DE1905681B2

DE1905681B2 - Stabilisiertes enzympraeparat und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE1905681B2
Application number: DE19691905681
Authority: DE
Inventors: Ralph Allan Horseheads N.Y. Messing (V.StA.)
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1968-02-05
Filing date: 1969-02-05
Publication date: 1977-12-01
Also published as: JPS5532356B1; SE348740B; DE1905681A1; DE1905681C3; DK120692B; BE727912A; US3556945A; NL6901742A; FR2001336A1; GB1259321A; NO126375B

Description

Die Erfindung betrifft ein stabilisiertes Enzympräparat, das im wesentlichen wasserunlöslich und fähig ist. Reaktionen wiederholt ohne Verlust seiner Aktivität zu katalysieren, wobei das Enzym an einen anorganischen Träger mit großer Oberfläche durch Aminosilikat- und Wasserstoffbindungen gekuppelt ist, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Ein Enzym ist ein biologischer Katalysator, der fähig ist, eine chemische Reaktion in Gang zu setzen, zu fördern und zu leiten, ohne daß es beim Prozeß aufgebracht oder zu einem Teil des gebildeten Produkts wird. Er ist eine Proteinsubstanz, die durch Pflanzen, Tiere und Mikroorganismen synthetisiert wird.

Alle isolierten Enzyme sind Proteine, d. h. Peptidpolymere von Aminosäuren. Ein Enzym kann prosthetische Gruppen wie Flavinadenin-dinucleotid, Porphyrin, Diphosphopyridin-nucleotid usw. enthalten. Verschiedene Enzyme brauchen Metalüonen wie Mg⁺+ oder Mn* ^f zur Wirksamkeit. Enzyme sind im allgemeinen Makromoleküle mit einem Molekulargewicht über 6000. Der isoelektrische Punkt der Enzyme liegt bei einem pH-Wert von etwas weniger als 1,0 bis 11,0. Bei oder in der Nahe dieser Wasserstoffionenkon;:entration neigen die Enzym-Proteine gewöhnlich zum Koagulieren.

Die besonderen Eigenschaften der Enzyme und ihre Fähigkeit, Reaktionen von Substraten bei niedrigen Konzentrationen zu katalysieren, ist in der chemischen Analyse von besonderem Interesse. Durch Enzyme katalysierte Reaktionen sind seit einiger Zeit zur Bestimmung von Substraten, Beschleunigern, Verzögerern und auch von Enzymen selbst verwendet worden.

Bis in die jüngste Zeit haben die bei Verwendung von Enzymen auftretenden Nachteile ihre Brauchbarkeit stark eingeschränkt. Einwände gegen die Verwendung von Enzymen sind ihre Instabilität, ihr Mangel an Verfügbarkeit, geringe Genauigkeit sowie der Arbeitsaufwand zur Durchführung der Analyse. Weiterhin sind die Kosten bei Verwendung großer Enzymmengen in der analytischen Chemie, besonders bei Routineanalysen, ein besonders schwieriges Problem.

Es sind Versuche unternommen worden, Fnzyme in immobilisierter Form ohne Verlust ihrer Wirksamkeit herzustellen, so daß ein Präparat kontinuierlich viele Stunden benutzt werden kann. Das gebundene Enzym wird auf die gleiche Weise verwendet wie lösliche Enzyme, d. h. zur Bestimmung der Konzentration eines Substrates, eines Inhibitors, der das Enzym inaktiviert, oder eines Aktivators, der eine Beschleunigung der Enzymaktivität bewirkt. Enzyme wurden diazotiert an Celluloseteilchen und Polyaminostyrolperlen. Auch sind Versuche unternommen worden, die Enzyme durch Adsorption, Absorption oder durch Ionenaustausch physikalisch einzuhüllen. Enzyme sind auch an Polystyrolpolypeptide gebunden worden und in Kollodiummatrizen und in semipermeable Mikrokapseln aus synthetischen Polymerisaten eingeschlossen worden.

Die meisten beschriebenen, zum Binden der Enzyme verwendeten Trägersubstanzen waren organische Substanzen, besonders organische Polymerisate. Der Hauptnachteil bei Verwendung von organischem Material beruht darauf, daß es gegen Mikrobenbefall infolge der Anwesenheit von C-Atomen in der polymeren Kette anfällig ist, wobei der Träger aufgebrochen und das Enzym löslich gemacht wird. Weiterhin erfolgt die Kupplung mit Hilfe einer Diazobindung durch eine Kupplungsgruppe, wobei die Enzymmoleküle an den Träger nur an verschiedenen Punkten entlang der Enzymkette gebunden sind. In wässeriger Lösung können die Moleküle auseinanderfallen, wobei das Protein denaturiert wird und dementsprechend ein Verlust an Enzymwirksamkeit auftritt.

