DE2611258A1

DE2611258A1 - Verfahren zur extraktion eines polypeptids, insbesondere eines enzyms, aus einer waessrigen loesung

Info

Publication number: DE2611258A1
Application number: DE19762611258
Authority: DE
Inventors: Michel Schneider
Original assignee: Battelle Memorial Institute Inc
Current assignee: Battelle Memorial Institute Inc
Priority date: 1975-03-18
Filing date: 1976-03-15
Publication date: 1976-09-30
Also published as: DE2611258C2; FR2304620B1; FR2304620A1; GB1516955A; JPH0224837B2; US4066505A; DK145062B; DK145062C; CH594696A5; NL7602715A; JPS51118808A; DK114976A

Description

l. BERLIN-DAHLEM 33 · PODBIELSKIALLEE 68 8 MÜNCHEN 22 · WIDENMAYERSTRASSE 49

BATTELLE MEMORIAL INSTITUTE berlin: dipl.-ing. r. müller-börner

MÜNCHEN: DIPL.-ING. HANS-H. WEY

25 912

Berlin, den 15. März 1976

Verfahren zur Extraktion eines Polypeptids,insbesondere eines Enzyms, aus einer wässrigen Lösung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Extraktion eines Polypeptide aus einer wässrigen Lösung.

Dieses Verfahren kann insbesondere zur Extraktion eines Enzyms angewandt werden.

Seit einigen Jahren nimmt die Verwendung von Enzymen für die Durchführung industrieller chemischer Verfahren großen Umfang an. Dies kann man hauptsächlich auf die Entwicklung von Verfahren zum Fixieren von Enzymenauf einem Träger oder in einer festen Matrize zurückführen, die z.B. aus einem synthetischen Harz bestehen, was eine einfache Rückgewinnung des Enzyms nach seiner Verwendung und in zahlreichen Fällen auch eine Erhöhung der Lebensdauer des Enzyms ermöglicht.

Industrielle Verfahren, in denen man Enzyme verwendet, sind z.B. die folgenden Verfahren: Trennung des Isomers L aus dem DL-Methionin unter Verwendung einer auf einem Polyacrylamid fixierten Acylase; Herstellung von Fructosesirup aus Glucose

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unter Verwendung von Glucose-Isomerase; Delactosation der Milch oder des Milchserums mit Hilfe von auf einem Träger fixierter Lactase; Herstellung von Penicillin-Derivaten unter Verwendung von Penicillin-Amidase usw..

Obwohl bei dieser Art von Verfahren durch die Fixierung des Enzyms auf einem Träger es ermöglicht wird, den spezifischen Verbrauch an Enzymen und damit den Gestehungspreis des Produkts wesentlich zu verringern, bleibt dieser doch im allgemeinen in der gleichen Größenordnung wie in dem Fall, wo man das gleiche Produkt nach einem nicht enzymatischen Verfahren herstellt. Man hat daher berechnet, daß eine Verringerung des Gestehungspreises um etwa 30% es ermöglichen würde, die enzymatischen Verfahren im Verhältnis zu ö<?n. anderen bekannten Verfahren wettbewerbsfähig zu machen.

Abgesehen von einigen seltenen Ausnahmen wie den Proteasen, den Amylasen und den Glucoatnylasen sind die Enzyme sehr teuer. Man kann den Gestehungspreis der Enzyme auf verschiedene Weise senken,, insbesondere durch geeignete Wahl der Enzym-Quellen und durch Schaffung neuer Mutantenstämme. Woher die Enzyme jedceL aurh iinmer stammen, man stößt gegenwärtig doch auf die Schwierigkeit, das Enzym aus einer Lösung (Rohextrakt) zu extrahieren, di«& im allgemeinen pro Liter nur Iu 000 bis lOO 000 Enzym-Einhei-uen enthält (eine Enzymeinheit wird dabei definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um die Umsetzung eines Micromol eines Substrats pro Minute unter optimalen Reaktionsbedingungen hervorzurufen), das sind maximal einige Gramm pro Liter.

Es sind zwei Arten von Verfahren zur Extraktion der Enzyme aus ihren Lösungen (Rohextrakt) bekannt.

