DE1944418B2 - Verfahren zur herstellung eines stabilisierten in wasser unloeslichen enzympraeparates - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines stabilisierten in wasser unloeslichen enzympraeparates

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Description

Enzym — Z— Silan
gebunden wird, worin Z eine der folgenden Gruppen bezeichnet:
OH S
!I I Il
— C —N-. — N— C-NH-.
O
Il —c—o—c—. —c—o—c—
—C—S—S—C—
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Silankupplungsmittel die allgemeine Formel aufweist
in der Y ein Amino, Carbonyl, Carboxy, Hydroxyphenyl, oder Sulfhydryl, R einen Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy und Halogen bezeichnet und π einen ganzzahligen Wert von 1 bis 3 darstellt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Silankupplungsmittel die allgemeine Formel
(Y'R>SiR4-„
aufweist, in der Y' ein Amino, Carbonyl, Carboxy, Isocyano, Diazo, Isothiocyano, Nitroso, Sulfhydryl oder Halocarbonyl, R einen Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy und Halogen, R' einen Rest der Gruppe niederes Alkyl, niederes Alkylphenyl, und Phenyl bezeichnet und η einen ganzzahligen Wert von 1 bis 3 darstellt.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem siliziumhaUigen Material besteht.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem nicht siüziumhaltigen Metalloxid besteht.
7. Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungsmittel zunächst an den Träger und sodann das Enzym an den Träger-Kupplungsmittel-Komplex gebunden wird.
65 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten, in Wasser unlöslichen Enzympräparates durch Binden eines Enzyms an einen anorganischen Träger.
Es ist bekannt, Enzyme durch Binden an organische Träger zu stabilisieren, d. h. wasserunlöslich zu machen, um sie nach einer Anwendung, z.B. zur Katalyse bestimmter Umsetzungen ohne aufwendige Rückgewinnung und möglichst unter Beibehaltung ihrer enzymetischen Wirkung oder Aktivität erneut und gegebenenfalls wiederholt verwenden zu können. So beschreibt z. B. die niederländische Offenlegungsschrift 67 08 738 die Bindung von Proteinen oder Enzymen an organische Polymere über Amidbindungen, oder das Enzym wird an ein Polyacrylamidgel gebunden (Science, 142, 678 [1963]) oder über Diazobindung an Cellulose-Derivate gekoppelt (Biochem. J., 107,669[1968]).
Organische Träger haben aber schwerwiegende Nachteile. Mikrobenbefall kann die Bindung lösen und das Enzym entstabilisieren oder deaktivieren. Das oft stark ausgeprägte Quellvermögen behindert den Enzymeinsatz in Kolonnen, z. B. in der Chromatographie; Durchlauf und Substratdiffusion können verlangsamt oder gehemmt werden.
Diese Nachteile können durch Verwendung anorganischer Träger zwar vermieden werden, jedoch standen dem bisher nachteilig die geringe stabilisierende Wirkung und Verluste der Aktivität gegenüber. Nach der US-PS 27 17 852 wird z.B. für die Dextroseherstellung Stärke-Glucogenase auf anorganischen Trägern wie Lehm, Silicagel u. dgl. adsorbiert. Jedoch wird durch die bloße physikalische Adsorption eine weniger gute und dauerhafte Stabilisierung erzielt, und auch die Aktivität kann auf die Dauer unbefriedigend sein.
Die DT-OS 19 05681 schlägt demgegenüber zur Verbesserung der Stabilisierung ein Verfahren zur Herstellung stabilisierter, wasserunlöslicher Enzympräparate vor, nach dem ein Enzym mit freien Aminogruppen an einen anorganischen, eine große Oberfläche und reaktive Silanolgruppen aufweisenden Träger durch Amino-Silikat- und Wasserstoffbindungen gekoppelt wird.
Es wurde nun gefunden, daß bei dieser unmittelbaren Kopplung des Enzyms an den Träger offenbar auch die aktiven Enzymstellen besetzt werden können und jedenfalls trotz erzielter höherer Stabilität die Enzymaktivität in vielen Fällen verbesserungsbedürftig ist.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Enzympräparat bereitzustellen, welches unter Beibehaltung der gegenüber organischen Trägern bestehenden Vorteile anorganischer Enzymträger eine verbesserte Stabilität und Aktivität des Enzympräparates erzielt.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren der Erfindung dadurch gelöst, daß das Enzym an einen freie Hydroxyl- oder Oxidgruppen aufweisenden anorganischen Träger vermittels eines Silankupplungsmittels kovalent gebunden wird, wobei der Siliziumteil des Silankupplungsmittels an den Träger und der organische Teil an das Enzym gekoppelt wird.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß diese bisher anorganischen Trägern entgegenstehenden Nachteile durch Zwischenschaltung eines Kupplungsmittels in Form eines Silans beseitigt werden, ohne wesentliche Eigenschaften wie Immunität gegen Mikrobenbefall, Quellungsfreiheit u. dgl. zu verlieren.
Die nach dem Verfahren der Erfindung stabilisierbaren Enzyme sind außerordentlich zahlreich und lassen sich in drei Hauptgruppen einteilen:
Hydrolasen, Redoxenzyme und Transerase-Enzym.
Zu den Hydrolasen gehören
proteolytische Enzyme wie Papaiii, Ficin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bromelin, Keratinase; Carbohydrasen wie Cellulase, Amylase, Maltase, Pectinase, Chitinase;
Esterasen wie Lipase, Cholinesterase, Leckhinase, alkalische und saure Phosphatasen;
Nucleasen wie Ribonuclease, Desoxyribonuclease, und
Amidasen wie Arginase, Asparaginase, Glutaminase und Urease.
Die zweite Gruppe besteht aus Redoxenzymen, die Oxydations- oder Reduktionsreaktionen katalysieren. Zu ihnen gehören Glucoseoxydase, Katalase, Peroxyda- ^e, Lipoxydase und Cytochrom-Reduktase.
Die dritte Gruppe, die Transferaren, übertragen Gruppen von einem Molekül zum anderen. Beispiele hierfür sind Glutaminsäure-pyruvat-transaminase, Glutaminsäure-oxalsäure-iransaminase, Trans-
methylase,Phosphopyruvatransphosphorylase.