Es sind auch bereits Enzympräparate bekannt, in denen Enzyme an wasserunlösliche anorganische Träger gebunden wird. Neben organischen Trägern sind anorganische Träger in der US-PS 27 17 852 genannt, die ein Verfahren zur Herstellung von Dextrose aus Stärke vermittels Enzymen betrifft. Die Enzyme werden an geeignete Träger adsorbiert, durch welche Kronsirup zwecks Hydrolyse geleitet wird. Als Träger wird eine Vielzahl der unterschiedlichsten Substanzen genannt, wie Aktivkohle, Tone, Bleicherde, aktivierter Bauxit, natürliche und synthetische Zeolite, Metallsilikate, insbesondere Eisen-, Aluminium- oder Magnesium-Silikate vom Bentonittyp, Silikagel, Aluminiumhydroxid, aktiviertes Aluminiumoxid, Getreidekörner, Getreidehülsen, Kleie und Ionenaustauscherharze (vgl. Spalte 2, ZZ. 57-63). In dieser Patentschrift wird weiterhin ausgeführt, daß Stabilität und Widerstand gegen die Elution eine Funktion der Adsorptionskraft des Trägers in einem normalen Substrat ist. Damit ist aber noch kein Anhaltspunkt gegeben, wie man diese Kraft definiert und welche speziellen Bedingungen erforderlich sind, um eine bleibende Aktivität zu erreichen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung is! es, cm stabilisiertes Enzympräparat zu schaffen, das im wesentlichen wasserunlöslich und fähig ist, Reaktionen wiederholt ohne Verlust seiner Aktivität zu katalysieren und das die beschriebenen Nachteile nicht aufweist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelost, daß der Trager eine Oberfläche größer als 0,1 m²/g hat nd aus einem porösen keramischen Körper, Wollastonit norösem getrocknetem Kieselsäuregel oder p.
sem Glas besteht.

Es ist überraschend, daß Enzyme durch Bindung an diese anorganischen Träger stabilisiert werden können. Sie sind im wesentlichen immun gegen einen mikrobiellen Befall und stark an die Trägersubstanz entlang der Kettenlänge gebunden. Durch Verwendung dieser Träger können hochstabile Enzyme hergestellt werden, die über eine lange Zeitdauer ohne Verlust der Wirksamkeit gebraucht und wiedergebraucht werden können. Es ist so möglich, die Enzymwirksamkeit zu eichen und sicherzustellen, daß die Höhe der Wirksamkeit nach Wiederverwendung im wesentlichen konstant bleibt. Die erfindungsgemäßen Enzympräparate können für analytische Zwecke und bei der Herstellung von chemischen Stoffen, pharmazeutischen Präparaten und Nahrungsmitteln verwendet werden.

Die erfindungsgemäß stabilisierbaren Enzyme sind außerordentlich zahlreich und lassen sich in drei Hauptgruppen einteilen: Hydrolasen, Redoxenzyme und Transferasen. Zu den Hydrolasen gehören proteolytische Enzyme wie Papain, Ficin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bromelin, Keratinase; Carbohydrasen wie Cellulase, Amylase, Maltase, Pectinase, Chitinase; Esterasen wie Lipase, Cholinesterade, Lecithinase, Phosphatase; Nucleasen wie Ribonuclease, Desoxyribonuclease; und Amidasen wie Arginase, Asparaginase, Glutaminase und Urease. Die zweite Gruppe besteht aus Redoxenzymen, die Oxydations- oder Reduktionsreaktionen katalysieren. Zu ihnen gehören Glucoseoxydase, Katalase, Peroxydase, Lipoxydase und Cytochrome. Die dritte Gruppe, die Transferasen, übertragen Gruppen von einem Molekül zum anderen. Beispiele hierfür sind Glutamin-pyruvin-trans-aminase, Glutaminoxalsäure-transaminase, Transmethylase, Phosphopyruvat-trans-phosphorylase.

Kennzeichnendes Merkmal der Erfindung ist, daß die Träger aus anorganischen Stoffen mit reaktiven Silanolgruppen bestehen. Diese Stoffe müssen eine große Oberfläche haben und wasserunlöslich sein. Beispielsweise ist bei keramischen Trägern die Menge des an der Oberfläche des Trägers stabilisierten Enzyms eine Funktion des Molekulargewichts des Enzyms und eine Funktion des Porendurchmessers und der Größe der Oberfläche des Trägers. Grobgerechnet soll der Porendurchmesser wenigstens gleich oder größer sein als die Quadratwurzel des Molekulargewichts des Enzyms und allgemein soll die Oberfläche größer sein als etwa 0,1 m²/g. Der keramische Träger muß reaktive Silanolgruppen enthalten zur Bildung von lonenverbindungen mit den Aminogruppen des Enzymmoleküls. Bevorzugter Träger ist poröses Glas entweder in Form von Feststoffpartikeln oder eines selbsttragenden Stückes wie einer Scheibe oder eines Zylinders. Glas hat den Vorteil, daß es in seiner Abmessung stabil ist und beispielsweise durch Sterilisieren gründlich gereinigt werden kann. Als Träger geeignetes poröses Glas ist schnell verfügbar und im Handel erhältlich. Geeignetes poröses Glas kann mit verschiedenen Porendurchmessern anch der US-PS 2106 774 oder der FR-PS i5 34 990 hcrgcsicüt werocn. /-vPvjcrc geeignet anorganische Träger mit großer Oberfläche und reaktiven Silanolgruppen sind kolloidale Kieselerde (SiOi). ferner Wollastonit, ein in der Natur vorkommendes Ca-silikat, sowie getrocknetes Silikagel u. dgl.

