NO127241B

NO127241B -

Info

Publication number: NO127241B
Application number: NO03506/69A
Authority: NO
Inventors: Ralph Allan Messing; Howard Hayyin Weetall
Original assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1968-09-05
Filing date: 1969-09-02
Publication date: 1973-05-28
Also published as: SE359842B; GB1283958A; DK120432B; CA945921A; FR2020527A1; NL146833B; US3519538A; NL6913499A; JPS5615231B1; DE1944418C3; DE1944418B2; BE738493A; JPS5532357B1; DE1944418A1

Description

Vannuoppløselig enzymraateriale og

fremgangsmåte til dets fremstilling.

Foreliggende oppfinnelse angår et vannuoppløselig enzymmate-

riale omfattende et enzym koblet til en uorganisk bærer med tilgjenge-

lige hydroksyl- eller oksydgrupper, og oppfinnelsen vedrører dessuten en fremgangsmåte til fremstilling av et slikt vannuoppløselig enzymmateriale.

Et enzym betraktes vanligvis som en biologisk katalysator som

er istand til å starte, fremme og.styre en kjemisk reaksjon uten å

bli forbrukt i selve fremgangsmåten eller bli en del av de fremstilte produkter. Enzymer syntetiseres av planter, dyr, visse typer virus og mikroorganismer. Alle hittil kjente enzymer har vist seg å være proteiner, dvs. peptidpolymere av aminosyrer. Et enzym kan inneholde en prostetisk gruppe, slik som flavinadenin-dinucleotid, porfyrin, di-

fosforpyridin-nucleotid, etc. De fleste enzymer er makromolekyler, dvs. med molekylvekt på mer enn 6000.

Enzymenes spesifisitet, og deres evne til å katalysere reaksjoner hvor reaktantene opptrer i meget lave konsentrasjoner, har vært av spesiell interesse ved kjemiske analyser. Enzymkatalyserte reaksjoner har tildels vært..anvendt for kvalitative og kvantitative bestemmelser av substrater, aktivatorer, inhibitorer eller hemmende forbindelser, foruten av selve enzymene. Inntil nylig har selve ulempene ved anvendelsen av enzymene i meget høy grad begrenset deres anvendbarhet. En av ulempene ved enzymene er deres ustabilitet, ettersom de meget lett påvirkes yed alle de betingelser som normalt denaturerer proteiner,dvs. høye temperaturer, konsentrasjonsforand-ringer, pH-forandringer, mikrobielle angrep og autohydrolyse. Videre har de store omkostninger ved enzymfremstillinger i industriell skala gjort det upraktisk og dels umulig å anvende dem ved vanlige kjemiske analyser.

Det har vært gjort en rekke forsøk på å-fremstille enzymer i en ubevegeliggjort form uten tap av aktivitet, slik at.en prøve, kunne brukes kontinuerlig i mange timer. De ubevegeliggjorte enzymer utfører med meget stor nøyaktighet alle de ting som et vanlig løselig enzym, dvs. at de kan brukes for å bestemme konsentrasjonen av et substrat, av en enzymhemmende forbindelse eller av en enzymaktivator. Disse ubevegeliggjorte enzymer har blitt fremstilt ved fysisk å inn-fange enzymene i en stivelsesgel, en polyakrylamidgel, agar, etc. Enzymene har videre vært gjort ubevegelige ved en diazotering til cellulosederivater og til polyaminostyrenperler. Enzymer har videre vært gjort ubevegelige på polytyrosyl-polypeptider og collodium-matriser. Hovedulempen ved å anvende slike organiske forbindelser er følgende (a) at de meget lett underkastes angrep, fra mikroorganismer på grunn av karbonatomene i polymerkjeden, hvorved bæreren brytes ned og enzymet blir oppløseliggjort, (b) substratdiffusjonen blir i mange tilfeller den begrensende faktor ved reaksjonshastigheten, hvorved man får en nedsatt enzymaktivitet, og (c) ved en anvendelse i kromatografiske kolonner, så vil pH og oppløsningsmidlets betingelser dels senke og dels øke svellingen, noe som påvirker strømningshastig-heten av substratet gjennom kolonnen.

