CN113528479B - 一种转谷氨酰胺酶的高效制备方法及其专用工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转谷氨酰胺酶的高效制备方法及其专用工程菌。本发明提供了一种蛋白质，为序列表的序列2所示的蛋白质。本发明还保护将表达所述蛋白质的DNA分子导入谷氨酸棒状杆菌得到的重组微生物。所述重组微生物可用于制备转谷氨酰胺酶。本发明将来源于茂源链霉菌的MTG在T7启动子下进行表达，并在MTG的pro区与成熟区之间插入ΔICM内含肽成功实现了MTG在谷氨酸棒杆菌中的高效表达，发酵所得菌体经超声破碎后，无需蛋白酶处理或者其他条件改变，即可得到具有生物活性的MTG。本发明可用于制备转谷氨酰胺酶，进而应用于组织工程、纺织品和皮革加工等领域，具有应用推广价值。

Description

一种转谷氨酰胺酶的高效制备方法及其专用工程菌

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转谷氨酰胺酶的高效制备方法及其专用工程菌。

背景技术

转谷氨酰胺酶(Transglutaminase，EC 2.3.2.13，TGase)是一种通过异肽键[ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸]来催化蛋白质或多肽链之间的酰基转移反应的转移酶。它可以催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与各种酰基受体发生反应，实现蛋白质分子内、分子间交联，从而极大地改变蛋白质的性质。由于其优良的交联性能，目前已广泛应用于食品和制药等行业以改善产品的硬度，粘度，弹性和持水能力等。TGase在自然界中广泛存在。1989年，微生物来源的TGase(Microbial TGase，MTG)被首次发现，与其它来源TGase相比，MTG不受Ca²⁺或鸟嘌呤5'-三磷酸(GTP)的调节。由于一些蛋白质如酪蛋白、大豆球蛋白和肌球蛋白等对Ca²⁺敏感且容易被Ca²⁺沉淀，这就使得MTG在食品工业中具有更广泛的应用价值。此外，MTG具有更广泛的底物特异性，较低的脱酰胺活性，并且可以通过传统发酵技术降低生产成本等特点，使其在食品、生物制药、化妆品、纺织等领域有着更广泛的应用前景，尤其是在食品工业中，是生产各种新型蛋白类加工产品的重要酶制剂。

内含肽是一种能够实现自我剪接的功能元件。目前为止，经过鉴定的约340个内含肽中的大多数都由两个结构和功能独立的结构域组成，即核酸内切酶结构域和剪接结构域。recA是一种来源于结核分枝杆菌的含有440个氨基酸的内含肽。经过不断的优化改造，最终确定保留其第1-110和383-440位残基是保留其剪切功能的最小作用单元。通过定向进化，确定含有两个突变位点即V67L和D422G的ΔICM能够增强其C端剪切活性并且这种剪切活性对pH有较强的敏感性。

MTG通常以无活性的酶原形式(pro-MTG)分泌到胞外，经蛋白酶作用切除掉酶原区(pro区)，才能形成有活性的成熟MTG。而pro区对MTG形成正确的空间构型并分泌到胞外具有重要的作用。目前MTG已在多种不同的表达系统中实现表达，但是依然存在包涵体，后期需蛋白酶二次处理等问题。也有一些研究利用内含肽在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中成功实现了MTG的表达，但是仍需经过pH或者温度变化的二次处理来实现pro区的剪切，极大的增加了工业生产成本及时间成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种转谷氨酰胺酶的高效制备方法及其专用工程菌。

本发明提供了一种蛋白质(蛋白质甲)，为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列2第1-546位氨基酸残基所示的蛋白质；

(a2)序列表的序列2所示的蛋白质。

编码所述蛋白质甲的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述蛋白质甲的DNA分子也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子具体为如下(b1)至(b6)中的任一：

(b1)编码区如序列表的序列1第6389-8023位核苷酸所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表的序列1第6386-8023位核苷酸所示的DNA分子；

(b3)编码区如序列表的序列1第6389-8041位核苷酸所示的DNA分子；

(b4)编码区如序列表的序列1第6386-8041位核苷酸所示的DNA分子；

(b5)编码区如序列表的序列1第6389-8044位核苷酸所示的DNA分子；

(b6)编码区如序列表的序列1第6386-8044位核苷酸所示的DNA分子。

具有所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组微生物均属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体为如下(c1)或(c2)：

(c1)具有序列表的序列1第6304-8044位核苷酸的重组载体；

(c2)如序列表的序列1所示的重组载体。

所述重组微生物是所述重组载体导入谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)得到的。

所述谷氨酸棒状杆菌具体可为谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum T7。

谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum T7是将T7-Plac导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032得到的重组菌。谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum T7是将T7-Plac整合到谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA后得到的重组菌。T7-Plac为序列表的序列4第537-4951位核苷酸组成的DNA分子。

与谷氨酸棒杆菌ATCC13032相比，谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum T7的差异仅在于：用序列表的序列4第17-5461位核苷酸所示的双链DNA分子取代了谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA中的序列表的序列5所示的双链DNA分子。

本发明还保护所述蛋白质甲或者所述核酸分子或者所述DNA分子或者所述表达盒或者所述重组载体或者所述重组微生物在制备转谷氨酰胺酶中的应用。

本发明还保护一种制备转谷氨酰胺酶的方法，包括如下步骤：培养所述重组微生物。

制备转谷氨酰胺酶的方法还包括如下步骤：完成所述培养后，收集菌体并进行菌体破碎。

制备转谷氨酰胺酶的方法还包括如下步骤：完成所述菌体破碎后收集上清液。

制备转谷氨酰胺酶的方法还包括如下步骤：取所述上清液，通过镍柱亲和层析收集具有His₆标签的蛋白质。

制备转谷氨酰胺酶的方法还包括如下步骤：完成镍柱亲和层析后，脱盐并更换溶剂体系。溶剂体系具体可为pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液。

