DE69822251T2

DE69822251T2 - Verfahren zur Herstellung von mikrobieller Transglutaminase

Info

Publication number: DE69822251T2
Application number: DE69822251T
Authority: DE
Inventors: Keiichi Kawasaki-shi Yokoyama; Nami Kawasaki-shi Nakamura; Tetsuya Kawasaki-shi Miwa; Katsuya Kawasaki-shi Seguro
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1997-07-04
Filing date: 1998-07-02
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2018-07-03
Also published as: DK0889133T3; CN1253177A; US6538122B1; EP0889133A2; CA2237041A1; BR9802403A; DE69822251D1; US6013498A; CN1151252C; EP0889133A3; EP0889133B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein mit Transglutaminaseaktivität, DNA, die für das Protein kodiert, und ein Verfahren zur Herstellung des Proteins. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Transglutaminaseaktivität durch ein gentechnisches Verfahren.
Transglutaminase ist ein Enzym, das die Acyltransferreaktion einer γ-Carboxyamidogruppe in einer Peptidkette eines Proteins katalysiert. Wenn ein solches Enzym mit dem Protein reagiert, kann eine Reaktion, nämlich eine ε-(γ-Glu)-Lys-Bildungsreaktion oder Substitutionsreaktion von Gln mit Glu durch Deamidierung von Glu auftreten.
Die Transglutaminase wird für die Produktion von gelierten Nahrungsmitteln, wie Gelees, Joghurts, Käse, gelierter Kosmetika usw. und auch für die Verbesserung der Qualität von Fleisch [vergleiche die Japanische Patentveröffentlichung für Einspruchszwecke (im Folgenden als "J. P. KOKOKU" bezeichnet) Nr. Hei 1-50382] eingesetzt. Die Transglutaminase wird auch für die Herstellung eines Materials für Mikrokapseln mit hoher thermischer Stabilität und einem Träger für ein immobilisiertes Enzym eingesetzt. Die Transglutaminase ist somit industriell sehr nützlich.
Bei den Transglutaminasen sind bislang solche, die aus Tieren abgeleitet sind, und solche, die aus Mikroorganismen (mikrobielle Transglutaminase; im Folgenden als "MTG" bezeichnet) bekannt.
Die Transglutaminasen aus Tieren sind Calciumionen-abhängige Enzyme, die in Organen, der Haut und im Blut von Tieren vorkommen. Es gibt beispielsweise die Meerschweinchenleber-Transglutaminase [K. Ikura et al., Biochemistry 27, 2898 (1988)], die menschliche Epidermiskeratinzellen-Transglutaminase [M. A. Philips et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9333 (1990)] und den menschlichen Blutgerinnungsfaktor XIII (A. Ichinose et al., Biochemistry 25, 6900 (1990)].
Bei den Transglutaminasen aus Mikroorganismen werden die Calcium-unabhängigen Enzyme aus Mikroorganismen der Gattung Streptoverticillium gewonnen. Es gibt beispielsweise Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum IFO 12852 und Streptoverticillium mobaraense IFO 13819 [vergleiche die ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldung (im Folgenden als "J. P. KOKAI" bezeichnet) Nr. Sho 64-27471].
Gemäß der Peptidkartierung und der Ergebnisse der Genstrukturanalyse wurde gefunden, dass die Primärstruktur der durch Mikroorganismen hergestellten Transglutaminase mit derjenigen aus Tieren überhaupt nicht homolog ist (Europäische Patentanmeldung Nr. 0 481 504 A1).
Da die Transglutaminase aus Mikroorganismen (MTG) durch die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen und durch nachfolgende Reinigung hergestellt werden, gab es Probleme hinsichtlich der Produktionsmenge, der Effizienz und dergleichen. Es wurde auch versucht, diese Enzyme durch gentechnische Verfahren herzustellen. Diese Techniken umfassen ein Verfahren, bei dem durch die Sekretionsexpression eines Mikroorganismus, E. coli, Hefe oder dergleichen, durchgeführt wird (J. P. KOKAI Nr. Hei 5-199883), und ein Verfahren, bei dem MTG als inaktiver Fusionsproteineinschlusskörper in E. coli exprimiert wird, dieser Einschlusskörper mit einem Proteindenatu rierungsmittel aufgelöst wird, das Denaturierungsmittel entfernt wird, und dann MTG reaktiviert wird, wobei aktive MTG erhalten wird (J. P. KOKAI Nr. Hei 6-30771).
Diese Verfahren sind jedoch problematisch, wenn sie im industriellen Maßstab durchgeführt werden. Wenn die Sekretion durch die Mikroorganismen, wie E. coli und Hefe, durchgeführt wird, ist die hergestellte Menge sehr gering. Wenn MTG in der Form inaktiver Fusionsproteineinschlusskörper in E. coli erhalten wird, ist ein teures Enzym für die Spaltung erforderlich.
Es ist bekannt, dass wenn ein fremdes Protein durch gentechnische Verfahren sekretiert wird, die Menge des so erhaltenen Proteins üblicherweise gering ist. Im Gegensatz dazu ist es auch bekannt, dass wenn das fremde Protein in E. coli produziert wird, das Produkt in der Form von inerten Proteineinschlusskörpern gebildet wird, obwohl in vielen Fällen die exprimierte Menge hoch ist. Die Proteineinschlusskörper müssen mit einem Denaturierungsmittel aufgelöst werden, das Denaturierungsmittel muss entfernt werden, und anschließend muss MTG reaktiviert werden.
Es ist bereits bekannt, dass bei der Expression in E. coli ein N-terminaler Methioninrest im natürlichen Protein, das nach der Translation des Gens erhalten wird, auf effiziente Weise mit Methioninaminopeptidase gespalten wird. Der N-terminale Methioninrest wird jedoch nicht immer in einem exogenen Protein gespalten.
Verfahren, die bislang vorgeschlagen wurden, um ein Protein zu erhalten, das frei vom N-terminalen Methioninrest ist, umfassen ein chemisches Verfahren, bei dem ein Protein mit einem Methioninrest am N-Terminus oder ein Fusionsprotein mit einem Peptid, das über den Methioninrest daran gebunden ist, hergestellt wird und anschließend das Produkt an der Position des Methioninrests mit Cyanogenbromid spezifisch gespalten wird; und ein enzymatisches Verfahren, bei dem eine Erkennungssequenz eines bestimmten ortsspezifischen proteolytischen Enzyms zwischen einem geeigneten Peptid und einem Zielpeptid eingefügt wird, um ein Fusionspeptid zu erhalten, und anschließend wird eine ortsgerichtete Hydrolyse mit dem Enzym durchgeführt.