Norsk patentsøknad nr. 413/69 beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av stabiliserte enzymer ved at en vandig oppløsning av et enzym med tilgjengelige amingrupper bringes i kontakt med en uorganisk bærer med et høyt overflateareal og reaktive silanolgrupper, dvs. ved temperaturer opp til romtemperatur og i et tilstrekkelig • langt tidsrom til at man får en vesentlig binding av enzymet. Man antar at enzymet ved denne fremgangsmåte kobles direkte til bæreren både ved hjelp av hydrogenbindinger og ved hjelp av amin-silikatbind-inger. En begrensning.ved nevnte fremgangsmåte er imidlertid at den ikke er generell for alle enzymer, ettersom man får et meget stort tap av aktivitet når det opptrer en binding i de aktive posisjoner på enzymmolekylet.

Slik de brukes her vil betegnelsene "stabilisert", "uopp-løseliggjort" og "ubevegeliggjort" ha følgende betydning. Med begrepet "stabilisert" forstås et nedsatt tap av enzymaktivitet som en funksjon av tid" og/eller temperatur. Med begrepet "uoppløseliggjort" forstås at enzymet i alt vesentlig er vannuoppløselig, noe som opp-står ved en kobling av enzymet ved hjelp av kovalente bindinger til den uoppløselige og uorganiske bærer. Med begrepet "ubevegeliggjort" forstås at enzymet innfanges i et polymert gitter eller i en semi-permeabel membran.

Relativt overraskende har man nå oppdaget en fremgangsmåte for stabilisering av enzymer ved at disse kjemisk kobles til en uorganisk bærer som i alt vesentlig er immunt overfor angrep av mikroorganismer. Enzymet kobles kjemisk til bæreren ved hjelp av et silan-koblingsmiddel som ved et passende valg i alt vesentlig redu-serer eller fullstendig eliminerer det aktivitetstap som skyldes en interferens med de aktive posisjoner på enzymmolekylet. Man kan fremstille meget stabile enzymer ved denne teknikk, og nevnte enzymer kan brukes i meget langt tidsrom. Det er endog mulig å kalibrere enzymets aktivitet og med en viss sikkerhet forutsi at enzymets aktivitetsnivå ved en senere anvendelse vil være i alt vesentlig konstant. Disse stabiliserte enzymer finner betydelig anvendelse for analytiske for-mål, og kan også brukes ved fremstilling av kjemikalier, farmasøytiske preparater.og matvarer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt et vannuoppløselig enzymmateriale omfattende et enzym koblet til en uorganisk bærer med tilgjengelige hydroksyl- eller oksydgrupper, og dette materiale er kjennetegnet ved at enzymet er koblet til bæreren ved hjelp av et mellomliggende organisk derivat av silan som koblingsmiddel, hvori koblingsmidlets silisiumdel er knyttet til bæreren, og koblingsmidlets organiske del er knyttet til enzymet. .Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte til fremstilling av et. slikt vannuoppløselig enzymmateriale, og denne fremgangsmåte er kjennetegnet ved at man omsetter en vannuoppløselig uorganisk bærer med tilgjengelige hydroksyl- eller oksydgrupper med et organisk derivat av silan, .som inneholder eller bringes til å inneholde reaktive grupper, og at man omsetter det oppnådde produkt med enzymet.

Enzymer som lar seg stabilisere ved denne fremgangsmåte omfatter en rekke forskjellige enzymer som kan klassifiseres i tre hovedgrupper: hydrolytiske enzymer, redox-enzymer og transferase-enzymer. Den første gruppe, dvs. hydrolytiske enzymer, omfatter pro-teolytiske enzymer som hydrolyserer proteiner, f.eks. pagain, ficin, pepsin,,trypsin, chymotrypsin, bromelin,. keratinase, karbohydraser som hydrolyserer karbohydrater, f.eks. cellulase, amylase, maltase, pectinase, chitinase, samt esteraser som hydrolyserer estere, f.eks. lipase, cholinesterase, lecithinase, alkaliske og sure fosfataser, nucleaser som hydrolyserer nucleinsyrer, f.eks. ribonuclease, des-oksyribonuclease, foruten amidaser som hydrolyserer aminer, f.eks. arginase, asparginase, glutaminase og urease. Den annen gruppe er redox-enzymer som katalyserer oksydasjons- eller reduksjonsreaksjoner. Disse enzymer omfatter glukoseoksydase, catalase, peroksydase, lip-oksydase, og cytokromreduktase. I den tredje gruppe finner man trans-feraseenzymer som overfører grupper fra et molekyl til et annet. Eksempler på disse er glutamindruesyretransaminase, glutamin-oksal-eddiksyre-transaminase, transmetylase, fosforpyrodruesyre-transfos-forylase.