Die Verfahren der ersten Art (sogen, "klassische"Verfahren) bestehen darin, die fraktionierte Ausfällung der Proteine mit Hilfe von Mineralsalzen wie Arrjnoniumsulfat oder verschiedenen organischen Verbindungen wie Ä'thanol, Aceton, Polyalkohole usw. hervorzurufen, nachdem durch Zusatz geeigneter Substanzen wie Protaminsulfat, Xaclease usw. die in dem Rohextrakt enthaltenen Nucleinsäuren entzogen \v*urdsn, worauf dann die Enzyme der anderen Proteine unter Durchführung einer Reihe von Chromatographien getrennt werden.

Die Verfahren der zweiten Art (Chromatographie durch Affinität, englisch: "Affinity chromatography") bestehen darin, wahlweise das Enzym zu extrahieren, indem man den Rohextrakt direkt mit einer festen Substanz wie Zellulose oder einem synthetischen Harz zusammenbringt, auf dem durch Kovalenz Moleküle eines spezifischen Inhibitors dieses Enzyms verbunden sind, und dann die Auswaschung des Enzyms zu veranlassen.

Ein Verfahren entsprechend dieser zweiten Art ist z.B. in den DT-OS'en 15 17 753 und 17 68 934 beschrieben. Entsprechend diesem Verfahren wird die feste Substanz, auf der die Inhibitor-Moleküle des Enzyms gebunden sind, entweder in einer Chromatographie-Säule verwendet oder in Suspension in der das Enzym, das man entziehen will, enthaltenden Lösung.

- 4 r-

-A-

Die Verfahren der ersten Art haben den Nachteil, daß für ein relativ geringes Gewicht an Enzymen große Mengen von Ammoniumsulfat sowie die Behandlung von großen Mengen wässriger Lösung erforderlich sind, wobei man nur eine schwache Reinigung des Enzyms erreicht. Die mit der Durchführung dieser Verfahren verbundenen Kosten sind hoch.

Auch die Verfahren der zweiten Art sind nicht frei von Nachteilen. Wenn man die feste Substanz,auf der die Inhibitor-Moleküle gebunden sind,in einer Chromatographie-Säule verwendet, rufen die Substanzen mit erhöhtem Molekulargewicht wie die Proteine, die in der die zu extrahierenden Enzyme enthaltenden Lösung vorhanden sind, sehr schnell die Sättigung oder Verstopfung der Säule hervor. Bei Verwendung dieser festen Substanz in dieser Lösung in Suspension kann nur ein kleiner Anteil der Inhibitor-Moleküle verwendet werden, um die Enzym-Moleküle zu fixieren, weil die Lösung nur mit der äußeren Oberfläche der Teilchen dieser festen Substanz und vielleicht mit einem kleinen Anteil der Oberflächen der Poren dieser Teilchen in Berührung steht, falls diese Teilchen porös sind, was nicht unbedingt der Fall sein muß. Der Ertrag dieser Verfahren, ausgedrückt als Verhältnis der entzogenen Menge an Enzymen zur erforderlichen Inhibitor-Menge, ist daher relativ gering, was ebenfalls einen kostenerhöhenden Faktor für ihre Durchführung darstellt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, diese Nachteile zu vermeiden und es zu ermöglichen, in hohem Maße die Kosten für die Extrahierung der Polypeptide aus wässrigen Lösungen zu senken, insbesondere die der Extrahierung der Enzyme aus "Rohextrakten".

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Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß man einen in Wasser löslichen makromolekularen Komplex (I) bildet, der aus Molekülen mindestens einer das Fixieren dieses Polypeptide in ausgewählter reversibler und nicht zerstörender Weise ermöglichenden Verbindung besteht, wobei diese Moleküle durch kovalep.te Bindungen auf Makromolekülen gebunden sind, daß man den Komplex (I) mit dem Polypeptid reagieren läßt, wobei dieser KcT.piex (I) sich in der wässrigen Lösung des Polypeotids in ~.uf gelöstem Zustand befindet, was durch Bildung eines ebenfalls wässrigen Komplexes (II) die selektive Fixierung dss iolypeptids auf dem Komplex (I) hervorruft, daß man den Komplex (II) ausfällt, daß man den Komplex (II) in Polypeptic-Moleküle und Moleküle des Komplexes (I) dissoziiert und daß man die Polypeptide des Komplexes (I) abtrennt.