培养所述重组微生物的方法具体包括如下步骤：

(1)采用液态培养基培养所述重组微生物至OD_600nm值＝1；

(2)完成步骤(1)后，向培养体系中加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.1-1mM，然后进行培养。

步骤(1)的培养条件可为：30℃、200r/min振荡培养。

步骤(2)的培养条件可为：16-30℃培养。

步骤(2)的培养条件可为：25℃、200r/min振荡培养48h。

IPTG在体系中的浓度具体可为0.5mM。

所述液态培养基具体可为含17μg/mL氯霉素的发酵培养基。

本发明还保护一种蛋白质(蛋白质乙)，自N端至C端依次由如下元件组成：MTG的pro区、ΔICM内含肽、氨基酸残基M、MTG的成熟区。

MTG即微生物来源的转谷氨酰胺酶。

MTG具体为来源于茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的MTG。

MTG的pro区如序列表的序列2第2至46位氨基酸残基所示，或者如序列表的序列2第1至46位氨基酸残基所示。

ΔICM内含肽为含有两个突变位点即V67L和D422G的ΔICM内含肽。

ΔICM内含肽如序列表的序列2第47-214位氨基酸残基所示。

MTG的成熟区如序列表的序列2第216-546位氨基酸残基所示。

编码所述蛋白质乙的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述蛋白质乙的DNA分子也属于本发明的保护范围。

具有所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组微生物均属于本发明的保护范围。

所述重组微生物可用于生产转谷氨酰胺酶。

所述重组微生物是将所述重组载体导入谷氨酸棒状杆菌得到的。

本发明还保护一种蛋白质(蛋白质丙)，自N端至C端依次包括如下区段：蛋白质乙、蛋白质标签。所述蛋白质标签具体可为His₆标签。

编码所述蛋白质丙的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述蛋白质丙的DNA分子也属于本发明的保护范围。

具有所述DNA分子的表达盒、重组载体或重组微生物均属于本发明的保护范围。

所述重组微生物是将所述重组载体导入谷氨酸棒状杆菌得到的。

所述重组微生物可用于生产转谷氨酰胺酶。

本发明将来源于茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的MTG在T7启动子下进行表达，并在MTG的pro区与成熟区之间插入ΔICM内含肽成功实现了MTG在谷氨酸棒杆菌中的高效表达，发酵所得菌体经超声破碎后，无需蛋白酶处理或者其他条件改变，即可得到具有生物活性的MTG。

本发明得到的重组微生物，25℃发酵48h酶活可达13U/mL。

本发明可用于制备转谷氨酰胺酶，进而应用于组织工程、纺织品和皮革加工等领域，具有应用推广价值。

附图说明

图1为实施例2的步骤五中的蛋白电泳图。

图2为实施例3中的最适反应温度结果图。

图3为实施例3中的温度稳定性结果图。

图4为实施例3中的最适pH结果图。

图5为实施例3中的pH稳定性结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。L-谷氨酸-γ-单羟基肟酸：sigma，产品编号G2253。N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸(N-CBZ-Gln-Gly)：sigma，产品编号C6154。谷氨酸棒杆菌ATCC13032即ATCC13032的谷氨酸棒杆菌。

脑心浸出液肉汤培养基(液体BHI培养基)：将37g复合干粉溶于水并定容至1L。复合干粉：北京润泽康生物科技有限公司，品牌OXOID，货号CM1135B。

发酵培养基(pH7.0)：3-(N-吗啉基)丙磺酸21g、尿素5g、硫酸铵5g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾1g、酵母粉2g、葡萄糖40g、硫酸镁0.25g、氯化钙0.01g、生物素0.2mg、微量元素溶液1mL，用水补足至1L。微量元素溶液：FeSO₄·7H₂O 16.4g、MnSO₄·H₂O 100mg、CuSO₄200mg、ZnSO₄·7H₂O 1g、NiCl₂·6H₂O 20mg，用水补足至1L。

实施例1、构建重组质粒和重组菌

一、构建重组质粒

1、构建重组质粒pXMJ19-pro-ΔICM-MTG。

重组质粒pXMJ19-pro-ΔICM-MTG为环形质粒，如序列表的序列1所示。

序列表的序列1中，第6304-6322位核苷酸组成T7启动子，第6323-6347位核苷酸组成lac operator，第6350-6385位核苷酸组成RBS，第6386-8044位核苷酸为完整的开放阅读框(编码融合蛋白)。序列表的序列1中，第6386-6388位为起始密码子，第6389-6523位核苷酸编码pro区，第6524-7027位核苷酸编码ΔICM内含肽，第7028-7030位核苷酸编码氨基酸残基M，第7031-8023位核苷酸编码成熟MTG，第8024-8041位核苷酸编码His₆标签，第8042-8044位核苷酸为终止密码子。

融合蛋白如序列表的序列2所示。序列表的序列2中，第47-214位氨基酸残基组成ΔICM内含肽，第215位氨基酸残基为M，第216-546位氨基酸残基组成成熟MTG，第547-552位氨基酸残基组成His₆标签。