Die Bindung des Enzyms an den Träger erfolgt in einer einfachen Reaktionsstufe ohne em Kupplungsmittel. Die Reaktion ist eine Wasserstoff- und lonenbindung vermittels der Aminogruppe des Enzyms und der

ι Silanolgruppe des keramischen Trägers. Die Wasserstoffbindung kann durch funktionell Gruppen am Enzym, z. B. Carbonyl-, Amid-, Sulfhydryl- und Hydroxylgruppen zustande kommen, während die lonenbindung eine Amino-Silikatbindung an endständigen oder

i" restlichen Aminen des Enzyms ist. Um einen Verlust an Enzymaktivität zu vermeiden, sollte keine Bindung an den aktiven Punkten des Enzymmoleküls vorliegen.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Enzympulver in einer Pufferlösung gelöst und geprüft.

i") Das Enzym wird dann an einen vorbehandeitcn keramischen Träger mit reaktiver Oberfläche im allgemeinen bei unter Raumtemperatur gebunden. Überschüssiges Enzym wird entfernt und das gebundene Enzym mit destilliertem Wasser und Pufferlösung

:o berieselt. Anschließend wird das Enzymträgerpräparat ausgelaugt und geprüft, bis ein konstanter Wert erhalten ist. Dann wird das stabilisierte Enzym in Wasser oder einer Pufferlösung bei Raumtemperatur oder darunter gelagert. Zur Bindung des Enzyms an den Träger wird

r> die wässerige Enzymlösung mit dem Träger bei einer Temperatur in Kontakt gebracht, die unter Raumtemperatur, vorzugsweise bei etwa 5° C, liegt, da Enzyme bei sehr niedrigen Temperaturen stabiler sind. Nach einer Kontaktzeit mit dem Träger von etwa 1—72

in Stunden ist das stabilisierte Enzym an die keramische Oberfläche gebunden, irgendwelches überschüssiges Enzym wird dann entfernt. Die anfängliche Aufnahme von Protein durch Glas hängt vom isoelektrischen Punkt ab. Je höher der isolelektrische Punkt des

π Moleküls liegt, d. h. je basischer das Protein infolge Anwesenhtit von Aminogruppen ist, um so größer ist die anfänglich gebundene Menge Protein bei der chemischen Bindung von basischen Aminogruppen an reaktive Silanolgruppen des Glases. Es ist wichtig, daß

•in der pH-Wert der Lösung während des Bindungsvorgangs so ist, daß das Enzym nicht denaturiert. Vorzugsweise soll dies auf der sauren Seite des isoelektrischen Punktes sein. Es ist wichtig, nichtgebundenes Enzym auszuwaschen, bevor ein stabilisierter Prüfwert erhalten ist. Das Auslaugen kann Stunden und selbst mehrere Tage dauern. Die Länge dieser Zei¹ scheint eine Funktion der Porengröße des keramischen Körpers zu sein. Körper mit kleinem Porendurchmesser, d. h. Poren mit den Molekulardimensionen des

>n Enzyms, erfordern längere Auslaugezeiten von 6—16 Tagen. Großporiges Material wie gefrittetes Glas und Wollastonit benötigen geringe oder gar keine Auslaugzeiten. Hieraus ist zu entnehmen, daß die Auslaugung das Resultat einer Kombination von lose gebundenen

ν· Enzymen in den Poren und verringerten Diffusionsgeschwindigkeiten (rates) entsprechend dem Verhältnis der Porendimensionen und der Molekulargröße des Enzyms ist. Eine induzierte negative Beladung über die erste Schicht von gebundenem Enzym kann zweite und

Wi dritte Enzymschichten lose binden.

Bei der Herstellung des Trägers für die Enzymbindung ist es häufig notwendig, den Träger vor/ubehandeln, um die Silanolgruppen schneller verfügbar und reaktiv zu machen. Wenn /. R. d;is poröse Glas nicht

hi vorbehandelt ist. kann es viele verschiedene Verunreinigungen enthalten, die die verfügbaren Bindungsstellen besetzen. Durch Reinigung der Glasoberfläche werden im wesentlichen alle aktiven Stellen verfügbar. Eine

typische Reinigung für poröses Glas ist folgende: Ein poröses Glasmuster wird mit Ultraschall in einer verdünnten Salpetersäurelösung bei etwa 80°C Vh Stunden gereinigt, mit dest. Wasser abgespült und in einen Ofen gebracht. Die Temperatur wird auf etwa > 625°C gesteigert und dabei 15-90 Minuten gehalten, während der Ofen mit Sauerstoff kont'nuierlich durchströmt wird. Das Muster wird sodann in einem Sauerstoffstrom gekühlt und unter verringertem Druck mit Wasserdampf vorbehandelt (equilibrated). Im Falle ι ο von Wollastonit wird das Material mit Ultraschall in Wasser gereinigt, bis der pH-Wert neutral ist, und dann einer ahnlichen Hitzebehandlung wie zuvor für poröses Glas unterworfen.

Das erfindungsgemäß erhaltene Produkt ist ein ii gebundenes, in Wasser unlösliches Enzym. Das Enzym ist so stabilisiert, daß es eine konstante Höhe an Wirksamkeit über einen langen Zeitraum besitzt. Bei Lagerung bei Temperaturen von 5° C oder auch bei Raumtemperatur während mehrerer Monate liefert das gebundene Enzym eine konstante Höhe an Wirksamkeit bei wiederholten Anwendungsbedingungen. Die Menge an stabilisiertem Enzym ist eine Funktion des Molekulargewichts des Enzyms und des Porendurchmessers und der Oberflächengröße des Trägers. :ί

Obwohl organische und anorganische Träger mit großer Oberfläche bereits bekannt waren, bringt die vorliegende Erfindung einen großen technischen Fortschritt, der nicht zu erwarten war. Insbesondere konnte die US-PS 27 17 852 die Erfindung nicht nahelegen, da in jo dieser Patentschrift zwar die verschiedensten anorganischen und organischen Träger offenbart sind, die aufgezeigten Vorteile der vorliegenden Erfindung jedoch nur mit porösen keramischen Körpern, Wollastonk, porösem getrockneten Kieselsäuregel oder r> porösem Glas jeweils mit einer Oberfläche größer als 0,1 m²/g erzielt werden können.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert:

Beispiel 1

Ein typisches Nuclease-Enzym (RN A-ase) mit folgenden Eigenschaften wurde hergestellt: Mol.-Gewicht 12 700; isoelektrischer Punkt pH 7,8; Aktivität des Präparates 1530 Einheiten/mg.