Um ein Enzym als "Rohextrakt" aus einer wässrigen Lösung zu extrahieren, kann man als das Polypeptid fixierende Verbindung eine Verbindung verwenden, die aus den reversiblen Inhibitoren und den Substraten und Pseudo-Substraten dieses Enzyms ausgewählt wird.

Unter "Rohextrakt" versteht man eine wässrige Lösung, die neben dem Enzym oder den Enzymen, die man extrahieren will, andere Proteine, Nukleinsäuren, Metabolite, Mineralsalze, Polysaccharide und viele andere mineralische und organische Substanzen enthält. Man kann "Rohextrakte" jeglicher Herkunft verwenden, insbesondere die, die in an sich bekannter Weise aus Mikroorganismus-Kulturen erhalten werden nach Zerspringen der Zellen und Extraktion der Proteine oder aus Homogenaten tierischer Gewebe oder auch aus Pflanzenextrakten.

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Unter "reversiblem Enzym-Inhibitor" versteht man eine Verbindung, deren Moleküle die Eigenschaft haben, sich in selektiver, reversibler und nicht destruktiver Weise auf einem gegebenen Enzym zu fixieren oder auf den Enzymen, die einer genau bestimmten Klasse angehören, und zwar durch chemische, an eine genau bestimmte Stelle des Enzyn-Moleküls lokalisierte Bindung, was die katalytische Aktivität des Enzyms aufhebt oder verringert. Da diese Fixierung nicht destruktiv und reversibel i?t, zerstört oder gefährdet sie das Enzym nicht, und die Moleküle dieses Enzyms können von den Inhibitor—Holekülen getrennt werden, wobei ihre ursprüngliche katalytische Aktivität wiederhergestellt wird.

Unter "Substrat" versteht man die Verbindung, im Hinblick auf v/elche das Enzym seine spezifische kataiytische Aktivität hat. Man kann eine solche Verbindung verwenden in dem Fall, wo sie sich unter Bedingungen auf dem Enzym fixiert, die geeignet sind, die katalytische Aktivität des Enzyms zu unterdrücken oder vorläufig zu hemmen, z.B. bei Fehlen eines gegebenen Metall-Ions, unterhalb einer bestimmten Temperatur, in einem genau bestimmten pH-Wert-Bereich usw.. Man kann ein "Substrat" auch in dem Fall verwenden, wo das Enzym nur bei gleichzeitiger Anwesenheit von zwei Substraten reagiert (von denen das eine z.B. eine elektronenspendende Verbindung ist und das andere eine eiektronenhsmmende Verbindung), und in dem Fall, wo das eine dieser beiden Substrate trotzdem in der Lage ist, sich in ausreichender Vieise auch in Abwesenheit des anderen Substrats auf dem Enzym zu fixieren.

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Unter "Pseudo-Substrat" (englisch "substrate analog") versteht man eine Verbindung, die hinsichtlich ihrer chemischen Struktur eine ausreichend gekennzeichnete Analogie mit dem bestimmten Substrat des Enzyms aufweist, um in der Lage zu sein, sich auf dem Enzym zu fixieren, ohne aa,3 dieses ihr gegenüber eine wesentliche "katalytische Aktivität hat.

Selbstverständlich können ebenso wie die "Substrate" und die "Pseudo-Substrate" auch die "reversiblen Enzym-Inhibitoren" zu selektiver, reversibler und nicht destruktiver Fixierung in der Lage sein, nicht nur im Hinblick auf ein gegebenes Enzym, sondern auch im Hinblick auf Enzyme, die zu einer oder mehreren Familien gehören.

Als reversiblen Enzym-Inhibitor kann man z.B. eine der folgenden Verbindungen verwenden: p-Aminophenylthiogalactosid (Inhibitor der Beta-Galactosidase)τ p-Aminobenzoesäure (Inhibitor der Tyrosinase).

Als Substrat kann man z.B. verwenden PoIy-L-Lysin (Substrat für Pepsin); Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid oder "NAD" (Elektronen-Annahmesubstrat für die Enzyme, die zur Familie der Dehydrogenasen gehören, deren enzymatische Aktivität sich nur in Anwesenheit von "NAD" auswirkt).