Nevnte bærere er uorganiske materialer med tilgjengelige oksyd- eller hydroksylgrupper. Disse materialer må i alt vesentlig være vannuoppløselige og er enten svake syrer eller baser. De kan også klassifiseres med hensyn til kjemisk sammensetning, og kan da betegnes enten som silisiumholdige materialer eller ikke-silisiumholdige metalloksyder. Av de nevnte silisiumholdige materialer, er et foretrukket stoff porøst glass, enten i partikkelform eller som et større stykke, f.eks. som en skive. Glass har den fordel at det er dimensjonalt stabilt, og at det kan renses for å fjerne forurens-ninger f.eks. ved en sterilisasjon. Porøst glass som kan brukes som en bærer er meget lett tilgjengelig og selges kommersielt som "Code 7930" porøst glass. Et slikt porøst glass kan fremstilles, med varierende poredimensjoner> f.eks. slik det -er beskrevet i US patent nr. 2 106 764, US patentsøknad nr. 565 .372 og US patentsøknad nr. 507 092. Andre silisiumholdige, uorganiske bærere som også kan brukes omfatter kolloidal silisiumdioksyd (kommersielt tilgjengelig under varemerket "CAB-O-SIL"), wollastonitt (et naturlig forekommende kalsiumsilikat), tørket silisiumdioksydgel samt bentonitt. Representative ikke-silisiumholdige metalloksyder omfatter aluminiumoksyd, hydroksyapatitt samt nikkeloksyd. Disse representative uorganiske bærere kan klassifiseres slik det er vist i den nedenstående tabell:

Uorganiske bærere

Silan-koblingsmidlene er molekyler med to forskjellige typer reaktivitet. Disse er organofunksjonelle og silisium-funksjonelle silisiumforbindelser karakterisert ved at silisiumdelen av molekylet har en affinitet for det uorganiske materiale, f.eks. glass eller aluminiumsilikat, mens den organiske del av molekylet har en affinitet for mange organiske forbindelser. Hovedfunksjonen for koblingsmidlet er å tilveiebringe en binding mellom enzymet (organisk) og bæreren (uorganisk). I teorien er mulige organofunksjonelie silaner begrenset bare av antallet kjente organofunksjonelle grupper og tilgjengelige posisjoner i enzymmolekylet. En rekke forskjellige silan-koblingsmidler kan brukes, og disse kan illustreres ved den følgende generelle formel:

hvor Y' er valgt fra gruppen bestående av amino, karbonyl, karboksy, isocyano, diazo, iso'tiocyano, nitroso, sulfhydryl, halokarbonyl; Q. er valgt fra gruppen bestående av lavere-alkoksy, fenoksy og halogen; Q<f >er valgt fra gruppen bestående av lavere-alkyl, lavere-alkylfeny1 og fenyl, mens n er et tall fra 1 til 3. Videre kan brukbare silan-koblingsmidler representeres ved formelen:

hvor Y er valgt fra gruppen bestående av amino, karbonyl, karboksy, hydroksyfenyl og sulfhydryl; Q er valgt fra gruppen bestående av lavere-alkoksy, fenoksy og halogen, mens n er et tall fra 1 - 3. De mest tilgjengelige koblingsmidler har imidlertid formelen:

Y • CH2 CH2 CH2-Si(OCH 5)3

hvor Y' har den ovenfor angitte betydning.. Det er her ikke nødvendig å angi mulige reaksjoner for alle nevnte produkter, ettersom reaksjoner for de forskjellige organofunksjonelle grupper kan finnes i enhver god lærebok i organisk kjemi.

Viktige bindingstyper mellom koblingsmidlet og enzymet kan imidlertid illustreres ved sine funksjonelle eller reaktive grupper på følgende måte:

Typer av binding

I en utførelse av oppfinnelsen er koblingsmidlene amino-funksjonelle alifatiske silaner, f.eks. N-3-aminoetyl-gamma-aminopropyl-trimetoksysilan, N-3-aminoetyl-(a-metyl-gamma-aminopropylj-dimetoksymetylsilan og gamma-aminopropyl-trioksysilan. Koblingsmidlet pålegges glassubstratet fra en oppløsning. Det har vist seg at man bare kan anvende høyere-kokende aromatiske og alifatiske • oppløsningsmidler. Spesielt gode oppløsningsmidler er toluen, benzen xylen og andre høytkokende hydrokarboner. Selyom silan-koblingsmidlene er oppløselige i alkohol og vann, så bør disse oppløsningsmidler unngås fordi de påvirker selve bindingen. Også aldehyder, ketoner, syrer, estere samt alkylklorider bør unngås som oppløsningsmidler, ettersom de har en tendens til å reagere med silanene'.