Als Träger dienen verfügbare Oxid- oder Hydroxidgruppen aufweisende anorganische Substanzen, die im wesentlichen wasserunlösliche und schwache Säuren oder Basen sind. Sie können nach ihrer chemischen Zusammensetzung in siliziumhaltige Substanzen und nichtsiliziumhaltige Metalloxide eingeteilt werden. Als siliziumhaltiger Träger kommt verzugsweise poröses Glas in Betracht, entweder in Form von Feststoffpartikeln oder als selbsttragendes Stück, wie z.B. als Scheibe oder Zylinder, das abmessungsstabil, leicht sterilisierbar und leicht zu reinigen ist und beispielsweise mit verschiedenen Porendurchmessern nach US-PS 2106 744 oder FR-PS 15 34 990 hergestellt werden kann. Andere geeignete anorganische Träger sind z. B. kolloidale Kieselerde (S1O2), Wollastonit, getrocknetes Silikagel, Bentonit usw.
Typische, nichtsiliziumhaltige Metalloxide sind z.B. Aluminiumoxid, Hydroxyapatit und Nickeloxid. Die in Frage kommenden anorganischen Träger lassen sich entsprechend der folgenden Tabelle zusammenfassen:
Siliziumhaltig
Amorph
Kristallin
Nichtsiliziumhaltige Metalloxide
ÜbergangsmetaHe
MeO saures MeO basisches MeO
Glas
Silikagel
Kieselsäurekolloid
Bentonit
Wollastonit
AI2O3
Hydroxy
Apatit
Die als Kupplungsmittel dienenden Silane sind Moleküle mit zweifacher, verschiedener Reaktivität. Es handelt s.ich um organisch-funktionelle und siliziumfunktionelle Siliziumverbindungen, deren Siliziumteil eine Affinität für anorganische Substanzen, z. B. Glas oder Aluminiumsilikate und deren organischer Teil eine Affinität für organische Verbindungen besitzt. Hauptaufgabe des Kupplungsmittels ist, das Enzym als organische Substanz mit dem Träger als anorganischer Substanz zu kuppeln. Theoretisch ist die mögliche Vielzahl der verwendbaren organisch-funktionellen Silane nur durch die Zahl der bekannten organisch-funktionellen Gruppen und der zur Bindung verfügbaren Stellen am Enzymmolekül begrenzt. Als Kupplungsmittel kommen die zahlreichen Silane der folgenden generellen Formel in Betracht:
(Y'R')/)SiR4-n.
In dieser Formel bezeichnet Y' eine Verbindung der Gruppe Amino, Carbonyl, Carboxy, Isocyano, Diazo, Isothiocyano, Nitroso, Suifhydryl, Halocarbonyl;
R einen Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy, Halo; R' einen Rest der Gruppe niederes Alkyl, niederes Alkylphenyl und Phenyl; und η einen ganzzahligen Wert von 1 bis 3.
Nach weiterer günstiger Ausgestaltung ist das Kupplungsmittel durch die generelle Formel YnSiR4-n gekennzeichnet, in der Y eine Verbindung der Gruppe Amino, Carbonyl, Carboxy, Hydroxyphenyl und Suifhydryl, R ein Rest der Gruppe niederes Alkoxy, Phenoxy und Halo und η ein ganzzahliger Wert 1 bis 3 ist.
Die am leichtesten zugänglichen Kupplungsmittel besitzen die generelle Formel
RCH2CH2CH2-Si(OCH3)3,
in der R eine reaktive organische Gruppe darstellt, die so ausgebildet ist, daß sie der Reaktivität in dem jeweiligen System entspricht. Die möglichen Umsetzungen der organisch-funktionellen Gruppen können dei Fachliteratur entnommen werden und bedürfen dahei keiner näheren Erläuterung.
Einige wichtige typische Bindungen des Kupplungs mittels mit dem Enzym seien beispielhaft aufgeführt:
Art der Bindung
Bindungstyp Struktur der Bindung Reaktive Gruppen
Enzyme		 Kupplungsmittel S
1. Amide O
Il
—C—NH-		 -COOH
-NH2 		-NH2
-COOH		 -NH2 + ClCCl
S
Il
">.. Sulfonamide Il
— N—C—NH-		 -NH,
Fortsetzung Struktur der Bindung Reaktive Gruppen Kupplungsmittel
Bindung'styp Enzyme
OH
I		 -N2 +Cr
-N = N- <) Tyrosin
Histidin
Lysin
3. Azobindung
4. Äther
5. Ester
6. Disulfid
R —O —R
O
Il
—C—O—R
R—S—S—R
Zur Auswahl der optimalen Kupplungsmittel müssen die aktiven Stellen des Enzymmoleküls berücksichtigt werden, die nach Möglichkeit freigehalten werden sollen. Das Kupplungsmittel soll die Enzymaktivität nicht wesentlich beeinträchtigen, z.B. im Falle von Trypsin durch Bindung an die Carboxyl- oder Sulfhydrylgruppe des Enzyms. Auch soll die Bindung bei das Enzym oder den Träger nicht zerstörenden Temperatur- und pH-Werten erfolgen können. Ferner soll die von dem jeweils verwendeten Kupplungsmittel in großem Maße abhängende Art der Bindung unter den Einsatzbedingungen stabil sein.
Die Bindung des Enzyms an den Träger erfolgt als zweistufige Umsetzung. Als erste Stufe wird das Kupplungsmittel an den Träger und als zweite Stufe das Enzym an das bereits mit dem Träger verbundene Kupplungsmittel gebunden. Die Menge des gekuppelten Enzyms hängt offenbar von der zur Umsetzung verfügbaren Oberfläche des Trägers ab. Die Enzymaktivität hängt dabei von nicht zu scharfen Kupplungsbedingungen, nicht dagegen notwendigerweise von der Struktur der aktiven Stellen ab.