Als Pseudo-Substrat kann man z.B. D-Asparagin (PseudoSubstrat für das L-Asparagin) verwenden.

Beispiele der Verwendung von Enzym-Inhibitoren, -Substraten und -Pseudo-Substraten für die Reinigung von Enzymen nach dem Chromatographie-Verfahren durch Affinität unter Ver-

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wendung dieser Verbindungen in veredeltem Zustand auf festen synthetischen Harzen werden insbesondere im folgenden Buch angegeben: "Biological Aspects of Reactions on Solid Supports" von George R. Stark (1971 - Academic Press, New York und London), Kapitel 2 von Pedro Cuatrecacas sowie in der folgenden Veröffentlichung von M. Wilchek und W.B. Jakoby "Methods in Enzymology" Band 34, Seite 3 (1974).

Zur Bildung des Komplexes (I) kann man auf eine geeignete polymere Substanz Moleküle der genannten Verbindungen aufpfropfen, die in der Lage ist, das PoIypeptid zu fixieren. Man kann den Komplex (I) auch durch Polymerisation eines Monomers bilden, dessen Moleküle aus einem polymerisierbaren Muster bestehen, z.B. einer Vinylgruppe, auf der durch kovalente Bindung mindestens ein Molekül der Verbindung fixiert ist, die in der Lage ist, das Polypeptid zu fixieren.

Als polymere Substanz, auf der man die zur Fixierung des Enzyms geeignete Verbindung aufpfropft, kann man eine in Wasser lösliche Substanz verwenden, z.B. Carboxymethylcellulose, Polyacrylamid, PoIyäthylengIyco1, ein Polyamin, Polyvinylalkohol, Dextran usw..

Man ksnn die Moleküle der Verbindung, die in der Lage ist, das Enzym zu fixieren ,auf die Moleküle der polymeren Substanz aufpfropfen, und zwar entweder direkt oder mit Hilfe von Mclakülen einer Hilfs-Verbindung, wobei letztere linear sind und eine geeignete Kettenlänge haben (z.B. Moleküle, dip mindestens teilweise aus einctr aliphatischen Kohlenvasserstcffkette bestehen). Diese Moleküle dieser HilfsVerbindung spielen im Komplex (I) die Rolle eines Abstandsarms oder Anhakarms (englisch "space arms" oder "anchoring

_ Q —

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arms"), die auf den Molekülen des Komplexes (I) eine Verankerung von Enzym-Molekülen ermöglichen, die sich bei Fehlen derartiger Abstandsarme aufgrund einer sterischen Sperre nicht auf dem Komplex (I) fixieren können.

Zahlreiche Beispiele, in denen die Art der Aufpfropfung von Molekülen aus mindestens einer Verbindung, die in der Lage ist, ein Enzym zu fixieren, auf einer organischen, polymeren, synthetischen, festen, in Wasser nicht löslichen Materie beschrieben ist, sind in dem oben genannten Buch beschrieben, soweit es sich um das direkte Aufpfropfen und um das Autpfropfen mit Hilfe von "AbstarvJsarmen" oder "Verankerungsarmen" handeIt.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man auf die gleichen Techniken wie die in diesem Buch beschriebenen zurückgreifen, jedoch unter Verwendung einer in Wasser in Lösung befindlichen polymeren Substanz anstelle einer festen in Wasser nicht löslichen Materie.

Beispielsweise kann man Moleküle von p-Aminophenyl-beta-D-Thiogalactopyranosid auf Polyacrylamid oder Moleküle von p-Aminophenol auf Carboxymethylcellulose mit Hilfe von N-Brornoacetyl-Äthylendiamin-Kolekülen aufpfropfen, oder man kann Moleküle von p-Amino-Benzoesäure (Inhibitor der Tyrosinase) mit Hilfe von Amino-6-Kapronsäure-Molekülen auf Polyacrylamid aufpfropfen.

Um den Komplex (I) mit dem zu extrahierenden Polypeptid reagieren zu lassen, kann man in jeder geeigneten Weise vorgehen, z.B. durch einfache Mischung einer wässrigen Lösung des Komplexes (I) mit der wässrigen Polypeptid-

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Lös ν ng oä.tx auch, in^"m τ\γ>.τ\. Tine-ε ^ te ns «inen Parameter verliert, wie z.B. die ionische Kraft, cie Temperatur, den p?:-^rcrt usw. des FIiIs sicpsiiieus, das ce η Komplex (I) und das Po Iy tse pt i d a nth alt.