For å kunne velge det optimale koblingsmiddel, er det viktig å ha kjennskap til de aktive posisjoner på enzymmolekylet. Som nevnt ovenfor er det uønsket og lite effektivt å binde et enzym med en amingruppe i sin'aktive posisjon ved hjelp av en amin-silikat-binding. Følgelig bør koblingsmidlet- velges slik at det ikke ødelegger enzymet, f.eks. i trypsin ved en binding, til karboksyl- eller sulfhydry 1-gruppen i enzymet. Videre- må koblingsmidlet velges slik at bindingen kan frembringes under betingelser som ikke ødelegger verken enzymet eller bæreren. De betingelser under hvilke det bundne enzym skal brukes' er også av betydning for" den type binding som dannes mellom koblingsmidlet og enzymet, og denne er i meget høy grad avhengig av at koblingsmidlet må være stabilt ved nevnte betingelser.

Bindingen av enzymet til bæreren er prinsippielt en to-trinns reaksjon. Første trinn omfatter at koblingsmidlet bindes til bæreren, mens annet trinn omfatter at enzymet bindes til kombina-sjonen av koblingsmiddel og bæreren. Den mengde enzym som kan kobles synes å være avhengig av overflatearealet på bæreren. Enzymaktiviteten -er til én viss grad avhengig av at man anvender relativt milde betingelser ved koblingen, og synes i mindre grad å være avhengig av strukturen på de aktive posisjoner.

Det første som må gjøres med bæreren er å rense dette

for forurensende materialer, 'f.eks. organiske stoffer, slik at man får oksyd- eller hydroksylgrupper tilgjengelige for binding. Denne renseteknikk vil til en viss grad være avhengig av den spesielle bærer som brukes. Når man anvender porøst glass, så- kan dette renses med en fortynnet salpetersyreoppløsning, vaskes med destillert vann, tørkes og så oppvarmes til ca. 625°C i en oksygenatmosfære.

Når man pålegger silan-koblingsmidle-t fra en oppløsning, er det nødvendig å tilveiebringe visse anordninger for å få den silisium-funksjonelle del av molekylet til å reagere. Dette kari oppnås ved å oppvarme oppløsningen til en temperatur mellom 60° og l40°C. Det er foretrukket å oppløse silan-koblingsmidlet i toluen i konsentrasjoner som varierer fra 0.1 til 10.0 vektprosent. Deretter blir oppløsningen av koblingsmidlet pålagt ved å behandle bæreren med oppløsningen ved forhøyede temperaturer, fortrinnsvis under tilbakeløpsbetingelser, dvs. at toluenoppløsningen koker ved ca. 105°C. Tilbakeløpskoking kan vare fra 1 - 16 timer, vanligvis er 4 timer ganske effektivt.

De anvendte -koblingsmidler er generelt definert ved den ovenfor angitte formel. For å fremstille visse typer forbindelser kan den organofunksjonelle del av silanet- modifiseres etter at koblingsmidlet er knyttet til bæreren. Mens en rekke silankoblings-midler er kommersielt tilgjengelige, så kan andre fremstilles ved vanlige, velkjente reaksjoner. Således kan f.eks. diazoderivåtet fremstilles fra gamma-aminopropyl-trietoksysilan etter binding til bærestoffet ved en omsetning med. p-nitrobenzosyre, hvorpå man redu-serer nitrogruppen til aminet og diazoterer med salpetersyrling. Hvis man har et gamma-aminopropyl-triet.oksysilan bundet til et bære-stoff, så kan isotiocyano-alkylsilanderivåtet fremstilles ved å om-sette den amino-funksjonelle gruppe med tiofosgen.