由于ΔICM内含肽的存在，融合蛋白发生自剪切(剪切位点为序列2的第214位氨基酸残基和第215位氨基酸残基之间)，得到序列表的序列3所示的MTG-His₆蛋白。

2、构建重组质粒pXMJ19-pro-MTG。

与重组质粒pXMJ19-pro-ΔICM-MTG相比，重组质粒pXMJ19-pro-MTG的差异仅在于缺少了编码ΔICM内含肽的部分(即缺少了序列表的序列1中的第6524-7027位核苷酸)。

二、构建谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum T7

1、采用限制性内切酶BamHI酶切pK18mobsacB质粒，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)连接线性化质粒和T7同源重组片段，获得的重组质粒命名为重组质粒pK18-T7。

T7同源重组片段为序列表的序列4所示的双链DNA分子。序列表的序列4中，第17-502位核苷酸组成上游同源臂，第537-4951位核苷酸组成T7-Plac，第4955-5461位核苷酸组成下游同源臂。

2、将重组质粒pK18-T7电转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032(电击条件：电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF)，通过两次筛选获得重组菌(在含25mg/L卡那霉素的BHI平板上进行第一次筛选得到单交换重组菌，之后在液体BHI培养基中培养过夜，之后在含200g/L蔗糖的BHI平板上进行二次筛选得到同源重组双交换菌株)，即为谷氨酸棒状杆菌C.glutamicumT7。

3、进行测序验证。

与谷氨酸棒杆菌ATCC13032相比，谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum T7的差异仅在于：用序列表的序列4第17-5461位核苷酸所示的双链DNA分子取代了谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA中的序列表的序列5所示的双链DNA分子。谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA如GenBank:NC_003450所示。

三、构建重组菌

将重组质粒pXMJ19-pro-ΔICM-MTG导入谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum T7，得到重组菌，命名为菌株CG-pXMJ19-pro-ΔICM-MTG。

将重组质粒pXMJ19-pro-MTG导入谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum T7，得到重组菌，命名为菌株CG-pXMJ19-pro-MTG。

实施例2、重组菌的摇瓶发酵

一、菌株CG-pXMJ19-pro-ΔICM-MTG的诱导发酵培养

1、将菌株CG-pXMJ19-pro-ΔICM-MTG单菌落接种至装有5mL含17μg/mL氯霉素的液体BHI培养基的试管中，30℃、200r/min振荡培养12h，即为种子液。

2、将1mL种子液接种至装有50mL含17μg/mL氯霉素的发酵培养基的250mL锥形瓶中，30℃、200r/min振荡培养至OD_600nm值＝1。

3、完成步骤2后，向培养体系中加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.5mM，然后25℃、200r/min振荡培养48h，此时体系OD_600nm值为20左右，此时的体系命名为发酵产物。

4、取发酵产物(菌量为：OD_600nm值×体积＝20；体积单位为ml)，12000r/min离心5min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀重悬于1mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0、50mM)，然后进行超声破碎(超声破碎参数：200W，工作5s停5s，总时间为20min)，完成超声破碎后离心(10000×g，5min)收集上清液。

二、菌株CG-pXMJ19-pro-ΔICM-MTG的非诱导发酵培养

不加入IPTG，其他同步骤一。

三、菌株CG-pXMJ19-pro-MTG的诱导发酵培养

用菌株CG-pXMJ19-pro-MTG代替菌株CG-pXMJ19-pro-ΔICM-MTG，其他同步骤一。

四、蛋白电泳

取步骤一得到的上清液，步骤二得到的上清液，步骤三得到的上清液，进行SDS-PAGE。

电泳图见图1。图1中的各个泳道：泳道1：步骤二得到的上清液；泳道2：步骤三得到的上清液；泳道3：步骤一得到的上清液；泳道M：蛋白marker。

结果表明：在不进行IPTG诱导的情况下，菌株CG-pXMJ19-pro-ΔICM-MTG不能产生目标蛋白；在没有ΔICM的情况下(即菌株CG-pXMJ19-pro-MTG)，不能产生成熟MTG。

五、检测MTG酶活的方法

MTG酶活定义：在37℃下每分钟催化生成1μmol L-谷氨酸-γ-单羟基肟酸所需要的酶量定义为1U。

MTG酶活测定方法(比色法)：①取200μL 37℃预热后的待测样本或待测样本稀释液(如无特殊说明，稀释采用的溶剂为pH6.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液)，加入500μL 37℃预热后的底物溶液，37℃反应10min，然后加入200μL终止剂，然后10000×g离心5min，收集上清液，525nm波长处测定吸光值；②以L-谷氨酸-γ-单羟基肟酸为溶质，以水为溶剂，制备不同浓度的标准品溶液，分别525nm波长处测定吸光值，制作标准曲线方程(标准曲线方程中，x为L-谷氨酸-γ-单羟基肟酸浓度，y为吸光值)；③将步骤①得到的吸光值代入步骤②得到的标准曲线方程，计算得到待测样本的MTG酶活。

底物溶液的制备方法：100mg N-CBZ-Gln-Gly溶于2mL 0.2mol/L的NaOH水溶液，然后加入4mL Tris-HCl缓冲液(pH6.0、0.2mol/L)、2mL 0.1mol/L羟胺水溶液和2mL 0.01mol/L还原型谷胱甘肽水溶液，调pH至6.0。