Um CCP. KoTplex ClI) auszufällen, kann man. in ⁴scer geeigneten "Seise vergehen, die entsprechen.;! der Art und Lösbarkeit dieses Komplexes sowie der Zusammensetzung und den Eigenschaften des Flüssigmilieus govah.lt wird, das oen ;'o-nplex (II) und das Poiyneptid =nthSl.t. Das zur Ausfüllung des Komplexes aufgebotene phyalkalischchemische Phänomen kann entsprechend clcra -.eveiligen Fall eine echte Ausfällung sein oder auch eine Aufflockung. Man kann z.B. dieses Phänomen durch Zufügen geeigneten Salzes in das Flüssigrnilieu hervorrufen oder auch, indem man mindestens einen Parameter des letzteren wie seine Temperatur, seinen pH-Wert, seine Konzentration usw. verändert.

Um den Komplex (II) in Polypeptid-Moleküle und in Moleküle des Komplexes (I) aufzuteilen und dann die Moleküle des Polypeptide von denen des Komplexes (I) zu trennen, kann man in jeder an sich bekannten geeigneten Weise vorgehen, insbesondere, indem man äen Komplex (II) nach ssiner Ausfällung und erforderlichenfalls seiner Reinigung wieder auflöst, und indem man die ionische Kraft dar derart erhaltenen Lösung modifiziert, oder auch, indem man diese letztere einer Dialyse oder einer Ultrafiltration unterwirft.

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SAD ORIGINAL

Beispiel 1

A. Bereitung des Komplexes (I^r

a) verwendete Ausgancs^ixbstanzen:

Al: Polyacrylamid (in Wasser lösliches Polymer aus linearen Makromolekülen mit einer Secrusnz von

-CH-CH- ¹ I
C=O

A2: Methylester der Polyacrylsäure (in Kasser nicht lösliches Polymer aus linearen Makromolekülen mit einer Sequenz von

-CH--CH-

² I
C=O

OCH-

A3: Acrylsaurechlorid (Monomerverbindung mit der Formel:

CH=CH₀

I ²

C=O

Cl )

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609840/ 1 1 SU

b) Arbeitsweisen:

Al und A2: Reaktion der makromolekularen Ausgangssubstanz mit dem Hydrazin bei einer jeweiligen Temperatur von 50°C (Al) und 90°C (A2), so daß das Polyacrylair.id-Hydrazic erhalten xvird (Foiyner aus linearen Makromolekülen mit einer Sequenz von:

-C H- -CH-i

C=O i

NH

NHL ),

dann Umwandlung des Polyacrylamid-Hydrazid in ein entsprechendes Azid-Derivat durch Reaktion bei O⁰C in Anwesenheit einer Mischung aus Hvdrochloridsaure und Natriumnitrit entsprechend der Reaktion:

-CH₇-CH-

^z ι

C=O

NH

Na NO, + NCl

-CH₂-CH-C=O

^n

wobei η die Anzahl der Folgeeinheiten pro Molekül der makromolekularen Substanz darstellt,und schließlich Reaktion des Polyacrylamid-Azid bei O⁰C mit der p-Amino-Benzoesäure in wässrigem Milieu mit einem pH-Wert von 9,4:

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\y-cocH-

-CH₂-CH-

-CH₀-CH- + η

² i C=O

N-

COOH Komplex (I)

A3: Reaktion zwischen dem Acrylsäure-Chlorid und der p-Amino-Benzoesäure:

CH=CH,

C=O

^COOH-

CH=CH

COOH

danach Polymerisation des derart erhaltenen Monomers in wässrigem Milieu bei Stickstoffatmosphäre und in Anwesenheit von Ammonium-Persulfat, das als Polyiaerisations-Katalysator dient.

Man unterwirft das Polymer, das durch Vorgehen entsprechend irgendeiner der oben genannten Möglichkeiten erhalten wurde, einer Ultrafiltration auf einer Ultrafiltrationsinembran, wobei man die Moleküle mit einem Molekulargewicht unter 50.000 passieren läßt (z.B. eine Membran eines im Handel unter der Bezeichnung XM 50 bezeichneten Typs, die von der Firma AMICON vertrieben wird) und verwendet die Polymerfraktion, die das Filtrat durchläuft.

