DE3329624C2

DE3329624C2 -

Info

Publication number: DE3329624C2
Application number: DE3329624A
Authority: DE
Inventors: Melvin Hubert Sylvania Ohio Us Keyes
Original assignee: Owens Illinois Inc
Current assignee: OI Glass Inc
Priority date: 1982-09-15
Filing date: 1983-08-17
Publication date: 1987-09-03
Also published as: FR2532949B1; IT1173739B; JPS5959188A; BR8304970A; GB2127024A; AU538170B2; AU1444583A; DE3329624A1; IT8348712A0; FR2532949A1; GB8314851D0; GB2127024B; CA1201990A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur chemischen Veränderung der Substratspezifität eines nativen Proteins zur Erzeugung eines enzymartig modifizierten Proteins.

Proteine sind biologisch synthetisierte Makromoleküle, die verschiedene Funktionen in lebenden Systemen haben. Enzyme sind besondere biologisch aktive Proteine, die bestimmte Reaktionen katalysieren. Derzeitig findet die Enzymtechnologie in vielen Bereichen von Industrie und Forschung Anwendung, zum Beispiel medizinische Forschung, Nahrungsmittel-Behandlung und -Konservierung, Herstellung fermentierter Getränke, Herstellung von Arzneimitteln und Bestimmung der Konzentration verschiedener Metabolite und Nahrungsmittelbestandteile mittels enzymatischer Analysen.

Enzyme sind in ihrer biologischen Aktivität hochspezifisch und katalysieren im allgemeinen eine bestimmte Reaktion in einem sehr hohen Grade im Vergleich zu der entsprechenden, bei Raumtemperatur ohne biologische Katalyse ablaufenden Reaktion. Ein Enzym kann katalytische Aktivität mit Bezug auf eine Anzahl von Substraten, auf die es wirken kann, zeigen. Demgemäß kann ein gegebenes Enzym die Synthese oder den Abbau von mehr als einem Substrat katalysieren. Einige Proteine, die nicht als klassische Enzyme angesehen werden, wie Rinderserum- Albumin, zeigen sehr begrenzte katalytische Aktivität mit Bezug auf ein oder mehrere Substrate.

Viele Enzyme werden in der Natur in sehr kleinen Mengen gefunden. Ihre Isolierung, Reinigung und Verwendung ist daher im Hinblick auf die Kosten und die Zeit, die zu ihrer Isolierung in verwendbarer Form erforderlich ist, auf Arbeiten in kleinem Maßstab beschränkt.

Einige Enzyme kommen in der Natur in relativ großen Mengen vor und sind verhältnismäßig leicht zu isolieren, zu reinigen und zu verwenden. Sie können aber wegen ihres bestimmten katalytischen Verhaltens nur bestimmte ausgewählte Reaktionen katalysieren.

In letzter Zeit sind viele Versuche unternommen worden, Enzyme zu synthetisieren, welche gleiches enzymatisches Verhalten zeigen wie die natürlichen Enzyme, die entweder selten sind oder deren Isolierung teuer ist. Ferner hat man versucht, native Enzyme zu modifizieren derart, daß sich ihre Substratspezifität ändert, so daß sie eine Reaktion katalysieren können, die sie vorher nicht katalysieren konnten.

Eine bekannte Technik, um enzymatisches Verhalten zur Katalysierung einer bestimmten gewünschten Reaktion zu erhalten, ist die Synthese der sogenannten Enzym-Modell- Moleküle. Zum Beispiel können Verbindungen niedrigen Molekulargewichts kovalent an funktionelle Gruppen gebunden werden, welche die Aktivität des Aktivitätszentrums eines Enzyms zeigen. (Siehe Breslow, R., Advances in Chemistry Series, R. F. Grould, Ed., American Chemical Society, Washington, D. C. 21-43 (1971) und Tang, C. C.; Davalian, D.; Haung, P. und Breslow, R., J. Amer. Chem. Soc., 100, 3918 (1978) und Breslow, R., Doherty, J., Guillot, G. und Lipsey, C., J. Amer. Chem. Soc., 100, 3227 [1978].)

Bei einer anderen Methode wird eine Matrix aus einem synthetischen Polymeren verwendet, welches entlang seiner Hauptkette modifiziert ist, um die funktionellen Gruppen, welche die Funktion des Aktivitätszentrums eines gegebenen Enzyms aufweisen, bereitzustellen. (Siehe z. B. Wulff, G. und Schulza, I., Israel J. Chem., 17, 291 (1978) und Suh, J. und Klotz, I. M., Bioorganic Chemistry, 6, 165 [1977].)

Durch Anhängen eines chemischen Teils an ein natives Enzym in der Nähe seines Aktivitätszentrums hat man versucht zu verursachen, daß solch ein Enzym mit einer anderen katalytischen Aktivität reagiert. Ein Beispiel dafür ist die Umwandlung von Papain, einem proteolytischen Enzym, in ein Enzym vom Typ der Oxidase durch die kovalente Bindung eines Flavins nahe dem Aktivitätszentrum des nativen Papainenzyms. (Levine, H. L. und Kaiser, E. T., J. Amer. Chem. Soc., 100, 7670 (1978), Kaiser, E. T., et al, Adv. in Chemistry Series, No. 191, Biomimethic Chemistry, Seite 35, 1980; und Otsuki, T; Nakagawa, Y. und Kaiser, E. T., J.C.S. Chem. Comm., 11, 457 (1978). Andere Beispiele für eine derartige enzymatische Modifikation sind dem folgenden Artikel zu entnehmen: Wilson, M. E. und Whitesides, G. M., J. Amer. Chem. Soc., 100, 306 [1978].)

Die Substratspezifität läßt sich auch durch Ruhigstellung eines nativen Enzyms in einer Gelmatrix ändern. So ist z. B. das Enzym Trypsin in Polyacrylamid-Gel ruhiggestellt worden. Das Polyacrylamid-Gel gestattet Aminosäureestern durch die Gel-Matrix hindurchzudiffundieren, um mit dem Enzym zu reagieren, gestattet aber größeren Proteinen das Hindurchdiffundieren nicht. So wird die Substratspezifität durch Eliminieren des Zutritts eines der Substratmoleküle zu dem Enzym geändert.

Die Ruhigstellung oder Immobilisierung nativer Enzyme ist Stand der Technik, ebenso die Änderung der Enzymspezifität durch Ruhigstellung. (Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 3 Ed., 9, 148 (1980), Wiley and Son, Inc.).

Zwei weitere Methoden der Enzymimmobilisierung sind in den US-PS 38 02 997 und 39 30 950 offenbart. Nach der US-PS 38 02 997 werden Enzyme durch Binden an anorganische Träger in Gegenwart ihrer Substrate stabilisiert, wodurch das Enzym immobilisiert wird. Gemäß der US-PS 39 30 950 wird ein aktiver Träger, der chemisch an das Enzym gebunden werden kann, mit einem Enzym-Substrat-Komplex, der durch Mischen eines Enzyms und eines spezifischen Substrats gebildet worden ist, in Kontakt gebracht, wobei die Transformation von Substrat zu Produkt auf einem Minimum gehalten wird. So wird die Enzymkomponente des Komplexes chemisch an den Träger gebunden.

Es ist auch bekannt, daß eine native Lysin-Monooxigenase derart umgesetzt werden kann, daß die Sulfhydrylgruppen an dem Enzym blockiert sind. Dann zeigt das Enzym Lysin- Monooxigenase eine neue katalytische Aktivität gegenüber Aminosäuren und katalysiert oxidativ Desaminierung anstatt, wie das natürliche Enzym oxigenativ Decarboxilierung. Die Autoren können jedoch nicht über das modifizierte Verhalten berichten (Siehe Yamauchi, T.; Yamamoto, S. und Hayaishi, O., in The Journal of Biological Chemistry, 248, 10, 3750-3752 [1973].) Auch durch Umsetzen eines nativen Enzyms, z. B. Trypsin, mit seinem natürlichen Inhibitor und anschließender Vernetzung kann Substratspezifität des Enzyms verändert werden. (Siehe Beaven, G. H. und Gratzer, W. B. in Int. J. Peptide Res., 5, 215-18 [1973].)

Außerdem sind synthetische Proteine durch Verankern eines Aminosäurerestes an einem festen Träger und anschließendes Zufügen eines Aminosäurerestes nach dem anderen hergestellt worden.