Der erstgenannte Prozess kann jedoch nicht eingesetzt werden, wenn die Proteinsequenz einen Methioninrest enthält, und das Zielprotein könnte im Verlauf der Reaktion denaturiert werden. Das letztgenannte Verfahren kann nicht eingesetzt werden, wenn eine Sequenz, die leicht gespalten werden kann, in der Proteinsequenz enthalten ist, weil dadurch die Ausbeute des Zielproteins verringert wird. Zusätzlich ist die Verwendung eines solchen proteolytischen Enzyms für die Produktion eines Proteins im industriellen Maßstab aus Kostengründen unzweckmäßig.
Herkömmliche Verfahren zur Produktion von MTG haben viele Probleme, wie Produktionsmenge und Kosten. Bei der Sekretionsexpression durch E. coli, Hefe oder dergleichen ist die exprimierte Menge unvorteilhafterweise sehr gering. Bei der Produktion von Fusionsproteineinschlusskörpern in E. coli ist es zur Herstellung von reifer MTG erforderlich, den Fusionsteil mit einer Restriktionsprotease nach der Expression zu spalten. Außerdem wurde gefunden, dass weil MTG Calcium-unabhängig ist, die Expression von aktiver MTG in der Zelle eines Mikroorganismus schädlich ist, weil dieses Enzym auf die Endoproteine wirkt.
Deshalb besteht bei der Verwendung von MTG, die durch Genrekombination hergestellt wird, in industriellem Maßstab ein Bedarf dahingehend, dass die Produktion von reifer MTG erhöht wird, die frei von einem Fusionsteil ist. Die vorliegende Erfindung wurde zu diesem Zweck gemacht. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, MTG in großer Menge in Mikroorganismen, wie E. coli, zu produzieren.
Wenn MTG mit der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA exprimiert wird, wird ein Methioninrest an den N-Terminus von MTG angehängt. Durch die Zugabe des Methioninrests an den N-Terminus von MTG kann es jedoch hinsichtlich der Sicherheit, wie der Verleihung von Antigenizität auf MTG, zu Problemen kommen. Eine weitere, durch die vorliegende Erfindung zu lösende Aufgabe ist es, MTG herzustellen, die frei vom Methioninrest ist, der dem Initiationscodon entspricht.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Protein mit Transglutaminaseaktivität bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, DNA bereitzustellen, die für das neue Protein mit Transglutaminaseaktivität kodiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine rekombinante DNA bereitzustellen, die für das neue Protein mit Transglutaminaseaktivität kodiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Transformante bereitzustellen, die durch Transformation mit der rekombinanten DNA erhalten wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Transglutaminaseaktivität bereitzustellen.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung und den Beispielen.
Zum Lösen der vorstehend beschriebenen Aufgaben haben die Erfinder ein Expressionssystem für ein Protein mit Transglutaminaseaktivität durch Verändern des Codons auf dasjenige für E. coli, oder vorzugsweise durch Verwenden eines Mehrkopienvek tors (pUC19) und eines starken Promotors (trp-Promotor) konstruiert.
Da MTG in Mikroorganismen der Gattung Actinomycetes in der Prepro-Form exprimiert und sekretiert wird, hat MTG nicht nur einen Methioninrest, der den Initiationscodon am N-Terminus entspricht, das durch das vorstehend beschriebene Expressionsverfahren exprimierte Protein hat vielmehr auch den Methioninrest an seinem N-Terminus. Um dieses Problem zu lösen haben sich die Erfinder mit der Substratspezifität der Methioninaminopeptidase von E. coli beschäftigt und haben ein Protein mit Transglutaminaseaktivität, das den Methioninrest am N-Terminus nicht aufweist, durch Exprimieren des Proteins in der Form erhalten, die den Asparaginsäurerest nicht aufweist, welcher die N-terminale Aminosäure von MTG ist. Die vorliegende Erfindung wurde auf diese Weise gemacht.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Protein mit Transglutaminaseaktivität bereit, welches eine Sequenz umfasst, die vom Serinrest an der zweiten Position bis zum Prolinrest an der 331. Position in der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1 reicht, worin die N-terminale Aminosäure des Proteins der Serinrest an der zweiten Position der SEQ ID No: 1 ist.
Es wird ein Protein bereitgestellt, das aus einer Aminosäuresequenz vom Serinrest an der zweiten Position bis zum Prolinrest an der 331. Position in der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1 reicht.
Es wird eine DNA bereitgestellt, welche für diese Proteine kodiert.
Es wird eine rekombinante DNA bereitgestellt, welche diese DNA aufweist, insbesondere eine rekombinante DNA, die diese DNA exprimiert.
Es wird ein Mikroorganismus bereitgestellt, der durch Transformation mit der rekombinanten DNA erhalten wird.
Es wird ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Transglutaminaseaktivität bereitgestellt, welches das Kultivieren der Transformante in einem Medium zur Herstellung des Proteins mit Transglutaminaseaktivität und das Gewinnen des Proteins umfasst.
Aufgrund der Substratspezifität Methioninaminopeptidase ist das Verfahren zur Herstellung des Proteins mit Transglutaminaseaktivität und fehlendem Initiationsmethionin nicht auf die Entfernung der N-terminalen Asparaginsäure beschränkt.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 zeigt ein Konstruktionsschema des MTG-Expressionsplasmids pTRPMTG-01.
2 zeigt ein Konstruktionsschema des MTG-Expressionsplasmids pTRPMTG-02.
3 zeigt ein SDS-Polyacrylamid-Elektrophoresegel, das die Expression von MTG zeigt.
4 zeigt ein Konstruktionsschema des MTG-Expressionsplasmids pTRPMTG-00.
5 zeigt ein Konstruktionsschema des Plasmids pUCN216D.
6 zeigt ein Konstruktionsschema des MTG-Expressionsplasmids pUCTRPMTG(+)D2.
7 zeigt, dass GAT, welches dem Asparaginsäurerest entspricht, deletiert ist.
8 zeigt, dass die N-terminale Aminosäure Serin ist.
Eingehende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Das erfindungsgemäße Protein mit Transglutaminaseaktivität umfasst eine Sequenz, die vom Serinrest an der zweiten Position bis zum Prolinrest an der 331. Position in der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1 als wesentliche Sequenz reicht, das Protein kann jedoch eine oder mehrere weitere Aminosäuren nach dem Prolinrest an der 331. Position haben. Unter diesen ist ein Protein bevorzugt, das aus einer Aminosäuresequenz von dem Serinrest an der zweiten Position bis zum Prolinrest an der 331. Position in der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1 reicht.