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- 14 B. Extraktion von Tyrosinase aus einer wässrigen Lösung;

In 100 Millilitern wässriger Salzlösung (FaCi 0,05 m) mit einem pH-Wert von 7,2, die lOO mg Rindereiweißserura und 1 mg Tyrosinase (mit einer enzymatischer. Aktivität von 900 Einheiten) enthält, löst man 30 rag des entsprechend A erhaltenen makromolekularen Komplexes (I) auf. Nach völliger Auflösung des Komplexes (I) senkt man die Temperatur des Flüssigmilieus auf OC, dann senkt man seinen. pH-Wert durch progressiven Zusatz einer wässrigen Zitronensäure-Lösung langsam auf 4,5. In dem Moment, wo dieser pK-Wert erreicht ist, beobachtet man die Bildung eines Niederschlags (Komplex II). Durch Zentrifugieren mit 2000 Umdrehungen pro Minute trennt man diesen Niederschlag von der Flüssigphase, dann wäscht man den Bodensatz aus der Zentrifugation zweimal mit Hilfe einer 0,5 molaren Natriumchlorid-Lösung, wobei man ihren pH-Wert auf 4,5 und ihre Temperatur auf 0 C hält. Man kann keine auf der Tyrosinase beruhende enzymatische Aktivität feststellen, weder in der Flüssigphase, die an der Oberfläche über dem Bodensatz aus der Zentrifugation schwebt, noch in den Waschwassern dieser, während die Anwesenheit des Rindereiweißserums in diesen Flüssigkeiten im Gegensatz dazu leicht nachzuweisen ist.

Nach dem Waschen löst man den Bodensatz aus der Zentrifugation in 20 Millilitern einer wässrigen Natrium-Pyrophosphat-Lösung, die 50 Millimol dieses Salzes pro Liter enthält und einen pH-Wert von 8,8 hat, und man unterwirft die derart erhaltene Lösung einer Ultrafiltration durch eine Ultrafiltrationsmembran, die die Moleküle mit einem Molekulargewicht unter 50 000 passieren läßt.

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Die Tyrosinase verbleibt in den Rückstand, während der Rest der Moleküle des Komplexes 'II), d.h. die Moleküle des Komplexes (I), das Fiitrat passieren, was ermöglicht, diese erneut für einen weiteren Extraktionsvorgang zu verwenden.

Die derart erhaltene Tyrosinase hat eine enzyinatische Aktivität, die ungefähr 40% derjenigen der Ausgangslösung entspricht, wobei sie aber mit mehr als 1,6 mg Proteinen (nach dem Lowry-Verfahren gemessen) vermischt ist. Der erhaltene Reinigungsfaktor beträgt 25.

Beispiel 2

A: Bereitung des Komplexes (I):

a) Ausgangssubstanz:

Carboxymethylcellulose-Hydrazid (in Wasser lösliches Polymer).

b) Arbeitsweise:

Umwandlung des Carboxymethylcellulose-Hydrazid in entsprechendes Azid-Derivat durch Reaktion bei 0°C in Anwesenheit einer Mischung aus Chlorwasserstoffsäure und Natriumnitrit und schließlich Reaktion des Azids in wässrigem ^Milieu mit einerr. pH-Wert von 8,7 immer bei 0 C, mit einer Mischung aus O-Aminobenzoesäure und einem Trypsin-Inhibitor, einem Soja-Extrakt (Inhibitor peptischer Art mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 23.000). (Für 1 g des Hydrazid-Ausgangsderivats verwendet man 0,1g 0-Aminobenzoesäure und 0,1 g Soja-Inhibitor). Auf diese Weise erhält man ein in Wasser

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lösliches Polymer, das gleichseitig O-Aminobenzoesäure· Moleküle und Trypsin-Irihibitor-Koleküle enthält, d.h. Koick'ile des Sojo.-Extrakt 3, öis r*it der Kette vcn PoLyanhydroglucose der makromolekularen Ausgangssubstanz über Abstandsarme (space arr.s) mit der Formel -O-CH -CO-KH- verbunden sind.