Bei der Herstellung des Trägers für die Enzymbindung ist es häufig notwendig, den Träger vorzubehandeln, um verschiedene, z. B. organische Verunreinigungen zu entfernen, die die verfügbaren Oxid- oder Hydroxidgruppen besetzen. Die Art der Reinigung hängt bis zu einem gewissen Grade vom Träger ab. Eine typische Reinigung für poröses Glas ist folgende: Ein poröses Glasmuster wird in einer verdünnten Salpetersäurelösung gereinigt, mit destelliertem Wasser abgespült und in Sauerstoff auf etwa 625° C erhitzt
Beim Einsatz des Kupplungsmittels in Form einer Lösung muß in geeigneter Weise die Umsetzung des silizium-funktionellen Molekülteils erreicht werden, z. B. durch Erhitzen der Lösung auf 60 bis 1400C. Nach bevorzugter Ausgestaltung wird das Silan in Toluol mit einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 Gewichtsprozent gelöst und der Träger mit der Lösung vorzugsweise im Rückfluß erhitzt, wobei das Toluol z. B. 1050C siedet. Die Rückflußdauer beträgt 1 bis 16 Stunden, wobei 4 Stunden in der Regel genügen.
Nach Bindung des Kupplungsmittels an den Träger kann zur Bildung gewünschter Verbindungen der organisch-funktionelle Teil des Silans modifiziert werden. Die meisten Kupplungsmittel sind im Handel erhältlich, andere in bekannter Weise unschwer darstellbar. So kann z.B. das Diazoderivat aus -C-ONa
— COOH
R-SH
-R-X
— R —Oll
R-SH
y-Aminopropyltriäthoxysilan nach Bindung an den Träger durch Umsetzung mit p-Nitrobenzoesäure, Reduktion der Nitrogruppe zum Amin und Diazotierung mit salpetriger Säure hergestellt werden. Bei gleichem Ausgangsmaterial kann z. B. das Isothiocyanoalkylsilanderivat durch Umsetzung der funktionellen Aminogruppe mit Thiophosgen hergestellt werden.
Nunmehr wird das Enzym mit dem organisch-funküonellen Teil des Silans umgesetzt. Zunächst wird das Enzympulver in einem Puffer gelöst und geprüft. Die wässerige Enzymlösung wird dann mit dem behandelten Träger bei einer in der Regel unter Zimmertemperatur liegenden Temperatur in Kontakt gebracht. Besonders bei Proteasen liegt die Kontakttemperatur günstigerweise bei 5°C, da Enzyme bei niedrigeren Temperaturen meist beständiger sind. In einigen Fällen, z. B. Glucoseoxidase, wird eine raschere Kupplung dagegen bei höheren Temperaturen, vorzugsweise Zimmertemperatur, bei einer Kontaktdauer von 1 bis 2 Stunden bevorzugt.
Nach einer Kontaktdauer von etwa 1 bis 72 Stunden ist das Enzym an den Träger gebunden, und ein etwaiger Überschuß wird entfernt. Wichtig dabei ist, den pH-Wert der Lösung in einem die irreversible Denaturierung des Enzyms vermeidenden Bereich zu halten. Die Kupplungsreaktion kann unter Umständen auch einen bestimmten pH-Bereich nötig machen, da z. B. die Azobindung am besten bei pH 8 bis 9 erfolgt Im Falle von Proteasen erfolgt die Kupplung günstigerweise im pH-Bereich niederer Enzymaktivität Anschließend wird das gekuppelte Enzym geprüft und schließlich an der Luft getrocknet, jedoch nicht bis zur Exsiccation, und gelagert. Die Lagerung kann auch in Wasser oder einer gepufferten Lösung bei oder unter Zimmertemperatur erfolgen.
Das erhaltene Produkt ist ein wasserunlösliches, stabilisiertes Enzym mit lang anhaltender, konstanter Aktivität. Bei Lagerung bei 50C, oder selbst bei Zimmertemperatur, selbst für mehrere Monate, wird die konstante Aktivität selbst nach wiederholter Einwirkungen von Prüfbedingungen aufrechterhalten.
An Hand der folgenden Beispiele sei die Erfindunj weiter erläutert
Beispiel 1
Eine Probe von porösem Glaspulver mit 96°y Kieselsäuregehalt (950 Ä ± 50 Ä Porengröße, 16 mV Oberfläche) wurde in HNO3, 0,2 N, bei 8O0C unte
9
ständiger Schallbehandlung wenigstens 3 Stunden lang gewaschen. Das Glas wurde mehrere Male mit destilliertem Wasser durch Abdekantieren nachgewaschen und dann über Nacht in Gegenwart von O2 auf 625° C erhitzt.
Das Glas wurde gekühlt und in eine Flasche mit rundem Boden gegeben. Je 2 g des Glases wurden 100 ml einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthyoxysilan in Toluol zugesetzt. Die Mischung wurde über Nacht im Rücklauf erhitzt und mit Azeton gewaschen. Das Endprodukt wurde an der Luft getrocknet und gelagert. Das erhaltene Derivat (nachfolgend als Aminoalkylsilanderivat bezeichnet) enthielt 0,171 mäq( = milliäquivalente Teile) Silanrückstände/g Glas, ermittelt auf Grund des gesamten Stickstoffgehalts.
Zu 1 g des so behandelten Glases wurde 3.5 ml destilliertes Wasser mit einem Gehalt von 100 mg kristallisiertem Trypsin zugegeben und das Ganze einer Mischung von N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 0,5 ml N, in 0,5 ml Tetrahydrofuran beigegeben und die Umsetzungsteilnehmer über Nacht gerührt. Das Produkt wurde gründlich mit NaHCCb Lösung, 0,001 Mol HCl und destilliertem Wasser gewaschen. Das unlöslich gemachte Trypsin wurde in 0,001 Mol HCl bei 5° C gelagert.
Die Hydrolyse des Benzoyl-Argininäthylesters wurde bei pH 8,1 in 0,1 Mol. Glycin-Lösung vorgenommen. Eine Aktivitätseinheit ist dabei gleich der Hydrolyse von 1 μ-Mol Substrat/Minute bei 25° C und pH 8,1.
Mehrere in dieser Weise hergestellte Proben wurden folgendern"aßen geprüft. 1 g des Glas-Enzympräparates wurde 50 ml Substrat enthaltend 0,08 mg Benzoyl-Argininäthylester/ml Puffer zugegeben. Die Umsetzungsteilnehmer wurden mit einem Magnetrührer bewegt und alle drei Minuten eine Probe entnommen und diese jeweils filtriert unr1 spektralphotornetrisch bei 247 πιμ gemessen. Die durchschnittliche Änderung der optischen Dichte/Minute wurde ermittelt und die Aktivität errechnet.
