalenten Bindung von Substanzen mit reaktionsfähigen Gruppen, vorzugsweise Enzymen.
Die als Träger zu verwendenden Copolymerisate entstehen durch eine alternierende Polymerisation zwischen Maleinsäureanhydrid und Vinyläthern, so daß pro Mol Maleinsäureanhydrid jeweils eine Vinyläthergruppe eingesetzt wird, die grundsätzlich aus Mono- und/oder Divinyläthern stammen kann. Mindestens 5 $> der erforderlichen Vinylgruppen sollen jedoch erfindungsgemäß aus Divinyläthern stammen. · .
Polymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Divinyläthern sind an sich bereits bekannt. Sie sind schon für verschiedene Einsatzgebiete vorgeschlagen worden, z. B. als -Zusatz zu Bohrflüssigkeiten (vgl. USA-Patentschrift 3,157,599) oder Dispergiermittel (vgl. USA-Patentschrift 3,085,077). Auch Polymerisate, die neben Maleinsäureanhydrid und Monovinyläthern geringe Mengen ' eines Divinyläthers enthalten, sind als Gelierungsmittel schon beschrieben worden (vgl. französische Patentschrift 1 572 412). Aufgrund ihrer Zusammensetzung, insbesondere wegen ihres sehr niedrigen Gehalts an Divinyläthern, sind sie jedoch wasserlöslich. Diese vorbekannten Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Mono- und Divinyläthern unterscheiden sich also in ihrer Zusammensetzung ganz wesentlich von den nach der vorliegenden Erfindung als Träger für zu fixierende Verbindungen zu verwendenden Polymerisaten und sind selbst, insbesondere wegen ihrer Löslichkeit in wäßrigem Milieu, ungeeignet für diesen Verwendungszweck.
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Die nach der vorliegenden Erfindung au verwendenden Träger enthalten als Divinyläther, die mit Maleinsäureanhydrid copolymerisiert sind, insbesondere Divinyläther von aliphatischen Diolen mit 2-12 C-Atomen, wobei die Hydroxylgruppen endständig und/oder mittelständig angeordnet sein können. In Betracht kommen z. B. Divinyläther von 1,2-Äthandiol, 1,2- und 1,3-Propandiol, 1,2-, 1,3- und 1,4-Butandiol, 1,2- und 1,5-Pentandiol, 1,6-Hexandiol, 1,7-Heptandiol, 1,8-Octandiol, 1,9-Nonandiol, 1,10-Decandiol, 1,11-Undecandiol und 1,12-Dodecandiol. Geeignet sind ferner auch die Divinyläther von z: B. Diäthylenglycol, Triäthylenglycol, Tetraäthylenglycol sowie auch weitere PoIyalkylenglycole bis zu einem Molekulargewicht von etwa 6000. Es kann außerdem auch' der Dianhydrosorbit-divinyläther verwendet werden. Diese Divinyläther können jeweils einzeln oder im Gemisch eingesetzt werden. Pro Mol Maleinsäureanhydrid wird zur Herstellung der Trägermaterialien etwa 0,5 Mol des Divinyläther s eingesetzt.
Wenn für spezielle Anwendungszwecke eine geringere Vernetzung der nach der Erfindung zu verwendenden Polymerisate erwünscht ist, können die Divinyläther teilweise durch Monpvinylather ersetzt werden. Als Monovinylather kommen insbesondere die Vinyläther niederer aliphatischer Alkohole in Präge, z. B. Methylvinyläther, Äthylvinyläther und/oder Butylvinyläther. Ihr Anteil im Copolymer!sat kann bis zu 0,95 Mol pro Mol Maleinsäureanhydrid betragen.
Die Polymerisation zur Herstellung der Träger wird zweckmäßig in an sich bekannter Weise als Lösungspolymerisation durchgeführt, wobei zu Beginn der Umsetzung eine homogene Lösung vorliegt. Bald nach dem Beginn der Polymerisation fallen die ersten unlöslichen Polymeren aus. Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise solche in Frage, die nach Beendigung der Polymerisation leicht entfernt werden können, vorzugsweise unter vermindertem Druck.