Ferner sind halbsynthetische Proteine synthetisiert worden, indem ein natives Protein einer begrenzten Hydrolyse ausgesetzt wurde, um Proteinbruchstücke zu erzeugen, denen dann ein oder mehrere Aminosäurereste angefügt oder von ihnen entfernt wurden, wodurch modifizierte Bruchstücke gebildet wurden. Diese wurden zu einem halbsynthetischen Protein mit einer geänderten Aminosäurezusammensetzung wieder zusammengefügt ("Semisynthetic Proteins" von R. E. Offord, John Wiley and Sons Ltd., 1980).

Obwohl diese Techniken für viele Anwendungszwecke geeignet sind, sind sie kostspielig. Nach den bekannten Methoden wird ein Enzym einfach einem Satz von Bedingungen unterworfen und dann versucht, sein Verhalten aufzuklären.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches einwandfrei arbeitendes wirtschaftliches und systematisches Verfahren zur chemischen Veränderung der Substratspezifität eines billigen und in großem Umfang zur Verfügung stehenden nativen Proteins zu einem enzymartig modifizierten Protein anzugeben. Dieses Protein soll eine katalytische enzymatische Aktivität mit Bezug auf eine gewünschte chemische Reaktion zeigen, die bisher, durch das native Enzym katalysiert, keine für die Industrie geeignete Reaktion war; die neue Reaktion soll systematisch vorher bestimmt werden können.

Die Aufgabe wird durch das Verfahren des Anspruches 1, Ausführungsform A oder Ausführungsform B und die enzymartig modifizierten Proteine oder Ansprüche 2 und 3 gelöst.

Durch die Erfindung wird ein enzymartig modifiziertes Protein durch chemische Veränderung eines natürlich vorkommenden sogenannten nativen Proteins in ein enzymartig modifiziertes Protein, das andere Eigenschaften aufweist als das native Protein, das das Ausgangsmaterial darstellt, erhalten.

Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird das native Protein durch Inkontaktbringen mit einem Denaturierungsmittel bei einer Konzentration und in einer Zeit, die ausreichen, eine Denaturierung in hohem Grade zu verursachen, denaturiert. Danach wird das in hohem Grade denaturierte Protein Bedingungen unterworfen, die eine partielle Renaturierung des Proteins bewirken. Das partiell denaturierte Protein wird mit einem Inhibitor eines Modellenzyms, dessen katalytische Aktivität nachgebildet werden soll, in Kontakt gebracht, um einen Komplex von partiell denaturiertem Protein und Inhibitor zu bilden. Unter "Inhibitor" ist eine Verbindung zu verstehen, die ausreichend strukturelle Ähnlichkeit mit dem Substrat des Modellenzyms hat, um als Schablone für die katalytische Stelle des enzymartig modifizierten Proteins zu dienen. Das partiell denaturierte Protein in dem Komplex wird dann vernetzt, um ein neues enzymartig modifiziertes Protein zu erzeugen.

Danach wird der Modellenzym-Inhibitor und eventuell überschüssiges Vernetzungsmittel von dem neugebildeten enzymartig modifizierten Protein entfernt, um ein funktionelles stabiles Analogon des Modellenzyms zu erhalten. Das enzymartig modifizierte Protein besitzt die katalytische Aktivität des Modellenzyms.

Nach einer anderen Ausführungsform wird das in hohem Grade denaturierte Protein mit einem Inhibitor des Modellenzyms vermischt und dann das in hohem Grade denaturierte Protein partiell renaturiert, um einen partiell denaturierten Protein-Inhibitor-Komplex zu erhalten.

Es ist gefunden worden, daß durch das voranstehende Verfahren ein Protein von seiner nativen Konformation in eine modifizierte Konformation übergeführt werden kann. Der neue konformationale Zustand definiert ein enzymartig modifiziertes Protein.

"Enzym" bedeutet hierin ein Protein von bekannter katalytischer Aktivität gegenüber spezifischen Substraten, d. h. bekannter Substratspezifität. "Protein" bedeutet hierin, wie allgemein, ein Polypeptid, ein von Aminosäuren gebildetes biologisches Molekül.

Das Verfahren umfaßt die chemische Veränderung eines nativen Proteins einer Konformation, seinem natürlichen oder nativen Zustand oder seiner nativen Erscheinungsform, in eine zweite Konformation, einem neuen modifizierten Zustand oder eine neue modifizierte Erscheinungsform, und führt zu einem neuen stabilen enzymartig modifizierten Protein, das ein oder mehrere enzymatische Aktivitäten des ausgewählten Modellenzyms nachahmt.

Die Erfindung wird nun ausführlich beschrieben.

Es wird ein natives Protein ausgewählt, das chemisch verändert werden soll, um das neue enzymartig modifizierte Protein, das ein Analogon des gewünschten Modellenzyms ist, zu erzeugen. Als natives Protein-Ausgangsmaterial kann sowohl ein enzymatisches als auch ein nicht-enzymatisches verwendet werden. Im allgemeinen sind die nativen Proteine, die in großem Umfang zur Verfügung stehen, nicht-enzymatische Proteine, wie z. B. Rinderserumalbumin. Zweckmäßigerweise wird ein natives Protein als Ausgangsmaterial gewählt, das in ausreichend reiner Form, in ausreichenden Mengen und zu einem vertretbaren Preis zur Verfügung steht. Das ausgewählte native Protein wird durch Inkontaktbringen mit einem Denaturierungsmittel ausreichend lange und in einer ausreichenden Konzentration in hohem Grade denaturiert, und anschließend durch Inkontaktbringen mit Reagenzien oder unter Verfahrensbedingungen, die ausreichen, das Protein partiell zu renaturieren, partiell renaturiert; das resultierende nur partiell denaturierte Protein wird mit einem Inhibitor für das ausgewählte Modellenzym ausreichend lange und bei ausreichender Temperatur in Kontakt gebracht, daß ein Komplex von dem partiell denaturierten Protein und dem Inhibitor gebildet wird; und anschließend wird das partiell denaturierte Protein in dem Komplex mit einem Vernetzungsmittel unter Bildung des neuen stabilen enzymartig modifizierten Proteins vernetzt. Überschüssiges Vernetzungsmittel oder überschüssiger Modellenzyminhibitor werden entfernt, um das neue katalytisch aktive enzymartig modifizierte Protein zu isolieren.

Das native Ausgangsprotein wird in hohem Grade denaturiert oder ausgebreitet, um seine native dreidimensionale chemische Struktur weitgehend zu zerstören, und partiell renaturiert oder rückgeklappt um eine Proteinstruktur zu erhalten, die in der Lage ist, Inhibitor zu binden, obwohl es nicht die native Struktur hat. Das partiell denaturierte Protein hat weder die chemische Struktur, die sogenannte Konformation des Ausgangsproteins, noch die des in hohem Grade denaturierten Proteins. Es wird angenommen, daß die starke Denaturierung des nativen Ausgangsproteins und die darauf folgende nur partielle Rückklappung potentiell die Bildung neuer Inhibitor- Bindungsstellen ermöglicht. So werden Stellen gebildet, die verschieden von denen sind, die gebildet werden, wenn das native Protein partiell denaturiert wird ohne vor dem Inkontaktbringen mit dem Inhibitor in hohem Grade denaturiert worden zu sein.

"In hohem Grade denaturiert" bedeutet eine große Änderung des nativen Zustands, was verursacht, daß das Protein im wesentlichen vollständig ausgebreitet wird. In dem in hohem Grade denaturierten Zustand fehlt dem Protein beides, die Sekundär- und die Tertiär-Struktur, und es gleicht einem willkürlichen Coil. Der in hohem Grade denaturierte Zustand kann durch Vergleich physikalischer Meßergebnisse, vorgenommen an dem in hohem Grade denaturierten Protein und dem eines Modells eines willkürlichen Coils, bestimmt werden. Beispiele für derartige physikalische Messungen sind die Viskosität, Zirkulardichroismus, Sedimentationskoeffizient und Ultraviolett-Spektren. Unter die Definition "in hohem Grade denaturiertes Protein", fallen auch Proteine, die noch Reste von Sekundär- und/oder Tertiär- Struktur enthalten. Spuren von Reststrukturen wirken sich nicht störend auf das Verfahren aus.