Drei typische, in der beschriebenen Weise geprüfte Proben enthielten 8,5 bzw. 25,2 bzw. 12 Enzym-Einheiten pro g Glas. Dies entspricht aktivem Enzym in Mikrogramm-Quantitäten. Die gesamte nach diesem Verfahren gekuppelte Enzymmenge betrug 0,437 mg/g Glas, ermittelt nach dem Gesamtstickstoffgehalt.
Beispiel II
2 g des nach Beispiel I hergestellten Aminoalkylsilanderivats von porösem Glas (780 A ± 50 A Porengröße) wurden mit 1 gp-Nilrobenzoesäure versetzt und das Ganze 2 Tage bei Zimmertemperatur in 10%iger Lösung N'-Dicyclohexylcarbodiimid in absolutem Methanol gerührt. Das umgesetzte Material wurde gründlich in Methanol gewaschen, 500 ml destilliertes Wasser enthaltend 5 g Nalriumdithionit zugegeben und 30 Minuten gewaschen. Das p-Aminobenzoesäureamid des Aminoalkylsilanglases (nachfolgend als Aminoarylsilanderivat bezeichnet) wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, mit Azeton nachgewaschen und an der Luft getrocknet
Das Aminoarylsilan wurde in HCl, 0,1 N, durch Zusatz eines Überschusses von festem NaNCh bei 00C diazotiert. t g des Produkt? (nachfolgend als Diazoarylsilan bezeichnet) wurde 14 mg kristallisiertes Trypsin in 50 ml NaHCOj Lösung zugesetzt und bei 50C über Nacht weiter umgesetzt. Anschließend wurde das chemisch gebundene Trypsin in NaHCCb-Lösung und destilliertem Wasser gewaschen.
Die Proben wurden im wesentlichen in der im Beispiel I beschriebenen Weise geprüft, nur enthielt das Substrat 0,08 mg Benzoyl-Argininäthylester/ml, gelöst in 0,07 Mol Phosphatpuffer, auf pH 7 eingestellt. Das chemisch gekuppelte Trypsin enthielt das Äquivalent von 0,189 mg aktives Enzym/g Glas. Die gebundene Enzymaktivität betrug 3,2% des eingesetzten Trypsins.
Eine Säule wurde bereitet und mit 1 g des chemisch gekuppelten Trypsins gefüllt. Der Durchmesser der gepackten Säule betrug 1 cm, die Länge 5 cm. Das Substrat — 0,08 mg/ml Benzoyl-Argininäthylester, gelöst in 0,07 Mol Phosphatpuffer, pH 7 — wurde durch die Säule mit einem Durchsatz von 0,5 ml/Min, geführt, mit einer 90%igen Umwandlung des Substrats in das Produkt. Der Betrieb der Säule war kontinuierlich bei 23° ± 1 ° C, und das Produkt wurde ebenfalls kontinuierlich bei 253 ιτιμ in einer 1 cm Durchflußzelle gemessen. Zum Nachweis der Zeitstabilität des chemisch gekuppelten Trypsins im Vergleich zum freien (nicht gekuppelten) Trypsin diente ein Vergleichsversuch bei 230C Krist Trypsin mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml wurde in 0,07 Mol Phosphatpufferlösung gegeben. In Abständen wurden 0,05 ml Proben entnommen, 3 ml Substrat zugesetzt und auf Aktivität geprüft.
Die Vergleichsergebnisse für freies und chemisch gekuppeltes Enzym (% Aktivität als Zeitfunktion bei Zimmertemperatur) sind der graphischen Darstellung der F i g. 1 zu entnehmen. Für das freie Enzym wurden dabei die Aktivitätswerte als % der ursprünglichen Aktivität des gelösten Enzyms abgetragen. In weniger als 2 Stunden war die gesamte Enzymaktivität durch Autohydrolyse des freien Trypsins zerstört. Die ursprüngliche Umwandlungsrate des chemisch gekuppelten Enzyms wurde willkürlich auf 100% Aktivität festgesetzt Kein Aktivitätsverlust konnte nach 154 Stunden ständiger Prüfung festgestellt werden. Danach setzte ein geringer Aktivitätsverlust ein, jedoch bestand erhebliche Aktivität noch nach 397 Stunden.
Beispiel 111
10 g des nach dem Beispiel II hergestellten Aminoalkylsilanderivats wurden 100 ml 10% Thiophosgen in Chloroform zugesetzt und mehrere Stunden im Rücklauf erhitzt. Das Produkt wurde gründlich in Chloroform zur Entfernung der Thiophosgenrückstände gewaschen. Das Isothiocyanoalkylsilanderivat wurde an der Luft getrocknet und sofort nach der Synthese zur Kupplung an Trypsin eingesetzt 2 g des Derivats wurden 50 ml NaHCCh-Lösung pH 9, enthaltend 100 mg Trypsin zugesetzt, das Ganze 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und danr gründlich in destilliertem Wasser gewaschen. Da: Produkt wurde in destilliertem Wasser bei 5° C bis zurr Gebrauch gelagert Das chemisch gekuppelte Trypsii enthielt 2,1 mg Protein, ermittelt nach den Gesamtstickstoffgehalt
Das Substrat bestand aus durch Wärme denaturier tem Kasein mit einer Konzentration von 5 g/l in 0,1 Mc Phosphatpuffer, pH 7. Ig des gekuppelten Enzym wurde 50 ml des Substrats zugesetzt Die Mischun wurde ständig gerührt Alle 60 Sek. wurden Probe entnommen und einem gleichen Volumen 10%ige Trichloressigsäure (TCE) zugesetzt Die Ausfällun wurde nach 15 Minuten abfiltriert und das Filtn spektralphotometrisch mit einem in der gleichen Weis behandelten Substrat verglichen. Das erhaltene Enzyn Giasprodukt enthielt 0,12 mg aktives Enzym/g Glas.
