JPS6178377A - イースト菌細胞の生長禁止を増大させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はイースト菌細胞の生長の禁止を抗生物質によっ
て増大させる方法に関する。

ボリミキシ７　（７ｙｏｌｙｍｙｚｉｎ）　Ｂは、バチ
ルスＯポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘ
ａ）の種々の種によって同化される複雑な抗生物質であ
り、バクテリヤ、菌及び動物の細胞にとって有毒である
。この毒性はその化合物の細胞膜の合体性を破喰し、そ
の結果細胞の内容物が外へ出てしまうという能力に帰す
ことができる。この抗生物質は環状ペプチド部分とアミ
ド結合によって連結した脂肪族アシル部分とからなる。

このアミド結合はパパイン又はフィチンによって開裂で
き、ポリミキシンＢノナペプチド又は単にＰＢＮとして
言及される環状ノナペプチドが生成する。ＰＢＮはバク
テリヤに対して無毒性であることが示されているが、バ
クテリヤ細胞を他の抗生物質又は血清補体に対して増感
せしめる。

バー　ラ（Ｆααγａ）及ヒバーラ〔ネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　、　３０３巻、　５２６〜ｓ　２　ｓ　（
１９８３）：］は、ＰＢＮ（文献にはＰ　Ｍ　Ｂ　Ｎと
記述）がダラム陰性バクテリヤの外側の細胞膜の透過性
を増加させ、これによってダラム陰性腸内バクテリヤを
補体及び抗生物質に対して増感させるために使用しうろ
ことを開示している。試験し九ノ（クチリヤは、大腸菌
、肺炎桿菌（Ｋｌｇｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ）、クレブシェラ拳オキシトカ（Ｋｌｇｂｓｉｅｌ
ｌａｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクタ−・アグロメラ
ンズ（αｇｇｌｏ叫ｒａｎｓ）、ネズミチプス菌（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｒｎｕｒｉｕｒｎ）、及
ヒｒｉｌｌ　（Ｐｓｅｎｄｏｒｎｏｎａ８　αｅｒｊＬ
ｒｔｔｎ０８ａ）の臨床学的分離体でめった。著者は、
細胞の増大した抗生物質に対する感度が故に、ＰＢＮを
多くの抗生物質の抗バクテリヤ作用範囲を広げるために
臨床学的に使用できるととを指摘している。しかし低級
真核生物（ｅｌｔｃａｒｙｏｔｅｓ）例えばイースト菌
におけるｐＥＮの使用については記述も提案もない。

英国特許願第ＧＢ２，１２８，６１７Ａ号は実質的に同
様の開示をしている。

ストーム（Ｓｔ　ｏｒｍ）ら〔アン・レブ・パイオケム
（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、）、　４６　：
；　７２３〜７６３　。

１９７７）は、ポリミキシン抗生物質の生化学的及び生
理学的データ及びそのバクテリヤ細胞に及ばず影響につ
いて総説を書いている。

上述の参考文献のいずれもが、イースト菌の種種の抗生
物質による生長の禁止を増加させるためにｐＢＮを使用
することを記述し或いは提案していない。

本発明はイースト菌細胞の生長の抗生物質による禁止を
増大させる方法に関する。本方法はイースト菌細胞を、
リファンピシン（τｉｆαｍｐｉｃｉｎ）、エリスロマ
イシン、Ｇ−４１８、シクロヘキシミド及びアクチノマ
イシンＤからガる群から選択される抗生物質の生長禁止
量の存在下に、ポリミキシンＢノナペプチドの有効量と
一緒に培養するものである。該イースト菌細胞のポリミ
キシンＢとの接触は、該細胞の透過性を増加させ、その
結果細胞が敏感である又はさもなければ耐性であってよ
い抗生物質によるその生長の禁止が増大するものと思わ
れる。

本明細書で用いる如きＧ−４１８はギブコ参ラボラトリ
ーズ（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入
手■ しうる抗生物質のＧｅｎｅｔｉｃｉｎに関するものであ
る。