Die Eigenschaften von in hohem Grade denaturierten Proteinen sind bekannt. Wenn z. B. eine Viskositätsmessung vorgenommen wird, um Protein-Denaturierung zu überwachen, steigt die Viskosität eines Kugelproteins während des Ausbreitungsvorgangs. Andererseits fällt die Viskosität eines Faserproteins nach Ausbreitung. Ausbreitung kann auch mittels Änderungen im UV-Spektrum überwacht werden. Die Hauptänderung in den Spektren findet wegen der Verlagerung von Phenylalanyl-, Trypyl- und Tryptophyl-Seitenketten vom Proteininneren zum umgebenden Lösungsmittel während der Denaturierung statt. Im allgemeinen nimmt der molare Absorptionskoeffizient infolge Verschiebung in den Absorptionsbanden bei einigen Wellenlängen ab, während er bei anderen steigt. Die starke Denaturierung der Proteinstruktur verändert die optische Drehung und die Zirkulardichroismus- Spektren drastisch. Die genaue Art der Änderungen steht in Beziehung zu der Sekundär- und Tertiärstruktur des nativen Proteins.

Verfahren der Denaturierung in hohem Grade und die Kriterien zur Demonstrierung starker Denaturierung sind beschrieben von: Charles Tanford, Adc. Protein Chemistry, 23, 121 (1968); P. L. Privalov, Adv. Protein Chemistry, 33, 167 (1979); und C. B. Anfinsen, Science, 181, 223 (1973).

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist zur Denaturierung in hohem Grade Guanidinhydrochlorid (GuHCl) besonders geeignet. Starke Proteindenaturierung ist gewöhnlich bei Konzentrationen von 6 bis 8 M GuHCl vollständig. In vielen Fällen kann GuHCl durch 8 M Harnstoff ersetzt werden. Denaturierung in hohem Grade kann auch erreicht werden durch Erhöhen der Temperatur, bis der bekannte Ausbreitungsübergang stattgefunden hat. Außerdem können extrem saure oder basische Bedingungen allein oder in Verbindung mit Temperaturerhöhung zur Anwendung kommen. Im allgemeinen reicht eine Temperatur von 50 bis 70°C aus. Geeignete Säuren sind z. B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure und Zitronensäure; Salpetersäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und Salzsäure; geeignete Basen sind z. B. Natronlauge und Kalilauge.

Eine weitere geeignete Methode zur Denaturierung in hohem Grade ist die folgende: Das native Protein wird mit Beta- Mercaptoethanol in einem Molverhältnis von etwa 1000 Einheiten Beta-Mercaptoethanol pro Einheit Protein vermischt, bei neutralem pH-Wert eine bis mehrere Stunden behandelt und dann 6 M Guanidinhydrochlorid zugegeben. Diese Bedingungen reichen aus, um die meisten Proteine vollständig zu denaturieren. Die Proteinkonzentration und der pH-Wert sollten so sein, daß mindestens ein Teil des Proteins in Lösung bleibt. Das Beta-Mercaptoethanol spaltet Disulfidbrücken und erleichtert durch Unterstützung der Strukturzerstörung die Denaturierung in hohem Grade des Proteins.

Wenn die Bedingungen für die Denaturierung in hohem Grade reduziert werden, wird das Proteinmolekül partiell renaturiert. Der partiell renaturierte Zustand kann von Proteinmolekülen gebildet werden, die nahezu vollständig denaturiert geblieben sind, vermischt mit Molekülen, die nahezu vollständig rückgefaltet oder rückgeklappt sind; oder von Proteinmolekülen, die nahezu vollständig rückgeklappt oder die nahezu alle partiell und nahezu gleich rückgeklappt sind. Der genaue physikalische Zustand ist für die Erfindung nicht kritisch. Der partiell renaturierte Proteinzustand wird durch die Änderungen physikalischer Parameter erkannt, die anzeigen, daß das Protein nicht mehr ein willkürliches Coil ist, sondern eine beträchtliche Sekundär- und Tertiär-Struktur hat. Der partiell renaturierte Zustand hat allerdings nicht die Struktur hoher Ordnung wie das native Protein; es wird angenommen, daß er andere potentielle Stellen für Inhibitorbindung bietet als ein partiell denaturiertes natives Protein, da das partiell renaturierte Protein strukturell in der Denaturierungsstufe vollständig umgelagert worden ist. Das in hohem Grade denaturierte Protein kann partiell renaturiert werden, um neue Stellen für die Inhibitorbindung zu erhalten, die bisher in einem partiell denaturierten Protein nicht vorhanden waren.

Die partielle Renaturierung von in hohem Grade denaturierten Proteinen ist im einzelnen beschrieben in: L. G. Chavez, Jr. und H. A. Scheraga, Biochemistry (1980), 19, 996-1004; H. Taniuchi und C. B. Anfinsin (1968), J. Biol. Chem., 243, 4778; H. Taniuchi und C. B. Anfinsin (1969), J. Biol. Chem., 244, 3864; M. I. Kanehisa und T. Y. Tsong, Biopolymers, 18, 2913-2928 (1979); E. W. Miles, K. Yutani und K. Ogasachara, Biochemistry, 21, 11 (1982) und D. B. Witlanfer, Adv. Protein Chemistry, 34, 61 (1981).

Nachdem das Protein partiell renaturiert ist, wird es mit einem Inhibitor eines Modellenzyms, dessen katalytische Aktivität es nachahmen soll, in Kontakt gebracht.

Der Ausdruck "Inhibitor" bedeutet hierin, wie weiter vorn schon angegeben, irgendeine Verbindung, die genügend strukturelle Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat des Modellenzyms aufweist, um als eine Schablone für die katalytische Stelle des enzymartig modifizierten Proteins zu dienen. Der Inhibitor ist zweckmäßigerweise irgendeiner der bekannten Inhibitoren des jeweils gegebenen Modellenzyms. Er kann auch irgendein Molekül einschließen, das eine ausreichende strukturelle Ähnlichkeit mit dem klassischen Inhibitor hat. (Siehe "Enzyme Inhibitors", Proceedings of a Meeting held in Basel, Switzerland, on 20 and 21 March 1980, edited by Urs Brodbeck, Verlag Chemie, Weinheim, "Inhibitor Index" p. 275 to 278; und "Handbook of Enzym Inhibitors", M. K. Jain, John Wiley + Sons, New York 1982, Inhibitor Index 1-380). Das natürliche Substrat des Modellenzyms kann in vielen Fällen als der Inhibitor oder die Schablone des modifizierten Proteins wirken. Inhibitoren werden im allgemeinen durch das Enzym nicht abgebaut wie Substrate und bieten einer katalytischen Stelle leichter Schutz als das natürliche Substrat. Ein Beispiel für die strukturelle Ähnlichkeit eines enzymatischen Inhibitors und des natürlichen Substrats eines Enzyms ist der Fall der Glukose-Oxidase. Glukose ist das Substrat der Glukose-Oxidase, während D-Glukal der Inhibitor für Glukose-Oxidase ist. Glukose und D-Glukal sind strukturell sehr ähnlich.

Nachdem das partiell renaturierte Protein mit dem Inhibitor ausreichend lang und bei einer zur Bildung des Protein-Inhibitor-Komplexes ausreichenden Temperatur in Kontakt gebracht worden ist, wird der partiell renaturierte Proteinanteil des Komplexes vernetzt, um die neue Struktur zu stabilisieren.

Der Ausdruck "Vernetzung" bedeutet hierin die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen reaktiven Stellen an einem Protein.

Im allgemeinen wird die Proteinvernetzung durch Verwendung multifunktioneller Reagenzien, wie Glutaraldehyd, ausgeführt. Weitere Beispiele für Vernetzungsmittel sind: 2-Amino-4,6-dichlor-s-triazin; Diazoniumsalze; N-Hydroxisuccinamid; p-Benzoylazid und solche Reagenzien, die offenbart sind in: Wold, F., Methods Enzymol, 11, edited by C. H. W. Hirs, C.H.W., Academic Press, 1967, 617; Fasold, H. et al., Augen. Chem. Int. Ed. Engl., 10, 795, 197 und Keyes, M. H., in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 9, 3rd Ed., 1980, J. Wiley + Sons, Inc., 148-172. Vernetzung kann auch durch Disulfid- Umlagerung bewirkt werden.