Versuchsbedingungen: 4 Minuten Inkubation bei 37°C in 0,1 Mol Acetatpuffer pH 5,0. Substrat: 1% Ribonucleinsäure in Pufferlösung. Fällungsmittel: 0,75% Uraiiylacetat in 25% Perchlorsäure.

Definition der Aktivitätseinheit: Eine Einheit ist äquivalent der Menge an saurem löslichen Oligonucleoiid, die einen Anstieg der spektrophotometrischen Absorption bei 260 Γημ von 1,0 in 4 Minuten bei pH 5,0 bewirkt.

Der Träger war ein poröses Glasmuster, und zwar ein Zylinder mit äußerem Durchmesser 1,2 cm und innerem Durchmesser 1,0 cm; Länge 5 cm; Gewicht 2,0 g; Porendurchmesser 74Ä; Oberfläche 113m²/g. Das Muster wurde durch Eintauchen in 1,2 Mol HCl 30 Minuten gereinigt, dann in einen Ofen gebracht, die Temperatur langsam auf 55O⁰C gesteigert und dabei 3 Stunden gehalten. Nach dem Abkühlen wurde das Glas über Nacht eingetaucht und mit 0,1 Mol Acetatpuffer auf pH 5,0 eingestellt.

Enzymbindung: Der Glaszylinder wurde in ein Versuchsrohr eingesetzt. Das Rohr wurde in ein Wasserbad von 5⁰C eingetaucht, sodann 6 ml einer Lösung von 0,5 mg RNA-ase/ml in 0,1 Mol Acetatpuffer,

40

5^r>

pH 5,0, in das Rohr zugegeben. Man ließ das Enzym mit dem Zylinder 6 Stunden bei 5°C reagieren. Der Zylinder wurde aus der Enzymlösung herausgenommen und zweimal mit der Pufferlösung extrahiert.

Probe und Lagerung des RN A-asezylinders:

Der Zylinder wurde in 20 ml einer 1:1 mit Acetatpuffer verdünnten Ribonucleinsäurelösung geprüft. Nach 4 Minuten Inkubationszeit wurde eine aliquote Menge von 4 ml zur Analyse entnommen. Zwischen den Analysen wurde der Zylinder zuerst kräftig mit der Pufferlösung gewaschen und dann in der Pufferlösung bei 5° C gelagert.

Die Resultate dieses Versuchs ergaben eine Anfangsaktivität von 0,040 mg/g Glas. Nach einer Auslaugezeit von etwa 12 Tagen erreichte der Zylinder einen relativ konstanten Aktivitätswert, äquivalent 0,0075 mg RNA-ase pro Gramm Glas. Die Aktivität blieb auf dieser Höhe über 111 Tage lang erhalten.

Die Menge des an das Glas gebundenen Proteins wurde durch Bestimmung der optischen Dichte bei 280 πιμ der Original-Enzymlösung, der zum Binden gebrauchten Lösung und der Extrakte festgestellt. Anfänglich waren 5% des gebundenen Enzyms aktiv. Dieser Wert fiel auf 1,2% nach der Auslaugeperiode.

Beispiel 2

Ein typisches proteolytisches Enzym, Papain, wurde mit folgenden Eigenschaften hergestellt: Mol-Gewicht 21 000, isoelektrischer Punkt: pH 8,75, Aktivität des Präparates: 0,01 Einheiten/mg.

Versuchsbedingungen (modifizierter Kunitzprozeß):

60 Minuten Inkubation bei 4O⁰C in 0,1 Mol Phosphatpuffer, pH 5,8, der 0,005 Mol Cystein und 0,005 Mol Cystein und 0,001 Mol Äthylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) enthielt. Substrat: 1% gekochtes Kasein in Pufferlösung. Fällungsmittel: 5% Trichloressigsäure. Definition der Aktivitätseinheit: Eine Einheit ist äquivalent der Menge an saurem löslichem Peptid, die eine Änderung der Beleuchtungsstärke bei 280 ΐημ von 0,001 pro Minute bewirkt.

Der Träger war ein poröses Glasmuster, nämlich ein Zylinder mit äußerem Durchmesser von 1,2 cm und innerem Durchmesser 1,0 cm, Länge 2,5 cm, Gewicht 1,27 g, Porendurchmesser 68 A, Oberfläche 118m²/g. Das Muster wurde mit Ultraschall in 0,2 n-Salpetersäure bei 80°C gereinigt, in einem Ofen gebracht, die Temperatur langsam auf 100°C gesteigert und bei 100°C eine Stunde gehalten. Das Glas wurde in einen Exsikkator eingesetzt, um mit Wasserdampf vorbehandelt zu werden. Das Glas wurde vor Gebrauch nicht mit Pufferlösung behandelt.

Enzymbindung: Der Glaszylinder wurde in ein Versuchsrohr eingesetzt, das Rohr in ein Bad von 5° C getaucht und 4 ml 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, enthaltend 4 mg Papaiti/1 ml, zugegeben. Das Enzym wurde mit dem Zylinder IV2 Stunden bei 5°C reagieren gelassen. Der Zylinder wurde aus der Enzymlösung herausgenommen und zweimal mit Wasser extrahiert.