609508/4
9
Beispiel IV
Das Diazoarylsilanderivat von Glas wurde entsprechend dem Beispiel II hergestellt. Das Enzym wurde durch eine Azokupplung in einer l°/oigen Lösung von rohem Papain gekuppelt und das gekuppelte Glas-Enzym sodann 100 ml 1% Kasein enthaltend 61,5 mg Cystein und 32 mg Dinatriumäthylendiamintetraazetat in 0,1 Mol Phosphatpuffer, pH 6,9, zugesetzt. Während der Prüfung wurden 4 ml aliquote Teile entnommen, 4 ml Trichloressigsäure zugesetzt, zentrifugiert und bei 280 ιτιμ gemessen. Die optischen Dichten wurden mit einer TCE ausgefällten Probe des Substrats vor Kontakt mit dem Enzym verglichen. Das chemisch gekuppelte Papain enthielt 2,55 mg aktives Enzym/g Glas.
Zum Nachweis der Wärmestabilität des gebundenen Papains wurde der folgende Versuch vorgenommen.
1 g des chemisch gekuppelten Papainpräparats wurde in eine Säule gegossen und aliquote Teile des Elutionsguts ständig geprüft. Das Substrat bestand aus 3% Kasein in 0,1 Mol Phosphatpuffer, pH 6,9. Während des ganzen Versuchs wurde die Säulentemperatur auf 880C gehalten. Der Durchsatz wurde auf 2,8 ml/Min, eingestellt. Das Substrat wurde kontinuierlich durch die Säule geleitet und aliquote Teile für die Prüfung durch Trichloressigsäure-Ausfällung gesammelt. Der anfangs erhaltene Grad der Hydrolyse wurde als prozentualer Wert der Anfangsaktivität abgetragen.
Durch Lösen von 50 mg in 100 ml Puffer wurde ein freies Enzym hergestellt und die Lösung auf 880C gehalten. Aliquote Teile wurden entnommen, in bekannter Weise geprüft und 2h prozentualer Wert Her Ausgangsaktivität des Enzyms vor Wärmeeinwirkung abgetragen.
Die Fig.2 zeigt die graphische Darstellung der Ergebnisse bei hoher Temperatur (880C), und zwar die prozentuale Aktivität des freien Enzyms und des chemisch gekuppelten Enzyms als Zeitfunktion. Das freie Enzym verlor seine Aktivität sofort und war nach 30 Min. völlig inaktiv. Demgegenüber zeigte das chemisch gekuppelte Papain keine Abnahme der Enzymaktivität nach 80 Minuten, ein klarer Beweis der verbesserten Wärmebeständigkeit.
Beispiel V
Ein Nickelsieb mit einer Siebweite von 150 mesh, 0,1 mm äußerer Durchmesser, wurde in Streifen von 2,54 χ 12,7 cm geschnitten. Die Streifen wurden zu Zylindern mit einer lichten Weite von etwa 1,25 cm gerollt und festgeschweißt und zunächst 2 Stunden in einem auf 7000C erhitzten Ofen mit einer Sauerstoffatmosphäre gebracht, um eine NiO-Schicht zu bilden.
Die mit NiO überzogenen Siebe wurden dann über Nacht in 10%iger Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Toluol im Rücklauf erhitzt. Das Aminoalkylsilanderivat wurde in Azeton gewaschen und getrocknet Die Siebe wurden über Nacht in 10% Thiophosgen in Chloroform im Rücklauf erhitzt. Das Isothiocyanoalkylsilanderivat wurde mit Chloroform gewaschen und sofort an Glucoseoxidase gekuppelt Das Derivat wurde einer l°/oigen Lösung von Glucoseoxidase in 0,1 Mol NaHCOa, pH 9, zugesetzt und auf Zimmertemperatur gehalten. Das Ganze wurde 2 bis 3 Stunden gerührt, mit destilliertem Wasser gewaschen, und das mit NiO überzogene Sieb mit dem chemisch gekuppelten Enzym bei 5° C in destilliertem Wasser gelagert
Die Enzymaktivität des Produkts wurde als μg Enzymaktivität im Vergleich zur Aktivität bekannter
45 Mengen des lösbaren Enzyms gemessen. In allen Versuchen wurde als Substrat D-Glucoseanhydrid (Dextrose) im Konzentrationsbereich von 0,00055 bis 0,055 Mol, gelöst in 0,01 Mol Phosphat, pH 6, verwendet.
Die freie Enzymprobe wurde durch Zusatz einer aliquoten Menge von 0,5 ml, enthaltend 250 μg gereinigter Glucoseoxidase, zu 50 ml Substrat, enthaltend ^ig/ml Meerrettichperoxidase und 0,0005% o-Dianisidin geprüft. Die Reagenzien wurden im Magnetrührer bewegt. Zunächst wurde zur Kontrolle eine 2-ml-Probe entnommen. Sodann wurden in 1 minutigen Abständen für insgesamt 5 Minuten 2-ml-Proben entnommen und in einen Tropfen HCl14 N1 in 0,5 ml destilliertem Wasser enthaltende Reagenzgläser gegeben. Die Lösung wurde spektralphotometrisch bei 460 ΐημ gemessen. Die Versuchstemperatur betrug 23° C.
Das mit NiO überzogene Sieb mit dem chemisch gekuppelten Enzym wurde in entsprechender Weise geprüft, wobei jedoch äquivalente Mengen Peroxidase und o-Dianisidin in 0,5 ml Volumenanteilen in die Reagenzgläser gegeben wurden, um eine Adsorption des o-Dianisidins auf dem Sieb zu verhindern, jedes Reagenzglas wurde zur Entwicklung des Ansatzes vor Zusatz der HCl 1 bis 3 Minuten stehengelassen.
A. Zeitstabilitätsversuch
Proben des chemisch gekuppelten Enzyms wurden bei 4°C gelagert und während einer 6 Monate währenden Versuchsdauer geprüft. Die folgende Tabelle verzeichnet die Ergebnisse.
Prüfung
tnzymakiivitäl
% der Äusgangsaktivität
Beginn 375 —
Nach 7 Tagen 375 100
Nach 14 Tagen 300 80
Nach 21 Tagen 225 60
Nach 28 Tagen 225 60
Nach 128 Tagen 225 53
Die Versuche zeigen deutlich die langanhaltende Stabilität des gekuppelten Enzyms.