Viele Enzyme können nach dem beschriebenen Verfahren nachgeahmt werden. Beispiele für solche Modellenzyme sind hydrolytische Enzyme, Redox-Enzyme und Transferase- Enzyme. Nachstehend einige Beispiele: Die hydrolytischen Enzyme schließen proteolytische Enzyme ein, die Proteine hydrolysieren, wie z. B. Papain, Ficin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bromelin, Keratinase; Carbohydrasen, die Kohlenhydrate hydrolysieren, wie z. B. Cellulase, Amylase, Maltase, Pektinase, Chitanase; Esterasen, die Ester hydrolysieren, wie z. B. Lipase, Cholinesterase, Lecithinase, alkalische und Säurephosphatasen; Nukleasen, die Nukleinsäuren hydrolysieren, wie z. B. Ribonuklease, Desoxiribonuklease; und Amidasen, die Amine hydrolysieren, wie z. B. Arginase, Asparaginase, Glutanase, Histidase und Urease. Die Redox-Enzyme katalysieren Oxidations- oder Reduktions- Reaktionen. Sie schließen ein Glukoseoxidase, Xanthinoxidase, Katalase, Peroxidase, Lipoxidase und Cytochrom- Reduktase. Die Transferase-Enzyme übertragen Gruppen von einem Molekül auf ein anderes. Beispiel hierfür sind Glutamin-Brenztraubensäure-Transaminase, Glutamin- Oxalsäure-Transaminase, Transmethylase, Phospho-Brenztraubensäure- Transphosphorylase.

Bei der praktischen Durchführung des Verfahrens wählt man ein Modellenzym aus. Dann wählt man ein natives Ausgangsprotein, das dem Modellenzym unter Erzeugung eines enzymartig modifizierten Proteins nachgebildet werden soll.

Man kann das native Protein zu einer davon verschiedenen stabilen enzymartig modifizierten Proteinform maßschneidern, welche die Substratspezifität des Enzyms zeigt, das nachgebildet werden soll. Die Möglichkeit, ein natives Protein in ein Protein vorbestimmter katalytischer Aktivität umzubilden, bringt in vielen Situationen in Chemie und Technik größere Vorteile. Wenn man z. B. ein Enzym verwenden will, das nur in kleinen Mengen zur Verfügung steht, sehr teuer ist oder sehr schwer zu isolieren und/ oder zu reinigen ist, kann ein solches Enzym als Modellenzym für die Herstellung eines enzymartig modifizierten Protein-Analogons nach dem Verfahren der Erfindung zur Nachahmung seiner Aktivität dienen.

Am besten wird das Ausgangsprotein gereinigt und in einem nahezu neutralen wäßrigen Lösungsmittel in Gegenwart eines Puffers zur Aufrechterhaltung der Neutralität der Lösung gelöst. Dann wird das native Protein nach irgendeiner der vorstehend beschriebenen Methoden denaturiert, um eine in hohem Grade denaturierte, insbesondere wasserlösliche Form des nativen Ausgangsproteins zu erhalten, das partiell renaturiert oder rückgeklappt wird. Das partiell denaturierte Protein wird mit einem Inhibitor für das Modellenzym vermischt und die Mischung stehengelassen, daß sich ein partiell denaturiertes Protein-Inhibitor-Komplex bilden kann. Danach muß der partiell denaturierte native Proteinteil des Protein- Inhibitor-Komplexes stabilisiert werden, was durch Vernetzen des Proteins geschieht. Häufig wird Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel verwendet, weil diese Chemikalie wirtschaftlich ist.

Der Inhibitor des Modellenzyms wird nach der Synthese des enzymartig modifizierten Proteins entfernt. Wiederholtes Waschen des immobilen modifizierten Proteins reicht gewöhnlich zur Entfernung des Inhibitors aus. Gepufferte wäßrige Lösungen können auch verwendet werden. Beispiele für geeignete Puffer sind weiter unten angegeben.

Die erhaltenen modifizierten stabilen Proteine, die enzymartiges katalytisches Verhalten zeigen, sind zur Durchführung von katalytischen anabolischen und katabolischen Reaktionen anstelle eines natürlich vorkommenden Enzyms geeignet.

Die Erfindung wird nun noch an speziellen Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

60 mg chromatografisch gereinigtes natives Enzym Pankreas- Ribonuklease (RNase), Charge 110F- 02051, Type IIA, Nr. R-5000, wurden in 3 ml 8 M Harnstoff als Denaturierungsmittel, das 0,1 M 2-Amino-2-(hydroxi- methyl)-1,3-propandiol-HCl-Puffer (nachstehend mit "Tris- Puffer" abgekürzt) enthielt, bei einem pH-Wert von 8 unter langsamem Rühren bei 25°C gelöst.

Als nächstes wurde der Lösung 0,1 ml Denaturierungsmittel β -Mercaptoethanol zugegeben, um die Disulfidbindungen aufzubrechen. Die resultierende Lösung wurde langsam 15 Minuten bei 25°C geschüttelt, dann unter Stickstoff in einen mit Stopfen versehenen Erlenmeyer-Kolben gegeben und darin bei 25°C 16 Stunden belassen. Die geschlossene Umgebung des Kolbens wurde durch einen durch Stickstoff unter Druck gesetzten Behälter erhalten, der Stickstoffgas an den Kolben bei Entgasen des Kolbens in eine Wasserfalle abgab.

Danach wurden 3 ml der Lösung über eine 30,48 × 2,54 cm Gel-Filtrationssäule chromatografiert. Die Säule enthielt als Filtermaterial im Handel erhältliches Sephadex G-15. Sephadex ist ein gekörntes hochmolekulares Polysaccarid, das mit Epichlorhydrin vernetzt ist. Als Eluant für die Gelsäure wurde 0,1 M Essigsäure, pH-Wert 3, verwendet. Die Flußgeschwindigkeit des Eluants wurde bei 1 ml/min mittels einer Niedergeschwindigkeits-Peristaltikpumpe gehalten. Ein Adsorbence-Monitor wurde am Auslauf der Säule in Stellung gebracht und ein UV-Detektor, eingestellt auf 276 nm, wurde verwendet, um die eluierenden Proteinfraktionen zu erfüllen. Eine größere Proteinfraktion von etwa 5 ml eluierte unter diesen Bedingungen aus der Säule und wurde in einem kleinen Becher gesammelt. Die Proteinfraktion wurde unter Verwendung eines Photometers ACTA III analysiert. Die Molarität der Proteinfraktion wurde mit 2,67 × 10^-5 bestimmt, wobei der Absorbence-Koeffizient bei 208 A 0,254 war. Das Molekulargewicht des Proteins war 13 000 Daltons und der Exitinktionswert E einer 1%igen Lösung 7,3.

Den 5 ml proteinhaltigen Eluants wurden zugesetzt: 1 ml 1,0 M Tris-HCl-Puffer, pH 8; 1 ml einer 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); 1 ml von 5 × 10^-4 M reduziertem Glutathion; 1 ml von 5 × 10^-4 M oxidiertem Glutathion und 1 ml von 0,02 M Tryptamin-HCl. Das Tryptamin-HCl wurde als der Inhibitor zugegeben, während die anderen Reagenzien, nämlich EDTA und Glutathion zugegeben wurden nach den Lehren von Lloyd Chavez, Jr. und Harold Scheraga in "Folding of Ribonuclease, S-Protein und Des (121-124) ribonuclease during Glutathione Oxidation of Reduced Proteins", 1980, Biochemistry, 19, 996-1004. Die resultierende Lösung zeigte einen pH-Wert von 5,5. Die Lösung wurde 1,5 Stunden bei einem pH-Wert von 5,5 langsam gerührt. Danach wurde der pH-Wert auf etwa 8,0 durch Zugabe von 100 mg Tris-Base-Kristallen erhöht. Die resultierende Tris-haltige Lösung wurde langsam bei einem pH-Wert von 8, einer Temperatur von 25° weitere 2,5 Stunden gerührt. Während des Rührens bildete sich ein flockiger weißer Niederschlag.

Nach Ablauf von 2,5 Stunden wurde zur Vernetzung die Lösung gegen 1 mM Tris-HC1-Puffer eines ph-Wertes von 7,2, der 0,005 M des Inhibitors Tryptamin enthielt, dialysiert.