Prüfung und Lagerung des Papain-Zylinders: Der Zylinder wurde in 5 ml einer 1 :1 mit Puffer verdünnter Substratlösung, enthaltend 0,005 Mol Cystein und 0,001 Mol Äthylendiamintetraessigsäure, geprobt. Nach 1 Stunde Inkubation wurde eine aliquote Menge von 4 ml zur Analyse entnommen. Zwischen den Analysen wurde der Zylinder mit Wasser extrahiert und dann entweder in Wasser oder in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Äthylendi-

in

amintetraessigsäure bei 5° C gelagert. (Die zur Lagerung verwendete Lösung hatte keinen sichtbaren Einfluß auf die Resultate). Nach einer Auslaugezeit von etwa 16 Tagen erreichten die Zylinder einen relativ konstanten Aktivitätsgrad äquivalent 0,07 mg Papain pro Gramm Glas. Die Aktivität blieb auf diesem Wert über einen Zeitraum von 122 Tagen. Anfänglich waren 90% des gebundenen Enzyms aktiv. Dieser Wert fiel auf 4% nach der Auslaugeperiode.

Beispiel 3

Zur Verwendung kam das Papainenzym von Beispiel 2. Poröses Glasmuster: Zylinder, äußerer Durchmesser 1,2 cm, innerer Durchmesser 1,0 cm, Länge 2,5 cm, Gewicht 1,26 g, Porendurchmesser 68 Ä, Oberfläche ι 118m²/g. Das Muster wurde mit Ultraschall in einer 0,2 η-Salpetersäure bei 80⁰C 1'/2 Stunden gereinigt, in einen Ofen gebracht, die Temperatur langsam auf 180⁰C gesteigert und und bei dieser Temperatur über Nacht gehalten. Das Glas wurde gekühlt und mit Wasserdampf behandelt. Es wurde vor Gebrauch nicht mit Pufferlösungbehandelt.

Enzymbindung: Der Glaszylinder wurde in ein Versuchsrohr eingesetzt, das Versuchsrohr in ein Bad von 5° C eingetaucht und 4 ml eines 0,1 Mol Phosphatpuffers, pH 8,7, enthaltend 1 mg Papain/ml, zugegeben. Das Enzym reagierte mit dem Glas 2 Stunden bei 5° C. Der Zylinder wurde aus der Enzymlösung entnommen und mit pH-8,7-Puffer extrahiert.

Lagerung des Papainzylinders: Zwischen den Analysen wurde der Zylinder in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Äthyldendiamintetraessigsäure, bei Raumtemperatur gelagert.

Der Zylinder behielt eine konstante Aktivitätshöhe, ; äquivalent 0,04 mg Papain pro Gramm Glas. Die Aktivität blieb auf dieser Höhe über einen Zeitraum von 86 Tagen erhalten.

Beispiel 4

Verwendung des Papainenzyms nach Beispiel 2

Poröses Glasmuster: Zylinder, äußerer Durchmesser 1,1cm, innerer Durchmesser 1,0 cm, Länge 3,5 cm, Gewicht 0,8 g, Porendurchmesser 92 A, Oberfläche 60 m²/g. Das Muster wurde mit Ultraschall in einer 0,2 t η-Salpetersäure bei 8O⁰C gereinigt, in einen Ofen gebracht und die Temperatur langsam auf 200⁰C gesteigert. Das Muster wurde bei dieser Temperatur über Nacht gehalten. Das Glas wurde gekühlt und mit Wasserdampf behandelt. Das Muster wurde vor ;■ Gebrauch nicht mit Pufferlösung behandelt.

Enzymbindung: Das Papain wurde an das Glas aus einer 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden. Das Glas wurde mit einer 5 ml Enzymlösung (4 mg Papain/ml) 1 Stunde bei 5°C zur Einwirkung gebracht. , Das Glas wurde 5mal mit Wasser und einmal mit 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Athylendiamintetraessigsäure, extrahien.

Lagerung des Papainzylinders: Zwischen den Analy- m sen wurde der Zylinder in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Athylendiamintetraessigsäure, bei 5"C gelagert.

Der Zylinder wurde 40mal über einen Zeitraum von 82 Tagen geprüft. Nach einer 12-Tage-Auslaugung tr wurde ein relativ konstanter Aktivitätswert, äquivalent 0,08 mg Papain pro Gramm Glas erhalten, der über einen Zeitraum von 70Tagen konstant blieb.

Beispiel 5

Verwendung des Papainenzyms von Beispiel 2

Poröses Glasmuster: Zylinder, äußerer Durchmesser 1,2 cm, innerer Durchmesser 1,0 cm, Länge 2,5 cm, Gewicht 1,3 g, Porendurchmesser 68 Ä, Oberfläche 118m²/g. Das Muster wurde mit Ultraschall in 0,2 η-Salpetersäure bei 80⁰C l'/j Stunden gereinigt, in einen Ofen gebracht, die Temperatur langsam auf 180° C gesteigert und dabei über Nacht gehalten. Das Glas wurde gekühlt und mit Wasserdampf behandelt. Das Muster wurde vor Gebrauch nicht mit Pufferlösung behandelt.

Bindung und Vernetzung des Enzyms: Das Papain wurde an das Glas aus 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, bei 5°C gebunden. Das Glas wurde mit 4 ml einer Lösung, enthaltend 2 mg Papain/ml, 4 Stunden zur Einwirkung gebracht. Das Glas wurde lmal mit Wasser extrahiert. Das an das Glas gebundene Enzym wurde in einer l%igen Formaldehydlösung über Nacht bei 5⁰C vernetzt. Der Zylinder wurde dann 3mal mit Wasser extrahiert und dann lmal mit 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Athylendiamintetraessigsäure, extrahiert.