ポリミキシンＢノナペプチド（本明細書ではｒ−ｐＢＮ
Ｊとして言及）は分子の脂肪族アシル残基とペプチド残
基を結合するアミド結合を酵素的に開裂することによっ
て抗生物質ポリミキシンから製造される。この反応は次
のように例示するこ゛とができる（式中、「ｄαｂ」は
ジアミノ酪酸、また「ＦＡ」は脂肪酸に関するものであ
る）：ｐＢＮの製造は、本明細書に参考文献として引用
されるチハラ（Ｃｈｉｈαｒα）らの方法に従い、アグ
ル・ビオｆｉｙａケｌｋ　（Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、　）　３７（１１）、２４５５〜２４６３　（
１９７３）に記述されているように省力われる。ポリミ
キシンＢサルフェートを、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７）中に
おいて３７℃で２４時間精製フィチン（ｆｉｃｉｎ）に
より加水分解する。次いで反応混合物を沸とうさせ（そ
の結果酵素を凝集させ）、そしてポリミキシンＢ加水分
解物を濾過によって清澄させる。次いでこの清澄した溶
液を１規定（Ｎ）ＦＩＣＩでｐｌｉ２まで酸性ＫＬ、続
いてｎ−ブタノールで抽出して脂肪族アシルジアミノ酪
酸を溶解させる。残存する水溶液をｔ＃　　ＮａＯＨで
ｐＨ８まで調節し、ｎ−ブタノールで繰返し調節してい
ずれか残存するポリミキシンＢを除去する。水性層のｐ
Ｈを再び（ｐＨ７に）調整し、この物質をアンバーライ
トのＩＲＡ−４１０（ＯＨ型）のカラム中を通過させる
。流出液をｐＨ５に調整し、真空下に濃縮し、凍結乾燥
する。得られるｐＥＮは多量のＮαＣ１（３〜４４ｆ）
を含有するが、この塩は標準的な技術例えば炭酸アンモ
ニウムを流出剤として用いてセファデックス＠Ｇ−１０
のカラムを通過させることにより除去することができる
。

本発明の方法は、イースト菌細胞を、抗生物質の生長禁
止量の存在下にｐＥＮの有効量と一緒にｍ養することか
らなる。

これらの目的のために使用しうるｐＢＮの量（即ち「有
効量」）はいずれか約１〜約１０，４力単位の範囲であ
ってよい。ＩＡ２＆ｌＡ２上ＰＢＮのｌ　ｗｎｌ試料の
２６０ｎｍにおける吸光度に関するものである。１単位
は塩を含まないＰＲＨの約６ｍｇに等しい。ＰＲＨの吸
光度の測定は、ポリミキシンＢサルフェートの酵素分解
後に塩が存在しているから、試料中のＰＲＨの濃度を重
量で決定するよりも信頼性のある方法と考えられる。イ
ースト菌細胞の、ＰＲＨの所望の量との培養は、抗生物
質の生長禁止量の存在下にいずれか簡便か方法で行なう
ことができる。本明細書に用いる如き「生長禁止量」と
け、ｐＢＮと接触したイースト菌の生長を抑制するのに
必要な抗生物質の量を意味する。

与えられた状態で使用しうる抗生物質の正確外景は、因
子例えば用いる抗生物質、試験するイースト菌の種及び
／又は属力どに依存しよう。いずれの場合においても、
抗生物質の量は通常の技術により同業者によって容易に
決定することができる。

本明細書に記述する如きｐＢＮの使用は細胞が予じめ敏
感であることの知られている抗生物質に対するイースト
菌細胞の敏感性を増大させるのに役立ち、或いはｐＢＮ
はイースト菌が通常耐性である抗生物質に対して細胞を
敏感にさせうる。しかしながら本明細書に記述されるｐ
ＢＮの効果は選択的であって、ＰＩ３Ｎがすべての抗生
物質によってイースト菌細胞の生長禁止を増大させえな
い。

イースト菌細胞の生長禁止を確かめる簡便々方法は次の
通りである。生きた夜通しの培養物からのイースト菌細
胞（細胞約１０７個）の試料を、ＰＢＨの所望の量を添
加した溶融寒天を含む生長媒体に添加する。得られた懸
濁液を迅速に混合し、次いで適当な生長媒体を含有する
寒天板上に注ぐ。

この溶融寒天を固化させ、無菌の円形濾紙を表面上に置
く。次いで試験すべき抗生物質の溶液をピペットで円形
涙紙上に注ぐ（濾紙当り５０μｌ）。

この寒天板を培養し、そして濾紙の周囲の禁止域によっ
て決定される如き抗生物質に対する敏感性を「読みとる
」。

本発明の方法が適用しうるイースト菌は、麦酒酵母菌、
鵞口須カンジダ、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉ
ｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）　、カンジダ−、＜ｆラ
トイデ７　（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｇ
ａ）などを含む種々のカンジダ属、クリプトコックスー
ネオフォ／ｌ／　−ｙ　７ズ（Ｃｒｙｃｌｏｃｏｃｃｒ
ｂｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシジオイデスφイ
ミチス（Ｃｏｃｃゼｄｉｏｉｄｅｓ匈ｍ１ｔｉｓ）、ト
ルロプシス・ゲラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏ−ｐｓｉｓ　ｇ
ｌαｂｒαｔα）、ヒストプラズマ・カプスラタム（Ｈ
ｉｓｔｏｐｌａｓｔｎｔｔ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、
及びトリコスボロンーカタネウＡ　（Ｔｒｉｃｈｏｓｐ
ｏｒｏｎ　ｃｕｔａ−ｎｇｕｒｎ）を含むが、とれに限
定されるものではない。