In diesen Aminosäuresequenzen umfasst die vorliegende Erfindung Aminosäuresequenzen, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder eingefügt sind, solange diese Aminosäuresequenzen Transglutaminaseaktivität haben.
Die erfindungsgemäße DNA kodiert für die vorstehend erwähnten Proteine. Unter diesen ist eine DNA bevorzugt, worin die Basensequenz, die für Arg an der 4. Position vom N-terminalen Aminosäurerest kodiert, CGT oder CGC ist, und die Basensequenz, die für Val an der fünften Position von der N-terminalen Aminosäure kodiert, GTT oder GTA ist. Außerdem ist die DNA bevorzugt, worin die Basensequenz, die für die N-terminale Aminosäure bis zur fünften Aminosäure, Ser-Asp-Asp-Arg-Val, die folgende Sequenz hat.

Ser : TCT oder TCC
Asp : GAC oder GAT
Asp : GAC oder GAT
Arg : CGT oder CGC
Val : GTT oder GTA

In diesem Fall hat die bevorzugte DNA die Basensequenz, die für die Aminosäuresequenz von der N-terminalem Aminosäure bis zur fünften Aminosäure, Ser-Asp-Asp-Arg-Val, kodiert, die Sequenz TCT-GAC-GAT-CGT-GTT.
Außerdem hat die bevorzugte DNA die Basensequenz, die für die Aminosäuresequenz von der sechsten Aminosäure bis zur neunten Aminosäure von der N-terminalen Aminosäure, Thr-Pro-Pro-Ala, kodiert, die folgende Sequenz.

Thr : ACT oder ACC
Pro : CCA oder CCG
Pro : CCA oder CCG
Ala : GCT oder GCA

Außerdem umfasst die bevorzugte DNA eine Sequenz, die von der Thyminbase an der vierten Position bis zur Guaninbase an der 993. Position in der Basensequenz der SEQ ID No: 2 reicht. In diesem Fall ist die DNA stärker bevorzugt, die aus einer Sequenz besteht, die von der Thyminbase an der vierten Position bis zur Guaninbase an der 993. Position in der SEQ ID No: 2 reicht.
In den vorstehend genannten DNA-Sequenzen können Nukleinsäuren, die für eine oder mehrere Aminosäuren kodieren, deletiert, substituiert oder eingefügt sein, solange eine solche DNA für eine Aminosäuresequenz mit Transglutaminaseaktivität kodiert.
Die erfindungsgemäße rekombinante DNA hat eine der vorstehend genannten DNAs. In diesem Fall ist eine DNA mit einem Promotor bevorzugt, der aus der aus trp, tac, lac, trc, λ PL und T7 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Die erfindungsgemäßen Transformanten werden durch Transformation mit der vorstehend erwähnten rekombinanten DNA erhalten. Unter diesen ist es bevorzugt, dass die Transformation unter Einsatz eines Mehrkopienvektors durchgeführt wird, und dass die Transformanten zu Escherichia coli gehören.
Das Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Transglutaminaseaktivität gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Kultivieren einer der vorstehend genannten Transformanten in einem Medium zur Herstellung des Proteins mit Transglutaminaseaktivität und das Gewinnen des Proteins.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung noch eingehender beschrieben.
(1) Es ist bekannt, dass die Expression von MTG in Mikroorganismen fatal ist. Es ist auch bekannt, dass bei der hohen Expression des Proteins in einem Mikroorganismus, wie E. coli, das exprimierte Protein zur Bildung von inerten unlöslichen Proteineinschlusskörpern neigt. Vor diesem Hintergrund haben die Erfinder Untersuchungen durchgeführt, um eine hohe Expression von MTG als inertes unlösliches Protein in E. coli zu erzielen.
Ein Strukturgen von MTG, das für die hohe Expression eingesetzt wird, ist eine DNA, die eine Sequenz enthält, die von der Thyminbase an der vierten Position bis zur Guaninbase an der 993. Position in der Basensequenz der SEQ ID No: 2 reicht. Aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codons wird der dritte Buchstabe in dem degenerierten Codon in einer Domäne, die für den N-terminalen Bereich kodiert, in ein Codon umgewandelt, das reich an Adenin und Uracil ist, und der verbleibende Bereich besteht aus einem Codon, der häufig für E. coli eingesetzt wird, um die Bildung von mRNA mit hoch geordneter Struktur zu verhindern, obwohl eine DNA, die für Proteine mit derselben Aminosäuresequenz kodiert, verschiedene Basensequenzen haben kann.
Ein starker Promotor, der üblicherweise für die Produktion eines fremden Proteins eingesetzt wird, wird für die Expression des MTG-Strukturgens verwendet, und ein Terminator wird stromabwärts des MTG-Strukturgens eingefügt. Beispielsweise sind die Promotoren trp, tac, lac, trc, λ PL und T7, und die Terminatoren sind trpA, lpp und T4.
Für eine effiziente Translation wurden die Variabilität und die Länge der SD-Sequenz, die Basenzusammensetzung, die Sequenz und die Länge in der Domäne zwischen der SD-Sequenz und dem Initiationscodon für die Expression von MTG optimiert.
Die Domäne, die von dem Promotor bis zum Terminator reicht und für die Expression von MTG erforderlich ist, kann durch ein bekanntes chemisches Syntheseverfahren hergestellt werden. Ein Beispiel der Basensequenz ist in SEQ ID No: 3 gezeigt. In der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 3 folgt der Asparaginsäurerest dem Initiationscodon. Dieser Asparaginsäurerest ist jedoch vorzugsweise entfernt, was nachstehend beschrieben wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine rekombinante DNA bereit, die für die Expression von MTG geeignet ist.
Die rekombinante DNA kann durch Einfügen einer DNA, welche das Strukturgen des vorstehend beschriebenen MTGs enthält, in einem bekannten Expressionsvektor, der in Abhängigkeit von dem gewünschten Expressionssystem ausgewählt ist, hergestellt werden. Der hier verwendete Expressionsvektor ist vorzugsweise ein Mehrkopienvektor.