Etter første trinn må enzymet omsettes med den organofunksjonelle del av silan-koblingsmidlet. Først blir enzympulveret oppløst i en bufferoppløsning ag prøvet. Den vandige enzymoppløs-ning ble så plassert i kontakt med den behandlede bærer ved temperaturer vanligvis under romtemperatur, og i forbindelse med proteaser, fortrinnsvis ved ca. 5°C, ettersom enzymer er mer stabile ved lavere temperaturer. I visse tilfeller, f.eks. i forbindelse med glukoseoksydase, så skjer koblingen raskere ved høyere temperaturer, og i dette tilfelle er en kobling ved romtemperatur i et par timer foretrukket. '

Etter en kontakt-med den behandlede bærer i tidsrom varierende fra 1-72 timer, er enzymet bundet til bæreren og et even-tuelt overskudd fjernes. Det er meget viktig at oppløsningens pH holdes innenfor et veldefinert område, slik at enzymet ikke blir irreversibelt denaturert. En reaksjon mellom et silan og et enzym kan f.eks. kreve et visst pH-område, f.eks. vil azobindingen best danne seg mellom pH 8 - 9. I forbindelse med proteaser er det foretrukket å utføre koblingen i et pH-område med relativt lav enzymatisk aktivitet. Etter dette blir så det bundne enzym bedømt. Så kan enzymet lufttørkes, men må ikke uttørres, og kan så lagres. Alterna-tivt kan det bundne enzym lagres i vann eller i en buffret oppløs-ning ved romtemperatur eller ved lavere temperaturer.

Produktet fremstilt ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåte er et uoppløseliggjort enzym som er blitt stabilisert slik at det har et konstant aktivitetsnivå i.et lengre tidsrom. Når det 1-agres ved temperaturer på ca. 5°C eller endog ved romtemperaturer i flere måneder, så viser det bundne enzymet konstant aktivitetsnivå selv ved flere gjentatte eksponeringer overfor bedømmelsesbetingelsene. •

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

En prøve pulverisert porøst 96 % silisiumdioksydglass

(950 A - + 50 Å porestørrelse, 16 m 2/g overflateareal) ble vasket i 0.2-n HNO^ ved 80°C og kontinuerlig behandling med ultralyd i minst 3 timer. Glasset ble så vasket flere ganger med destillert vann ved dekantering og så oppvarmet til 625°C over natten i nærvær av 0^.

Glasset ble avkjølt og plassert i en rundhalskolbe. For hver 2 g glass ble det tilsatt 100 ml av en 10 $'s oppløsning av gamma-aminopropyl-trietoksysilan i toluen. Blandingen ble tilbake-løpskokt over natten og vasket med aceton. Det endelige produkt ble lufttørket og lagret. Det resulterende derivat (heretter betegnet som aminoalkylsilanderivåtet) inneholdt 0.171-meq silanresiduer/g glass, slik dette kunne bestemmes ved totalt nitrogeninnhold.

Et gram av det behandlede glass ble tilsatt 3.5 ml destillert vann inneholdende 100 mg krystallinsk trypsin. Dette ble så tilsatt en blanding av 0.5 ml N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (DCCI) i 0. 5 ml tetrahydrofuran (THF). Reaktantene ble omrørt over natten ved romtemperatur. Produktet ble vasket med NaHCO^ oppløsning, 0.001 molar HC1 og destillert vann. Det uoppløseliggjorte trypsin ble lagret i 0.001 molar HC1 ved 5°C

Hydrolysen av benzoy1-arginin-etylester (BAEE) ble utført ved pH 8.1 i 0.1 molar glycin. En aktivitetsenhet tilsvarer hydrolysen av 1 u mol substrat/minutt ved 25°C ved pH 8.1

Flere prøver fremstilt som beskrevet ovenfor ble prøvet. Fremgangsmåten var følgende: Ett gram glass-enzym ble tilsatt 50 ml av substratet inneholdende 0.08 mg BAEE/ml buffer. Reaktantene ble omrørt ved hjelp av en magnetisk rører og bedømt hvert tredje minutt. Prøvene ble filtrert og undersøkt spektrofotometrisk ved 247 my.- Den midlere forandring i optisk tetthet per minutt ble målt og aktiviteten beregnet.

Tre representative prøver bedømt ved ovennevnte fremgangsmåte, inneholdt 8.5 enheter, 25.2 enheter og 12.0 enheter per gram glass. Dette representerer bare mikrogram-kvantiteter aktivt enzym. Det totale enzym koblet ved denne fremgangsmåte var 0.4 37 mg/g glass, slik det kunne bestemmes ved totalt nitrogen.

Eksempel II

2 g aminoalkylsilanderivat .på porøst glass (780 A + 50 A porestørrelse), slik det ble fremstilt i eksempel I, ble tilsatt 1 g p-nitrobenzosyre. Røring ble utført i 2 døgn ved romtemperatur i en 10 $'s oppløsning av DCCI i absolutt metanol. Det omsatte materiale ble vasket i metanol, tilsatt ^ 00 ml destillert vann inneholdende 5,0 g natriumditionitt og kokt i 30 minutter, p-aminobenzosyreamidet av aminoalkylsilan-glasset (heretter betegnet som aminoarylsilanderivatet) ble vasket med destillert vann, deretter med aceton og så. lufttørket.