次の実施例は本発明を例示する手段として記述するもの
であり、本発明を制限するものとして見なすべきではな
い。

実施例■ 種々の抗生物質によるイースト菌細胞の生長禁止に及ぼ
すＰＢＨの効果 Ａ、ポリミキシンＢノナペプチドの製造上述のチハラら
の方法により、ポリミキシンＢサルフェート［シグマ・
ケミカル社ＣＣ５１ｖαＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）
製、カタログ番号ＰＩＯ０４］からポリミキシンＢネオ
ペプチド＜ＰＢＮ）を調製した。ポリミキシンＢサルフ
エー）９ｇヲ０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）
９００ｍ／に溶解し、これにフィチン（シグマ・ケミカ
ル社製、カタログ番号４１２５）２０００単位を添加し
、得られた混合物を穏やかに攪拌しながら３７℃に２４
時間保った。次いでこの混合物を１５分間沸とうさせて
酵素を凝固させ、次いで孔の寸法が０．４５μｍのフィ
ルターを通して濾過した。清澄した溶液をＩＮ　　ＨＣ
ｌで７）Ｈ２まで酸性にし、次いでｎ−ブタノールで抽
出した。残存水溶液をｌＮＮａＯＨでｐＨ８に調節し、
ｎ−ブタノールで再び抽出した。この水性層をｐＨ７に
調節し、次いでこれをアンバーライト＠ＩＲＡ−４１０
（ＯＨ型）のカラム中を通過させた。次いで流出液を凍
結乾燥し、Ｈ，０３’Ｉｔｎｌの全量に溶解した。

得られた溶液は１４５，４．、単位の濃度を有した。

この溶液の１０ｍ／試料を、炭酸アンモニウムを流出剤
として用いるセファデックス（Ｒ）Ｇ−１００カラムで
脱塩した。流出液を再び凍結乾燥し、Ｈ２Ｏ５ｍ１に溶
解させて、最終溶液を１５．２４６ｏ単位の濃度にした
。

Ｂ、ポリミキシンＢノナペプチドの麦酒酵母菌に及ぼす
効果 １％（ｗ　／　ｖ　）イースト抽出物、２％（ｗ／ｖ）
ペプトン及び２％（ｗ／υ）グルコースからなる液体媒
体（ＹｐＤ媒体）からなる液体媒体中において、麦酒酵
母菌種５２８８Ｃを３０℃で１６時間生長させた。この
培養物からの細胞懸濁液１滴（細胞的５Ｘ１０Ｌ−約１
×１０７個）を、寒天が固化するのを妨げるために４５
〜５０℃に保った０、７チ寒天、１チイースト抽出物、
２チベブトン、２％グリセロール（又は他に炭素源とし
て２優グルコース）及び５　ＭＮ　ａ　ＣＩ　０．２５
　ｍｌの溶液３ｍｌを含む２本の試験管のそれぞれに添
加した。１つの試験管は上記物質のほかに、上述の如く
調製したＰＢＮ溶液（４，８Ａ２．。単位）０，５ゴを
含有した。もう１つの試験管を対照例とした。試験管内
容物を迅速に混合し、そして２ヂ寒天、１デイースト抽
出物、２チペブトン及び２チグリセロール（ＹＰＧ媒体
）　２　ｓ　Ｆ＋／を含むペトリ皿−ヒに注いだ。寒天
を固化させた後、無菌の円形Ｆ紙（直径０、５インチ）
を寒天の表面上に置き、試駆すべき種々の抗生物質の溶
液をピペットで円形炉紙上に注いだ。次いでこの寒天プ
レートを３０℃で４８時間培養し、円形原紙の周囲に形
成される透明な領域の面積（−円形沖紙の面積）を測定
することによって生長の禁止を決定した。結果を第１表
に示す。