Die Dialysiermembran war ein Spektrapor-Membranrohr, Nr. 2, das einen Molekulargewichtsausschlußbereich von 12-14 000 Daltons hat. Das Dialysieren schloß zwei Pufferwechsel ein mit einem Volumen von 7000 ml Puffer über eine Zeitdauer von 17 Stunden bei 0,5°C und schwachem Schütteln des Dialysierrohres in dem Dialysiermedium.

Nach der Dialyse wurden 2 ml der das enzymartig modifizierte Protein enthaltenden Lösung über eine 1,27 × 30,48 cm Sephadex G-15 Säule chromatografiert. Sie war mit Gelfiltrationsmittel unter Verwendung von Trispuffer, pH 7, als Eluant gefüllt. Eine solche Gelfiltrationssäule wird verwendet, um Materialien niedrigeren Molekulargewichts von Proteinmaterialien abzutrennen. Die Flußgeschwindigkeit des Eluants war 1 ml/min. Das Eluant wurde bei 254 nm überwacht, um das Eluieren von enzymartig modifiziertem Protein festzustellen. Ein erster Teil von eluiertem enzymartig modifiziertem Protein wurde gesammelt und gegen Substrat für Esterase-Enzym geprüft. Das verwendete Substrat war Tryptophan-Methylester (TME), Charge 109C-0048, Nr. T-5505).

Die Untersuchung auf enzymatische Aktivität des esterase- enzymartig modifizierten Proteins wurde wie folgt durchgeführt. Die vorstgehend gesammelte Proteinfraktion wurde durch Hochdruck-Flüssigchromatografie (HPLC) geprüft, um die Aktivität gegenüber dem TME-Substrat zu bestimmen. Die Versuchsbedingungen waren die folgenden: das HPLC- Säuleneluat war 0,03 M Acetat, pH-Wert 6. Das Säulenträgermaterial war an poröses Siliciumdioxid gebundenes Phasenmaterial, das Carboxylseitenketten enthielt. Die Säule war aus rostfreiem Stahl und 2 mm × 25 cm. Die Strömungsgeschwindigkeit von 4 ml/min wurde durch eine übliche Hochdruckpumpe aufrechterhalten. Das Säuleneluat wurde mittels eines üblichen UV-Monitors bei 254 nm überwacht.

Die Untersuchungsprobe wurde auf folgende Weise bereitet. 1 ml des esterase-enzymartig modifizierten Proteins (mit einer Absorption von 0,222 bei 280 nm, was 0,335 mg/ml entspricht) wurde vermischt mit 8 ml 5 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, und 1 ml 0,1 M TME-Substrat. Die Untersuchungs-Kontrollösung wurde bereitet durch Zufügen von 8 ml des 5 mM Tris- HCl-Puffers, pH 8, zu 1 ml von 0,1 M TME und 1 ml des Tris- Puffers, pH 7, verwendet als die Eluantlösung. Der pH-Wert von der Kontroll- und der Untersuchungs-Probenlösung war 6,6.

1 ml der Probe wurde aus dem Becher unter Verwendung einer 2 ml Subkutanspritze mit einer 18 Gauge (4,57 µm) dicken Nadel entfernt. Diese 1 ml Probe wurde durch eine 20 ml Injektionsprobeschleife auf der HPCl-Säule hindurchgeschickt. Die Injektionszeit wurde aufgezeichnet. Dieses Vorgehen wurde mit der Kontrollösung wiederholt. Beide, die Probe und die Kontrolle, wurden viermal chromatografiert, um den Verlauf von Molarität des Tryptophans gegen die Zeit des Eluierens von Probe und Kontrolle zu erhalten.

Mit den erhaltenen Daten wurde eine statistische Analyse durchgeführt, die einen Anstieg von 0,3171 × 10^-5 M/min zeigte, wobei ein Fehler von 0,00685 × 10^-5 M/min für die Probe ermittelt wurde. Ein Anstieg von 0,2878 × 10^-5 M/min mit einem Fehler von 0,0091 × 10^-5 M/min wurde für die Kontrolle ermittelt.

Die folgende Beziehung wurde benutzt, um die Aktivität des esterase-enzymartig modifizierten Proteins nach der Erfindung zu berechnen.

worin bedeuten: Die Änderung in der Neigung die Differenz zwischen der Probe und der Kontrolle (in diesem Beispiel 0,0293); der Fehler ist die Summe der Fehler der Neigung von Probe und Kontrolle; Vs das Volumen der Probe in Liter: 10⁶ Mikromole/Mol; und MP ist mg modifiziertes Protein in der Untersuchungsprobe.

In der vorstehenden Berechnung wird die Konzentration des modifizierten Proteins aus seiner Absorbance bei 280 nm berechnet, und zwar unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten für Ribonuclease, die bei einer 1%igen Lösung 7,3 ist. Der Extinktionskoeffizient ist offenbart in Int. J. Peptide Protein Res. 5, 49-62 (1973) authored by D. M. Kirschenbaum.

Die Untersuchungsergebnisse sind nachstehend aufgeführt:

Substrat
TME (Einheiten/g) Aktivität zu Beginn0,000 Aktivität am Schluß8,0 ± 0,717

Die Ergebnisse zeigen, daß das esterase-enzymartig modifizierte Protein, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, Aktivität mit Bezug auf das Esteraseenzym-Substrat TME besitzt, obwohl vorher im nativen Ribonucleaseenzym keine Aktivität festgestellt worden ist. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Gattung von Enzym, nämlich einer Nuclease, in eine andere, nämlich ein esterase-enzymartig modifiziertes Protein.

(In den folgenden Beispielen schließt "wie in Beispiel 1 beschrieben" sowohl die Verfahrensweise als auch die dabei verwendeten Geräte ein).

Beispiel 2

120 mg chromatografisch gereinigtes natives Enzym von Rinderpankreas-Ribonuclease (RNase), das auch in Beispiel 1 verwendet wurde, wurden in 6 ml 8 M Harnstoff, der 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8, enthielt, unter langsamem Rühren bei 25°C gelöst. Danach wurde mit 0,2 ml Beta-Mercaptoethanol, wie in Beispiel 1 beschrieben, denaturiert.

Danach wurden 5 ml der Lösung an einer mit Sephadex G-15 Gel gefüllten 30,48 × 2,54 cm Säule chromatografiert. Das Eluant für die Gelsäule war 0,1 M Essigsäure eines pH-Werts von 3. Die Flußgeschwindigkeit des Eluants durch die Säule war 1 ml/min. Die Absorbance des Ausflusses wurde bei 276 nm mittels eines UV-Detektors überwacht: Eine größere Proteinfraktion von etwa 1 ml wurde gesammelt. Die Fraktion wurde mittels eines Beckman-Photometers ACTA III analysiert. Die Molarität der gesammelten Proteinfraktion wurde mit 6,64 × 10^-5 bestimmt, wobei die Absorbance bei 280 A 0,63 war. Das Molekulargewicht des Proteins war 13 000 Daltons und der Extinktionskoeffizient E einer 1%igen Lösung war 7,3.

Dem gesammelten 5 ml Proteinmaterial wurden zugesetzt: 0,5 ml des 1,0 M Tris-HCl-Puffers, pH 8; 0,5 ml von 1 mM EDTA; 0,5 ml von 5 × 10^-4 M reduziertem Glutathion; 0,5 ml von 5 × 10^-4 M oxidiertem Glutathion und 0,5 ml von 0,02 M Inhibitor Tryptamin für Esteraseenzym. EDTA und Glutathion wurden nach den Lehren von Lloyd Chavez zugegeben (siehe Beispiel 1).

Am Schluß der 4,0 Stunden dauernden Periode zeigte die resultierende Lösung einen pH-Wert von 5,0. Nach 0,5 Stunden langem Rühren der resultierenden Lösung bei dem pH-Wert 5 wurde der pH-Wert durch Zugabe von 100 mg Tris-Base-Kristallen auf 8 erhöht. Die Lösung wurde langsam bei pH 8 und 25°C 4 Stunden lang gerührt. Während des Rührens bildete sich ein weißer flockiger Niederschlag.

Nach diesen 4 Stunden wurde zur Vernetzung die resultierende Lösung gegen 1 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7, der 2% des Inhibitors Tryptamin enthielt, dialysiert, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Zwei ml der vorstehend beschriebenen Proteinlösung wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, chromatografiert. Die erste Hälfte der eluierenden Proteinfraktion wurde gesammelt und gegenüber Esterasesubstrat, nämlich dem in Beispiel 1 verwendeten Tryptophan-Methylester (TME) untersucht.