终止剂：含1mol/L HCl、4g/100ml三氯乙酸、5g/100ml FeCl₃·6H₂O，余量为水。

六、检测MTG酶活

取步骤一得到的上清液和步骤三得到的上清液，分别作为待测样本，检测MTG酶活，计算得到发酵产物的酶活。

步骤一得到的发酵产物的酶活为13U/mL。

步骤三得到的发酵产物的酶活为0U/mL。

七、制备MTG-His₆溶液并测序鉴定和检测酶活

1、取步骤一得到的上清液，用0.22μm滤膜过滤，然后进行镍柱亲和层析，收集含有具有目标蛋白的过柱后溶液(目标蛋白即MTG-His₆蛋白)。

2、取步骤1得到的过柱后溶液，采用3KD孔径的柱式超滤膜和pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液进行脱盐，得到以pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液为溶剂体系的蛋白溶液，将该蛋白溶液命名为MTG-His₆溶液。

3、进行N-端测序

取步骤2得到的MTG-His₆溶液，进行12.5％SDS-PAGE，将其转印到PVDF膜上，并用丽春红染色检查转印效果。送北京大学生命中心蛋白质测序实验室采用Edman法测定N-末端5个氨基酸序列为M-D-S-D-D。结果可知，菌株CG-pXMJ19-pro-ΔICM-MTG在胞内表达融合蛋白，由于ΔICM内含肽的存在，融合蛋白发生自剪切(剪切位点为序列2的第214位氨基酸残基和第215位氨基酸残基之间)，得到序列表的序列3所示的MTG-His₆蛋白。上述步骤无需二次处理，即可得到有活性的MTG-His₆蛋白。

4、检测MTG酶活

取步骤2得到的MTG-His₆溶液，作为待测样本，检测MTG酶活。

取步骤2得到的MTG-His₆溶液，采用Bradford法检测蛋白浓度。

MTG-His₆溶液的酶活除以MTG-His₆溶液的蛋白浓度，得到MTG-His₆蛋白比活力，为47U/mg。

实施例3、MTG酶学性质的研究

MTG-His₆溶液为实施例2的步骤七制备的MTG-His₆溶液。

一、最适反应温度及温度稳定性

1、最适反应温度

取MTG-His₆溶液，作为待测样本，检测MTG酶活。检测MTG酶活的方法参照实施例2的步骤五。反应温度分别设置为30℃、37℃、45℃、50℃、55℃或60℃。

将酶活最高点作为100％酶活，计算其他温度下的相对酶活。结果见图2。

将酶活最高点作为最适反应温度。最适反应温度为50℃。

2、温度稳定性

取MTG-His₆溶液，分别置于三个温度(40℃、50℃或60℃)下放置，每20分钟取样，作为待测样本，检测MTG酶活。

取MTG-His₆溶液，作为待测样本，检测MTG酶活，作为参比酶活。

检测MTG酶活的方法参照实施例2的步骤五。

将参比酶活作为100％，绘制热稳定性曲线。结果见图3。40℃处理100分钟约保留60％的活性，50℃处理20分钟活性基本丧失，60℃处理20分钟活性基本丧失。

二、最适pH及pH稳定性

底物缓冲液分别为：pH4.0、50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH5.0、50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，pH6.0、50mM的Tris-HCl缓冲液，pH7.0、50mM的Tris-HCl缓冲液，pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液，pH9.0、50mM的Tris-HCl缓冲液。

1、最适pH

取MTG-His₆溶液，用底物缓冲液稀释至10倍体积，作为待测样本，检测MTG酶活。

检测MTG酶活的方法参照实施例2的步骤五。

底物溶液的制备方法：100mg N-CBZ-Gln-Gly溶于2mL 0.2mol/L的NaOH水溶液，然后加入4mL底物缓冲液、2mL 0.1mol/L羟胺水溶液和2mL 0.01mol/L还原型谷胱甘肽水溶液，调pH至底物缓冲液的pH。

将酶活最高点作为100％酶活，计算其他pH下的相对酶活。结果见图4。

酶活最高点为最适反应pH。最适反应pH为8.0。

2、pH稳定性

取MTG-His₆溶液，用底物缓冲液稀释至10倍体积，室温放置1h，作为待测样本，检测MTG酶活。

取MTG-His₆溶液，用pH8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液稀释至10倍体积，作为待测样本，检测MTG酶活，作为参比酶活。

检测MTG酶活的方法参照实施例2的步骤五。

将参比酶活作为100％，绘制pH稳定性曲线。结果见图5。pH8.0处理1h，活性基本没影响；pH5.0-7.0处理1h，保留80％以上活性；pH4.0处理1h，保留50％以上的活性；pH9.0处理1h，保留50％以上的活性。

三、金属离子及EDTA、PMSF对酶活性的影响

取MTG-His₆溶液，作为待测样本，检测MTG酶活，作为参比酶活。

取MTG-His₆溶液，加入抑制剂并使其浓度为1mM，室温放置1h，作为待测样本，检测MTG酶活。

检测MTG酶活的方法参照实施例2的步骤五。

将参比酶活作为100％，计算各个抑制剂作用后的相对酶活。

结果见表1。Cu²⁺、Mn²⁺、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺对酶活有一定的抑制作用，但仍保留80％左右的活性。Fe²⁺对酶活有较强的抑制作用，经过处理后活性约丧失了70％。Zn²⁺对酶活抑制作用最大，经过处理后95％活性基本丧失。EDTA对酶活并没有产生抑制作用。经过PMSF处理后，活性丧失了10％左右。