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Außerdem sollen die Lösungsmittel die Monomeren, also Maleinsäureanhydrid und die Vinyl- und/oder Divinyläther, lösen, aber nicht mit diesen Substanzen reagieren. Aus der Literatur sind zahlreiche geeignete lösungsmittel bekannt. Besonders . vorteilhaft sind z. B. ,Toluol, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat, Tetrahydrofuran und/oder Dioxan." Die Art und Menge der Lösungsmittel beeinflussen z. B. das Schüttgewicht der Polymerisate. Bei Anwendung größerer Lösungsmittelmengen.; erhalt man bekanntlich, lockerere Produkte. Im allgemeinen wird man etwa 1-50, vorzugsweise 3-15 Teile Lösungsmittel auf ein Teil des Monomerengemisches !(Maleinsäureanhydrid und Vernetzer) " verwenden. - '
Üblicherweise wird die Polymerisation in an sich bekannter Weise durch radikalische Initiierung eingeleitet. Als Initiatoren und Radikalspender kommen insbesondere Azo- und Perverbindungen in Frage, z. B. Peroxide, insbesondere Dibenzoylperoxid, Dilauroylperoxid, oder Di-o-tolylperoxid. Die gebräuchlichste Azoverbindung ist Azoisobutyrodinitril. Die Initiatoren werden in üblicher Weise in Konzentrationen von " 0,01 - 10 io, vorzugsweise'0,1 - 2 % eingesetzt (bezogen auf das Gesamtpolymerisat). In der" Regel wird die' Polymerisation ■ zweckmäßig bei erhöhten Temperaturen durchgeführt, ζ. B-. . bei 40 - 1700C.: ■ ' - . ' '
Die erhaltenen Polymerisate sind weiße, pulvsge, fein ver- teilte Stoffe. Die Schüttvolumina erreichen je nach Art und Menge der bei der Polymerisation verwendeten Lösungsmittel 2 - 12 ml/g. Die Schüttgewichte·liegen dementsprechend zwischen etwa 0,5 - 0,08 g/ml . :
Die Umsetzung dieser Polymerisate mit den.zu fixierenden" · Verbindungen erfolgt in.der Regel in einem Lösungsmittel, ; vorzugsweise^^ Wasser, bei -pH-Werten zwischen A und 14. ■ -; , Bei der Fixierung von Enzymen wird zweckmäßigerweise
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in gepufferter wäßriger Lösung umgesetzt, ζ. Β.· in 0,005 - 0,5 M vorzugsweise 0,05 M Acetatpuffer im pH-Bereich von 4-5, oder in Phosphatpuffer derselben Konzentration im pH-Bereich von 5-8. Im pH-Bereich von 7-9 kommen Triäthanolamin (=Tram)-puffer oder Trishydroxymethylaminomethan (=Tris)-puffer oder Borsäure/Borax-puffer derselben Konzentration in Präge, im pH-Bereich von 9-11 Carbonat/Bicarbonat-puffer. Auch andere in de"n angegebenen Bereichen wirksame Puffer können verwendet werden. Nähere Angaben über solche Puffersysteme finden sich z. B. in H.M. Rauen, Biochemisches Taschenbuch, II. Teil, Seiten 90 106; Springer Verlag 1964· Die Temperaturen sollen bei der Umsetzung von empfindlichen Enzymen vorzugsweise bei etwa Obis 100O liegen.
Das Verhältnis von Trägerpolymerisat zu der zu fixierenden Verbindung beträgt etwa 5 : 1 bis 1:5» vorzugsweise etwa 2:1. Hierbei handelt es sich bei hochmolekularen Substanzen, also z. B. Proteinen (Enzymen) um Gewichtsteile .Bei der Fixierung niedermolekularer Substanzen bezieht man sich dagegen auf die Anzahl Mole (bzw. Millimole) reaktiver Gruppen.
Zur Fixierung kann die reaktionsfähige Gruppen enthaltende Verbindung in der gepufferten wäßrigen Lösung vorgelegt und das Polymerisat in diese Lösung eingerührt werden. Man kann jedoch auch die zu fixierende Verbindung in wäßriger, gepufferter Lösung in die Polymerisatsuspension einrühren. Gegebenenfalls enthält das Reaktionsgemisch beim Umsatz mit Proteinen in an sich üblicher Weise noch Stabilisatoren, z. B. SH-Reagenzien wie Cystein oder Merkaptoäthanol oder auch Ca-Ionen. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch für eine Reaktionszeit von etwa 5· Minuten bis zu 48 Stunden, in der Regel etwa 1 Stunde, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 14» bei Enzymen'vorzugsweise um •etwa 9, gehalten. Danach wird das Reaktionsprodukt in an sich üblicher Weise aus der Suspension isoliert. Es' wird in der Regel
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abfiltriert und zur Entfernung adsorbierter Reste der fixierten Verbindung in an sich bekannter Weise gewaschen. Bei Enzymen verwendet man dazu vorzugsweise Salzlösungen unterschiedlicher Ionenstärke von u. = O bis u = 3 und unterschiedlicher pH-Werte zwischen 4 und 14.AIs Salze kommen insbesondere leicht lösliche und stark dissoziierende Alkalisalze, z. B. NaOl oder Na9SO., in Frage. Es können jedoch auch Pufferlösungen, gegebenenfalls im Gemisch mit diesen Alkalisalzlösungen,eingesetzt werden. ·
Grundsätzlich können nach der Erfindung alle Verbindungen mit reaktionsfähigen Gruppen vorteilhaft fixiert werden, wobei als reaktionsfähige Gruppen insbesondere Aminogruppenr Hydroxylgruppen und/oder Mercaptogruppen in Betracht kommen. Die Aminogruppen können primäre oder sekundäre Aminogruppen sein, während die OH- und SH-Gruppen auch als tertiär gebundene Reste vorliegen können. Alle Reste können jeweils sowohl aliphatisch als auch aromatisch gebunden sein. Bei der covalenten Bindung an das Trägermaterial darf selbstverständlich das aktive Zentrum eines Enzyms nicht beeinträchtigt werden. Besondere Bedeutung hat das neue Verfahren naturgemäß für Proteine, insbesondere Enzyme.