Die Untersuchung auf enzymatische Aktivität des neu synthetisierten esterasen-enzymartig modifizierten Proteins wurde an einem HPLC-System vorgenommen. Die Versuchsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1 angegeben.

Die Untersuchungsprobe wurde wie folgt hergestellt. Drei ml des esterase-enzymartig modifizierten Proteins (mit einer Absorbance von 0,450 bei 280 nm, was 0,67 mg/ml entspricht) wurden mit 6 ml eines 1 mM Tris-HCl-Puffers, pH 7,5 und 1 ml 0,1 M TME-Substrat vermischt. Eine Untersuchungskontrollösung wurde hergestellt durch Zufügen von 6 ml des 1 mM Tris-HCl-Puffers, pH 7,5 zu 1 ml TME-Substrat und 3 ml des Sephadex G-15-Eluantpuffers, nämlich des 1 mM Tris-Puffers, pH 7. Der pH-Wert sowohl der Kontrollösung als auch der Untersuchungsprobelösung war 6,4.

1 ml der Probe wurde aus dem Becher unter Verwendung einer 2 ml Subcutanspritze mit einer 18 Gauge (4,57 µm) dicken Nadel entfernt. Diese 1-ml-Probe wurde durch eine 20 ml Injektions-Probeschleife auf der HPLC-Säule hindurchgeschickt. Die Injektionszeit wurde aufgezeichnet. Dieses Vorgehen wurde mit der Kontrollösung wiederholt. Beide, die Probe und die Kontrolle, wurden viermal chromatografiert, um den Verlauf der Molarität des Tryptophans gegen die Zeit des Eluierens der Probe und der Kontrolle zu erhalten.

Mit den erhaltenen Daten wurde eine statistische Analyse durchgeführt, die einen Anstieg von 0,81333 × 10^-5 M/min zeigte, wobei ein Fehler von 0,1021 × 10^-5 für die Probe festgestellt wurde. Ein Anstieg oder eine Neigung von 0,54062 × 10^-5 M/min mit einem Fehler von 0,093291 × 10^-5 M/min wurde für die Kontrolle ermittelt.

Die Aktivität des esterase-enzymartig modifizierten Proteins wurde, wie in Beispiel 1 erläutert, berechnet.

Die Änderung in der Neigung war in diesem Beispiel 0,272713 und der Fehler 0,134.

Die Untersuchungsergebnisse sind nachstehend aufgeführt: Substrat
TME (Einheiten/g) Aktivität zu Beginn0,000 Aktivität am Schluß13,62 ± 6,62

Die Ergebnisse zeigen, daß das esterase-enzymartig modifizierte Protein, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, Aktivität mit Bezug auf das Esteraseenzym- Substrat TME besitzt, obwohl vorher im nativen Ribonucleaseenzym, keine Aktivität festgestellt worden ist. Dies zeigt die Umwandlung einer Gattung von Enzym, nämlich einer Nuclease in eine andere Gattung von Protein, nämlich einem esterase-enzymartig modifizierten Protein.

Beispiel 3

100 mg Rinderserumalbumin (BSA), Charge 90F-9315, No. A-7511) wurden in 5 ml von 8 M Harnstoff, der 0,1 M Tris-Puffer, pH 8, enthielt, unter langsamem Rühren bei 25°C gelöst.

Dieser Lösung wurden 0,2 ml Beta-Mercaptoethanol als Denaturierungsmittel zugegeben. Die Lösung wurde 15 Minuten bei 25°C schwach geschüttelt. Danach wurde die Lösung unter Stickstoffatmosphäre 16 Stunden bei 25°C, wie in Beispiel 1 beschrieben, belassen.

Im Anschluß daran wurden 5 ml der Lösung über eine Gel- Filtrationssäule, wie in Beispiel 1 beschrieben, chromatografiert.

Zu der eluierten Proteinfraktion von 5 ml wurden zugegeben: 1 ml von 1,0 M Tris-HCl-Puffer, pH 8; 1 ml von 1 mM EDTA; 1 ml von 5 × 10^-4 M reduziertem Glutathion; 1 ml von 5 × 10^-4 M oxidiertem Glutathion und 1 ml von 0,02 M Tryptamin als Esterase-Inhibitor. Die resultierende Lösung zeigte einen pH-Wert von 5,2. Sie wurde bei diesem pH-Wert langsam 0,5 Stunden gerührt. Danach wurde der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 0,1 M NaOH auf 6 erhöht. Die Lösung vom pH-Wert 6 wurde 4 weitere Stunden bei 25°C langsam gerührt. Während des Rührens bildete sich ein flockiger weißer Niederschlag. Am Ende dieser vier Stunden dauernden Periode wurde die Lösung gegen 1 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7, der 2% Tryptamin enthielt, dialysiert. Das Tryptophan wurde als der Inhibitor zugesetzt, während die anderen Reagenzien nach den Lehren von Chavez et al, wie in Beispiel 1 angegeben, zugefügt wurden. Die Dialyse wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.

4 ml der das esterase-enzymartig modifizierte Protein enthaltenden Lösung wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, chromatografiert.

Ein erster Teil eluierenden enzymartig modifizierten Proteins wurde gesammelt und gegenüber Substrat für Esteraseenzym untersucht. Das Substrat war das gleiche Tryptophan-Methylester (TME), der in Beispiel 1 verwendet wurde.

Die Untersuchung auf enzymatische Aktivität des esterase- enzymartig modifizierten Proteins wurde mittels HPLC vorgenommen, um die Aktivität gegenüber dem TME-Esterase- Substrat zu bestimmten. Die Untersuchungsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1 angegeben. Der Säuleneluant wurde mittels eines üblichen UV-Monitors bei 254 nm und 0,05 A erfühlt.

Die Untersuchungsprobe wurde wie folgt hergestellt: 5 ml von 0,03 M Acetatpuffer, pH 6, wurden mit 1 ml 0,1 mM TME und mit 4 ml des esterase-enzymartig modifizierten Proteins, hergestellt, wie vorstehend beschrieben (mit einer Adsorption bei 280 nm von 0,016, entsprechend 0,024 mg/ml) vermischt. Die Untersuchungsprobe wurde durch Zugabe von 5 ml 0,03 M Acetat, pH 6, zu 1 ml 0,1 M TME und 4 ml des Eluants, nämlich des Tris-HCl-Puffers, pH 7, hergestellt. Sowohl die Kontrollösung wie die Untersuchungsprobelösung zeigten einen pH-Wert von 5,8.

1 ml Probe wurde aus dem Becher unter Verwendung einer 2 ml Subcutanspritze mit einer 18 Gauge (4,57 µm) dicken Nadel entfernt. Diese 1 ml Probe wurde durch eine 20 ml Injektionsprobeschleife auf der HPLC-Säule hindurchgeschickt. Die Injektionszeit wurde aufgezeichnet. Dieses Vorgehen wurde mit der Kontrollösung wiederholt. Beide, die Probe und die Kontrolle, wurden viermal chromatografiert, um den Verlauf der Molarität des Tryptophans gegen die Zeit des Eluierens von Probe und Kontrolle durch die Säule zu erhalten.

Mit den erhaltenen Daten wurde eine statistische Analyse durchgeführt, die eine Neigung von 0,05596 × 10^-5 M/min zeigt, wobei ein Fehler von 0,00213 × 10^-5 Min/min für die Probe ermittelt wurde. Eine Neigung von 0,6244857 × 10^-5 M/min mit einem Fehler von 0,0000823 × 10^-5 M/min wurde für die Kontrolle ermittelt.

Die Aktivität des esterase-enzymartig modifizierten Proteins wurde, wie in Beispiel 1 erläutert, berechnet. Die Änderung in der Neigung war in diesem Beispiel 0,0314 und der Fehler 0,00296.

In der vorstehenden Beziehung wird die Konzentration des modifizierten Proteins aus seiner Absorbance bei 280 nm berechnet unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von Ribonuclease, welcher bei einer 1%igen Lösung 6,62 ist.

Die Untersuchungsergebnisse sind nachstehend ausgeführt:

Substrat
TME (Einheiten/g) Aktivität zu Beginn0,00 Aktivität am Ende32,7 ± 3,08

Die Ergebnisse zeigen, daß das esterase-enzymartig modifizierte Protein, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, Aktivitäten gegenüber dem Esterase-Enzym-Substrat TME besitzt.