B. Wärmestabilitätsversuch
Die Fig.3 zeigt die thermische Stabilität der chemisch gekuppelten Glucoseoxidase im Vergleich zum freien Enzym. Das gebundene Enzym wurde zu 50 ml Substrat bei der gewünschten Temperatur zugesetzt und geprüft. Nach der Prüfung wurde die Probe bei der nächsthöheren Temperatur geprüft Durch dieses Vergeben wird die Einwirkungsdauer dei höheren Temperaturen akkumuliert. Infolgedesser kann der tatsächliche Aktivitätsunterschied (basierenc auf μg des aktiven, gebundenen Enzyms) zwischen den freien und dem gebundenen Enzym größer sein. Die Ergebnisse sind also als Mindestwerte aufzufassen.
Für das chemisch gekuppelte Enzym ist also eine verbesserte Wärmebeständigkeit erreicht. Bei 33° C is sogar eine Aktivitätszunahme des gebundenen Enzym festzustellen, während die Aktivität des freien Enzym: abgenommen hat Zur Annäherung an den Aktivitäts wert des chemisch gekuppelten Enzyms wurde ein freie Enzym mit 480 μg Glucoseoxidase verwendet Da gelöste Enzym einer Temperatur von 23° C wurde de erwärmten Pufferlösung bei jeder der angegebene! Temperaturen zugesetzt Die Aktivität sank sofort nacl Einwirkung zunehmender Temperaturen.
11
<*■** *t ι ο
Die Ergebnisse zeigen also klar die verbesserte Wärmebeständigkeit des chemisch gekuppelten Enzyms (Glucoseoxidase) im Vergleich zum freien Enzym.
Beispiele VI bis XVIII
Es wurde im wesentlichen nach den Beispielen II und III vorgegangen, um verschiedene Enzyme mit einer Reihe von typischen anorganischen Trägern zu kuppeln. In der folgenden Tabelle ist das Ausgangsmaterial,
insbesondere das Enzym, der Träger, und di Kupplungsmittel in den Spalten 2, 3 und 4 verzeichne Das Kupplungsmittel ist mit großen Buchstabe angegeben, wobei B das Diazoarylsilanderivat (wie ii Beispiel II näher erläutert) und C das lsothiocyanoalky silanderivat (vgl. Beispiel III) bezeichnet. Die Aktivität; werte der chemisch gekuppelten Enzyme sind b Verwendung des Substrats der Spalte 5 in der Spalte wiedergegeben.
Beispiel Gekuppeltes Enzym
Anorganischer Träger Kupplungs- Substrat
mittel
Probenaktivität mg/g
VI Papain
VII alkalische Protease
VIII Ficin
IX Ficin
X Urease
XI alkalische Phosphate
XII Glucose-Oxidase
XIII Glucose-Oxidase
XIV Glucose-Oxidase
XV Glucose-Oxidase:
XVI Glucose-Oxidase
XVII Peroxidase
XVIII Peroxidase
poröses Glas kolloidale Kieselsäure poröses Glas poröses Glas poröses Glas poröses Glas poröses Glas poröses Glas kolloidale Kieselsäure Aluminiumoxid Hydroxyapatit poröses Glas Nickeloxid
C Kasein 1,5
C Kasein 92,0
B Kasein 0,9
C Kasein 2,7
B Hai nstoff 1,0
i> p-Nitrophenylphosphat 0,7
B Dextrose 10,1
C Dextrose 11,8
C Dextrose 24,0
C Dextrose 6,0
C Dextrose 10,7
B Wasserstoffperoxid 1,0
C Wasserstoffperoxid 0,5
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen
7

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten, in Wasser unlöslichen Enzympräparates durch Binden eines Enzyms an einen anorganischen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym an einen freie Hydroxyl- oder Oxidgruppen aufweisenden anorganischen Träger vermittels eines Silankupplungsmittels kovalent gebunden wird, ι ο wobei der Siliziumteil des Silankupplungsmittels an den Träger und der organische Teil an das Enzym gekoppelt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Silan an das Enzym entsprechend der Formel
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Families Citing this family (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE31006E (en) * 1968-09-24 1982-08-03 Akzona Incorporated Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other
GB1265818A (de) * 1969-03-19 1972-03-08
US3669841A (en) * 1970-02-11 1972-06-13 Monsanto Co Attachment of enzymes to siliceous materials
US3715278A (en) * 1970-02-11 1973-02-06 Monsanto Co Enzyme-polymer product attached to surface of siliceous materials thereof
US3957748A (en) * 1971-07-30 1976-05-18 Corning Glass Works Nicotinamide-adenine-dinucleotide chemically coupled to water-insoluble carriers
US4152210A (en) * 1971-08-27 1979-05-01 Beecham Group Limited Biologically active materials attached to a ferromagnetic support
US3886080A (en) * 1972-02-17 1975-05-27 Corning Glass Works Chelating agents coupled to inorganic carriers and method of preparing
US4025667A (en) * 1972-02-17 1977-05-24 Corning Glass Works Enzyme carriers
US3928143A (en) * 1972-02-23 1975-12-23 Robert W Coughlin Method of carrying out enzyme-catalyzed reactions
US4016293A (en) * 1972-02-23 1977-04-05 Coughlin Robert W Method of carrying out enzyme catalyzed reactions
LU65729A1 (de) * 1972-07-14 1974-01-21
US3850751A (en) * 1973-02-16 1974-11-26 Corning Glass Works Enzymes immobilized on porous inorganic support materials
US3959078A (en) * 1973-05-18 1976-05-25 Midwest Research Institute Enzyme immobilization with a thermochemical-photochemical bifunctional agent
US3849254A (en) * 1973-05-31 1974-11-19 Univ Virginia Process for effecting enzymatic reactions in aerosols
US3902970A (en) * 1973-07-30 1975-09-02 Leeds & Northrup Co Flow-through amperometric measuring system and method