Zu den fixierbaren niedermolekularen Verbindungen, von denen die als Enzymsubstrate fungierenden die größte Bedeutung haben, gehören z. B-.-: Adenin, Cytosin, Guanin und deren Derivate, Aminosäuren wie Glykokoll, Alanin, lysin, Serin, Cystin und Cystein, Phenylalanin und Tryptophan; ferner auch niedere aliphatische Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol, Propanole und Butanole sowie die entsprechenden Thioalkohole, oder auch Phenole, z. B. Phenol, 4-Aminophenol, Thiophenol, oder "Tyrosin, Piperidin, "und ,Piperazin < " ·
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Auch Steroide mit den genannten reaktionsfähigen Gruppen kommen in Betracht, z. B. Prednisolon, 16-Methylenprednisolon, Dexamethason und östradiole. Aus der Gruppe der Proteine seien beispielhaft die Trypsininhibitoren sowie folgende Enzyme genannt:
Proteasen und Peptidasen, z. B. Trypsin,tChymotrypsin, Pepsin, α-Protease, Papain, Picin, Bromelin, Bakterienproteinasen (Thermolysin, Subtilisin),'. Pilz-proteinasen, Aminopeptidase, Carboxypeptidase;
Enzyme des Nucleinsäurestoffwechsele:
Endonucleasen: Desoxyribonucleasen, RibOnucleasen Exonucleasen: Phosphddiesterasen I und II. DNS-polymerase, ENS-polymerase;
ferner weitere Hydrolasen, z. B. a-Amylase, ß-Amylase, Amyloglucosidase, Saccharase (=Invertase), lactase (=ß-Galactosidase), ß-Glucuro-nidase, Penicillinase, Urease, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase;
Transferasen, z. B. Glyceratkinase, Glutamat - Pyruvat - Transaminase, Glutamat - Oxalacetat - Transaminase; Oxidoreduktasen, z. B. Lactatdehydrogenase, Malatdehydrogenase, Steroiddehydrogenasen, Steroidhydroxylasen, Glucosedehydrogenase, Glucoseoxidase, Katalase, Peroxidaee, Uricase; Lyasen, z. B. Aminosäuredecarboxylasen und Ketocarbonsäuredecarboxylasen;
außerdem Isomerasen, z. B. Glucosephosphatisomerase. Synthetasen,z. B. Aminosäure-tBNS-ligasen, Peptidsynthetasen,
Carboxylaeen;
Grundsätzlich kommen auch ganz allgemein Enzymeffektoren und 'Enzymstabilisatoren in Betracht.
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Darüberhinaus können natürlich auch Viren, Bakterien,, Peptide und weitere Naturstoffe fixiert werden, wenn sie die für die Reaktion mit den Anhydridgruppen des Polymerisats geeigneten reaktionsfähigen Gruppen enthalten.
Die Enzymgehalte von Polymerisaten, die die erfindungsgemäß fixierten Enzyme enthalten, liegen sehr hoch. Es wurden z. B. Enzymgehalte von 14 - 28 # erzielt. Auch die Aktivitäten dieser fixierten Enzyme sind hervorragend.
Die Aktivitäten der nach der vorlegenden Erfindung fixierten Enzyme werden in an sich üblicher Weise bestimmt, und zwar so wie die Enzyme selbst. So werden z. B. zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität die für das zu prüfende Enzym spezifischen N-acylierten L-Aminosäureäthylester verwendet. Pur Trypsin und damit auch für das erfindungsgemäß polymer gebundene Trypsin iet das z. B. N-Benzoyl-L-arginin-äthylester. Die Reaktionsgeschwindigkeit, die ein Maß für die Aktivität ist, wird durch kontinuierliche Titration mit z. B. NaOH der aus dem Substrat freigesetzten Carboxylgruppen bei konstantem pH-Wert gemessen. Als pH-Wert wird der für das zu untersuchende Enzym optimale Wert gewählt. Die Reaktionstemperaturen liegen in der Regel bei etwa 20° - 600O, vorzugsweise 25°0, die Reaktionsvolumina bei etwa 1 - 10 ml. Die gemessene enzymatisch« Aktivität wird in : internationalen Einheiten (TJ) angegeben. 1 Enzymeinheit (1 U) ; ist diejenige Enzymmmenge, die 1 u Mol Substrat (z. B. N-Benzoyl-L-arginin-äthyl-ester) pro Minute umsetzt. '■
Neben dieser Aktivitätsbestimmung an niedermolekularem Substrat kann auch eine Messung an hochmolekularen Substraten in an sich ; bekannter Weise vorgenommen werden* Zur Messung der proteolytischen Aktivität verwendet man z. B* häufig Hämoglobin /Methode naoh Anion: J. gen. Physiol., £2, 79» (1939)17.