Aminoarylsilanderivatet ble diazotert i 0,1-n HC1 ved tilsetning av et overskudd av fåst NaNO,-, ved 0°C!. Et gram produkt (heretter betegnet diazoarylsilanderivatet) ble tilsatt 14 mg krystallinsk trypsin i 50 ml NaHCO^-oppløsning. J Reaksjonen ble fortsatt ved 5°C over natten. Deretter ble det kjemisk koblede trypsin vasket i NaHCO^-oppløsning og deretter i destillert vann.

Bedømmelsen ble utført slik det er beskrevet i eksempel I bortsett fra at substratet inneholdt 0,08 mg BAEE/ml oppløst i 0,07 molar fosfatbuffer justert til pH 7, 0. Man fant at det kjemisk koblede trypsin inneholdt en ekvivalent på 0,189 mg aktivt enzym pr. gram glass. Nitrogenbestemmelsen viste at 5>67 m§ enzvm var koblet pr. gram glass. Den beholdte enzymaktivitet var J, 2 %. av det totalt koblede trypsin.

Det ble fremstilt en kolonne og denne ble fylt med 1,0 g av det kjemisk koblede trypsinpreparat. Den pakkede kolonne hadde en diameter på 1 cm og var 5 cm lang. Substratet, P,o8 mg/ml BAEE oppløst.i 0,07 molar fosfatbuffer, pH 7»0> ble ført gjennom kolonnen med en hastighet på 0,5 ml/minutt, noe som ga en omdannelse av substratet til produktet på ca. 90 ^« Kolonnen hadde en temperatur på ca. 23°C + 1°C. Produktet ble kontinuerlig bedømt spektrofotometrisk ved 253 m/u i en 1>0 cra gjennomstrømningscelle.

For å vise stabiliteten med hensyn til tiden for det kjemisk koblede trypsin i forhold til det frie enzym, så ble det utført et sammenlignende eksperiment ved 23°C. Krystallinsk trypsin ved en konsentrasjon på 0,5 mg/ml ble plassert i 0,07 molar fosfat-bufferoppløsning. Med jevne mellomrom ble 0,05 ml prøver tatt ut, . tilsatt 3,0 ml av substratet og bedømt for-aktivitet.

Fig. 1 viser grafisk de resultater som ble oppnådd ved romtemperatur som prosent aktivitet som en funksjon av tiden for både det frie enzym og det kjemisk koblede enzym. For det frie enzym ble aktivitetene angitt som prosent av den opprinnelige aktivitet. I løpet av mindre enn 2 timer ble all enzymaktivitet ødelagt ved autohydrolyse av det frie trypsin. Den opprinnelige omdannelseshastighet for det kjemisk koblede enzym ble vilkårlig satt til 100 %. Man kunne ikke observere noe tap av aktivitet i løpet av 154 timers kontinuerlig bedømmelse. Deretter begynte enzymet å tape aktivitet, men selv etter 397 timer kunne man observere en betydelig aktivitet.

Eksempel III

Ti gram av aminoalkylsilanderivatet, slik det er fremstilt i eksempel I, ble tilsatt 100 ml 10 <% > tiofosgen i kloroform og refluksert i et par timer. Produktet ble vasket i kloroform for å fjerne- gjenværende tiofosgen. Isotiocyanoalkylsilanderivåtet ble lufttørket og brukt umiddelbart etter for kobling til trypsin. .2 gav isotiocyanoalkylsilanderivatet ble tilsatt 50 ml NaHCO^-oppløsning, pH 9, 0, inneholdende 100 mg trypsin. Reaktantene ble rørt i 2 timer ved romtemperatur og deretter vasket i destillert vann. Produktet ble lagret i destillert vann ved 5 C inntil det skulle brukes. Man fant at det kjemisk koblede trypsin inneholdt 2,1 mg protein, slik det kunne bestemmes ved totalt nitrogen.

Substratet var varmedenaturert kasein ved en konsentrasjon på 5 g/liter i en 0,1 molar fosfatbuffer, pH 7>0. En 1 grams prøve av det koblede enzym ble tilsatt 50. ml av substratet. Røringen ble blandet konstant. Det ble tatt ut prøver hvert 60. sekund og tilsatt et tilsvarende volum 10 % trikloreddiksyre. Bunnfallet ble filtrert etter 15 minutter, og deretter avlest spektrofotometrisk mot en substratkontrollprøve som var behandlet på samme måte. Man fant at enzym-glassproduktet inneholdt 0>120 mg aktivt enzym pr. gram glass.