B. Extraktion von Trypsin aus einer wässrigen Lösung

In 100 Millilitern einer wässrigen Salzlösung (NaCl 0,04 m) mit einem pH-Wert von 7,2, die 100 mg Rindereiweißserum und 1 mg Trypsin (enzymatisch^ Aktivität : 7,200 Einheiten) enthält, löst man 20 mg des entsorechend A erhaltenen makromolekularen Komplexes (I) auf. Nach völliger Auflösung des Komplexes (I) senkt man die Temperatur des Flüssigmilieus auf OC, dann senkt man den pH-Wsrt langsam auf 3,7 durch Zufügen einer wässrigen Essigsäurelösung. Man erhält auf diese Weise einen Niederschlag (Komplex II), den man durch Zentrifugieren (2 000 U/min) trennt,und man wäscht den Bodensatz der Zentrifugation mit Hilfe einer 0,5 molaren Natriumchloridlösung, wobei man ihren pH-Wert auf 3,7 und die Temperatur auf 0 C hält. Danach fügt man den derart gewaschenen Bodensatz aus der Zentrifugation in Suspension in einer 0,5 molaren Natriumchloridlösung und senkt den pH-Wert der derart erhaltenen Suspension durch Hinzufügen einer wässrigen Chlorwasserstoffsäurelösung auf 2,2. Man schleudert dann die Suspension (2 000 U/min) und gewinnt die an der Oberfläche schwimmende Flüssigphase zurück. Die enzymatische Aktivität dieser letzteren entspricht ungefähr 23% von der der Ausgangslösung und hat einen Proteingehalt von 5,2 mg. Der Reinigungsfaktor des Trypsin beträgt daher 4,4.

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- 17 Beispiel 3

A. Bereitung des Komplexes (I):

Man läßt 1 g Polyacrylamid-Azid, das entsprechend dem Beispiel 1 gewonnen wurde, mit einer wässrigen Lösung aus 0,1g o-Aminobenzoesäure und C,l g Trypsin in einem wässrigen I4ilieu bei einem pE-vrert von 9,2 und bei O C reagieren.

B. Extraktion des Soja-Inhibitors aus einer wässrigen Lösung:

Unter Verwendung des wie in A beschrieben bereiteten Komplexes (I) verfährt man analog de— Beispiel 2, jedoch anstelle von Trypsin mit 1 mg Trypsin-Irihibitor, in Form eines Sojaextrakts in einer wässrigen Ausgangslösung. Man erhält schließlich eine wässrige Lösung mit einer inhibitor!sehen Aktivität des Trypsin entsprechend ungefähr 28% derer der Ausgsngslösung und mit 4,5 mg Proteinen.

Beispiel 4

A. Bereitung des Komplexes (I):

Man läßt die N (omega-amonihexyl)-L-Asparaginsäure (Zusammensetzung mit folgender Formel:

₀) ,-NH-CH-COOH
Ζό ι

CH₂-COOH )

— ] 8 —

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mit Acrylsäurechlorid reagieren, so daß man ein Monomer mit der Formel

CH=CH₂
C=O

2JH- (CH₂) g-NH-CH-COOH CH₂-COOH

erhält. Dann polymerisiert man dieses Kononier in wässrigem Milieu bei Stickstoffatmosphäre und in Anwesenheit von Ammonium-Persulfat, das als Katalysator dient. Man unterwirft das derart erhaltene in Lösung befindliche Polymer (Koir.c-Icx I) einer Ultrafiltration durch eine Ultraf iitrationsrr.eiribran, deren Poren eine Größe von 0,05 1-Iikron haben, und man konserviert den Rückstand.

B. Asparaginase-Extraktion aus einer wässrigen Lösung:

In 100 Millilitern einer wässrigen Salzsäurelösung (NaCl 0,05 m) mit einem pH-Wert -von 7,2 und 100 Milligramm Rindereiweißserum sowie I ng Asparaginase (enzyraatische Aktivität: 210 Einheiten) löst man 30 Milligramm des entsprechend A erhaltenen makromolekularen Komplexes (I) auf.