第１表 エリスロマイシン（０，５）　　　　８０　　　　２２
７Ｇ−４１８（５，０）　　　　　　１１３　　　　４
９０α　３０チエタノール中 ｂ　　Ｇ−４１８はギプコ・ラボラトリーズ製の抗生物
質Ｇｅｔｓｅｔｓｃｉ−に関するものである。

Ｃジメチルスルホキシド中 ｄ　寒天プレートに用いたＹｐＤ媒体 これらの結果は、ｐＢＮがイースト細胞による上記抗生
物質の捕捉を容易にすることを示唆する。

ミトコンドリアの蛋白質合成に影響するエリスロマイシ
ンは、（グルコースよりもむしろ）グリセロールを炭素
源として用いる場合にだけ、この試験系において効果的
であった。これはミドコンドリヤの蛋白質合成機能がグ
ルコースを炭素源として用いる時に細胞によって必要と
されないという事実のためである。リファンピシン、Ｇ
−４１８及びアクチノマイシンＤは炭素源とは無関係に
イースト菌の生長の禁止を示したが、一方カナマイシン
、ストレプトマイシン及びクロランフェニコール（それ
ぞれ５．０．２５及びｏ、２５ｔｓｉ／円形流紙）は対
照例及びｐＢＮ含有試料の双方に対して、この実験の場
合効果を示さなかった（データーは第１表に示してない
）。

実施例■ 鵞口涜カンジダの生長に及ばずＰＢＨの影響鵞口瘡ガン
シダ（ＡＴＣＣ１０２３１）に関して実施例１に記述し
た方法を繰返した。この有機体の、ＰＢＮの存在及び不
存在（対照例）下におＩｒｊルＧ−４１８、リファンピ
シン、シクロヘキシミド及びアクチノマイシンＤによる
生長の禁止を決定した。結果を第２表に示す。

第２表 Ｇ−４１８（５，０）　　　　　２０　　３４６リフア
ンピシン（２，５）　　　　　（３３シクロヘキシミド
（０，５）　　　　（３６４アクチノマイシ７Ｄ（０，
５）　　　（３４５２α　ｐＢＮはＹｐＤ媒体の寒天板
当り３．０Ａ力単位の濃度で存在 これらのデータは、鵞ロ涜カンジダ種ＡＴＣＣ１０２３
１の生長がＰｎＮの存在下に、その有機体に耐性がある
か又は弱い感性しか有さない抗生物質によって某１）−
され、′こことを示す。この観察は、ｐＲＮが皮膚、粘
嘆及び消化器管の種々のカンジダ属の感染並びにイース
ト菌起源の他の感染の処置における治療学的助剤として
有用なことを示唆する。

実施例■ イースト菌のりファンビシンによる生長禁止に及ぼすｐ
ＢＮの種々の濃度の影響 麦酒酵母菌種５２８８Ｃに関して、ＰＢＮの増加量を用
いる以外実施例Ｉに記述した方法を繰返した。リファン
ピシンの円形Ｆ紙上の濃度をすべて２５■／円形済紙に
保った。この結果を第３表に示す。

第３表 リファンピシンによる生長禁止に及ぼすｐ　Ｂ　ｒ’Ｊ
の０．００ １．９　　　　　　　　　　　　　　　３．０２、０　
　　　　　　　　　　　　　　２０．０３、　Ｑ　　　
　　　　　　　　　　　　　３８．５４、９　　　　　
　　　　　　　　　　３８．５５、０　　　　　　　　
　　　　　　　５　０．０６・０　　　　　　　　　　
　　　　　　６４．０７、　Ｑ　　　　　　　　　　　
　　　　　７８．５８、０　　　　　　　　　　　　　
　　７　１．０９、０　　　　　　　　　　　　　　　
７８．５１　０、０　　　　　　　　　　　　　　　９
　５．０これらのデータは、リファンピシンによる生長
禁止の増大が用いたｐＢＮの濃度に凡そ比例するという
ことを示す。

特許出願人　　マイルス・ラボラドリース・インコーボ
レーテツド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イースト菌細胞を、リフアンピシン、エリスロマイ
   シン、Ｇ−４１８、シクロヘキシミド及びアクチノマイ
   シンＤからなる群から選択される抗生物質の生長禁止量
   の存在下に、ポリミキシンＢノナペプチドの有効量と一
   緒に培養することを特徴とするイースト菌細胞の生長禁
   止を増大させる方法。 ２、イースト菌がカンジダ属又は酵素菌属の種である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、イースト菌が鵞口瘡ガンシダである特許請求の範囲
   第２項記載の方法。