RU1790410C - Способ получени противоракового препарата - Google Patents

Abstract

Использование: микробиологи . Сущность изобретени : включает культивирование штамма Bacillus thuringlensls. подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов. Молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов разлагают растворением в щелочи, причем растворение осуществл ют непосредственное споро-дельта73ндотоксиновой смеси с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой, в качестве растворител  используют едкий натр или едкое кали при соотношении объемов спо- ро-дельта-эндотоксиновой смеси и растворител  соответственно 1:10-1:15, концентрированную уксусную кислоту дл  осаждени  добавл ют до достижени  рН 4. 2 з.п.ф-лы.

Description

СП

с

Изобретение относитс  к микробиологии , а именно к способу получени  препарата на основе штамма Bacillus thuringlensls, обладающего противораковой активностью .

Известен способ получени  препарата на основе штамма Bacillus thuringlensls.

Известный способ включает культивирование штамма, подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до . полипептидов.

Недостатком способа  вл етс  его сложность и трудоемкость, т.к. разложение молекул дельта-эндотоксина осуществл ют после удалени  спор из споро-дельта-эндо- токсиновой смеси.

Разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов осуществл ют с помощью щелочи, а осаждение - целлюлозно колоночной хроматографией, Это очень сложный и дорогосто щий процесс.

Известен также способ получени  препарата на основе штамма Bacillus thurlngiensb, обладающего противоопухолевой активностью, наиболее близкий по технической сущности и достигаемому эффекту .

Известный способ включает культивирование штамма Bacillus thuringlensls, подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов.

Недостатком известного способа  вл етс  его сложность и длительность, т.к. разложение молекул дельта-эндотоксина осуществл ют после удалени  спор из спо- ро-дельта-эндотоксиновой смеси.

Удаление спор осуществл ют флотацией . Однако при этом удал етс  около 80% спор, а остальные 20% удал ют путем фазового разделени  в двухфазной системе четы реххлористы и углеродсернокислый натрий, что требует дополнительных заVI чэ о

4

СО

трат и также усложн ет способ, увеличивает его длительность.

Кроме того, разрушение кристаллической структуры дельта-эндотоксина, при котором происходит разложение молекул до полипептидов, что необходимо дл  использовани  препарата, осуществл ют облуча  дельта-эндотоксин ультрафиолетовыми лучами , что требует специального оборудовани  и удорожает и усложн ет способ.

Цель изобретени  -упрощение способа и повышение его экономичности.

Указанна  цель достигаетс  тем, что в известном способе получени  препарата на основе штамма Bacillus thurlenglensls, обладающего противоопухолевой активностью , включающем культивирование штамма, подготовку культуры и разложение молекул дельта-эндотоксина до полипептидов , согласно изобретению, культивируют штамм Bacillus thuringiensls var. gallerle, молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов разлагают растворением о щелочи, причем это растворение осуществл ют непосредственно в споро-дельта-эндотокси- нов ой смеси, с последующим осаждением полипептидов титрованием концентрированной уксусной кислотой.

Целесообразно в качестве растворител  использовать едкий натр или едкое кали при соотношении объемов споро-дельта-эн- дотоксиновой смеси и растворител  соответственно 1:10 - 1:15.

... Уксусную кислоту дл  титровани  добавл ют до достижени  рН 4.

Предлагаемый способ отличаетс  от прототипа тем, что культивируют штамм .Bacillus thuringlensis Var. gallerie, молекулы дельта-эндотоксина до полипептидов раз- лагают растворением в щелочи, причем рас- творение осуществл ют непосредственно в споро-дельта-эндотоксиновой смеси с последующим осаждением полипептидов тит- ;рованием концентрированной уксусной кислотой. Способ отличаетс  также тем, что R качестве растворител  используют едкий натр или едкое кали при соотношении обь- емов споро-дельта-эндотоксиновой смеси и растворител  соответственно 1:10 - 1:15, а концентрированную уксусную кислоту дл  осаждени  титрованием добавл ют до достижени  рН 4.

Сущность предлагаемого способа наиболее полно раскрыта в примерах его конкретного осуществлени .

П р и м е р 1. Культивирование Bacillus thuringiensls Var. gallerie осуществл ли на твердой питательной среде в термостате при 28-30°С в течение 10 дней. После чего культуру промыли дистиллированной во0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

дои, затем физиологическим раствором и снова дистиллированной водой. При этом споро-дельта-эндотоксинова  смесь освобождаетс  от растворимых токсинов. В смеси остаютс  в основном споры и кристаллы дельта-эндотоксина, вегетативные клетки.

Дл  разложени  молекул, образующих кристаллы дельта-эндотоксина, до полипептидов ,  вл ющихс  по сути действующим началом препарата, непосредственно в спо- ро-дельта-эндотоксиновую смесь добавили растворитель - едкий натр, в соотношении объемов 1:10, т.е. на 1 г споро-дельта-эндотоксиновой смеси - 10 мл едкого натра, и выдержали до растворени  кристаллов дельта-эндотоксина, посто нно перемешива . При этом частично раствор етс  и белок спор. Причем он разлагаетс  также до полипептидов, сходных с полипептидами, на которые разлагаютс  молекулы дельта- эндотоксина.

Осадок, включающий остатки спор и вегетативных клэток, удалили центрифугированием в течение 20 мин, при скорости вращени  ротора 5000 об/мин. Возможно удаление осадка и любым другим способом, например фильтрацией. Дл  повышени  чистоты действующего начала (полипептидов) их осадили титрованием концентрированной уксусной кислотой до рН А.