lv\ ^ 101837/1004
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Die erfindungsgemäß fixierten Verbindungen können aufgrund ihrer vorteilhaften Eigenschaften mannigfache Anwendung finden. Hervorragend geeignet sind sie im Gegensatz zu den bekannten Trägersubstanzen zu Reaktionen in Säulenpackungen. So sind z. B. als Säule gepackte, nach der Erfindung fixierte niedermolekulare Substanzen von großem Vorteil bei der Enzymaufreinigung. Gibt man z. B. ein Enzymgemisch in einer Lösung geringer Ionenstärke über eine solche Säule, die ein durch Fixierung am Polymeren unlöslich gemachtes Enzymsubstrat enthält, so wird das zum unlöslichen Substrat gehörige Enzym selektiv adsorbiert. Durch eine Lösung höherer Ionenstärke kann dann das betreffende Enzym ψ in an sich bekannter Weise wieder desorbiert werden.
Darüberhinaus können aber auch die erfindungsgemäß fixierten Enzyme selbst überraschenderweise mit'Vorteil in Säulenpackungen eingesetzt werden. Das umzusetzende Reaktionsgemisch wird dann durch diese Säule geschickt, wo es mit dem enzymatischen Katalysator in Berührung kommt. Die Reaktionsprodukte verlassen die Säulen wiederum enzymfrei. Die Säulenpackung kann in dieser Weise längere Zeit hindurch benutzt werden.
Grundsätzlich können die erfindungsgemäß fixierten Enzyme in besonders vorteilhafter Weise für alle diejenigen enzymatischen Reaktionen eingesetzt werde),, für die auch die bisher an anderen Trägern fixierten Enzyme eingesetzt wurden. In der Anwendung unterscheiden sie sich nicht von den an anderen Trägern fixierten Enzymen.
Der Einsatz fixierter und unlöslich gemachter Enzyme gewinnt zunehmend an Bedeutung, auch In industriellen Prozessen, z.B. in der Gärungsindustrie, bei der Herstellung von Antibiotica - und auch bei chemischen bzw. biologischen Synthesen. Weitere Anwendungsgebiet« sind beispielsweise StoffweohselunterBuchungen,
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■-■ OSfGfNAL
insbesondere zu diagnostischen Zwecken, und die Verwendung als Arzneimittel, speziell bei topischer Anwendung, aber auch bei oraler und parenteraler Applikation, wo sie vorzugsweise in Form von Mikrokapseln verabreicht werden.
Beispiel 1
a) 19,6 g Maleinsäureanhydrid, 14,2 g Butandiol-1,4-divinyläther und 30 mg Dibenzoylperoxid werden in 300 ml Benzol gelöst. Es wird 7 Stunden bei 70° polymerisiert, wobei so lange gerührt wird, wie es die Viskosität erlaubt. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz abgezogen. Ausbeute: 33,3 g.
Schüttvolumen: 6,5 ml/g.
Schüttgewicht: 0,15 g/ml
b) 20 g des nach Beispiel 1 a) erhaltenen Trägermaterials werden in 500 ml eines eiskalten 0,05 M Phosphatpuffers, pH 7, der neben Alkalidihydrogenphosphaten und Dialkalihydrogenphosphaten zur Stabilisierung noch 0,001 M Cysteinhydrochlorid und 0,001 M Äthylendiamintetraessigsäure enthält, suspendiert. Hierzu gibt man eine Lösung von 10 g Papain in 50 ml Wasser und stellt den pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zutropfen von 1 N NaOH auf pH 9 ein. Während der 1-stündigen Reaktionszeit wird dieser pH-Wert und die Reaktionstemperatur von etwa 0 - 4°C gehalten. Das Eeaktionsprodukt wird abgesaugt und durch Aufschlämmen in den folgenden Lösungen gewaschen:
3 χ mit je 500 ml des oben genannten Phosphatpuffers
1 χ mit ' 500 ml Wasser
2 χ mit je 500 ml 0,1 η NaCl-Lösung 2 χ mit je 500 ml 1,0 η NaCl-Lösung
1X5 9 8 3 7 / 1 6 0 A
ζ mit je 500 ml Wasser '
χ mit je 500 ml 0,05 M Tris-Puffer pH 8,5 (0,001 N Oysteinhydrochlorid enthaltend) χ mit je 500 ml Wasser
Ausbeutet 92,jt d. Th. (bezogen auf die Einwaage an Träger
und Enzym)
Enzymatisohe Aktivität: 0,2 U/mg Substratι Na-Benzoyl-L-argininäthylester Teetbedingungen: pH 8,51 300C. Beispiel 2
a) 56,8 g Maleinsäureanhydrid, 51,0 g Hexandiol-1,6-divinyläther und 90 mg Azoieobutyronitril werden in 250 ml Butylaoetat gelöst und die Mischung wird eine Stunde bei 50 bis 60° polymerisiert. Anschließend wird die Reaktion unter Kühlung zu Ende geführt. Das Polymerisat wird bei Raumtemperatur mit 11 Benzol versetzt und abgesaugt.Ausbeute: 101,5g. SohÜttvolumen: 4,5 ml/g.