Im nativen BSA-Protein war keine Esteraseaktivität festgestellt worden.

Dies zeigt die Umwandlung einer Gattung eines nichtenzymatischen Proteins, eines Albumins, in eine andere Gattung von Protein, nämlich eines enzymatisch aktiven esterase-enzymartig modifizierten Proteins.

Beispiel 4

250 mg BSA Charge 90F-8351, No. 7511) wurden in 25 ml 8 M Harnstoff unter langsamem Rühren 2 Stunden bei 25°C und pH 7,8 gelöst. Nach 2 Stunden langem Rühren wurden der Lösung 1 ml von 10 mM Beta- Mercaptoethanol als Reduktionsmittel zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde bei pH 7,6 und 25°C gerührt.

Danach wurden 75 ml einer 1%igen Lösung von Tryptamin als Esteraseenzym-Inhibitor zugegeben. Die Lösung wurde 2 Stunden bei pH 7,0 langsam gerührt.

Im Anschluß daran wurde das Protein wie folgt vernetzt. Die das Protein enthaltende Lösung wurde in einen Dialysiersack gegeben, nämlich ein Spectrapor-Dialysierrohr, No. 2. Das in dem Dialysiersack enthaltene Protein wurde gegen 1% Tryptamin-Inhibitorlösung in 1 mM Tris-Puffer bei pH 7 in einer Zeit von 17 Stunden bei 0-5°C dialysiert.

Das resultierende esterase-enzymartig modifizierte Protein wurde wie folgt gereinigt. 2 ml des vorstehend erhaltenen Präparats wurde über eine Sephadex G-10 Chromatografiersäule unter Verwendung von 0,03 M Acetatpuffer, pH 6, als das Eluant chromatografiert. Die Eluant-Flußgeschwindigkeit war 2 ml/min. Die erste Hälfte des Proteinpeaks war etwa 5 ml des Eluantvolumens und zeigte eine Absorbance von 0,666 bei 280 nm.

Die Untersuchung auf enzymatische Aktivität des so erhaltenen esterase-enzymartig modifizierten Proteins wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, vorgenommen. Die Proteinfraktion des Säuleneluants wurde durch übliche UV-Überwachung bei 254 nm erfühlt.

Die Untersuchungsprobe wurde wie folgt hergestellt: 5 ml von 0,03 M Acetat, pH 6, wurden mit 1 ml von 0,1 M TME und 4 ml der vorstehend beschriebenen proteinhaltigen Lösung vermischt. Die Untersuchungskontrollösung wurde hergestellt durch Vermischen von 9 ml 0,03 M Acetat, pH 6, mit 1 ml von 0,1 M TME-Substrat. Der pH-Wert der Kontroll- und der Untersuchungsprobelösung war 6,0.

1 ml der Probe wurde unter Verwendung einer 2 ml Subcutanspritze mit einer 4,57-µm-Nadel entfernt. Diese 1-ml-Probe wurde durch eine 20 ml Injektionsprobeschleife auf die HPLC-Säule hindurchgeschickt. Die Injektionszeit wurde aufgeschrieben. Dieses Vorgehen wurde mit der Kontrollösung wiederholt. Die Probe und die Kontrolle wurden viermal chromatografiert, um den Verlauf der Molarität des Tryptophans gegen die Zeit des Eluierens von Probe und Kontrolle zu erhalten.

Mit den erhaltenen Daten wurde eine statistische Analyse durchgeführt, die eine Neigung von 0,0516 × 10^-5 M/min zeigte mit einem Fehler von 0,004 M/min für die Probe. Eine Neigung von 0,0287 × 10^-5 M/min mit einem Fehler von 0,0016 × 10^-5 M/min wurde für die Kontrolle ermittelt.

In der vorstehenden Beziehung wird die Konzentration des modifizierten Proteins aus seiner Absorbance bei 280 nm berechnet, und zwar unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten für Rinderserumalbumin, der für eine 1%ige Lösung 6,6280 ist.

Die Untersuchungsergebnisse sind nachstehend aufgeführt:

Substrat
TME (Einheiten/g) Aktivität zu Beginn0,0 Aktivität am Ende0,57 ± 0,16

Die Ergebnisse zeigen, daß das modifizierte esterase-enzymartig modifizierte Protein, hergestellt nach dem Verfahren der Erfindung, Aktivität mit Bezug auf das Esteraseenzym- Substrat TME besitzt. Das native BSA hatte keine Aktivität mit Bezug auf Esterase-Substrat TME gezeigte.

Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Gattung eines nichtenzymatischen Proteins, eines Albumins, in eine andere Gattung von Protein, nämlich eines enzymatisch aktiven esterase-enzymartig modifizierten Proteins.

Beispiel 5 (Vergleichsbeispiel)

Um zu zeigen, daß das native Rinderserumalbumin (BSA)- Protein keine katalytische Aktivität mit Bezug auf das L-Tryptophan-Methylester (TME)-Substrat des Beispiels 4 besitzt, wurde folgender Vergleichsversuch vorgenommen.

1 gBSA Type 7511, Charge 90F-9315) wurde in 25 ml destilliertem deionisiertem Wasser unter langsamem Rühren bei 25°C gelöst. Dieser Lösung wurden 75 ml einer 1%igen Tryptamin-HCl-Lösung zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 15 Minuten bei 25°C bebrütet und dann in einem Spectra-Membranrohr Nr. 2 gegen 3500 ml einer 1%igen Tryptamin-HCl-Lösung 4 Stunden dialysiert. Während des Dialysierens wurde die Temperatur der Lösung auf 0-5°C und der pH-Wert auf 6,0 gehalten. Nach dem 4 Stunden dauernden Dialysieren wurden 2 ml der Lösung über eine 63,50 × 1,27 cm Sephadex G-10-Säule chromatografiert. Die Säule wurde mit 0,03 M Acetatpuffer, pH 6, bei einer Flußgeschwindigkeit von 2 ml/min eluiert.

Es wurden zwei deutliche Peaks gesammelt. Der erste Peak wurde bei etwa 30 ml eluiert. Er wurde durch ein 300-200 nm Scan an einem Spectrophotometer ACTA 3 als BSA- Protein identifiziert. Der zweite Peak eluierte bei 60 ml und wurde durch UV-Spectrophotometrie als Tryptamin identifiziert.

4 ml des gesammelten BSA wurden dann gegen TME-Substrat auf mögliche enzymatische Aktivität untersucht. Die Untersuchung wurde wie folgt durchgeführt. Ein HPLC-System wurde für die Untersuchung verwendet. Die Säule war 2 mm × 25 cm groß, aus rostfreiem Stahl und mit porösen Siliciumdioxidpartikeln, die Carboxylseitenketten aufwiesen, beschickt; die durchschnittliche Partikelporengröße war 40 µm.

Der Säuleneluant war 0,03 M Acetat, pH 6, bei einer Flußgeschwindigkeit von 4 ml/min. Die Absorbance des Ausflusses der Säule wurde bei 254 nm überwacht. 5 ml des 0,03 M Acetats, pH 6, und 1 ml von 0,1 M TME-Substrat wurden mit 4 ml der oben erhaltenen BSA-Lösung vermischt.

Die Untersuchungskontrollösung wurde durch Vermischen von 9 ml eines 0,03 M Acetats, pH 6 und 1 ml von 0,1 M TME- Substrat hergestellt. Der pH-Wert sowohl von der Kontrolle als auch von der Probe war 6,0.

1 ml der Untersuchungsprobe wurde aus dem Becher unter Verwendung einer 2 ml Subcutanspritze mit einer 28 Gauge (4,57 µm) dicken Nadel entfernt und durch eine 20 Microliter Injektionsprobenschleife auf der Säule injiziert. Die Zeit der Injektion wurde aufgezeichnet.

Das Vorgehen wurde dann unter Verwendung der Kontrollösung wiederholt. Beide, die Probe und die Kontrolle, wurden viermal chromatografiert, um den Verlauf von Molarität von TME gegen die Zeit des Eluierens von Probe und Kontrolle zu erhalten.