Bekannte Expressionsvektoren, die für die Produktion der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA einsetzbar sind, umfassen pUC19 und pHSG299. Ein Beispiel der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA, erhalten durch Einfügen der erfindungsgemäßen DNA in pUC19, ist pUCTRPMTG-02(+).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch verschiedene Transformanten, die durch Einfügen der rekombinanten DNA erhalten werden.
Die Zellen, die für die Bildung der Transformanten geeignet sind, umfassen E. coli und dergleichen.
Ein Beispiel für E. coli ist der Stamm JM109 (recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, re1A1, Δ(lac-proAB)/F' [traD36, proAB+, lacIg, lacZ ΔM15]).
Ein Protein mit Transglutaminaseaktivität wird durch Kultivieren der Transformante, wie derjenigen, die durch Transformieren von E. coli JM109 mit pUCTRPMTG-02(+) erhalten wird, welcher ein erfindungsgemäßer Vektor ist, hergestellt.
Beispiele des für die Produktion eingesetzten Mediums umfassen 2xYT-Medium, das in dem nachstehenden Beispiel eingesetzt wird, und ein Medium, das üblicherweise für die Kultivierung von E. coli eingesetzt wird, wie ein LB-Medium und M9-Casaminosäuremedium.
Die Kultivierungsbedingungen und die Bedingungen zur Induzierung der Produktion werden in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Art des Vektors, des Promotors, des Wirts und dergleichen ausgewählt. Beispielsweise kann für die Produktion eines rekombinanten Produkts mit einem trp-Promotor ein chemisches Mittel, wie 3-ß-Indolacrylsäure, für den effizienten Betrieb des Promotors eingesetzt werden. Falls erforderlich, können Glucose, Casaminosäuren oder dergleichen im Verlauf der Kultur zugegeben werden. Außerdem kann ein chemisches Mittel (Ampicillin) zugegeben werden, um eine rekombinante E.-coli-Zelle selektiv zu proliferieren.
Die Proteine mit Transglutaminaseaktivität, die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden, werden aus dem kultivierten Stamm wie folgt extrahiert: Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung werden die Zellen gewonnen und in einer Pufferlösung suspendiert. Nach der Behandlung mit Lysozym, durch Frieren/Schmelzen, Ultraschallzerstörung und dergleichen, wird die so erhaltene Suspension der zerstörten Zellen zentrifugiert, um sie in einem flüssigen Überstand und in Präzipitate abzutrennen.
Das Protein mit Transglutaminaseaktivität wird in der Form eines Proteineinschlusskörpers erhalten, der in den Präzipitaten enthalten ist. Dieses Protein wird mit einem Denaturierungsmittel oder dergleichen aufgelöst, das Denaturierungsmittel wird entfernt, und das Protein wird abgetrennt und gereinigt. Beispiele der für die Auflösung der Proteineinschlusskörper, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, einsetzbaren Denaturierungsmittel umfassen Harnstoff (wie 8M) und Guanidinhydrochlorid (wie 6M). Nach dem Entfernen des Denaturierungsmittels durch Dialyse oder dergleichen wird das Protein mit Transglutaminaseaktivität regeneriert. Lösungsmittel, die für die Dialyse einsetzbar sind, sind Phosphorsäurepufferlösung, Trishydrochloridpufferlösung usw. Das Denaturierungsmittel kann nicht nur durch Dialyse, sondern auch durch Verdünnung, Ultrafiltration und dergleichen entfernt werden. Die Regenerierung der Aktivität kann durch eine beliebige dieser Techniken durchgeführt werden.
Nach der Regenerierung der Aktivität kann das aktive Protein durch eine geeignete Kombination bekannter Trenn- und Präzipitationsverfahren, wie Aussalzen, Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese, Ionenaustauscherchromatografie, Affinitätschromatografie, Umkehrphasen-HPLC und Elektrophorese zum isoelektrischen Punkt getrennt und gereinigt werden.
(2) Die vorliegende Erfindung stellt ein Protein mit Transglutaminaseaktivität bereit, das eine Sequenz im Bereich von dem Serinrest an der zweiten Position bis zum Prolinrest an der 331. Position in der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1 hat.
Die N-Terminie von MTG, hergestellt durch die mit der rekombinanten DNA, die eine DNA der SEQ ID No: 3 enthält, hergestellten Transformante, wurde analysiert, wobei gefunden wurde, dass die meisten einen (Formyl)methioninrest des Initiationscodons enthielten.
Wenn jedoch ein Gen, das für ein exogenes Protein kodiert, in E. coli exprimiert wird, wird das Gen so konstruiert, dass das gewünschte Protein nach dem Methioninrest, der für ATG kodiert, welches das Translationsinitiationssignal für das Gen ist, positioniert ist. Es ist bereits bekannt, dass N-terminale Methioninreste eines natürlichen Proteins, erhalten durch Translation eines Gens, durch Methioninaminopeptidase effizienter gespalten werden. Die N-terminalen Methioninreste werden jedoch nicht immer in dem exogenen Protein geschnitten.
Es ist bekannt, dass die Substratspezifität von Methioninaminopeptidase in Abhängigkeit von den verschiedenen Aminosäureresten, die neben dem Methioninrest liegen, variiert. Wenn der Aminosäurerest, der neben dem Methioninrest liegt, ein Alaninrest, Glycinrest, Serinrest oder dergleichen ist, wird der Methioninrest leicht gespalten, und wenn dieser Rest Asparaginsäure, Asparagin, Lysin, Arginin, Leucin oder dergleichen ist, wird der Methioninrest nicht leicht gespalten [Nature 326, 315(1987)].
Der N-terminale Aminosäurerest von MTG ist Asparaginsäure. Wenn ein Methioninrest, der von dem Initiationscodon abgeleitet ist, direkt vor dem Asparaginsäurerest liegt, kann die Methioninaminopeptidase nur schwer auf die erhaltene Sequenz wirken, und der N-terminale Methioninrest wird üblicherweise vom Rest nicht entfernt. Da jedoch der Serinrest neben dem N-terminalen Asparaginsäurerest in MTG liegt, kann die Sequenz so konstruiert werden, dass der Aminosäurerest neben dem Methioninrest, der vom Initiationscodon abgeleitet ist, ein Serinrest ist (ein Aminosäurerest, auf dem die Methioninaminopeptidase leicht wirkt), indem der Asparaginsäurerest entfernt wird. Somit kann ein Protein mit hoher Transglutaminaseaktivität, von dem der N-terminale Methioninrest abgespalten worden ist, effizient hergestellt werden.