Sohüttgewicht: 0,22 g/ml»
b) 10 g des nach Beispiel 2 a) erhaltenen Trägerpolymerisats werden in 250 ml eines eiskalten 0,05 M Phosphatpuffers,
Λ pH 7» suspendiert. Dazu gibt man 5 g Trypsin (vom Schwein), das in 50 ml Wasser (plttot ist. Der pH-Wert des Reaktionsgemisohee wird mit 1 H VaOH auf pH 9 eingestellt. Dieser pH-Wert und die Reaktionetemperatur von 0 - 40O werden während der 1-stündigen Reaktionszeit beibehalten. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und durch Aufschlämmen in den folgenden ' Lösungen gewaschen: .
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ORIGINAL INSPECTED
3 χ mit de 250 ml des oben genannten η NaCl-Lösung Phosphatpuffere
1 χ mit 250 ml Wasser η NaCl-Lösung
2 X mit de 250 ml 0,1 •
2 X mit de 250 ml 1,0
2 χ mit je 250 ml 0,01 η CaClg-Lösung 2 χ mit je 250 ml 0,05 m Tris-Puffer pH 8,5' 5 x mit je 250 ml 0,01 η CaClg-Lösung
Ausbeute: 73 # d. Th. (bezogen auf die Einwaagen an Träger
und Enzym)
Enzymatische Aktivität: 3 U/mg
Substrat: Na-Benzoyl-L-argininäthylester
Testbedingungen: pH 9,5; 300C.
Beispiel 3
a) 19,6 g Maleinsäureanhydrid, 7,1 g Butandiol-1,4-divinyläther, 7,2 g Äthylvinylather und 30 mg Azoisobutyrodinitril werden in 500 ml Toluol gelöst. Es wird 5 Stunden bei 80° polymerisiert. Anschließend wird abfiltriert und mit 500 ml Toluol nachgewaschen. Ausbeute: 29.7 g
Schüttvolumen: 5,3 ml/g
Schüttgewicht: 0,19 g/ml
b) 20 g des nach Beispiel 3 a erhaltenen Trägermaterials werden in 500 ml eines eiskalten 0,05 M Phosphatpuffers, pH 7, suspendiert. Hierzu gibt man eine Lösung von 10 g Ribonuclease in 50 ml Wasser und stellt den pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zutropfen von 1 N Natronlauge auf pH 9 ein. Während der einstündigen Reaktionszeit wird dieser pH-Wert gehalten. Die Reaktionstemperatur beträgt 40O. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und durch Aufschlämmen in den folgenden Lösungen gewaschen:
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-H-
3 x mit je 500 ml des oben genannten Phosphatpuffera 1 χ mit 500 ml Wasser
4 x mit je 500 ml 1 M Natriumchloridlösung
1 χ mit 500 ml Wasser
2 χ mit de 500 ml 0,05 M Trispuffer pH 8,5
3 x mit de 500 ml Wasser
Ausbeute: 98 # d. Th. (bezogen auf die Einwaagen an Träger
und Enzym)
Enzymatische Aktivität: 0,5 U/mg
fc Substrat: Cytidin-2'^'-cyclophosphat
Testbedingungen: pH 8,3; 250C.
Beispiel 4
a) 39,2 g Maleinsäureanhydrid, 15»8 g Diäthylenglycoldivinyläther, 14,4 g Äthylvinylather und 50 mg Dibenzoylperoxid werden in 300 ml«Benzol gelöst.Es wird 5 Stunden bei 70° polymerisiert. Anschließend wird abfiltriert und mit 500 ml Benzol nachgewaschen.
