-
-
Verfahren zum Abbau von Proteinen mit Proteinasen
-
Die meisten Nahrungsproteine, vor allem die biologisch hochwertigen,
besitzen eine globale Struktur, z.B. die Milchproteine, die Eiproteine, die Proteine
des Muskelsarcoplasmas, die Cerealienproteine und die meisten anderen Pflanzenproteine.
Sie können in bekannter Weise aufbereitet und von den Enzymen des Organismus problemlos
metabolisiert werden.
-
Anders verhalten sich in der Regel die Strukturproteine, wie Kollagen,
Keratin, Elastin usw., die sich nicht ohne weiteres für die Ernährung, insbesondere
für die menschliche Ernährung> verwerten lassen.
-
Bei nicht unmittelbar technisch verwertbaren Proteinen führt häufig
eine (enzymatische) Hydrolyse zu besser verwertbaren Produkten, insbesondere können
in der Regel eine verbesserte Löslichkeit im sauren Bereich und allgemein verbesserte
technologische Eigenschaften erreicht werden.
-
Die Problematik, die bei der Verwerttmg von Proteinen auftreten kann,
sei am Bei.spiel des Caseins erläutert. Unmodifiziertes Casein-Protein hat beispielsweise
im ph-Bereich 4 - 5, den ein großer Teil der Konsum-Getränke und Früchtedesserts
besitzt, eine sehr geringe Löslichkeit. Die Folge ist ein Ausflocken des Proteins5
was einerseits das Aussehen der Getränke und das Zusammenbrechen von Aufschlagmassen
die Desserts in höchst unwillkommener Weise verändert, andererseits einen unangenehmen,
sandigen Geschmack hervorruft.
-
Die Technik bemüht sich mit Nachdruck um Reinigung und Modifikation
von Proteinen wie Soja-, Mais-, Blut-, Fisch-, Molkeproteine im Hinblick auf die
Ernährung.
-
Im Mittelpunkt der Untersuchungen steht speziell die enzymatische
Hydrolyse der Proteine.. Die Hydrolyse der Proteine führt zum Abbau des Protein-Nlakromoleküls
in kleinere Peptide und gegebenenfalls zu Aminosäuren.
-
Auch Strukturproteine sind in den Kreis der zu untersuchenden Alternativ-Proteine
einbezogen worden.
-
Die Eigenschaften eines Protein-Hydr.oiysats hängen verständlicherweise
vom Abbaugrad ab. Ein Maß für den Abbaugrad ist z.B. der Prozentsatz an Peptid-Bindungen,
der beim Abbauvorgang gelöst wurde (D.H. = Degree of Hydrolysis). In erster Näherung
gilt, daß bei vorgegebenem Protein und vorgegebener Protease die Eigenschaften des
Proteinhydrolysats durch den DH-Wert festgelegt sind, der durch den Natronlaugeverbrauch
bei konstantem pH während der Hydrolyse bestimmbar ist.
-
* durch
Eines der größten Hindernisse bei der Verwertung
von Proteinhydrolysaten in der Ernährung, insbesondere der menschlichen Ernährung,
liegt im Bereich des Geschmacks. Der Geschmack reinen Proteins ist normalerweise
ziemlich neutral. Der mit einem Protein bestimmter Herkunft assoziierte Geschmack
rührt in der Regel von nicht-proteinartigen Geschmacksstoffen her und es ist häufig-notwendig,
diese Geschmacksstoffe zu entfernen, um eine -allgemeinere Verwendbarkeit der ProteinhDrdrolysate
zu gewährleisten.
-
Die entscheidende Schwierigkeit liegt im bitteren Geschmack der Proteinhydrolysate.
Die intensive Bitterkeit der Proteinhydrolysate läßt sich in den zum Konsum bestimmten
Nahrungsmitteln kaum maskieren. Tatsächlich hat diese Bitterkeit bisher verhindert,
daß es zu einer extensiven Verwendung derartiger Proteinhydrolysate in der Ernährung
kam.
-
Die Anzeichen sprechen dafür, daß die Ursache des bitteren Geschmacks
mit dem Proteinsubstrat zusammenhängt und nicht mit dem verwendeten Enzym. Bestimmte
P:-oteine (wie Casein) ergeben fast ausnahmslos bitterschmeckende Hydrolysate, wo
hingegen Gelatine bei analoger Behandlung mit denselben Enzymen höchstens geringfügig
bitterschmeckende Hydrolysate liefert.