Eksempel IV

Diazoarylsilanderivåtet på glass ble fremstilt slik det er beskrevet i eksempel II. Enzymet ble koblet via en azobinding i en 1 1 oppløsning av et råprodukt av papain. Det koblede glass-enzym ble tilsatt 100 ml av 1 % casein inneholdende 6l,5 g cystein og 32 mg dinatriumetylendiamintetraacetat (Na^^EDTA) i 0,1 molar fosfatbuffer, pH 6,9- Under prøven ble det tatt ut volumer på 4 ml, dette ble tilsatt 4 ml trikloreddiksyre (TCA), sentrifugert og avlest ved 280 n<y>u. De optiske tettheter ble sammenlignet med en TCA-utfelt prøve av substratet før kontakt med enzymet. Man.fant at det kjemisk koblede papain inneholdt 2,55 mg aktivt enzym pr. gram glass.

For å bedømme den fermale stabilitet for det bundne papain ble følgende eksperiment utført. 1 g av det kjemisk koblede papainpreparat ble helt over i en kolonne, og det ble tatt ut prøver av kolonneeluatet kontinuerlig. Substratet for eksperimentet var 3 % kasein i 0,1 molar fosfatbuffer, pH 6,9. Kolonnetemperafuren ble

holdt på 88°C i hele eksperimentet. Strømningshastigheten ble justert til 2,8 ml/minutt. Substratet ble kontinuerlig ført gjennom kolonnen, og det ble tatt ut prøver for bedømmelse ved hjelp av TCA-utfelling. Hydrolysegraden oppnådd umiddelbart ble vilkårlig satt til 100 % enzymaktivitet. En senkning av hydrolysen ble angitt som prosent av opprinnelig aktivitet.

Et fritt enzym ble fremstilt ved hjelp, av 50 mg i 100 ml buffer, og oppløsningen ble holdt på 88°C. Små prøver ble tatt ut og bedømt ved vanlig standardteknikk og avsatt som prosent av opprinnelig enzymaktivitet før eksponering for nevnte høye temperatur.

Fig. 2 viser dé oppnådde resultater som prosent aktivitet som en funksjon av tiden for både det frie enzym og det kjemisk koblede enzym. Det frie enzym mistet aktiviteten umiddelbart og var fullstendig inaktivert i løpet av 30 minutter. I sammenligning viste det kjemisk koblede papain ingen senkning med hensyn til enzymatisk aktivitet i løpet av de første 80 minutter-. Disse resultater viser at det kjemisk koblede papain har langt bedre varmestabilitet enn det frie enzym.

Eksempel V

Et nikkelnett, 150 mesh, 0,1 mm tråd, ble skåret opp i striper på ca. 12,5 x 2,5 cm. Strimlene eller stripene ble rullet til sylindere med en indre diameter på ca. 1,25 cm og ble loddet for å hindre en videre utrulling. Nevnte striper ble først plassert i en ovn ved rJ00°C i 2 timer i en oksygenatmosfære for å oksydere over-flaten til et nikkeloksydbelegg.

De nikkeloksydbelagte striper eller ruller ble refluksert over natten i en 10 $'s oppløsning av gamma-aminopropyl-trietoksysilan i toluen. Aminoalkylsilanderivatet ble vasket i aceton og tørket. Rullene ble så tilbakeløpskokt over natten i 1Q% tiofosgen i kloroform. Isotiocyanoalkylsilanderivatet ble vasket med kloroform og umiddelbart koblet til glukoseoksydase.

Derivatet.ble tilsatt en 1 s oppløsning av glukoseoksydase i 0,1 molar NaHCO^, pH 9>0 °g holdt på romtemperatur. Reaktantene ble omrørt ifra 2-3 timer, vasket med destillert vann og det kjemisk koblede enzym nikkeloksydbelagte nett ble lagret ved 5°C i destillert vann.

Enzymaktiviteten for produktet ble bedømt med hensyn til /ug enzymaktivitet basert på aktiviteten for kjente mengder av det løselige enzym. Det anvendte substrat i alle eksperimenter var vannfri D-glukose (dekstrose) i konsentrasjoner varierende fra 0,00055 molar til 0,055 molar oppløst i 0,01 molar fosfatbuffer, pH 6,0.