Lagerung des Papainzylinders: Zwischen den Analysen wurde der Zylinder in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Athylendiamintetraessigsäure, bei 5° C gelagert.

Nach einer Auslaugezeit von 9 Tagen zeigte das Glas eine konstante Aktivitätshöhe äquivalent 0,09 mg Papain/g Glas. Dieser Wert wurde über eine Periode von 48 Tagen aufrechterhalten und schien etwa 1,3mal größer zu sein als der von nicht vernetzten! Papain.

Be i s ρ i el 6
Verwendung des Papainenzyms von Beispiel 2

Fein gefrittetes Glasmuster: Borsilikatglas, vier 20 mm Scheiben mit ebenen Kanten, Gesamtgewicht 4.63 g, Porendurchmesser 50 000 Ä, Oberfläche 0,2 m²/g. Das Muster wurde mit Ultraschall in 0,2 n-Salpetersäure bei 80⁰C IV2 Stunden gereinigt, in einen Ofen gebracht, die Temperatur langsam auf 200⁰C gesteigert und dabei 2 Stunden gehalten. Das Glas wurde gekühlt. Es war nicht mit Pufferlösung oder mit Wasserdampf behandelt.

Enzymbindung: Das Papain wurde an das Glas in 0.1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden. Die vier Glasscheiben wurden mit 5 ml Enzymlösung (0,84 mg Papain/ml) 17 Stunden bei 5°C zur Einwirkung gebracht. Das Glas wurde 2mal mit Pufferlösung unc 2mal mit Wasser extrahiert. Lagerung der Papain-Sehci ben: Zwischen den Analysen wurden die Scheiben in 0,' Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mo Cystein und 0,002 Mol Äthylendiamintetracssigsüun. bei 5^C'C gelagert.

Nach einer Auslaugung wahrend eines Tages zeigt das Glas einen konstanten Wert der Aktivilii äquivalent 0,014 mg Papain/g Glas. Dieser Wen wind über einen Zeitraum vor 8 3 Tagen aufrechterhalten.

Beispiel 7

Verwendung des l'apainen/yms mich Beispiel 2

l'omsi: Glastcilchen einer l'ariikelgmlk von 0,177 1: 0.250 mm, Gewicht 1,0 g, PorendurchiiH'sser 400
Oberfläche 20 nv7g. Das Muster wurde durch Erhitzui auf 625°C in Anwesenheit von Sauerstoff während

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Minuten gereinigt. Es wurde in einem Strom von Oj gekühlt und dann unter verringertem Druck gegen Wasserdampf gleichgestellt. Das Muster wurde vor Gebrauch nicht mit Puffer behandelt.

Enzymbindung: Das Papain wurde an das Glas aus 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden. 1 g Glaspartikel wurde mit 4 ml einer Enzymlösung (4 mg Papain/ml) 70 Stunden bei 5°C zur Einwirkung gebracht. Das Glas wurde 2mal mit Pufferlösung und dann mit Wasser extrahiert. Die Enzymglaspartikeln wurden auf ein Stück Filterpapier übertragen und das Papier mit einem Faden zusammengebunden. Die in Papier eingewickelten Teilchen wurden wie ein »Teebeutel« für die Enzymbestimmung verwendet.

Prüfung und Lagerung der Papainpartikel: Der Beutel ι "> wurde in 15 ml einer 1 : 1 mit Puffer verdünnten Substratlösung (pH 5,8), enthaltend 0,005 Mol Cystein und 0,001 Mol Äthylendiamintetraessigsäure, geprüft. Nach einstündiger Inkubation bei 40⁰C wurden 4 ml aliquote Teile zur Analyse entnommen. Zwischen den >o Analysen wurde der Beutel bei 5°C in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Äthylendiamintetraessigsäure, gelagert.

Nach einer Auslaugung während eines Tages zeigte _>> das Glas einen konstanten Aktivitätswert, äquivalent 0,33 mg Papain/g Glas. Dieser Wert blieb über eine Zeitdauer von 43 Tagen erhalten.

Beispiel 8 _j(>

Verwendung des Papainenzyms nach Beispiel 2

Poröses Kieselerdeglas, gebildet durch Trocknung eines Kieselsäuregelglasstücks von ungleichmäßiger Gestalt, Gewicht 0,793 g, Porendurchmesser 75 Ä, Oberfläche 398 m²/g. Das Muster wurde durch langsame Erhitzung auf 625°C in einem Oj-Strom gereinigt, bei dieser Temperatur 45 Minuten gehalten und dann durch Aufblasen eines O₂-Stromes gekühlt. Das Glas wurde unter vermindertem Druck mit Wasserdampf behandelt. Es wurde vor Gebrauch nicht mit Pufferlösung behandelt.

Enzymbindung: Das Papain wurde an das Glasstück in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden. Das Glas wurde mit 6 ml Enzymlösung (2 mg Papairi/ml) 17 Stunden bei 5°C zur Einwirkung gebracht. Das Glas wurde lmal mit Pufferlösung und lOmal mit Wasser extrahiert.