Das so erhaltene rekombinante Protein ist um eine Aminosäure kürzer als die natürliche MTG, die Funktion dieses Proteins ist jedoch die gleiche wie die von natürlicher MTG. Die MTG-Aktivität geht durch den Verlust der einen Aminosäure nicht verloren. Obwohl die Möglichkeit besteht, dass ein Protein mit Transglutaminaseaktivität, von dem der Methioninrest nicht abgespalten worden ist, neue Antigenizität gewinnt, geht man allgemein davon aus, dass die um mehrere Reste verkürzte Sequenz eine neue Antigenizität, welche die natürliche MTG nicht besitzt, gewinnt. Somit gibt es hinsichtlich der Sicherheit keine Probleme.
Es wurde dann eine Sequenz Met-Ser-Asp-Asp-Arg- ..... durch Deletieren des N-terminalen Asparaginsäurerests von der Transglutaminase aus Mikroorganismen (MTG) konstruiert, und dieses Protein wurde in E. coli produziert. Der Methioninrest wurde effizient entfernt, wodurch ein Protein mit der Sequenz Ser-Asp-Asp-Arg-..... erhalten wurde. Es wurde bestätigt, dass die spezifische Aktivität des so erhaltenen Proteins sich von derjenigen der natürlichen MTG nicht unterscheidet.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Transglutaminaseaktivität das eine Sequenz im Bereich vom Serinrest an der zweiten Position bis zum Prolinrest an der 331. Position in der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1 hat, wird im Folgenden beschrieben.
Eine DNA, die für ein Protein mit Transglutaminaseaktivität kodiert und eine Sequenz im Bereich vom Serinrest an der zweiten Position bis zum Prolinrest an der 331. Position in der Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 1 hat, wird als MTG-Strukturgen auf einer rekombinanten DNA, die für die Expression von MTG geeignet ist, eingesetzt. Genauer gesagt wird eine DNA mit der Sequenz im Bereich der Thyminbase an der vierten Position bis zur Guaninbase an der 993. Position in der Basensequenz der SEQ ID No: 2 verwendet.
Die N-terminale Sequenz kann durch übliche DNA-Rekombinationstechniken oder durch ortsspezifische Mutagenesetechniken, eine Technik, worin PCR für die gesamte Länge oder eine Teillänge des MTG-Gens eingesetzt wird, oder eine Technik, worin der Teil der zu ändernden Sequenz mit einem synthetischen DNA-Fragment durch eine Restriktionsenzymbehandlung ausgetauscht ist, verändert werden.
Die auf diese Weise mit der rekombinanten DNA transformierte Transformante wird in einem Medium kultiviert, um ein Protein mit Transglutaminaseaktivität zu produzieren, und das Protein wird gewonnen. Die Verfahren zur Herstellung der Transformante und zur Produktion des Proteins sind dieselben wie vorstehend beschrieben.
Da das so hergestellte Protein die Sequenz Met-Ser ... hat, von dem Methioninrest leicht durch Methioninaminopeptidase gespalten wird, wird der Methioninrest in der Zelle von E. coli abgespalten, wodurch ein Protein erhalten wird, das mit dem Serinrest beginnt.
Obwohl MTG mit einem N-terminalen Methioninrest in der Natur nicht vorhanden ist, haben die Erfinder gefunden, dass in einigen natürlichen MTG der Asparaginsäurerest deletiert ist, wodurch der N-terminale Rest Serin ist. Obwohl ein Protein mit einem N-terminalen Methioninrest sich somit von der natürlichen MTG in der Sequenz unterscheidet, wird ein Protein mit einem N-terminalen Serinrest von der Sequenz der natürlichen MTG umfasst, und zusätzlich ist ein Protein mit einer solchen Sequenz tatsächlich in der Natur vorhanden. Somit kann gesagt werden, dass eine solche MTG einer natürlichen MTG entspricht. Bei der Herstellung eines für Nahrungsmittel einzusetzenden Enzyms, wie MTG, worin die Proteinantigenizität ein erhebliches Problem ist, ist es wichtig, ein Protein mit Transglutaminaseaktivität zu produzieren, dessen Sequenz einer natürlichen MTG entspricht, anders ausgedrückt, eine Sequenz herzustellen, von der der N-terminale Methioninrest gespalten worden ist.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter, sie ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Beispiel
Großproduktion von MTG in E. coli:
<1> Konstruktion des MTG-Expressionsplasmids pTRPMTG-01:
Das MTG-Gen ist bereits vollständig unter Berücksichtigung der Häufigkeit der verwendeten Codons in E. coli und Hefe synthetisiert worden (J. P. KOKAI Nr. Hei 5-199883). Dessen Gensequenz war jedoch nicht optimal für die Expression in E. coli. Das heißt, alle Codons der 30 Argininreste waren AGA (unbedeutendere Codons). Angesichts dessen wurden etwa 200 Basen vom N-Terminus des MTG-Gens erneut synthetisiert, um eine optimale Sequenz für die Expression im E. coli zu erhalten.
Als Promotor für die Transkription des MTG-Gens wurde der trp-Promotor eingesetzt, der die Transkription in einem Medium, das kein Tryptophan enthält, leicht durchführt. Das Plasmid pTTG2-22 (J. P. KOKAI Nr. Hei 6-225775) für die starke Expression des Transglutaminase(TG)-Gens von Pagrus major wurde mit dem trp-Promotor erhalten. Die Sequenz stromaufwärts des TG-Gens von Pagrus major wurde so konstruiert, dass ein fremdes Protein in E. coli stark exprimiert wird.
Bei der Konstruktion von pTRPMTG-01 wurde das DNA-Fragment von der ClaI-Schnittstelle stromabwärts vom trp-Promotor bis zur BglII-Schnittstelle stromabwärts des Expressionsplasmids für Pagrus major TG pTTG2-22 (J. P. KOKAI Hei 6-225775) durch das ClaI/HpaI-Fragment des synthetischen DNA-Gens und das HpaI/BamHI-Fragment (kleines Fragment) von pGEM15BTG ersetzt (J. P. KOKAI Hei 6-30771).
Das ClaI/HpaI-Fragment des synthetischen DNA-Gens hat eine Basensequenz von der ClaI-Schnittstelle stromabwärts des trp-Promotors von pTTG2-22 bis zum Translationsinitiationscodon und 216 Basen vom N-Terminus des MTG-Gens. Die Basensequenz in dem MTG-Strukturgen wurde ausgehend von der Häufigkeit der Verwendung der Codons in E. coli für die Expression in E. coli optimiert. Zur Vermeidung der Bildung hoch strukturierter mRNA wurde der dritte Buchstabe des degenerierten Codons in der Domäne des für den N-Terminus kodierenden Teils in einen Codon umgewandelt, das reich an Adenin und Uracil war, um die Anordnung gleicher Basen so weit wie möglich zu vermeiden.