表1

供试液含有的抑制剂	相对酶活(％)
		CuSO<sub>4</sub>	82.57±4.63
MnSO<sub>4</sub>	77.12±4.07
		NaCl	81.26±7.92
KCl	81.78±6.69
		CaCl<sub>2</sub>	82.96±4.46
ZnSO<sub>4</sub>	4.55±0.50
		FeSO<sub>4</sub>	28.55±0.22
MgSO<sub>4</sub>	82.01±5.09
		EDTA	98.26±2.45
PMSF	88.16±6.00

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种转谷氨酰胺酶的高效制备方法及其专用工程菌

<130> GNCYX200806

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8228

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

tagtgtgggg tctccccatg cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata aaacgaaagg 60

ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga 120

gtaggacaaa tccgccggga gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc ggagggtggc 180

gggcaggacg cccgccataa actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc atcctgacgg 240

atggcctttt tgcgtttcta caaactcttt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 300

tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 360

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 420

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 480

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 540

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 600

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 660

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 720

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 780

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 840

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 900

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat 960

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1020

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1080

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1140

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 1200

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1260

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1320

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1380

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1440

cttttggggt gggcgaagaa ctccagcatg agatccccgc gctggaggat catccagcca 1500

ttcggggtcg ttcactggtt cccctttctg atttctggca tagaagaacc cccgtgaact 1560

gtgtggttcc gggggttgct gatttttgcg agacttctcg cgcaattccc tagcttaggt 1620

gaaaacacca tgaaacacta gggaaacacc catgaaacac ccattagggc agtagggcgg 1680

cttcttcgtc tagggcttgc atttgggcgg tgatctggtc tttagcgtgt gaaagtgtgt 1740

cgtaggtggc gtgctcaatg cactcgaacg tcacgtcatt taccgggtca cggtgggcaa 1800

agagaactag tgggttagac attgttttcc tcgttgtcgg tggtggtgag cttttctagc 1860

cgctcggtaa acgcggcgat catgaactct tggaggtttt caccgttctg catgcctgcg 1920

cgcttcatgt cctcacgtag tgccaaagga acgcgtgcgg tgaccacgac gggcttagcc 1980

tttgcctgcg cttctagtgc ttcgatggtg gcttgtgcct gcgcttgctg cgcctgtagt 2040

gcctgttgag cttcttgtag ttgctgttct agctgtgcct tggttgccat gctttaagac 2100

tctagtagct ttcctgcgat atgtcatgcg catgcgtagc aaacattgtc ctgcaactca 2160

ttcattatgt gcagtgctcc tgttactagt cgtacatact catatttacc tagtctgcat 2220

gcagtgcatg cacatgcagt catgtcgtgc taatgtgtaa aacatgtaca tgcagattgc 2280

tgggggtgca gggggcggag ccaccctgtc catgcggggt gtggggcttg ccccgccggt 2340

acagacagtg agcaccgggg cacctagtcg cggatacccc ccctaggtat cggacacgta 2400

accctcccat gtcgatgcaa atctttaaca ttgagtacgg gtaagctggc acgcatagcc 2460

aagctaggcg gccaccaaac accactaaaa attaatagtc cctagacaag acaaaccccc 2520

gtgcgagcta ccaactcata tgcacggggg ccacataacc cgaaggggtt tcaattgaca 2580

accatagcac tagctaagac aacgggcaca acacccgcac aaactcgcac tgcgcaaccc 2640

cgcacaacat cgggtctagg taacactgag taacactgaa atagaagtga acacctctaa 2700

ggaaccgcag gtcaatgagg gttctaaggt cactcgcgct agggcgtggc gtaggcaaaa 2760

cgtcatgtac aagatcacca atagtaaggc tctggcgggg tgccataggt ggcgcaggga 2820

cgaagctgtt gcggtgtcct ggtcgtctaa cggtgcttcg cagtttgagg gtctgcaaaa 2880

ctctcactct cgctgggggt cacctctggc tgaattggaa gtcatgggcg aacgccgcat 2940

tgagctggct attgctacta agaatcactt ggcggcgggt ggcgcgctca tgatgtttgt 3000

gggcactgtt cgacacaacc gctcacagtc atttgcgcag gttgaagcgg gtattaagac 3060

tgcgtactct tcgatggtga aaacatctca gtggaagaaa gaacgtgcac ggtacggggt 3120

ggagcacacc tatagtgact atgaggtcac agactcttgg gcgaacggtt ggcacttgca 3180

ccgcaacatg ctgttgttct tggatcgtcc actgtctgac gatgaactca aggcgtttga 3240

ggattccatg ttttcccgct ggtctgctgg tgtggttaag gccggtatgg acgcgccact 3300

gcgtgagcac ggggtcaaac ttgatcaggt gtctacctgg ggtggagacg ctgcgaaaat 3360

ggcaacctac ctcgctaagg gcatgtctca ggaactgact ggctccgcta ctaaaaccgc 3420

gtctaagggg tcgtacacgc cgtttcagat gttggatatg ttggccgatc aaagcgacgc 3480

cggcgaggat atggacgctg ttttggtggc tcggtggcgt gagtatgagg ttggttctaa 3540

aaacctgcgt tcgtcctggt cacgtggggc taagcgtgct ttgggcattg attacataga 3600

cgctgatgta cgtcgtgaaa tggaagaaga actgtacaag ctcgccggtc tggaagcacc 3660

ggaacgggtc gaatcaaccc gcgttgctgt tgctttggtg aagcccgatg attggaaact 3720

gattcagtct gatttcgcgg ttaggcagta cgttctcgat tgcgtggata aggctaagga 3780

cgtggccgct gcgcaacgtg tcgctaatga ggtgctggca agtctgggtg tggattccac 3840

cccgtgcatg atcgttatgg atgatgtgga cttggacgcg gttctgccta ctcatgggga 3900

cgctactaag cgtgatctga atgcggcggt gttcgcgggt aatgagcaga ctattcttcg 3960

cacccactaa aagcggcata aaccccgttc gatattttgt gcgatgaatt tatggtcaat 4020

gtcgcggggg caaactatga tgggtcttgt tgttggcgtc ccggaaaacg attccgaagc 4080