Den frie enzymprøve ble bedømt ved å tilsette en 0,5 ml prøve inneholdende 250 /ug renset glukoseoksydase til 50 ml substrat inneholdende 100 yug/ml peroksydase og 0,0005 ^ o-dianisidin. Reaktantene ble rørt ved hjelp av en magnetisk rører. Det ble umiddelbart tatt ut en 2 ml prøve som kontroll. I 1 minutts mellomrom i løpet av 5 minutter ble 2,0 ml prøver tatt ut og plassert i rør inneholdende en dråpe 4_n- HC1 i 0,5 ml destillert vann. Oppløsningene ble avlest spektrofotometrisk ved 46O nyu. Alle eksperimenter ble utført ved 23°C.

Det kjemisk koblede enzym-nikkeloksydbelagte nett ble bedømt ved samme fremgangsmåte, bortsett fra at ekvivalente mengder av peroksydase og o-anisidin ble tilsatt hvert rør i 0,5 ml volumer. Dette ble gjort for å hindre en absorbsjon av o-dianisidinet til nikkeloksyd-nettene. Hvert rør ble hensatt i 1 - 3 minutter før tilsetning av 4-n. HC1.

A.. Tidsstabilitetseksperiment

Prøver av det kjemisk koblede enzym ble lagret ved 4°C og bedømt i en 6 måneders periode. Resultatene er angitt i den nedenstående tabell.

Disse resultater viser klart at det koblede enzym har meget lang tidsstabilitet.

B. Varmestabilitetseksperiment.

Fig. 3 viser varmestabiliteten for kjemisk koblet' glukoseoksydase i forhold til det frie enzym. Det bundede enzym ble tilsatt 50 ml av substratet ved den forønskede temperatur og deretter bedømt. Ved slutten av eksperimentet eller prøven ble samme prøve igjen bedømt ved den neste forønskede, temperatur. Ved å anvende denne.fremgangsmåte får man en cumulativ tidseksponering overfor høyere temperaturer. Den virkelige aktivitetsforskjell (basert på /ug aktivt enzym bundet) mellom det frie enzym og det bundede enzym er derfor større. De angitte resultater kan ansees som minimale verdier.

Man oppnådde en meget øket varmestabilitet for det kjemisk bundede enzym. Ved 33°G var aktiviteten for det bundede enzym noe forøket, mens aktiviteten var avtatt for det frie enzym. Det frie enzym ble bedømt slik det er beskrevet ovenfor ved å bruke 48O /ug glukoseoksydase.. Det oppløste enzym ved 23°C ble tilsatt en oppvarmet bufferoppløsning ved de angitte temperaturer. Aktiviteten avtok umiddelbart ved eksponering overfor økende temperaturer.

Dette resultat viser klart at den kjemisk koblede glukoseoksydase har en bedre varmestabilitet enn det frie enzym.

Eksemplene VI - XVIII

Ved å anvende de fremgangsmåter som er beskrevet i eksemplene II og III ble forskjellige enzymer kjemisk koblet til en serie representative, uorganiske bærestoffer. I den nedenforstående tabell er utgangsmaterialene, nemlig enzymet, bærestoffet og koblingsmidlet angitt i kolonnene 2, 3 °g 4- Koblingsmidlene er angitt med bokstaver hvor B er diazoarylsilanderivatet (slik det er angitt i eksempel II) og C er isotiocyanoalkylsilanderivatet (slik det er angitt i eksempel III). Aktivitetene for de kjemisk koblede enzymer er angitt i kolonne 6, idet man anvendte det substrat som er angitt i kolonne 5-

Claims

Vannuoppløselig enzymmateriale omfattende et enzym koblet til en uorganisk bærer med tilgjengelige hydroksyl- eller oksydgrupper,karakterisert ved at enzymet er koblet til bæreren ved hjelp av et mellomliggende organisk derivat av silan som koblingsmiddel, hvori koblingsmidlets silisiumdel er knyttet til bæreren, og koblingsmidlets organiske del er knyttet til enzymet.
2. Fremgangsmåte til fremstilling av et vannuoppløsélig enzymmateriale ifølge krav 1, karakterisert ved at man (a) omsetter en vannuoppløselig uorganisk bærer med tilgjengelige hydroksyl- eller oksydgrupper med et organisk derivat av silan, som inneholder eller bringes til å inneholde reaktive grupper, og (b) omsetter det oppnådde produkt med enzymet.