-
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung sei als "Ritterpunkt" derjenige
Gehalt an löslichem Proteinhydrolysat (in Prozent des Ausgangsproteins) definiert,
bei dessen Degustatation erstmalig bitterer Geschmack festgestellt wird.
-
Das Problem des bitteren Geschmacks von llydrolysaten ist bisher hauptsächlich
bei Casein sowie Soja-, Getreide- und Mais-Proteinen aufgetreten, es könnte indessen
auch bei intensiver Untersuchung anderer alternativer Proteinquellen in Erscheinung
treten.
-
Es wurde nun gefunden, daß durch Zusatz von Kohlenhydraten zu enzymatischen
Ansätzen die Proteine zu Protein-Hydrolysaten abgebaut werden können, die bis zu
einem hohen hydrolytischen Abbaugrad*oder allenfalls einen vernachlässigbar geringen
Bittergeschmack aufweisen. Die mit dem erfinderischen Verfahren erreichte Wirkung,
dürfte nicht oder nur in geringem Maße auf einem 'Verdrängen" des bitteren durch
einen süßen Geschmack beruhen, da offenbar:der süße Geschmack der zuzusetzenden
Kohlehydrate keineswegs notwendige Voraussetzung für das Eintreten der fortschrittlichen
Wirkung gemäß der vorliegenden Erfindung ist.
-
Zum Abbau der Proteine eignen sich bekanntlich Proteasen, sowohl tierischer
und pflanzlichtr als auch mikrobielier Herkunft (vgl. Ullmanns Encyklopädie der
technischen Chemie 4. Auflage, Band 10, S. 517-522, Verlag Chemie, 1975). Genannt
seien als pflanzliche Enzyme Papain, Ficin und Bromelain.
-
Als tierische Proteasen seien Pankreas-Proteasen, Pankreatin, Trypsin
und Chymotrypsin und Pepsin genanntO Von größter Bedeutung sind zweifellos die Proteasen
mikrobiellen Ursprungs. Zwar sind mehr als hundert ver-.keinen
schiodone
Spezies als Qllelle für Proteasen in der Patentliteratur angegeben worden, aber
unter kommerziellen Aspekten reduzierte sich die Auswahl bisher auf einige wenige
Genera, insbesondere vom Typ Bacillus, Streptomyces, Aspergillus, Rhizopus, Mucor
und einige Vertreter der Macrofungi.
-
Aus dem Genus Bacillus seien vor allem B.subtilis, amyloliquifaciens,
licheniformis, thermoproteolyticus und alkalophilus, aus dem Genus streptomyces
die Vertreter S. fradiae, griseus lnd rectus, aus dem Genus Aspergillus die Vertreter
flavus-oryzae, saitoi und niger, aus dem Genus Mucor die Vertreter pusillus und
miehei sowie Endothia parasitica und Trametes sanguinea genannt.
-
Es sei jedoch daran erinnert, daß die Verwendung auf dem Ernährungsgebiet
auf Enzyme beschränkt sein sollte, deren Unbedenklichkeit außer Zweifel steht. Beispielsweise
liegt eine amtliche Unbedenklichkeitsbestätigung (GRAS-Clearance)' in den USA auf
diesem Anwendungsgebiet bisher nur für Enzyme aus B.subtilis, A.oryzae und A.niger
neben Papain und Pankreasenzymen,vor.
-
Bekanntlich wird bei. den Proteasen eine Unterscheidung nach ihrem
pH-Wirkungsbereich getroffen (vgl. Ullmann loc.cit). Als alkalische Proteasen werden
Proteasen mit einem pH-Wirkungsbercich von 7 - 11, überwiegend mit Aktivitätsmaximum
im Bereich 10 - 11 bezeichnet. Besonders genannt seien die Subtilisine, speziell
Subtilisin Carlsberg und Subtilisin Novo. Neutrale Proteinasen sind
im
Bereich zwischen Pl" 6 und 9 wirksam, mit Aktivitätsmaximum, meist zwischen pH 7
und 8. Genannt sei beispielsweise der Enzymkomplex Pronase aus Streptomyces gri.seus,
das aus B.thennoprotcolyticus gewonnene Enzym Thermolysin und die aus B.subtiiis
gewonnene neutrale Bakterienamylase.