ccaacctttc atagaaggcg gcggtggaat cgaaatctcg tgatggcagg ttgggcgtcg 4140

cttggtcggt catttcgaag ggcaccaata actgccttaa aaaaattacg ccccgccctg 4200

ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga agccatcaca 4260

gacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt gcgtataata 4320

tttgcccatg gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt ttaaatcaaa 4380

actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt 4440

agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa 4500

ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg 4560

gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc 4620

catacggaac tccggatgag cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata 4680

aaacttgtgc ttatttttct ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca gctgaacggt 4740

ctggttatag gtacattgag caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca 4800

ttgggatata tcaacggtgg tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc 4860

tcctgaaaat ctcgtcgaag ctcggcggat ttgtcctact caagctgatc cgacaaaatc 4920

cacacattat cccaggtgtc cggatcggtc aaatacgctg ccagctcata gaccgtatcc 4980

aaagcatccg gggctgatcc ccggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg 5040

caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgtg 5100

gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg atggtggtta acggcgggat ataacatgag 5160

ctgtcttcgg tatcgtcgta tcccactacc gagatatccg caccaacgcg cagcccggac 5220

tcggtaatgg cgcgcattgc gcccagcgcc atctgatcgt tggcaaccag catcgcagtg 5280

ggaacgatgc cctcattcag catttgcatg gtttgttgaa aaccggacat ggcactccag 5340

tcgccttccc gttccgctat cggctgaatt tgattgcgag tgagatattt atgccagcca 5400

gccagacgca gacgcgccga gacagaactt aatgggcccg ctaacagcgc gatttgctgg 5460

tgacccaatg cgaccagatg ctccacgccc agtcgcgtac cgtcttcatg ggagaaaata 5520

atactgttga tgggtgtctg gtcagagaca tcaagaaata acgccggaac attagtgcag 5580

gcagcttcca cagcaatggc atcctggtca tccagcggat agttaatgat cagcccactg 5640

acgcgttgcg cgagaagatt gtgcaccgcc gctttacagg cttcgacgcc gcttcgttct 5700

accatcgaca ccaccacgct ggcacccagt tgatcggcgc gagatttaat cgccgcgaca 5760

atttgcgacg gcgcgtgcag ggccagactg gaggtggcaa cgccaatcag caacgactgt 5820

ttgcccgcca gttgttgtgc cacgcggttg ggaatgtaat tcagctccgc catcgccgct 5880

tccacttttt cccgcgtttt cgcagaaacg tggctggcct ggttcaccac gcgggaaacg 5940

gtctgataag agacaccggc atactctgcg acatcgtata acgttactgg tttcacattc 6000

accaccctga attgactctc ttccgggcgc tatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcac 6060

cattcgatgg tgtcaacgta aatgccgctt cgccttcgcg cgcgaattgc aagctgatcc 6120

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gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 6300

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccca ataattttgt 6360

ttaactttaa gaaggagata tacatatgga caatggcgcg ggggaagaga cgaagtccta 6420

cgccgaaacc taccgcctca cggcggatga cgtcgcgaac atcaacgcgc tcaacgaaag 6480

cgctccggcc gcttcgagcg ccggcccgtc gttccgggcc cccgcactgg ccgagggcac 6540

ccgcattttc gatccagtga cgggcacgac gcaccgcatt gaagatgtag tgggtggtcg 6600

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cttgtgggct acccctgatc ataaagtcct gacggaatat ggatggcggg cagccggtga 6780

gctgcgcaag ggtgatcgcg ttgcccaacc ccgtcggttt gatggttttg gcgattctgc 6840

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gaacagactg gccttcgcgt ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg 7320

caggccccgg tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt 7380

cgacgaggag aagggcttcc agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct 7440

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gccgtccttc aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat 7620

ctactcgaag cacttctgga gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta 7680

cggcgacccg gacgccttcc gccccgcccc gggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga 7740

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ctggttcggc gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca 7860

ctatcacgcg cccaatggca gcctgggtgc catgcatgtc tacgagagca agttccgcaa 7920

ctggtccgag ggttactcgg acttcgaccg cggagcctat gtgatcacct tcatccccaa 7980

gagctggaac accgcccccg acaaggtaaa gcagggctgg ccgcaccacc accaccacca 8040

ctgaccgggt accgagctcg aattcagctt ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc 8100

agcctgatac agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc 8160

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gccgatgg 8228

<210> 2

<211> 552

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr

1 5 10 15

Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser

20 25 30

Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Ala Leu

35 40 45

Ala Glu Gly Thr Arg Ile Phe Asp Pro Val Thr Gly Thr Thr His Arg

50 55 60

Ile Glu Asp Val Val Gly Gly Arg Lys Pro Ile His Val Val Ala Ala

65 70 75 80

Ala Lys Asp Gly Thr Leu His Ala Arg Pro Val Val Ser Trp Phe Asp

85 90 95

Gln Gly Thr Arg Asp Val Ile Gly Leu Arg Ile Ala Gly Gly Ala Ile

100 105 110

Leu Trp Ala Thr Pro Asp His Lys Val Leu Thr Glu Tyr Gly Trp Arg

115 120 125

Ala Ala Gly Glu Leu Arg Lys Gly Asp Arg Val Ala Gln Pro Arg Arg

130 135 140

Phe Asp Gly Phe Gly Asp Ser Ala Pro Ile Pro Ala Arg Val Gln Ala

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Phe Leu His Asp Met Leu Ala Glu