Eine statistische Analyse der erhaltenen Daten zeigt eine Neigung von 0,19689 × 10^-5 M/min mit einem Fehler von 0,0089 × 10^-5 M/min für die BSA-Untersuchungsprobe. Bei der Kontrollprobe wurde eine Neigung von 0,20296 × 10^-5 M/min bei einem Fehler von 0,0062 × 10^-5 M/min festgestellt. Die Neigungen plus die Summe der Fehler sind tatsächlich identisch. Demgemäß zeigt das native BSA-Protein keine meßbare katalytische Aktivität mit Bezug auf TME-Substrate.

Beispiel 6 (Vergleichsbeispiel)

Um zu zeigen, daß das native Ribonuclease-Enzym keine katalytische Aktivität mit Bezug auf L-Tryptophan-Methylester- (TME)-Substrat, das in den Beispielen 1 und 2 eingesetzt worden ist, hat, wurde folgender Vergleichsversuch durchgeführt.

60 mg Ribonuclease-Enzym Type R-5000, Charge 20F-2010) wurden in 100 ml 1 mM Tris-Puffer bei pH 7 unter langsamem Rühren bei 25°C gelöst.

Die Ribonuclease enthaltende Lösung wurde dann unter Verwendung eines Spektrapor-Membranrohres No. 3 gegen 3500 ml eines 1 mM Tris-Puffers, pH 7, 17 Stunden bei 0-5°C dialysiert. Dieses Dialysierrohr No. 3 hat einen Molekulargewichts-Ausschlußbereich von 35-4500 Daltons. Danach wurde 1 ml der Ribonuclease enthaltenden Lösung gegenüber TME-Substrat auf mögliche enzymatische Aktivität mit Bezug auf TME untersucht. Die Untersuchung wurde wie folgt durchgeführt:

Für die Untersuchung wurde ein HPCL-System verwendet. Die Säule war die gleiche wie die in Beispiel 5 verwendete. Das Säuleneluant war 0,03 M Acetat, pH 6, die Flußgeschwindigkeit 7 ml/min. Die Absorbance des Säulenausflusses wurde bei 280 nm überwacht.

Die native Ribonuclease enthaltende Untersuchungsprobelösung wurde wie folgt hergestellt: 8 ml von 1 mM Tris- Puffer, pH 8,05, wurden mit 1 ml von 0,1 M TME, pH 3,4 und 1 ml der Ribonuclease enthaltenden Lösung vermischt. Die Untersuchungskontrollösung wurde hergestellt durch Vermischen von 8 ml eines 1 mM Tris-Puffer, pH 8,05, mit 1 ml von 0,1 M TME, pH 3,4, und 1 ml von 1 mM Tris- Puffer, pH 7,0. Der pH-Wert der Kontroll- und der Untersuchungsprobelösung war 6,5.

1 ml der Untersuchungsprobelösung wurde wie in Beispiel 5 aus dem Becher entfernt und auf die Säule durch eine 20 ml Injektionsprobeschleife injiziert. Die Zeit der Injektion wurde aufgezeichnet.

Dieses Vorgehen wurde mit der Kontrollösung wiederholt. Sowohl die Untersuchungsprobelösung als auch die Kontrollösung wurden viermal chromatografiert, um den Verlauf der Molarität von TME gegenüber der Zeit des Eluierens von Probe- und Kontrollösung zu erhalten.

Die statistische Analyse der erhaltenen Daten zeigte praktisch die gleichen Neigungen von 0,1400 ± 0,003 für die Kontroll- und die Untersuchungsprobelösung. Demgemäß zeigt die native Ribonuclease keine meßbaren katalytischen Aktivitätseigenschaften mit Bezug auf das TME-Substrat.

Beispiel 7 (Vergleichsbeispiel)

Um zu zeigen, daß natives Rinderserumalbumin (BSA) Aktivität mit Bezug auf das in Beispiel 3 benutzte L-Tryptophan- Methylester (TME)-Substrat aufweist, wurde folgende Kontrolluntersuchung durchgeführt.

100 mg BSA No. 7511, Charge 90F-8351) wurden in 100 ml eines 1 mM Tris-Puffers bei pH 7 unter langsamem Rühren bei 25°C gelöst.

Die BSA enthaltende Lösung wurde dann unter Verwendung eines Spektrapor-Membranrohres No. 2 gegen 3500 ml eines 1 mM Tris-Puffers, pH 7, 17 Stunden bei 0-5°C dialysiert. Danach wurde 1 ml der BSA enthaltenden Lösung gegenüber TME-Substrat auf mögliche enzymatische Aktivität mit Bezug auf TME untersucht. Die Untersuchung wurde wie folgt durchgeführt.

Für die Untersuchung wurde ein HPLC-System verwendet. Die Säule war die gleiche wie die in Beispiel 5 verwendete. Das Säuleneluant war 0,03 M Acetat, pH 6, die Flußgeschwindigkeit 7 ml/min. Die Absorbance des Säulenausflusses wurde bei 280 nm überwacht.

Die das native BSA enthaltende Untersuchungsprobelösung wurde wie folgt hergestellt. 8 ml von 1 mM Tris-Puffer, pH 7,5, wurde mit 1 ml von 0,1 M TME, pH 3,2 und 1 ml der Ribonucleaselösung vermischt. Die Untersuchungskontrollösung wurde hergestellt durch Vermischen von 8 ml eines 1 mM Tris-Puffers, pH 7,5, 1 ml 0,1 M TME, pH 3,2 und 1 ml eines 1 mM Tris-Puffers, pH 7,0. Der pH-Wert der Kontrollösung und der Untersuchungsprobelösung war 5,8.

Dann wurde 1 ml der Untersuchungsprobelösung, wie in Beispiel 5, aus dem Becher entfernt und auf die Säule durch eine 20 ml Injektionsprobeschleife injiziert. Die Injektionszeit wurde aufgezeichnet.

Dieses Vorgehen wurde dann mit der Untersuchungskontrollösung wiederholt. Die Untersuchungsprobelösung und die Kontrollösung wurden viermal chromatografiert, um eine Neigung der Molarität von TME gegenüber der Zeit des Eluierens der Untersuchungsprobelösung und der Kontrollösung zu erhalten.

Eine statistische Analyse der erhaltenen Daten zeigte eine praktisch gleiche Neigung von 0,06 ± 0,0065 für die Kontrollösung und die Untersuchungsprobelösung. Folglich zeigt die native Ribonuclease keine meßbaren katalytischen Aktivitätseigenschaften mit Bezug auf das TME- Substrat.

Claims

1. Verfahren zur chemischen Veränderung der Substratspezifität eines nativen Proteins zur Erzeugung eines enzymartig modifizierten Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß man A) a) ein Enzym als Modellenzym auswählt, das nachgebildet werden soll; b) ein natives Protein in hohem Grade denaturiert; c) das in hohem Grade denaturierte Protein zu einem partiell denaturierten Protein partiell renaturiert; d) das partiell denaturierte Protein mit einer Verbindung ausreichend struktureller Ähnlichkeit mit dem Substrat des Modellenzyms, um als Schablone für die katalytische Stelle des enzymartig modifizierten Proteins zu dienen, in Kontakt bringt, um einen partiell denaturierten Protein- Modellenzyminhibitor-Komplex zu bilden; e) das partiell denaturierte Protein in dem Protein-Inhibitor-Komplex vernetzt und f) den Modellenzym-Inhibitor und evtl. überschüssiges Vernetzungsmittel entfernt; oder daß man B) a) ein Enzym als Modellenzym auswählt, das nachgebildet werden soll; b) ein natives Protein in hohem Grade denaturiert; c) das in hohem Grade denaturierte Protein mit einer Verbindung ausreichend struktureller Ähnlichkeit mit dem Substrat des Modellenzyms, um als Schablone für die katalytische Stelle des enzymartig modifizierten Proteins zu dienen, vermischt; d) das in hohem Grade denaturierte Protein in Gegenwart des Inhibitors partiell renaturiert, um einen partiell denaturierten Protein-Inhibitor-Komplex zu erhalten; e) den partiell denaturierten Proteinteil des Protein- Inhibitor-Komplexes vernetzt; und f) den Modellenzym- Inhibitor und evtl. überschüssiges Vernetzungsmittel entfernt.

2. Enzymartig modifiziertes Protein, erhalten nach dem Verfahren des Anspruches 1, Ausführungsform A).

3. Enzymartig modifiziertes Protein, erhalten nach dem Verfahren des Anspruches 1, Ausführungsform B).