-
Saure Proteasen, die überwiegend aus Pilzen stammen, haben ihr Wirlwngsmaximum
im pH-Bereich 2 - 5. Als Beispiele seien die sauren Proteasen aus Asaitoi, A.niger,
A.oryzae, Trametes sanguinea und Mucor pusillus genannt.
-
Auch das Pepsin (gewonnen aus Magenschleimhaut) ist eine saure Protease.
Die Verfahrensparameter, wie pH (Puffer), Temperatur, Zusätze und flilfsstoffe sowie
Verfahrensdauer bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in
erster Linie durch das bzw. die verwendeten Enzyme'und das Substrat bestimmt. Sie
sind im allgemeinen bekannt.
-
Die erfindungsgemäß verwendbaren Kohlenhydrate sollen sowohl a) neutrale
als b) saure (carboxylgruppenhaltige) Kohlehydrate und zwar Oligomere und polymere
Verbindungen umfassen, soweit diese wasserlöslich bzw. in Wasser quellbar (Verdickungsmittel)
und soweit sie physiologisch unbedenklich sind. Unter Oligomeren (Oligosacchari.den)
seien in der Regel die durch Kondensation von 2-7 Monosacchariden gebildeten Einheiten
verstanden. Als neutrale Kohlehydrate seien beispielsweise genannt:
Oligomere
und Polymere, die aus Glucosc- und/oder Fructose-Einheiten aufgebaut sind, wie:
z.B. lösliche Stärke, Dextrine, Oligosaccharide, lösliche Derivate der Cellulose
wie Carboxymethylcellulose, Maltodextrin usw., Oligomere und Polymere, die aus Galactose,
Anhydrogalactose und SulE.atestcr der Gälactose au£gebaut sind, wie Carrageen und
die Carragenate, Oligomere und Polymere, die aus Mannose und/oder Galactose aufgebaut
sind, wie z.B. Johannisbrotkernmehl, Guarkernmehl; als saure Kohlehydrate seien
beispielsweise genannt: z.B. Pektine oder Pektinsäuren (Pektate), Oligomere und
Polymere aus D-Mannuronsäure und L-Guluronsäure, wie z.B. Alginsäure bzw. Alginate1
Polymerengemische aus Galacturonsäure, Arabinose, Galactose, Xylose, wie z.B. Traganth.
-
Aus praktischen Gründen seien unter den erfindungsgemäß verwendbaren
Kohlehydraten in erster Linie solche verstanden, die lebensmittelrechtlich zugelassen
sind (vgl. Kuhnert-Pölert-Schroeter "Lebensmittelzusatzstoffe", Deutscher Fachverlag,
Frankfurt 1978).
-
Die erfindungsgemäß zuzusetzenden Kohlehydrate werden in der. Regel
im Gew.-Verhältnis 3 : 1 bis 1 : 100, vorzugsweise im Gew.-Verhältnis 2 : 1 bis
1 : 30, besonders bevorzugt 1 : 1 bis 1 : 5, bezogen auf das Protein, angewendet.
-
Auch für-die Proteasen soll gelten, wie bereits ausgeführt, daß sie
als unbedenklich eingestuft werden können.
-
Als bevorzugt genannt sei die Pankreasproteinases Papain, ferner alkalische
und neutrale Baktericnproteasen sowie Schimmelpilzproteasen.
-
Die Dosierung beträgt im allgemeinen 0,01 - 5 Gew.-% vorzugsweise
0,1 - 2 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,25 -1 Gew.-%, bezogen auf das Substrat, wobei
natürlich die Art und Aktivität des Enzyms in Betracht zu ziehen ist sowie bis zu
einem gewissen Grad Art und Vorbehandlung des Substrats. Bei der praktischen Durchführung
der enzymatischen Verfahren kann weitgehend von Methoden und Erfahrungen des Standes
der Technik Gebrauch gemacht werden.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren soll am Beispiel der Herstellung eines
Hydrolysats aus Casein näher erläutert werden: Casein kann, wie bereits ausgeführt,
durch enzymatische Hydrolyse nicht hundertprozentig in Lösung gebracht werden, ohne
daß intensiver Bittergeschmack auftritt. Wie bereits festgestellts beeinflußt das
Enzym diesen Befund nicht in entscheidender Weise.
-
Da die Fähigkeit> bitteren Geschmack wahrzunehmeng von Individuum
zu Individuum etwas schwankt, sollte die Geschmacksprobe von ein und derselben Versuchsperson
möglichst in vergleichbarem Zustand vorgenommen werden.