Prüfung und Lagerung des Papain-Kieselsäuregels'iücks: Das Glasslück wurde in 6 ml eines 1 : 1 pH 5,8 Puffer verdünnten Subsirats, enthaltend 0,005 Mol Cystein und 0,001 Mol Älhylendiamintctraessigsäure, geprüft. Nach einstündiger Inkubation bei 40⁰C wurden 4 ml aliquote Teile zur Analyse entnommen. Zwischen den Analysen wurde das Glasstück bei 5°C in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pll 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Älhylcndiamintctraessigsäure, gelagert.

Nach einer über 6 Tage dauernden Auslaugung /eigie das Glas einen Aklivitätswert, äquivalent etwa 0,055 mg Papain/g Glas.

Be ι s ρ ι e I 4
Verwendung des l'apaincn/.yms nach Beispiel 2

Wollastoiiitmuster: Kin Zylinder, äußerer Durchmesser 0,9 cm, innerer Durchmesser 0,8 cm. Länge 2,5 cm, Gewicht 0,925 g, Porendurchmesser < 150 A bis 4500 A, Oberfläche 0,1 m²/g. Das Muster wurde durch langsames Erwärmen auf 625°C in einem O2-Strom gereinigt, 45 Minuten bei dieser Temperatur gehalten und durch Anblasen eines O₂-Stroms gekühlt. Der Wollastonit wurde unter vermindertem Druck mit Wasserdampf behandelt. Das Muster wurde nicht mit Pufferlösung vor dem Gebrauch behandelt.

Enzymbindung: Das Papain wurde an den Wollastonit in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden. Es wurde mit 4 ml Enzymlösung (2 mg Papain/ml) 17 Stunden bei 5°C zur Einwirkung gebracht. Der Wollastonit wurde lmal mit Pufferlösung und lOmal mit Wasser extrahiert.

Prüfung und Lagerung des Papain-Wollastonitzylinders:

Der Zylinder wurde in 5 ml einer 1 : 1 pH 5,8 Puffer verdünnten Substratlösung, enthalten 0,005 Mol Cystein und 0,001 Mol Äthylendiamintetraessigsäure geprüft. Nach einstündiger Inkubation bei 40⁰C wurde ein 4 ml Muster zur Analyse entommen. Zwischen den Analysen wurde der Zylinder bei 5° C in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 5,8, enthaltend 0,01 Mol Cystein und 0,002 Mol Äthylendiamintetraessigsäure gelagert. Obwohl bei dieser Prüfung die Aktivitätswerte sehr gestreut liegen, ist keine Auslaugezeit ersichtlich. Der Gesamtaktivitätswert über einen Zeitraum von 35 Tagen lag bei 0,11 mg Papain/g Wollastonit.

Beispiel 10

Ein typisches Redox-Enzym, Glukoseoxydase, wurde mit folgenden Eigenschaften hergestellt: Mol-Gewicht 150 000, isoelektrischer Punkt 4,3, Aktivität des Präparates 45,5 μ/mg.

Versuchsbedingungen: Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur in 0,01 Mol Phosphatpufferlösung, pH 7,0, Substrat: 22,4 mg jS-D-Glucose/ml Puffer (Endkonzentration 18 mg/ml). Zur Bestimmung des gebildeten H₂O₂ wurden 2,5 ml aliquote Teile der Reaktionsmischung abgenommen und 0,025 ml einer 1%igen O-Dianisidinlösung in Methanol zugegeben, dann 0,5 ml Peroxydaselösung (0,04 mg/ml).

Bestimmung der Aktivitätseinheit: Eine Einheit ist äquivalent der Produktionsrate von 1 Mikromol H₂O; pro Stunde bei Raumtemperatur. Die gebildete H₂O₂-Menge wird durch Zersetzung in Gegenwart vor Peroxydase und O-Dianisidin bestimmt. Die Oxydation von O-Dianisidin wird durch Steigerung der Beleuchtungsstärke bei 460 ιημ bestimmt.

Poröses Glasmuster: Zylinder, äußerer Durchmesset 1,2 cm, innerer Durchmesser 1,0 cm, Länge 2,5 cm Gewicht 1,3 g, Porendurchmesser 68 A, Oberfläche 118nv7g. Das Muster wurde mit Ultraschall ir O,2n-Salpetersäure bei 80⁰C P/₂ Stunden lang gereinigt. Das Muster wurde in einen Ofen gebracht, die Temperatur langsam auf 180" C gesteigert und bei diesel Temperatur über Nacht gehalten. Das Glas wurde gekühlt und mit 0,01 Mol Phosphatpufferlösung auf pH 7,0 eine Stunde eingestellt.

Enzymbindung: Das Enzym wurde an das (Mas in 0,01 Mol Phosphatpufferlösung. pH 7,0, gebunden. Pci Zylinder wurde mit 4 ml einer Glucoseoxydasclösung (2 mg/ml) 1 Stunde bei 5"C zur Einwirkung gebracht Der Zylinder wurde mit Wasser extrahiert.

Lagerung des Glueoscoxydase-Zylinders: Der Zylinder wurde in 0,01 Mol Phosphatpufferlösung. pl 1 7,0 be Raumtemperatur /wischen den Amilvsen i'd;iL'crl.

Nach einer Auslaugezeit von 3 Tagen hatte der Zylinder einen Aktivitätswert, äquivalent 0,0001 mg Glucoseoxydase.

Beispiel 11

Verwendung des Glucoseoxydaseenzyms
nach Beispiel 10

Poröses Glasmuster einer Partikelgröße von 0,177 bis 0,250 mm, Gewicht 1 g, Porendurchmesser 900 Ä, Oberfläche 20 m²/g. Das Muster wurde bei 625°C in Gegenwart von Sauerstoff 15 Minuten gereinigt. Es wurde in einem Sauerstoffstrom gekühlt, dann unter verringertem Druck mit Wasserdampf behandelt. Das Glas wurde vor Gebrauch nicht mit Pufferlösung behandelt.