165 170 175

Glu Leu Arg Tyr Ser Val Ile Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg Arg Ala

180 185 190

Arg Thr Phe Gly Leu Glu Val Glu Glu Leu His Thr Leu Val Ala Glu

195 200 205

Gly Val Val Val His Asn Met Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro

210 215 220

Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly

225 230 235 240

Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val

245 250 255

Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg

260 265 270

Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly

275 280 285

Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg

290 295 300

Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg

305 310 315 320

Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys

325 330 335

Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu

340 345 350

Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu

355 360 365

Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro

370 375 380

Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly

385 390 395 400

Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His

405 410 415

Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr

420 425 430

Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp

435 440 445

Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu

450 455 460

Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala

465 470 475 480

Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro

485 490 495

Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn

500 505 510

Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr

515 520 525

Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly

530 535 540

Trp Pro His His His His His His

545 550

<210> 3

<211> 338

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg

1 5 10 15

Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val

20 25 30

Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly

35 40 45

Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly

50 55 60

Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg

65 70 75 80

Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys

85 90 95

Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg

100 105 110

Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg

115 120 125

Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu

130 135 140

Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp

145 150 155 160

Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg

165 170 175

Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser

180 185 190

Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp

195 200 205

Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe

210 215 220

Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn

225 230 235 240

Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp

245 250 255

Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val

260 265 270

Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala

275 280 285

Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser

290 295 300

Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp

305 310 315 320

Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro His His His His

325 330 335

His His

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<211> 5482

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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ggcggcagtc gcactggttg cgtgttcccc taatgagatt gattctgaac tgaaggtgcc 120

aacggcaact ggcgtttctt taccttcgaa gaacgtttcc gcgacctcaa ctgctactac 180

agatgaggat gcgcctggct acattgattg cgtagccgca ccaactcagc aacctgctga 240

aatctcacta aactgtgcaa tggatattga tcggctcacg gatatttctt ggagcgaatg 300

ggatactgat tccgcaactg gaaccggtac ccgcatcgta accgctgcaa atggtcaaga 360

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ccatcgaatg gcgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat 600

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aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac 780

tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc 840

cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg 900

tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg 960

cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg 1020

tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca 1080

tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg 1140

cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc 1200

tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac 1260

gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg 1320

gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg 1380

ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata 1440

ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc 1500

tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca 1560

atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa 1620

ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 1680

tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtaagtt agctcactca ttaggcaccc 1740

caggctttac actttatgct tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa 1800

tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacggattca ctggccgtcg ttttacaacg 1860

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt 1920

cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 1980

cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc cggaaagctg 2040

gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac tgtcgtcgtc ccctcaaact ggcagatgca 2100

cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt gacctatccc attacggtca atccgccgtt 2160

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cgaactggct gctatcccgt tcaacactct ggctgaccat tacggtgagc gtttagctcg 2400

cgaacagttg gcccttgagc atgagtctta cgagatgggt gaagcacgct tccgcaagat 2460

gtttgagcgt caacttaaag ctggtgaggt tgcggataac gctgccgcca agcctctcat 2520

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agcgtacatc accattaaga ccactctggc ttgcctaacc agtgctgaca atacaaccgt 2700

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tggcgtagta ggtcaagact ctgagactat cgaactcgca cctgaatacg ctgaggctat 3060

cgcaacccgt gcaggtgcgc tggctggcat ctctccgatg ttccaacctt gcgtagttcc 3120

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tgaggtgtac aaagcgatta acattgcgca aaacaccgca tggaaaatca acaagaaagt 3300