-
Es wurde jeweils wie folgt verfahren: Der Verlauf der enzymatischen
Hydrolyse wird durch Titration mit Lauge * im sauren pH-Bereich
(1
N NaOH) kontrolliert und eine Titrationskurve aufgestellt. Gleichzeitig wird das
Auftreten des bitteren Geschmacks in Abhängigkeit von der Inkubationszeit (Probennahme
ca. alle zwei Minuten) bestimmt, so daß das als "Bitterpunkt" bezeichnete, erstmalige
'Auftreten des bitteren Geschmacks jeweils mit dem zugehörigen Punkt auf der Titrationskurve
und damit leni korrespondierenden Hydrolysegrad des Proteins korreliert werden kann.
-
Zur Bestimmung der Löslichkeit des Proteins wird die Protein-Lösung
mit einer verdünnten Säure auf pH 5 gestellt und zur Inaktivierung der Enzyme auf
90 - 1000C erhitzt. Der bei pH 5 ausfallende Protein-Niederschlag wird abzentrifugiert,
der Proteingehalt im Uberstand wird mit Hilfe der Biuret-Methode bestimmt.
-
Es wurde nun gefunden, daß nachdem erfindungsgemäßen Verfahren durch
Zusatz von Kohlehydraten zu den enzymatischen Ansätzen ein sehr hoher Hydrolysegrad
erreicht werden kann, bevor bitterer Geschmack auftritt.
-
Die in den nachfolgenden Beispielen gcfundenen Ergebnisse seien in
der folgenden Tabelle dargestellt:
Abbau von Cascin mit Pankreasproteinase
A bei pH 8,5 ( 0,5 %ig, bezogen auf Casein)
| Am Bitterpunkt Inkuba- |
| Substrat % lösl. Protein tionszeit |
| bei pH 5 ml NaOH ( min ) |
| Casein (5 %) 37 1,2 7 |
| *) |
| Casein (5 %) + 5 % Maltodextrin 51 2.4 16 |
| *) |
| Casein (5 %) + 2 % Alginsäure 55 2,4 18 |
| *) |
| Casein (5 %) + 2 % lösl. Stärke bis 70 > 4,0 # 60 |
| *) |
| Casein (5 %) + 2 % Pektinsäure 56 4,0 32 |
| *) |
| Casein (5 %) + 1 % Apfelpektin 55 3,4 24 |
| *) |
| Casein (5 %) + 1 % Guar 3,3 24 |
| *) |
| Casein (5 %) + 2 % Carrageen 2,3 15 |
Abbau von Casein mit alk. Baterienproteinase bei pH 8,5 ( 1 %, bezogen auf Casein)
| Am Bitterpunkt Inkuba- |
| Substrat % lösl. Proteil tionszeit |
| bei pH 5 ml. NaOH ( min ) |
| Casein (5 %) 39 1,2 10 |
| Casein (5 %) + 2 % lösl. Stärke 63 2,9 33 |
| Casein (5 %) + 2 % Pektinsäure 65 2,7 40 |
| *) |
| Casein (5 %) + 1 % Apfelpektin 3,8 39 |
| *) |
| Casein (5 %) + 1 % Guar 3,1 31 |
*) bezogen auf Casein-Lösung
Abbau von Cascin mit neutral. Bakterienproteinase
(0,5 tig) (Bakterienprotease N) bei pH 6,5
| Am Bitterpunkt Inkuba- |
| Substrat %-losl. Protein tionszeit |
| bei pH 5 ml NaOH ( min |
| Casein (5 %) - - 44 0,5 30 |
| Casein (5 %) + 2 % losl. Starke ) 56 0,8 45 |
Abbau von Casein mit Pilzprotease (0,5 %ig) (aus A.oryzae) bei pH 8,5
| Am Bitterpunkt Inkuba- |
| Substrat % löst. Protein tionszeit |
| bei pH 5 ml. NaOH ( min ) |
| Casein (5 %) 50 2,7 15 |
| Casein (5 %) + 2 % lösl. Stärke *) 88 3,6 23 |
Abbau von Casein mit saurer Pilzprotease (5 %ig) (aus A.niger) bei pH 6,5
| km Bitterpunkt Inkuba- |
| Substrat % iosi. Protein tionszeit |
| bei pH 5 ml NaOH ( min ) |
| Casein (5 %) 30 0,5 30 |
| Casein (5 %) + 2 % lösl. Stärke*) | 40 | 1,9 | 45 |
bezogen auf Casein-Lösung
Beispiele: Enzymatische Hydrolyse der
Proteine a. . Verwendete Geräte Metrohm pH-Stat.-Einheit mit, 1. pH-Meter E 603,
Fa. Metrohm, Herisau 2. Impulsomat E 473, Metrohms Herisau 3. Dosimat E 535/4, Fa.