Das ClaI/HpaI-Fragment des synthetischen DNA-Gens wurde so konstruiert, dass es EcoRI- und HindIII-Schnittstellen am Terminus hatte. Das konstruierte Gen wurde in zwei Blöcke geteilt, die jeweils 40 bis 50 Basen umfassten, sodass die +-Kette und die –-Kette miteinander überlappten. 12 DNA-Fragmente, die der jeweiligen Sequenz entsprachen, wurden synthetisiert (SEQ ID No: 4 bis 15). Der 5'-Terminus der synthetischen DNA wurde phosphatiert. Damit zu paarende synthetische DNA-Fragmente wurden hybridisiert, und sie wurden miteinander verbunden. Nach der Acrylamidgel-Elektrophorese wurden die DNA-Fragmente einer gewünschten Größe herausgenommen und in die EcoRI/HindIII-Schnittstelle von pUC19 eingefügt. Die Sequenz wurde bestätigt, und die korrekte Sequenz wurde als pUCN216 bezeichnet. Aus pUCN216 wurde ein ClaI/HpaI-Fragment (kleines Fragment) herausgenommen und für die Konstruktion von pTRPMTG-01 verwendet.
<2> Konstruktion des MTG-Expressionsplasmids pTRPMTG-02:
Da E. coli JM109, das pTRPMTG-01 enthielt, die MTG nicht stark exprimierte, wurden Teile (777 Basen), die nicht die geänderten Teile am N-Terminus von MTG waren, auf geeignete Weise für E. coli verändert. Da es schwierig ist, 777 Basen gleichzeitig zu synthetisieren, wurde die Sequenz unter Berücksichtigung der Häufigkeit der Verwendung von Codons in E. coli bestimmt, und dann wurden 4 Blöcke (B1, 2, 3 und 4), die jeweils etwa 200 Basen enthielten, dafür synthetisiert. Jeder Block wurde so konstruiert, dass er am Terminus eine EcoRI/HindIII-Schnittstehle hatte. Das konstruierte Gen wurde in Blöcke von etwa 40 bis 50 Basen geteilt, sodass die +-Kette und die –-Kette miteinander überlappten. 10 DNA-Fragmente derselben Sequenz wurden für jeden Block synthetisiert und somit wurden insgesamt 40 Blocks synthetisiert (SEQ ID No: 16 bis 55). Der 5'-Terminus der synthetischen DNA wurde phosphatiert. Damit zu paarende synthetische DNA-Fragmente wurden hybridisiert, und sie wurden miteinander verbunden. Nach Acrylamidgel-Elektrophorese wurde die DNA einer gewünschten Größe herausgenommen und in die EcoRI/HindIII-Schnittstellen von pUC19 eingefügt. Die Basensequenz jeder dieser DNAs wurde bestätigt, und die korrekte Sequenz wurde als pUCBl, B2, B3 und B4 bezeichnet. 2 zeigt, dass B1 mit B2 verbunden war und B3 mit B4 verbunden war. Durch Ersetzen eines korrespondierenden Teils von pTRPMTG-01 wurde pTRPMTG-02 konstruiert. Die Sequenz des stark exprimierenden MTG-Gens, das auf pTRPMTG-02 vorhanden war, ist in SEQ ID No: 3 gezeigt.
<3> Konstruktion des MTG-Expressionsplasmids pUCTRPMTG-02(+), (–):
Da E. coli JM109, welches pTRPMTG-02 enthielt, auch die MTG nicht stark exprimierte, wurde das Plasmid mehrfach kopiert. Ein EcoO109I-Fragment (kleines Fragment), welches den trp-Promotor von pTRPMTG-02 enthielt, wurde geglättet und dann in die HincII-Schnittstelle von pUC19, welches ein Mehrkopienplasmid ist, eingebaut. pUCTRPMTG-02(+), worin der lacZ-Promotor und der trp-Promotor in derselben Richtung angeordnet sind, und pUCTRPMTG-02(–), worin sie in Gegenrichtung angeordnet sind, wurden konstruiert.
<4> Expression von MTG:
E. coli JM109, transformiert mit pUCTRPMTG-02(+) und pUC19, wurde durch Schütteln in 3 ml 2xYT-Medium, enthaltend 150 μg/ml Ampicillin, bei 37°C während 10 Stunden kultiviert (Vorkultur). 0,5 ml der Kultursuspension wurden zu 50 ml 2xYT-Medium, enthaltend 150 μg/ml Ampicillin, gegeben, und es wurde eine Schüttelkultur bei 37°C während 20 Stunden durchgeführt.
Die Zellen wurden aus der Kultursuspension gewonnen und durch Ultraschallzerstörung aufgebrochen. Die Ergebnisse der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese der gesamten Fraktion, des Überstands und der Präzipitationsfraktionen, die beide durch Zentrifugation erhalten wurden, sind in 3 gezeigt. Die starke Expression des Plasmids mit einem Molekulargewicht, das demjenigen von MTG identisch war, wurde in der gesamten Fraktion der aufgebrochenen pUCTRPMTG-02(+)/JM109-Zellen und in der Präzipitationsfraktion, die durch Zentrifugation erhalten wurde, beobachtet. Es wurde durch Western Blotting bestätigt, dass das Protein mit Anti-MTG-Antikörpern aus Maus reagierte. Die Expression des Proteins war 500 bis 600 mg/l. Eine ausreichend starke Expression wurde selbst dann erhalten, wenn 3-β-Indolacrylsäure zu dem Produktionsmedium nicht gegeben wurde.
Außerdem wurde mit MTG-Antikörpern gegen Maus ein Western Blotting durchgeführt, um festzustellen, dass MTG in der Über standsfraktion, die durch Zentrifugation erhalten wurde, nur leicht exprimiert wurde und dass die exprimierte MTG im Wesentlichen vollständig in der Form eines unlöslichen Proteineinschlusskörpers vorlag.
<5> Konstruktion des MTG-Expressionsplasmids pTRPMTG-00:
Um zu beweisen, dass der Austausch in dem Codon des MTG-Gens eine deutliche Erhöhung der Expression bewirkte, wurde pTRPMTG-00, welches pTRPMTG-02 entsprach, worin jedoch das MTG-Gen gegen eine Gensequenz ausgetauscht war, die vorher vollständig synthetisiert worden war (J. P. KOKAI Nr. Hei 6-30771), konstruiert.