Таким образом препарат, обладающий противоопухолевой активностью, на основе штамма Bacillus thurlenglensls Var, gallerle получен без применени  специального оборудовани , простым переосаждением дельта-эндотоксина , растворенного щелочью непосредственно в споро-дельта-эндоток- синовой смеем, что значительно ускор ет процесс, делает его более простым м экономичным .

П р и м е р 2, Технологи  аналогична примеру 1, но в качестве растворител  использовали едкое кали при соотношении объемов 1:10 (т.е. на 1 г споро-дельта-эндо- токсинной смеси - 10 мл едкого кали).

П р и м е р 3. Технологи  аналогична примеру 1, но в качестве растворител  брали едкий натр при соотношении объемов 1:15.

П р и м е р 4. Технологи  аналогична примеру 1, но в качестве растворител  использовали едкое кали в количестве 1:15.

Противоопухолевую активность препарата на основе штамма Bacillus thuringiensls. Var. gallerie, полученного предлагаемым способом провер ли на культурах раковых клеток HeLa и НеР. Все операции способа дл  испытани  именно на клетках проводили в стерильных услови х,

использу  стерильные растворы и вещества ,

Перед использованием, чтобы нейтрализовать возможное цитотоксическре вли - ние щелочи на клетки, титровали одномол рным раствором сол ной кислоты до рН 8. Далее раствор препарата разбавили стерильным буфером следующего состава: 0,8% NaCI + 0.02% KCi + 0.115% Na2HPCM + 0,02% КН2РСМ + Н20 - остальное , имеющим рН 7,5 до необходимой концентрации (0,025-0,075 мг/мл). В опыте разбавили до концентрации 0,05 мг/мл, В этом же буфере дважды промыли раковые клетки HeLa и НеР, Затем указанные раковые клетки инкубировали при 28°С с приготовленным белково-дельта-эндотоксиновым раствором . Через 1, 5, 10, 15 и 30 мин, а затем через 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24 и 48 часов раковые клетки осторожно промывали и тотчас фиксировали. Обработанные клетки исследовали методами световой, электронной сканирующей и просвечивающей микроскопии.

Дл  световой микроскопии обработанные препаратом раковые клетки промывали 4-6 раз фосфатным буфером рН 7,4, фиксировали в фиксаторе Карнуа и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Просматривали под световым микроскопом марки Эр- гавал (ГДР). Хорошо просматривалось изменение клеток во времени под действием препарата вплоть до их разрушени ,

При помощи сканирующего микроскопа при увеличении в 5000 раз получены фотографии , показывающие изменение раковых клеток HeLa во времени под действием препарата , полученного предлагаемым способомнепосредственно из споро-дел ьта-эндотоксиновой смеси.

Ясно видна противоракова  активность препарата на основе Bacillus thurlnglensls Var. gallerle, полученного более простым способом непосредственно из споро-дель- та-эндотоксиновой смеси.

Claims (2)

1. Формула изобретени  1. Способ получени  противоракового препарата, включающий культивирование штамма Bacillus thurlnglensfs с последующим разложением дельта-эндотоксина до полипептидов , отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа и поБелок спор, при добавлении щелочи частично разлагаетс  на полипептиды, сходные с полипептидами молекул дельта-эндотоксина и не снижает противораковой активности 5 препарата, что установлено экспериментально .

   Дл  контрол  раковые клетки культур HeLa и НеР обрабатывали по указанной выше технологии, но раствор препарата заме- 0 пили раствором щелочи равного объема и концентрации. Изменений в раковых клетках в указанные выше периоды времени не наблюдалось.

   При осуществлении способа получени  5 препарата использовать едкий натр или едкое кали нецелесообразно в соотношении меньшем чем 1:10, т.к. в этом случае получитс  перенасыщенный раствор, в котором не все молекулы дельта-эндотоксина могут 0 разложитьс  до полипептидов.

   Соотношение споро-дельта-эндотоксиновой смеси и едкого кали или едкого натра большее чем 1:15 нецелесообразно, т.к. приведет к непроизводительному расходу 5 щелочи, концентрированной уксусной кислоты дл  титровани .

   Предлагаемый способ позвол ет получить препарат на основе штамма Bacillus thuringiensls Var. galierie, обладающий про- 0 тивоопухолевой активностью, обычным растворением до полипептидов молекул дельта-эндотоксина, составл ющих его кристаллы , и простым переосаждением действующего начала, т.е. полипептидоо 5 титрованием концентрированной уксусной кислотой, что значительно удешевл ет и упрощает способ (за счет сокращени  числа операций, по сравнению с прототипом, уменьшени  их сложности и трудоемкости, 0 отсутстви  специального оборудовани ).

   Белок спор, при добавлении щелочи частично разлагаетс  на полипептиды, сходные с полипептидами молекул дельта-эидотоксмна и не снижает противо- 5 раковой активности препарата, что установлено экспериментально.

   вышени  его экономичности, из штаммов используют штамм Bacillus thuringiensls Var. galierie, разложение дельта-эндотоксина осуществл ют щелочью в споро-дельта- эндотокси новой смеси, после чего полипептиды осаждают концентрированной уксусной кислотой.

   71790410 8
2. 2. Способ по п.1.отличающийс З.Споообпопп,1и2,отличающийс тем,что тем, что из щелочи используют едкий натр указанную кислоту добавл ют до достиже- или едкое кали при их соотношении к спо- ни  рН 4. ро-дельта-эндотоксиновой смеси 10-15:1.