US4052010A (en) * 1974-03-01 1977-10-04 Corning Glass Works Suspendable porous glass particles
US3933997A (en) * 1974-03-01 1976-01-20 Corning Glass Works Solid phase radioimmunoassay of digoxin
US3975511A (en) * 1974-03-01 1976-08-17 Corning Glass Works Solid phase radioimmunoassay
US4048018A (en) * 1974-08-05 1977-09-13 Coughlin Robert W Method of carrying out enzyme catalyzed reactions
US4034073A (en) * 1975-03-28 1977-07-05 Corning Glass Works Composite for biased solid phase radioimmunoassay of triiodothyronine and thyroxine
JPS5218892A (en) * 1975-08-04 1977-02-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Process for preparing 5'-ribonucleotides
US4102746A (en) * 1975-08-29 1978-07-25 Amerace Corporation Immobilized proteins
USRE32696E (en) * 1975-09-04 1988-06-14 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for determination of antigens and antibodies
CA1083508A (fr) * 1975-11-13 1980-08-12 Jacques Grange Supports porteurs de chaines laterales, procedes d'obtention de ces supports, procedes de fixation de composes organiques comportant un residu glucidique sur lesdits supports, produits et reactifs resultant de ladite fixation chimique
US4071409A (en) * 1976-05-20 1978-01-31 Corning Glass Works Immobilization of proteins on inorganic support materials
US4072566A (en) * 1976-09-27 1978-02-07 Corning Glass Works Immobilized biologically active proteins
DE2726188C2 (de) * 1977-06-10 1979-05-10 Kali-Chemie Ag, 3000 Hannover Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparats
US4206286A (en) * 1977-11-14 1980-06-03 Technicon Instruments Corporation Immobilization of proteins on inorganic supports
US4204040A (en) * 1977-11-18 1980-05-20 Technicon Instruments Corporation Copolymerization of proteins on an inorganic support
DE2758507C3 (de) * 1977-12-28 1981-05-27 Byk-Mallinckrodt Chemische Produkte Gmbh, 6057 Dietzenbach Stabilisierte biochemische Präparate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US4176006A (en) * 1978-01-13 1979-11-27 Redpath Sugars Limited Enzyme immobilization with a disulphide bridge
DE2963866D1 (en) * 1978-02-16 1982-11-25 Rhone Poulenc Spec Chim Support-enzyme complexes and method for preparing them
JPS54113492A (en) * 1978-02-24 1979-09-05 Sanyo Chem Ind Ltd Preparation of glucoprotein derivative
DE2821890A1 (de) * 1978-05-19 1979-11-22 Dynamit Nobel Ag Verfahren zur regenerierung von enzym-immobilisaten
US4218363A (en) * 1978-10-16 1980-08-19 Uop Inc. Preparation of support matrices for immobilized enzymes
US4229536A (en) * 1978-12-28 1980-10-21 Uop Inc. Process for preparing immobilized enzymes
US4430348A (en) 1980-01-29 1984-02-07 Miller Brewing Company Immobilized glucoamylase reactor for preparing a low calorie beer
EP0035883B1 (de) * 1980-03-08 1984-06-06 Fuji Oil Company, Limited Verfahren zur enzymatischen Zwischenveresterung von Fett und hierzu verwendetes Enzym
US4506015A (en) * 1980-05-08 1985-03-19 Borden Company Limited Multi-layer immobilized enzyme compositions
CA1130228A (en) * 1980-05-21 1982-08-24 Chiang-Chang Liao Support matrix for amino-containing biologically active substances
US4363634A (en) * 1980-07-18 1982-12-14 Akzona Incorporated Glass support coated with synthetic polymer for bioprocess
US4432877A (en) * 1981-10-19 1984-02-21 New England Nuclear Corporation Organo-mercurial materials
SE8200442L (sv) * 1982-01-27 1983-07-28 Forsvarets Forsknings Forfarande vid detektion av organiska molekyler, sasom biomolekyler
DE3223101A1 (de) * 1982-06-21 1983-12-22 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V., 8000 München Stabilisierte biochemische suspensionspraeparate
US4530963A (en) * 1982-08-20 1985-07-23 Devoe-Holbein International, N.V. Insoluble chelating compositions
FI85284C (fi) * 1982-10-06 1992-03-25 Novo Nordisk As Foerfarande foer framstaellning av ett immobiliserat enzympreparat med hjaelp av ett tvaerbindningsmedel.
US4679562A (en) * 1983-02-16 1987-07-14 Cardiac Pacemakers, Inc. Glucose sensor
DK317483D0 (da) * 1983-07-08 1983-07-08 Superfos As Immobiliseret enzympraeparat og fremgangsmade til fremstilling deraf
EP0137601B1 (de) * 1983-10-13 1989-10-25 Corning Glass Works Enzymatische Synthese von Gallussäure-Estern
US4632904A (en) * 1983-12-27 1986-12-30 Ciba Corning Diagnostics Corp. Immobilized enzyme composites having carriers derivatized with an organotitanate
US4522724A (en) * 1984-03-02 1985-06-11 J. T. Baker Chemical Company Diazonium affinity matrixes
US4683203A (en) * 1984-04-14 1987-07-28 Redco N.V. Immobilized enzymes, processes for preparing same, and use thereof
FR2573772B1 (fr) * 1984-11-23 1987-03-20 Sucre Rech & Dev Enzyme invertase insolubilisee a haute activite specifique, son procede d'obtention et procede utilisant cet enzyme
US4748121A (en) * 1984-11-30 1988-05-31 Ppg Industries, Inc. Porous glass fibers with immobilized biochemically active material
CH663728A5 (fr) * 1985-06-10 1988-01-15 Battelle Memorial Institute Procede de purification de substances bioactives par adsorption biospecifique.