Dann löst man die Ausfällung des makromolekularen Komplexes (II) aus , der durch Fixierung von Asparaginase-Molekülen auf dem Komplex (I) in Lösung

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erhalten wird, wobei der pH-Wert des Flüssigmilieus auf 4,5 festgelegt wird, und man schleudert die derart erhaltene Lösung (2COO U/min). Man wäscht den Bodensatz aus der Zentrifugation, wobei nan seinen pH-Wert auf 4,5 hält. Dann löst man ihn in einer wässrigen Salzlösung (NaCl: 0,04 mil; Natriurr.acetat: 0,01 roM) mit einem pH-Wert von 7,0 auf. Man unterwirft die derart erhaltene Lösung einer Ultrafiltration durch eirs Membran mit Poren von 0,05 Mikron Durchmesser, wäscht äsn Rückstand mit einer ausreichenden Menge der genannten wässrigen Salzlösung, damit nicht mehr als nur Spuren von Proteinen in dem Endfiltrat verbleiben» Dann fügt nan dem Rückstand eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 zu, die 70 Millimol L-Asparaginsäure und 10 ?:illi:noi Natriumacetat pro Liter enthält. Man verschiebt dadurch die Asparaginase des Komplexes (II), und dieses Er.zym erscheint dann in dem Filtrat. Man erhält auf diese Weise eine wässrige Asparaginase-Lösung mit einer enzyrnatischen Aktivität, die 65% von derjenigen der Ausgangslösung beträgt und nur 1,8 mg Proteine enthält (Menge gemessen nach dem Lowry-Verfahren).

Es sei bemerkt, daß, obwohl in der vorangehenden Beschreibung nur Beispiele für die Verwendung des Verfahrens entsprechend 3er Erfindung für die Extraktion von Enzymen oder des Inhibitors von polypeptischem Enzym aus einer wässrigen Lösung genannt sind, dieses Verfahren auch zur Extraktion anderer Polypeptide angewendet werden kann, insbesondere von Antikörpern oder Antigenen, polypeptischen Hormonen wie Insulin,Proteinen wie Albumin, Glycoproteinen, Lectinen usw..

Patentansprüche; Se/>IP - 25 912

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Claims

- 20 Patentansprüche

ill Verfahren zum Extrahieren eines Polypeptids aus einer wässrigen Lösung, dadurch, gekennzeichnet, daß man einen in Wasser löslichen makromolekularen Komplex

(I) bildet, der aus Molekülen mindestens einer das Fixieren dieses Polypeptids in ausgewählter, reversibler und nicht destruktiver Weise ermöglichenden Verbindung besteht, wobei diese Moleküle durch kovalente Bindungen auf Makromolekülen gebunden sind, daß man den Komplex (I) mit dem Polypeptid reagieren läßt, wobei dieser Komplex (I) sich in der wässrigen Lösung des Polypeptids in aufgelöstem Zustand befindet, was durch Bildung eines ebenfalls wässrigen Komplexes

(II) die selektive Fixierung des Polypeptids auf dem Komplex (I) hervorruft,. daß man den Komplex (II) ausfällt, daß man den Komplex (II) in Polypeptid-Moleküle und Moleküle des Komplexes (I) dissoziiert, und daß man das Polypeptid des Komplexes (I) abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Komplex (I) durch Aufpfropfen von Molekülen der Verbindung bildet, die in der Lage ist, das Polypeptid auf einer polymeren Substanz zu fixieren.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Komplex (I) durch Polymerisation eines Monomers bildet, dessen Moleküle aus einem polymerisierbaren Muster bestehen, auf dem durch kovalente Bindung mindestens ein Molekül der Verbindung fixiert ist, die in der Lage ist, das Polypeptid zu fixieren.

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4. Verfahren nach Anspruch 1 zum Extrahieren eines Enzyms aus einer wässrigen Lösung, dadurch gekennz e i c h η e t, daß man als Verbindung, die das PoIypeptid fixieren kann, eine Verbindung aus den reversiblen Inhibitoren und den Substraten und Pseudo-Substraten dieses Enzyms verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Inhibitor eine der folgenden Verbindungen verwendets p-Aminophenyl-Thiogalactosid und p-Aminobenzoesäure.
6. Verfahren nach Anspruch 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymer-Substanz Polyacrylamid und der Inhibitor p-Aminobenzoesäure sind.

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