cctagcggtc gccaacgtaa tcaccaagtg gaagcattgt ccggtcgagg acatccctgc 3360

gattgagcgt gaagaactcc cgatgaaacc ggaagacatc gacatgaatc ctgaggctct 3420

caccgcgtgg aaacgtgctg ccgctgctgt gtaccgcaag gacaaggctc gcaagtctcg 3480

ccgtatcagc cttgagttca tgcttgagca agccaataag tttgctaacc ataaggccat 3540

ctggttccct tacaacatgg actggcgcgg tcgtgtttac gctgtgtcaa tgttcaaccc 3600

gcaaggtaac gatatgacca aaggactgct tacgctggcg aaaggtaaac caatcggtaa 3660

ggaaggttac tactggctga aaatccacgg tgcaaactgt gcgggtgtcg ataaggttcc 3720

gttccctgag cgcatcaagt tcattgagga aaaccacgag aacatcatgg cttgcgctaa 3780

gtctccactg gagaacactt ggtgggctga gcaagattct ccgttctgct tccttgcgtt 3840

ctgctttgag tacgctgggg tacagcacca cggcctgagc tataactgct cccttccgct 3900

ggcgtttgac gggtcttgct ctggcatcca gcacttctcc gcgatgctcc gagatgaggt 3960

aggtggtcgc gcggttaact tgcttcctag tgaaaccgtt caggacatct acgggattgt 4020

tgctaagaaa gtcaacgaga ttctacaagc agacgcaatc aatgggaccg ataacgaagt 4080

agttaccgtg accgatgaga acactggtga aatctctgag aaagtcaagc tgggcactaa 4140

ggcactggct ggtcaatggc tggcttacgg tgttactcgc agtgtgacta agcgttcagt 4200

catgacgctg gcttacgggt ccaaagagtt cggcttccgt caacaagtgc tggaagatac 4260

cattcagcca gctattgatt ccggcaaggg tctgatgttc actcagccga atcaggctgc 4320

tggatacatg gctaagctga tttgggaatc tgtgagcgtg acggtggtag ctgcggttga 4380

agcaatgaac tggcttaagt ctgctgctaa gctgctggct gctgaggtca aagataagaa 4440

gactggagag attcttcgca agcgttgcgc tgtgcattgg gtaactcctg atggtttccc 4500

tgtgtggcag gaatacaaga agcctattca gacgcgcttg aacctgatgt tcctcggtca 4560

gttccgctta cagcctacca ttaacaccaa caaagatagc gagattgatg cacacaaaca 4620

ggagtctggt atcgctccta actttgtaca cagccaagac ggtagccacc ttcgtaagac 4680

tgtagtgtgg gcacacgaga agtacggaat cgaatctttt gcactgattc acgactcctt 4740

cggtaccatt ccggctgacg ctgcgaacct gttcaaagca gtgcgcgaaa ctatggttga 4800

cacatatgag tcttgtgatg tactggctga tttctacgac cagttcgctg accagttgca 4860

cgagtctcaa ttggacaaaa tgccagcact tccggctaaa ggtaacttga acctccgtga 4920

catcttagag tcggacttcg cgttcgcgta acgcggaaat aggggccttt tgttgtcttc 4980

tcctggaggc tatttaagaa gtttaaattg tgtccatgag ttcgcgtatg gcaatgacag 5040

tttgagacgg ccacaggcga ttctgagaag ccattttctt tgggcgccgt ggcagttttt 5100

attgggtccc accgccgaac tgcatattcg aaccaaggag cctcaaaaat cgagctcgct 5160

ttggtctcaa acgcacattt atcgcgcgtt gaagtgtgcg tttgagacca aagagccctc 5220

cacaacgcac gtctttggtt tggatatgac aggtgcccaa gaactcaccc cgccccatgc 5280

tcacagagcc cccatcagaa gccaaaagac cccttccctg cccaagaaga acaggatgaa 5340

ggggtcttgt gctgcgtaaa ctagcggttt tggaagtagc taagcagacg taggatttcg 5400

gtgtagagcc agaccaaggt cactgcaaga ccaagcgcaa cgccccatgc catcttggaa 5460

gggaaatagg ggccttttgt tg 5482

<210> 5

<211> 1000

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

acaactcttt cacgtaagtt cttcgtttct gctaccacag ccctggcggc agtcgcactg 60

gttgcgtgtt cccctaatga gattgattct gaactgaagg tgccaacggc aactggcgtt 120

tctttacctt cgaagaacgt ttccgcgacc tcaactgcta ctacagatga ggatgcgcct 180

ggctacattg attgcgtagc cgcaccaact cagcaacctg ctgaaatctc actaaactgt 240

gcaatggata ttgatcggct cacggatatt tcttggagcg aatgggatac tgattccgca 300

actggaaccg gtacccgcat cgtaaccgct gcaaatggtc aagagaccga aaccgaagat 360

attgaggtga agctttcctt ccccaccgag tcttcccaag gcctagtgtt cactcaggtc 420

accgtcgatg gacaggttct cttcctctaa tcctccataa ttagagagcg taaggcccct 480

acttcctgtt ttaggaaata ggggcctttt gttgtcttct cctggaggct atttaagaag 540

tttaaattgt gtccatgagt tcgcgtatgg caatgacagt ttgagacggc cacaggcgat 600

tctgagaagc cattttcttt gggcgccgtg gcagttttta ttgggtccca ccgccgaact 660

gcatattcga accaaggagc ctcaaaaatc gagctcgctt tggtctcaaa cgcacattta 720

tcgcgcgttg aagtgtgcgt ttgagaccaa agagccctcc acaacgcacg tctttggttt 780

ggatatgaca ggtgcccaag aactcacccc gccccatgct cacagagccc ccatcagaag 840

ccaaaagacc ccttccctgc ccaagaagaa caggatgaag gggtcttgtg ctgcgtaaac 900

tagcggtttt ggaagtagct aagcagacgt aggatttcgg tgtagagcca gaccaaggtc 960

actgcaagac caagcgcaac gccccatgcc atcttggaag 1000

Claims (8)

1.蛋白质，为如下（a1）或（a2）：

（a1）序列表的序列2第1-546位氨基酸残基所示的蛋白质；

（a2）序列表的序列2所示的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.具有权利要求3所述 DNA分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为如下（c1）或（c2）：

（c1）具有序列表的序列1第6304-8044位核苷酸的重组载体；

（c2）如序列表的序列1所示的重组载体。

6.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物是将权利要求5所述重组载体导入谷氨酸棒状杆菌得到的。

7.权利要求1所述蛋白质，或者权利要求2所述核酸分子，或者权利要求3所述DNA分子，或者权利要求4所述表达盒，或者权利要求4或5所述重组载体，或者权利要求4或6所述重组微生物在制备转谷氨酰胺酶中的应用。

8.一种制备转谷氨酰胺酶的方法，包括如下步骤：培养权利要求6所述重组微生物。

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