EP0216730B1 (de) * 1985-08-12 1991-01-23 Battelle Memorial Institute Poröse Filtrierungsglaskugeln und Methode zu deren Herstellung
US5037749A (en) * 1986-07-08 1991-08-06 Protein Foods Group Inc. Porous immobilization support prepared from animal bone
IT1223319B (it) * 1987-10-23 1990-09-19 Eniricerche Spa Procedimento per la immobilizzazione chimica di sostanze biologicamente attive su silice
US5043288A (en) * 1988-06-20 1991-08-27 Motsenbocker Marvin A Immobilize molecular binding partners to contact activating supports
US5137765A (en) * 1988-08-05 1992-08-11 Porton Instruments, Inc. Derivatized glass supports for peptide and protein sequencing
US5431160A (en) * 1989-07-19 1995-07-11 University Of New Mexico Miniature implantable refillable glucose sensor and material therefor
US5288619A (en) * 1989-12-18 1994-02-22 Kraft General Foods, Inc. Enzymatic method for preparing transesterified oils
IE914007A1 (en) * 1990-11-19 1992-05-20 Univ Illinois A protein being genetically engineered to provide¹orientability and a substrate having an oriented layer of¹proteins
US5643721A (en) * 1994-02-09 1997-07-01 Abbott Laboratories Bioreagent immobilization medium
JP2862509B2 (ja) * 1996-05-28 1999-03-03 東洋電化工業株式会社 リパーゼ固定化用担体及び固定化リパーゼ
US6730144B2 (en) * 1996-07-25 2004-05-04 Nikki - Universal Co., Ltd. Air purifying filter using modified enzymes
CN1087961C (zh) * 1996-07-25 2002-07-24 日挥通用株式会社 空气净化过滤器
US6013855A (en) * 1996-08-06 2000-01-11 United States Surgical Grafting of biocompatible hydrophilic polymers onto inorganic and metal surfaces
DE59808721D1 (de) * 1997-11-24 2003-07-17 Efmt Entwicklungs Und Forschun Verfahren zur immobilisierung von mediatormolekülen auf anorganischen und metallischen implantatmaterialien
CA2243230A1 (en) * 1998-07-15 2000-01-15 Aled Edwards A device and method for the determination of protein domain boundaries
US6306665B1 (en) 1999-10-13 2001-10-23 A-Fem Medical Corporation Covalent bonding of molecules to an activated solid phase material
US6987079B2 (en) 2001-08-14 2006-01-17 W.R. Grace & Co.-Conn. Supported catalyst systems
US6812268B2 (en) * 2001-11-01 2004-11-02 Science Applications International Corporation Methods for material fabrication utilizing the polymerization of nanoparticles
US7267971B2 (en) * 2003-03-25 2007-09-11 Council Of Scientific And Industrial Research Process for preparation of thermostable enzyme
JP4740598B2 (ja) * 2003-03-28 2011-08-03 カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ 熱安定酵素の製造方法
WO2007050100A2 (en) * 2004-11-24 2007-05-03 Industrial Science & Technology Network, Inc. Immobilized enzymes and processes for preparing and using same
US20070055013A1 (en) * 2005-02-21 2007-03-08 Noriho Kamiya Substrate and method of immobilizing protein
EP2092076A4 (de) 2006-11-13 2011-01-05 Ateris Technologies Llc Biomarker für pestizide
US9828597B2 (en) 2006-11-22 2017-11-28 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Biofunctional materials
WO2009003111A2 (en) * 2007-06-27 2008-12-31 H R D Corporation High shear process for dextrose production
US8603339B2 (en) 2007-08-28 2013-12-10 Diamond Engineering Co., Ltd. Activated sludge material, method for reducing excess sludge production in bioreactor, and method of controlling bioreactor
US20110218365A1 (en) * 2008-09-05 2011-09-08 Cobalt Technologies, Inc. Engineered light-emitting reporter genes and methods of use
NZ727087A (en) * 2009-05-20 2018-06-29 Xyleco Inc Bioprocessing
RU2011153546A (ru) 2009-06-26 2013-08-10 Кобальт Текнолоджиз, Инк. Способ и комплексная система для получения биопродукта
US9121016B2 (en) 2011-09-09 2015-09-01 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Coatings containing polymer modified enzyme for stable self-cleaning of organic stains
US9388370B2 (en) 2010-06-21 2016-07-12 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Thermolysin-like protease for cleaning insect body stains
US8796009B2 (en) 2010-06-21 2014-08-05 Toyota Motor Engineering & Manufacturing North America, Inc. Clearcoat containing thermolysin-like protease from Bacillus stearothermophilus for cleaning of insect body stains
US10988714B2 (en) 2010-06-21 2021-04-27 Regents Of The University Of Minnesota Methods of facilitating removal of a fingerprint from a substrate or a coating
US11015149B2 (en) 2010-06-21 2021-05-25 Toyota Motor Corporation Methods of facilitating removal of a fingerprint
JP5840004B2 (ja) * 2012-01-23 2016-01-06 株式会社ワイビーエム 有機性汚水の浄化方法とその装置
PL3196315T3 (pl) 2016-01-19 2020-07-13 Oritest Spol. S R.O. Kuliste pelety, proces produkcyjny takich peletów, zastosowanie oraz rurka detekcyjna zawierająca takie pelety
US20210285974A1 (en) * 2016-10-28 2021-09-16 University Of Washington Rapid polymerization of polyphenols
EP4019627A1 (de) 2020-12-28 2022-06-29 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Neue enzyme und verfahren für benzoesäurebezogene stoffwechselwege
CN112772707B (zh) * 2020-12-31 2023-11-21 安徽苗员外农业有限公司 一种用于鳜鱼气泡解冻的解冻保护液及其制备方法和应用
CN112715868B (zh) * 2020-12-31 2024-02-20 安徽苗员外农业有限公司 一种臭鳜鱼发酵方法
IL304099A (en) 2020-12-31 2023-08-01 Paleo B V A meat substitute containing animal myoglobin
EP4032900A1 (de) 2021-01-21 2022-07-27 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Neue enzyme und verfahren für vanillesäurebezogene stoffwechselwege
MX2024004635A (es) 2021-10-21 2024-04-30 Givaudan Sa Metodos y enzimas mejorados.
EP4278900B1 (de) 2022-06-29 2024-07-24 Paleo B.V. Verfahren zur herstellung eines haustierfuttermittels
WO2024100067A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Paleo B.V. Dairy product or replica thereof supplemented with heme-comprising protein

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2717852A (en) * 1949-08-18 1955-09-13 Wallerstein Co Inc Method of making dextrose using starch-glucogenase
US2712852A (en) * 1951-07-21 1955-07-12 Black Clawson Co Cutter unit for slitting machines
NL6708738A (de) * 1966-06-24 1967-12-27

Also Published As

Publication number Publication date
DE1944418C3 (de) 1985-07-11
DK120432B (da) 1971-06-01
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NL146833B (nl) 1975-08-15
CA945921A (en) 1974-04-23
JPS5615231B1 (de) 1981-04-09
US3519538A (en) 1970-07-07
DE1944418A1 (de) 1970-04-23

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