Ausbeute: 61,2 g
Schüttvolumen: 5,0 ml/g
Schüttgewicht: 0,2 ml/g.
b) 10 g des nach Beispiel 4 a erhaltenen Trägermaterials werden in 100 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers pH 7,5 suspendiert. Hierzu gibt man eine Lösung von 2,8 g Piperidin in 50 ml desselben Phosphatpuffers. Durch Zutropfen von 1 N Natronlauge stellt man den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf pH 9»5 ein. Während der 30-nfaütigen Reaktionszeit wird dieser • pH-Wert gehalten. Die Reaktionstemperatur beträgt ca. 200C.
1 09837/160A
Sas Reaktlonsprodukt wlrd'abgeeaugt und durch Aufschlämmen In den folgenden Lösungen gewaschen?
3 χ mit je 100 ml des oben genannten Phosphatpufferβ 1 χ mit 100 ml Wasser
4 χ mit je 100 ml 1 H Natriumchloridlösung
1 χ mit 100 ml Wasser
2 χ mit je 100 ml 0,05 M Trispuffer
3 χ mit je 100 ml Wasser
Ausbeute: 86 £ der Theorie (bezogen auf die Einwaagen an Trägermaterial und Piperidin) Beispiel 5
10 g des nach Beispiel 1 a erhaltenen Trägermaterials werden in 100 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers, pH 7,5, suspendiert. Hierzu gibt man eine lösung von 6,4 g Lysinhydrochlorid in 50 ml desselben Phosphatpuffere. Durch Zutropfen von 1 N Natronlauge stellt man den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf pH 9,5 ein. Während der 30-minütigen Reaktionszeit wird dieser pH-Wert gehalten. Sie Reaktionstemperatur beträgt etwa 200O. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und durch Aufschlämmen in den folgenden Lösungen gewaschen:
3 x mit je 100 ml des genannten Phosphatpuffers 1 χ mit 100 ml Wasser
4 x mit je 100 ml 1 H Natriumohloridlöeung
1 χ mit 100 ml Wasser
2 χ mit je 100 ml 0,05 M Trispuffer pH 8,5
3 x mit je 100 ml Wasser ·
Ausbeute: 93£ der Theorie (bezogen auf die Einwaagen an Trägermaterial und Lyslnhydroohlorld)
1 09837/16OA
- Io —.
Beispiel 6
10 g des nach Beispiel 1 a erhaltenen Trägermaterials werden in 100 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers pH 7,5 suspendiert. Hierzu gibt man eine Lösung von 3*3 g Phenol in 50 ml desselben Pho-sphatpuffers. Durch Zutropfen von 1 N Natronlauge stellt man den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf pH 9,5 ein. Während der 30-minütigen Reaktionszeit wird dieser pH-Wert gehalten. Die Reaktionstemperatur beträgt etwa 200C. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und durch Aufschlämmen in den folgenden Lösungen gewaschen:
3 x mit je 100 ml des oben genannten Phosphatpuffers 1 χ mit 100 ml Wasser
4 x mit je 100 ml 1 M Natriumchloridlösung
1 χ mit 100 ml Wasser
2 χ mit je 100 ml 0,05 M Trispuffer pH 8,5
3 x mit je 100 ml Wasser
Ausbeute: 79 # der Theorie (bezogen auf die Einwaagen an
Trägermaterial und Phenol)
Beispiel 7
10 g des nach Beispiel 1 a erhaltenen Trägermaterials werden in 100 ml Benzol suspendiert. Hierzu gibt man eine Lösung von 3,1 ml n-Butanol in 50 ml Benzol. Das Reaktionsgemisch wird
1 Stunde lang am Rückfluß gekocht. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und durch Aufschlämmen in folgenden Lösungsmitteln gewaschen:
3 x mit je 100 ml Benzol
2 χ mit je 100 ml Äther
Das gewaschene Reaktionsprodukt wird an der Luft getrocknet. Ausbeute: 92 # der Theorie (bezogen auf die Einwaage an Trägermaterial und n-Butanol)
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Beispiel 8
« 10 g des nach Beispiel 1 a erhaltenen Trägermaterials werden in 100 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers pH 7i5 suspendiert. Hierzu gibt man eine Lösung von 2,7 g 2-Mercaptoäthanol in 50 ml desselben Phosphatpuffers. Durch Zutropfen von "1 N Natronlauge stellt man den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf pH 9,5 ein. Während der 30-minütigen Reaktionszeit wird dieser pH-Wert gehalten. Die Reaktionstemperatur beträgt etwa 200C. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und durch Aufschlämmen in den folgenden Lösungen gewaschen:
3 x mit je 100 ml des oben genannten Phosphatpuffers 1 χ mit 100 ml Wasser
4 x mit je 100 ml 1 M Natriumchloridlösung
1 χ mit 100 ml Wasser
2 χ mit je 100 ml 0,05 M Trispuffer pH 8,5
3 x mit je 100 ml Wasser
Ausbeute: 83$> der Theorie (bezogen auf die Einwaagen an Trägermaterial und 2-Mercaptoäthanol) .