Metrohm, Herisau Schreiber Thermostationsgefäß (40°C) 2 Rührmotore 2 Propellerrührer
(# = 4 cm, = 1 cm) Photometer (540 nm) Zentrifuge (~ 4200 Upm) Ultra-Turrax b. Verwendete
Enzyme Pankreasprotease A alkal. Bakterienproteinase, alkal. Pilzproteinase neutrale
- "- X saure Pilzproteinase c. Versuchsdurchführung In 220 ml destilliertes Wasser
werden bei Raumtemperatur unter Verwendung des Ultra-Turrax 11 g Casein bzw. Na-Caseinat
eingerührt und mit 6 n NaOH auf den gewünschten pH-Wert (entsprechend dem pH-
Optimum
der Enzymwirkung) gebracht. Als günstig hat sich vierstündiges Stehenlassen bei
Raumtemperatur erwiesen; die Lösung kann aber auch über Nacht gelagert werden.
-
Die Lösung wird in ein temperierbares Reaktionsgefäß (Volumen ca.
250 ml) gegeben, mit 700 - 100 Upm geruhrt, auf 40°C temperiert und der pH-Wert
gegebenenfalls nachgestellt. Anschließend werden 5 ml einer Enzymlösung zugesetzt,
die bei der Verdüngung im Medium die gençunschte Enzymkonzentration, bezogen auf
das Substrat (z.B. 0,5 %ig, bzw. 1,0 %ig, bezogen auE Casein), ergibt. Die durch
die enzymatische Hydrolyse freigesetzten Aminosäuren bzw. Oligopeptide werden mit
1 n NaOH mittels des pH-Staten titriert (pH konstant). Der Verbrauch an Natronlauge
wird fortlaufend vom Schreiber aufgezeichnet. Die Geschmacksveränderung wird durch
eine in Abständen von 2 Minuten durchgeführte Probennahme und Verkostung verfolgt.
Zur Bestimmung der Löslichkeit des Proteins werden vor der Enzymzugabe (Null wert)
alle 15 Min. und am Bitterpunkt 20 ml aus dem Reaktionsgefäß entnommen, mit 4 n
Salzsäure eingestellt und im Wasserbad auf 90 -100 °C erhitzt. (Man gibt dazu die
eingestellte Suspension in ein Reagenzglas, das vorher schon im kochenden Wasserbad
stand und läßt es 10 - 15 Min. im Wasserbad stehen).
-
Werden die Proben in der Folge als Zusätze zu Fruchtsäften verwendet,
so muß Citronensäure zum Einstellen verwendet werdell. Alle die erhaltenen Proben
werden nach
Rückstellung auf pH 5 bei 4200 Upm zentrifugiert.
-
Der Uberstand wird zur Proteinbestimmung herangezogen.
-
Die Proteinbestimmung erfolgt nach der Biuret-Methode (modifiziert
nach A.G. Gornall et al. J. biol. chem.
-
177, 751 (1949) : E korrigiert = E1 - (E2 + E3) E1 = Extinktion der
Probc, E2 = Eigenfarbe der Bl-obclösung, E3 = Eigenfarbe der Kupfersul fat-Lösung.
-
d. Ergebnisse Die Versuchsresultate können den vorstehenden Tabellen
entnommen werden. Der Bitterpunkt wird bei einem erheblich höheren Prozentsatz an
löslichem Protein ermittelt, als bei Abwesenheit des erfindungsgemäß mitverwendeten
Kohlehydrats. Im Falle der Caseinhydrolyse mittels Pankreasproteinase A kann bei
Verwendung von 2 Oo löslicher Stärke eine annähernd doppelt so große Umsetzung zu
löslichem Protein erfolgen, bevor der Bitterpunkt erreicht wird. Von ausschlaggebender
praktischerer Bedeutung ist indessen, daß sich bis annähernd 70 % des Caseins*in
dieser Weise zu Proteinhydrolysaten umsetzen lassen, die nach bisherigen Ergebnissen
uneingeschränkt zur Ernährung geeignet sind.
-
*) (mit Pilzprotease sogar wesentl.ich darüber)