Enzymbindung: Die Glucoseoxydase wurde an das Glas in 0,1 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gebunden, 1 g Glaspartikcl wurden mit 4 ml Enzymlösung (5 mg Glucoseoxydase/ml) 70 Stunden bei 5° C zur Einwirkung gebracht. Das Glas wurde 2mal mit Pufferlösung und dann mit Wasser extrahiert. Die Enzymglaspartikeln wurden auf ein Stück Filterpapier übertragen und dann das Filerpapier mit einem Faden zusammengebunden. In Form eines »Teebeutels« wurden die Teilchen zur Enzymbestimmung verwendet.

Prüfung und Lagerung der Glucoseoxydaseteilchen:

20 Der Beutel wurde in 125 ml einer 0,01-Mol-Phosphatpufferlösung, pH 6,95, enthaltend 18 mg Glucose/ml, bei Raumtemperatur geprüft. 2,5 ml aliquote Teile wurden in Abständen von 3 Minuten zur Analyse entnommen. Zwischen den Analysen wurde der Beutel bei 5°C in 0,01 Mol Phosphatpufferlösung, pH 6,95, gelagert.

Während der Anfangslagerzeit von 17 Tagen wurde keine sichtbare Auslaugeperiode beobachtet, und das Glas lieferte einen konstanten Aktivitätswert äquivalent 0,123 mg Glucoseoxydase/g Glas. Am 21. Tag war ein Abfall auf etwa 40% des Aktivitätswertes festzustellen. Dieser Abfall der Aktivität war der Einwirkung von CS> und C^HsOH-Dämpfen auf das Enzym zuzuschreiben. Bei wiederholten Analysen während der nächsten 24 Stunden war ein Wiederaufstieg auf 78% des Originalaktivitätswertes festzustellen. Aktivitätsverluste waren nach weiteren 20 Tagen und 41 Tagen zu beobachten. Nach einer Lagerzeit von 64 Tagen war der Aktivitätswert äquivalent 0,04 mg Glucoseoxydase/g Glas. Bei diesem Punkt zeigte sich ein starker mikrobieller Befall an der Oberfläche des Beutels. Die Aktivitätsverluste sind daher vermutlich auf die Bildung eines Verögerers oder auf einen Abbau des Enzyms durch einen Mikroorganismus zurückzuführen.

Einige Resultate der Beispiele sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt. Die Werte sind verglichen mit einem nichtporösen Glasrohr.

Verhältnis gebundenes Enzym zu Trägerparameter

Träger	Porendurch	Enzym	Oberfläche	mg Enzym
	messer A			gebunden
		(Mol.-Gew.)	(mVg)	an g Keramik
Borsilikatglasrohr	nicht porös	Papain (21 000)	sehr niedrig	0
Beispiel 6	50 000	Papain (21 000)	0,2	0,014
Beispiel 7	900	Papain (21 000)	20	0,33
Beispiel 4	92	Papain (21 000)	60	0,08
Beispiel 2	68	Papain (21 000)	118	0,07
Beispiel U	900	Glucoseoxydase (150 000) Glucoseoxydase	20	0,12
Beispiel 10	68	(150 000)	118	0,0001

Aus den Werten der Tabelle ist folgendes zu ersehen: 1) Entsprechend einer Zunahme der Oberflächengröße des Trägers steigt auch die Menge des gebundenen Enzyms (Papain), bis sich die Porendurchmesser den Molekulargrößen des Enzyms nähern. Bei diesem Punkt ist weniger Oberflächcnbercich des Trägers zur Bindung verfügbar mit einem resultierenden Abfall der Menge des gebundenen Enzyms.

2) Bei einem gegebenen porösen Träger fällt die Menge des gebundenen Enzyms, wenn das Mol-Gewicht des Enzyms steigt, jedoch gibt es einen optimaler Porendurchmesser für ein bestimmtes Enzym, utu dieser Punkt ist erreicht, wenn der Porendurchmcssci äquivalent angenähert der Quadratwurzel des Enzym: ist.

Claims

Patentansprüche:

1. Stabilisiertes Enzympräparat, das im wesentlichen wasserunlöslich und fähig ist, Reaktionen wiederholt ohne Verlust seiner Aktivität zu katalysieren, wobei das Enzym an einen anorganischen Träger mit großer Oberfläche durch Aminosilikat- und Wasserstoffbindungen gekuppelt ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger eine Oberfläche größer als 0,1 m²/g hat und aus einem porösen keramischen Körper, Wollastonit, porösem getrocknetem Kieselsäuregel oder porösem Glas besteht.

2. Stabilisiertes Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym zur Gruppe der Hydrolasen, Redoxenzyme und Transferasen gehört.

3. Stabilisiertes Enzympräparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus Papain besteht und der Träger ein hochporöses Kieselsäueglas mit einem Porendurchmesser von 68-900 A ist.

4. Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten Enzympräparates nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässerige Lösung des Enzyms mit verfügbaren Aminogruppen mit dem anorganischen Träger mit reaktiven Silanolgruppen bei bis zu Raumtemperatur und bei einem solchen pH der Lösung, daß eine Denaturierung des Enzyms vermieden wird, eine zur Bindung des Enzyms an den Träger ausreichende Zeitdauer in Berührung bringt und daß man dann überschüssiges ungebundenes Enzym entfernt.