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„ Beispiel 9
10 g des nach Beispiel 1 a erhaltenen Trägermaterials werden in 100 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers pH 7,5 suspendiert. Hierzu gibt man eine Lösung von 12 g Adenosin-5'-nionophosphorsäure in 50 ml desselben Puffers. Durch Zutropfen von 1 N Natronlauge stellt man den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf pH 9*5 ein. Während der 30-minütigen Reaktionszeit wird dieser pH-Wert gehalten. Die Reaktionstemperatur beträgt etwa 200C. Das Reakti onsprodukt wird abgesaugt und durch Aufschlämmen in den folgenden Lösungen gewaschen:
fe 3 x mit je 100 ml des oben genannten Phosphatpuffers 1 χ mit 100 ml Wasser
4 x mit je. 100 ml 1 N Natriumchloridlösung
1 χ mit 100 ml Wasser
2 χ mit je 100 ml 0,05 M Trispuffer pH 8,5
3 χ mit je 100 ml Wasser
Ausbeute: 59 i» der Theorie (bezogen auf die Einwaagen an Trägermaterial und Adenosin-5'-monophosphorsäure)
Beispiel 10
10 g des nach Beispiel 2 a erhaltenen Trägermaterials werden ' in 100 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers pH 7,5 suspendiert. Hierzu gibt man eine Lösung von 3,8 g Thiophenol in 50 ml desselben Phosphatpuffers. Durch Zutropfen von 1 N Natronlauge stellt man den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf pH 9i5 ein. Während der 30-minütigen Reaktionszeit wird dieser pH-Wert
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gehalten. Die Reaktionstemperatur "beträgt ca. 200C.
Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und»durch Aufschlämmen in den folgenden Lösungen gewaschen:
3 χ mit je 100 ml des oben genannten Phosphatpuffers 1 χ mit 100 ml Wasser
4 x mit je 100 ml 1 M Natriumchloridlösung
1 χ mit 100 ml Wasser
2 χ mit je 100 ml 0,05 M Trispuffer pH 8,5
3 χ mit je 100 ml Wasser
Ausbeute: 84 $> der Theorie (bezogen auf. die Einwaagen an Trägermaterial und Thiophenol)
Beispiel 11
10 g des nach Beispiel 1 a erhaltenen Trägermaterials werden in 100 ml Chloroform (äthanolfrei) suspendiert. Hierzu gibt man eine Lösung von 10 g östradiol in 50 ml Chloroform. Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde lang am Rückfluß gekocht. Das Reaktionsprodukt wird abgesaugt und durch Aufschlämmen in folgenden Lösungsmitteln gewaschen:
3 x mit je 100 ml Chloroform aufkochen 2 χ mit je 100 ml Äther waschen
Das gewaschene Reaktionsprodukt wird an der Luft getrocknet.
Ausbeute: 82 % der Theorie (bezogen auf die Einwaagen an Trägermaterial und östradiol)
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Claims (26)

  1. Patentansprüche
    rfahren zur covalenten Bindung von Substanzen mit reaktionshigen Gruppen an Maleinsäureanhydrid-Polymerisate, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger ein wasserunlösliches Copolymerisat aus Maleinsäureanhydrid und Vinyläthern verwendet, worin Maleinsäureanhydrid und Vinylgruppen etwa im Verhältnis 1 : 1 vorliegen und mindestens 5 f> der Vinylgruppen aus Divinyläthern stammen.
  2. 2. Verfahren nach Anspruoh 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat pro Mol Maleinsäureanhydrid etwa 0,025 - 0,5 Mol Divinylather und 0 bis etwa 0,95 Mol Monοvinylather enthält.
  3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat Divinyläther aliphatischer Diöle mit vorzugsweise 2-12 0-Atomen enthält.
  4. 4· Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat als Divinyläther Butandiol-1,4-divinyläther, Hexandiol-i.e-divinyläther, Diäthylenglyool-divinyläther und/oder Dianhydrosorbit-divinyläther enthält.
  5. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat ale Monovinyläther Alkylvinylather enthält, wobei die Alkylgruppe vorzugsweise 1-4 O-Atome aufweist.
  6. 6. Verfahren nach den Ansprüohen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet» daß man als Träger ein Polymerisat aus Maleinsäureanhydrid und Butandiol-1,4-divinyläther im Molverhältnis 1 : 0,5 verwendet.
    1 09837/1
  7. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bie 5» dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger ein Polymerisat aus Maleinsäureanhydrid, Butylvinyläther und Butandiöl-1,4-divinyläther im Molver^ hältnis 1 : 0,5 : 0,25 verwendet.