Das Plasmid pTRPMTG-00 wurde durch Verbinden des PvuII/PstI-Fragments (kleines Fragment) aus dem Expressionsplasmid für Pagrus major TG, pTRPMTG-02, mit dem PstI/HimdIII-Fragment (kleines Fragment, einschließlich PvuII-Schnittstelle) und dem PvuII/HindIII-Fragment (kleines Fragment) von pGEM15BTG konstruiert (J. P. KOKAI Nr. Hei 6-30771).
<6> Konstruktion des MTG-Expressionsplasmids pUCTRPMTG-00(+), (-):
Das Plasmid pTRPMTG-00 wurde mehrfach kopiert. Das EcoO109I-Fragment (kleines Fragment), welches den trp-Promotor und den trpA-Terminator von pTRPMTG-00 enthielt, wurde geglättet und dann in die HincII-Schnittstelle von pUCl9, einem Mehrkopienplasmid, eingebaut. Das Plasmid pUCTRPMTG-00(+), worin der lacZ-Promotor und der trp-Promotor in derselben Richtung angeordnet waren, und das Plasmid pUCTRPMTG-00(–), worin die Anordnung in entgegengesetzter Richtung war, wurden konstruiert.
<7> Vergleich der MTG-Expressionen:
E. coli JM109, transformiert mit pUCTRPMTG-02 (+) oder (–), pUCTRPMTG-00 (+) oder (–), pTRPMTG-02, pTRPMTG-01, pTRPMTG-00 oder pUC19 wurden durch Schütteln in 3 ml eines 2xYT-Mediums, enthaltend 150 μg/ml Ampicillin, bei 37°C während 10 Stunden kultiviert (Vorkultur). 0,5 ml der Kultursuspension wurden zu 50 ml 2xYT-Medium, enthaltend 150 μg/ml Ampicillin, gegeben, und dann wurde die Schüttelkultur bei 37°C während 20 Stunden durchgeführt.
Die Zellen wurden aus der Kultursuspension gewonnen, und deren MTG-Expression wurde bestimmt, wobei die in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse erhalten wurden. Es wurde gefunden, dass das neu konstruierte E. coli, enthaltend pTRPMTG-00, pUCTRPMTG-00 (+) oder (–), MTG nicht stark exprimierten. Diese Ergebnisse zeigen, dass es für eine hohe Expression von MTG erforderlich ist, das Codon des MTG-Gens in ein Codon für E. coli zu ändern und auch das Plasmid mehrfach zu kopieren.
Tabelle 1
<8> Analyse der N-terminalen Aminosäure der exprimierten MTG:
Der N-terminale Aminosäurerest der Proteineinschlusskörper der exprimierten MTG wurde analysiert, wobei gefunden wurde, dass etwa 60% der Sequenz des N-Terminus Methioninreste und etwa 40% Formylmethioninreste waren. Der (Formyl)methioninrest, der dem Initiationscodon entspricht, wurde durch die nachstehend beschriebene Technik entfernt.
<9> Deletion des N-terminalen Asparaginsäurerests von MTG:
Eine Basensequenz, die dem Asparaginsäurerest (dem N-Terminus von MTG) entsprach, wurde durch PCR unter Einsatz von pUCN216, enthaltend 216 Basen, als Matrize entfernt. pUCN216 ist ein Plasmid, das durch Klonieren von etwa 216 Basenpaaren, enthaltend das ClaI-HpaI-Fragment des N-Terminus von MTG, in die EcoRI/HindIII-Schnittstelle von pUC19 erhalten wurde. pF01 (SEQ ID No. 56) und pR01 (SEQ ID No. 57) sind Primer mit jeweils einer Sequenz in dem Vektor, pDELD (SEQ ID No. 58) wurde durch Deletieren einer Basensequenz, die dem Asparaginsäurerest entspricht, erhalten. pHd01 (SEQ ID No. 59) wurde durch Ersetzen von C durch G erhalten, um die HindIII-Schnittstelle nicht zu enthalten. pF01 und pDELD sind Sinn-Primer und pR01 und pHd01 sind Gegensinn-Primer.
Es wurden 35 Zyklen der PCR einer Kombination von pF01 und pHd01, und eine Kombination von pELD und pR01 für pUCN216 bei 94°C während 30 Sekunden, bei 55°C während einer Minute und bei 72°C während zwei Minuten durchgeführt. Jedes PCR-Produkt wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 100 μl H₂O gelöst.
1 μl jedes PCR-Produkts wurde entnommen und miteinander gemischt. Nach der Hitzedenaturierung bei 94°C während 10 Minuten wurden 35 Zyklen der PCR einer Kombination von pF01 und pHd01 bei 94°C während 30 Sekunden, bei 55°C während einer Minute und bei 72°C während 2 Minuten durchgeführt.
Das zweite PCR-Produkt wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und mit HindIII und EcoRI behandelt. Nach der Subklonierung von pUC19 wurde pUCN216D erhalten ( 5). Die Sequenz des erhaltenen pUCN216D wurde als die gewünschte bestätigt.
<10> Konstruktion des Plasmids, das für MTG kodiert, welcher die N-terminale Asparaginsäure fehlt:
Das Eco0109I/Hpa1-Fragment (kleines Fragment) von pUCN216D wurde mit dem Eco0109I/Hpa1-Fragment (großes Fragment) von pUCB1-1 (Plasmid, das durch Klonieren des HpaII/BglII-Fragments des MTG-Gens in die EcoRI/HindIII-Schnittstelle von pUC19 erhalten wurde) kombiniert, wobei pUCNB1-2D erhalten wurde. Außerdem wurde das ClaI/BglII-Fragment (kleines Fragment) von pUCNBl-2D mit dem ClaI/B/BglIII-Fragment (großes Fragment) von pUCTRPMTG-02(+), welches ein Plasmid für die starke MTG-Expression ist, kombiniert, wobei pUC TRPMTG(+)D2 erhalten wurde, das Expressionsplasmid von MTG, dem die N-terminale Asparaginsäure fehlt (6). Es wurde ein Plasmid erhalten, das das MTG-Gen enthält, dem GAI fehlt, das dem Asparaginsäurerest entspricht, was in 7 gezeigt ist.