  8. 8. Verfahren nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger ein Polymerisat mit einem Schüttvolumen zwischen 2-12 ml/g verwendet.
  9. 9* Verfahren naoh den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger ein Polymerisat mit einem Schüttgewicht zwischen 0,5 - 0,08 g/ml verwendet.
  10. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger ein durch Lösungspolymerisation hergestelltes Polymerisat verwendet wird. .
  11. 11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung mit reaktionsfähigen Gruppen ein Enzym verwendet.
  12. 12. Verfahren nach den Ansprüchen 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung mit reaktionsfähigen Gruppen ein Enzymsubstrat, einen Enzymeffektor oder einen Enzymstabilisator verwendet.
  13. 13· Verfahren nach den Ansprüchen 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu fixierende Verbindung und das Trägerpolymerisat im Verhältnis 5 : 1 bis 1:5, vorzugsweise 1:2, aufeinander einwirken läßt. .
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man ■ die Fixierung in gepufferter Lösungbei einem pH-Wert zwischen 4 und 14 durchfuhrt.
    109837/1604
    **
  15. 15. Verwendung von wasserunlöslichen Polymerisaten, erhalten aus Maleinsäureanhydrid und Vinyläthern, wobei Maleinsäureanhydrid und Vinylgruppen etwa im Verhältnis 1 : 1 vorliegen und mindestens 5 # der Vinylgruppen aus Divinylathern stammen, zur covalenten Bindung von Substanzen mit reaktionsfähigen Gruppen.
  16. 16. Verwendung von wasserunlöslichen Polymerisaten, erhalten aus Maleinsäureanhydrid und Vinyläthera, wobei Maleinsäureanhydrid und Vinylgruppen etwa im Verhältnis 1 : 1 vorliegen und mindestens 5 # der Vinylgruppen aus Divinyläthern stamps ' men, zur covalenten Bindung von Enzymen und Enzymsubstraten, Enzymeffektoren und Enzymstabilisatoren.
  17. 17i Verwendung eines wasserunlöslichen Polymerisats nach den Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat pro Mol Maleinsäureanhydrid etwa 0,025 - 0,5 Mol Divinyläther und 0 bis etwa 0,95 Mol Monovinyläther enthält.
  18. 18. Verwendung eines wasserunlöslichen Polymerisats nach den Ansprüchen 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat Divinyläther aliphatischer Diole mit vorzugsweise 2-12 C-Atomen enthält.
  19. 19· Verwendung eines wasserunlöslichen.Polymerisats nach den Ansprüchen 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat als Divinyläther Butandiol-1,4-divinyläther, Hexandiol-1,6-divinyläther, Diäthylenglycoldivinyläther und/oder Dianhydrosorbit-divinyläther enthält.
  20. 20. Verwendung eines wasserunlöslichen Polymerisats nach den Ansprüchen 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat als Monovinyläther Alkylvinyläther enthält, wobei die Alkylgruppe vorzugsweise 1 - 4 C-Atome aufweist.
    1 09837/1604
    2Ü08990
  21. 21. Verwendung eines wasserunlöslichen Polymerisats nach den Ansprüchen 15 his 19» dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger ein Polymerisat aus Maleinsäureanhydrid und Butandiol-1,4-divinyläther im Molverhältnis 1 : 0,5 verwendet.
  22. 22. Verwendung eines wasserunlöslichen Polymerisats nach den Ansprüchen 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger ein Polymerisat aus Maleinsäureanhydrid, Butylvinyläther und Butandiol-1,4-divinyläther im Molverhältnis 1 : 0,5 : 0,25 verwendet.
  23. 23· Verwendung eines wasserunlöslichen Polymerisats nach den Ansprüchen 15 - 22, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger ein Polymerisat mit einem Schüttvolumen zwischen 2-12 ml/g verwendet.
  24. 24* Verwendung eines wasserunlöslichen Polymerisats nach den Ansprüchen 15 - 23, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger ein Polymerisat mit einem .Schüttgewicht zwischen 0,5 - 0,08 g/ml verwendet.
  25. 25. Verwendung eines wasserunlöslichen Polymerisats nach den Ansprüchen 15 - 24, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger ein durch Lösungspolymerisation hergestelltes Polymerisat verwendet wird.
  26. 26. Verwendung eines wasserunlöslichen Polymerisate nach den Ansprüchen 15 - 25, dadurch gekennzeichnet, daß man zu fixierende Verbindung und Trägerpolymerisat im Verhältnis 5 : 1 bis 1:5» vorzugsweise 1:2, aufeinander einwirken läßt.
    1 09837/1604
    ORIGINALJNSPECTED
    27· Enzyme, die nach einem Verfahren der Ansprüche 1-14 fixiert sind.
    109837/1604
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