<11> Expression des Plasmids, das für MTG kodiert, der die N-terminale Asparaginsäure fehlt:
E. coli JM109, das mit pUCTRPMTG(+)D2 transformiert war, wurde durch Schütteln in 3 ml eines 2xYT-Mediums, enthaltend 150 μg/ml Ampicillin, bei 37°C während 10 Stunden kultiviert (Vorkultur). 0,5 ml der Kultursuspension wurden zu 50 ml eines 2xYT-Mediums, enthaltend 150 μg/ml Ampicillin, gegeben, und dann wurde eine Schüttelkultur bei 37°C während 20 Stunden durchgeführt. Die Zellen wurden durch Ultraschallzerstörung aufgebrochen. Die Ergebnisse der Färbung mit Coomassie Brilliant Blue-Färbung und des Western Blottings mit Anti-MTG-Antikörper aus Maus unter Einsatz der so erhaltenen Über standsflüssigkeit und des Präzipitats zeigten, dass das MTG-Protein, dem der N-terminale Asparaginsäurerest fehlt, in dem Präzipitat, das durch Ultraschallzerstörung erhalten wurde, nämlich in der unlöslichen Fraktion, nachgewiesen wurde. Diese Tatsache weist daraufhin, dass das MTG-Protein, dem der N-terminale Asparaginsäurerest fehlt, als Proteineinschlusskörper in den Zellen akkumuliert wurde.
Die N-terminale Aminosäuresequenz der Proteineinschlusskörper wurde analysiert, und es wurde gefunden, dass etwa 90% davon Serin war, was in 8 gezeigt ist.
Die Ergebnisse der Analyse der N-terminalen Aminosäuren der exprimierten MTG, die in <8> und <11> erhalten wurde, wurden wie in Tabelle 2 gezeigt, miteinander verglichen. Es wurde gefunden, dass durch Entfernung des N-terminalen Asparaginsäurerests von MTG das Initiationsmethionin, das zu dem N-Terminus der exprimierten MTG angehängt wurde, effizient entfernt wurde.
Tabelle 2
<12> Auflösung von MTG-Einschlusskörpern, denen die N-terminale Asparaginsäure fehlt, Renaturierung der Aktivität und Bestimmung der spezifischen Aktivität:
MTG-Einschlusskörper, denen die Asparaginsäure fehlt, wurden durch wiederholte Zentrifugation teilweise gereinigt und dann in 8 M Harnstoff [50 mM Phosphatpuffer (pH 5,5)] gelöst, wobei die 2 mg/ml-Lösung erhalten wurde. Präzipitate wurden aus der Lösung durch Zentrifugation entfernt, und die Lösung wurde auf eine Konzentration von 0,5 M Harnstoff mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 5,5) verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 5,5) weiter dialysiert, um Harnstoff zu entfernen. Gemäß dem Mono-S-Säulentest wurde der Peak mit der TG-Aktivität bei einer NaCl-Konzentration im Bereich von 100 bis 150 mM eluiert. Die spezifische Aktivität der Fraktion wurde durch das Hydroxamatverfahren bestimmt, wobei gefunden wurde, dass die spezifische Aktivität der Asparaginsäurerest fehlt, etwa 30 U/mg war. Dieser Wert ist gleich der spezifischen Aktivität natürlicher MTG. Es ist deshalb offensichtlich, dass das Fehlen des Asparaginsäurerests auf die spezifische Aktivität keinen Einfluss hat.
SEQUENZLISTE

Claims

Protein mit Transglutaminaseaktivität, welches eine Sequenz umfasst, die von dem Serinrest an der zweiten Position bis zu dem Prolinrest an der 331. Position einer Aminosäuresequenz der SEQ ID No. 1 reicht, worin die N-terminale Aminosäure des Proteins der Serinrest an der zweiten Position der SEQ ID No. 1 ist.
Protein nach Anspruch 1, welches aus einer Aminosäuresequenz besteht, die von dem Serinrest an der zweiten Position bis zu dem Prolinrest an der 331. Position einer Aminosäuresequenz der SEQ ID No. 1 reicht.
DNA, welche für das Protein nach Anspruch 1 kodiert.
DNA, welche für das Protein nach Anspruch 2 kodiert.
DNA nach Anspruch 3, worin die Basensequenz, welche für Arg an der 4. Position, ausgehend von der N-terminalen Aminosäure, kodiert, CGT oder CGC ist und die Basensequenz, welche für Val an der fünften Position, ausgehend von der N-terminalen Aminosäure, kodiert, GTT oder GTA ist.
DNA nach Anspruch 5, worin die Basensequenz, welche von der N-terminalen Aminosäure bis zur Aminosäure an der fünften Position für Ser-Asp-Asp-Arg-Val kodiert, die folgende Sequenz hat: Ser: TCT oder TCC Asp: GAC oder GAT Asp: GAC oder GAT Arg: CGT oder CGC Val: GTT oder GTA
DNA nach Anspruch 6, worin die Basensequenz, welche von der N-terminalen Aminosäure bis zur Aminosäure an der fünften Position für die Aminosäuresequenz Ser-Asp-Asp-Arg-Val kodiert, die Sequenz TCT-GAC-GAT-CGT-GTT hat.
DNA nach Anspruch 6 oder 7, worin die Basensequenz, welche von der Aminosäure an der sechsten Position bis zur Aminosäure an der neunten Position, ausgehend von der N-terminalen Aminosäure, für die Aminosäuresequenz Thr-Pro-Pro-Ala kodiert, die folgende Sequenz hat: Thr: ACT oder ACC Pro: CCA oder CCG Pro: CCA oder CCG Ala: GCT oder GCA
DNA, welche aus einer Sequenz besteht, die von der Thyminbase an der fünften Position bis zu der Guaninbase an der 993. Position in der Basensequenz der SEQ ID No. 2 reicht.
Rekombinante DNA mit der DNA nach einem der Ansprüche 3, 5 und 6 bis 8.
Rekombinante DNA nach Anspruch 10, welche einen unter trp, tac, lac, trc, λ PL und T7 ausgewählten Promotor hat.
Mikroorganismus, erhalten durch Transformation mit der rekombinanten DNA nach Anspruch 10.
Mikroorganismus nach Anspruch 12, worin eine Transformation unter Verwendung eines multicopy-Vektors durchgeführt wird.
Mikroorganismus nach Anspruch 12, welcher zu Escherichia coli gehört.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Transglutaminaseaktivität, welches die Stufen des Kultivierens des Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 12 bis 14 in einem Medium zur Herstellung des Proteins mit Transglutaminaseaktivität und das Gewinnen des Proteins umfasst.