FR2533218A1 - Procede de preparation et d'immobilisation de proteines modifiees et produits ainsi obtenus - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A POUR OBJET UN PROCEDE DE MODIFICATION CHIMIQUE D'UNE PROTEINE NATURELLE POUR OBTENIR UNE PROTEINE MODIFIEE, ANALOGUE A UNE ENZYME BIOLOGIQUEMENT ACTIVE. DANS UN MODE DE MISE EN OEUVRE, ON DENATURE PARTIELLEMENT LA PROTEINE NATURELLE EN PRESENCE D'UN INHIBITEUR D'UNE ENZYME-MODELE DONT L'ACTIVITE DOIT ETRE REPRODUITE; ON DEPOSE LE COMPLEXE DE LA PROTEINE NATURELLE PARTIELLEMENT DENATUREE ET DE L'INHIBITEUR SUR UN SUPPORT SOLIDE ET ON RETICULE POUR OBTENIR UNE NOUVELLE PROTEINE MODIFIEE ANALOGUE A UNE ENZYME. OBTENTION D'UNE PROTEINE MODIFIEE DONT LE COMPORTEMENT CATALYTIQUE ENZYMATIQUE EST CELUI DE L'ENZYME-MODELE.

Description

1 -

PROCEDE DE PREPARATION ET D'IMMOBILISATION DE PROTEINES

MODIFIEES ET PRODUITS AINSI OBTENUS

Les protéines sont des macromolécules synthétisées par voie biologique et remplissant des rôles variés dans

les systèmes vivants Les enzymes sont des variétés parti-

culières de protéines biologiquement actives pouvant cata-

lyser des réactions spécifiques A l'heure actuelle on uti-

lise la technologie des enzymes dans de nombreux domaines

industriels et de la recherche, comme par exemple, la re-

cherche médicale, le-traitement et la conservation des ali-

ments, la production de boissons fermentées, la fabrication de produits pharmaceutiques et la détermination analytique de la concentration de divers métabolites et composants

d'aliments par des techniques analytiques enzymatiques.

Les enzymes sont hautement spécifiques en ce qui

concerne leur activité biologique et en général elles cata-

lysent une réaction particulière à une vitesse qui est très grande par comparaison à la réaction correspondante ayant

lieu à la température ordinaire sans catalyse biologique.

Une enzyme peut faire preuve d'activité catalytique pour un certain nombre de substrats sur lesquels elle peut agir En conséquence, une enzyme donnée peut catalyser la synthèse ou la dégradation de plus d'un substrat Certaines protéines qui ne sont pas considérées comme des enzymes classiques, comme par exemple la séro-albumine bovine, font preuve d'une

activité catalytique très limitée sur un ou plusieurs subs-

trats. De nombreuses enzymes se trouvent dans la nature en de très petites quantités En conséquence, leur isolement, purification et utilisation sont limités à une opération à petite échelle par suite des frais et du temps nécessaires

pour les isoler sous une forme utilisable.

Certdines enzymes se trouvent dans la nature en

quantités relativement importantes et elles sont relative-

2 -

ment faciles à isoler, purifier et utiliser Malheureuse-

ment, en raison du comportement catalytique précis des en-

zymes, celles qui sont disponibles en grosses quantités ne

peuvent catalyser que certaines réactions choisies.

Depuis peu de temps de nombreux efforts ont été

consacrés à une synthèse des catalyseurs biologiques syn-

thétiques faisant preuve d'un comportement enzymatique si-

milaire à celui des enzymes naturelles qui sont ou bien ra-

res ou bien coûteuses à isoler En outre, certaines tenta-

tives ont été faites pour modifier les enzymes naturelles afin de changer leur spécificité enzymatique de sorte qu' elles puissent fonctionner pour catalyser une réaction

qu'elles ne pouvaient pas catalyser antérieurement.

Une technique connue pour obtenir un comportement

enzymatique permettant de catalyser une réaction spécifi-

que désirée consiste en une synthèse de ce qu'on appelle les molécules d'enzymes-modèles Par exemple, on peut lier par voie covalente des composés de bas poids moléculaire à des groupes fonctionnels qui manifestent l'activité du site actif d'une enzyme Des exemples de telles préparations sont décrites dans les publications suivantes: Breslow,

R., Advances in Chemistry Series, R F Gould, Ed, Ameri-

can Chemical Society, Washington, D C 21-43 ( 1971) et Tang, C C; Davalian, D; Haung, P et Breslow, R,,

J Amer Chem Soc, 100, 3918 ( 1978) et Breslow, R, Doher-

ty, J, Guillot, G et Lipsey, C, J Amxer Chem Soc, 100,

3227 ( 1978).

Une autre technique comporte l'emploi d'une matrice

de polymère synthétique qui est modifiée suivant sa struc-

ture de base pour fournir des groupes fonctionnels jouant le rôle du site actif d'une enzyme donnée On trouve des exemples de telles techniques dans les articles suivants: Wulff, G et Schulza, I, Israel J Chem, 17, 291 ( 1978)

et Suh, J et Klotz, I M, Bioorganic, 6, 165 ( 1977).

Une autre technique implique la fixation d'un nou-

veau fragment chimique à une enzyme naturelle près du site

actif de L'enzyme pour tenter de permettre à une telle en-

zyme de réagir avec une activité catalytique différente.

Un exemple est la conversion de la papaine, qui est une en-

zyme protéolytique en une enzyme du type oxydase par la fi-

xation covalente d'une flavine près du site actif de l'en- zyme de papaine naturelle, comme décrit dans les articles

suivants: Levine, H L et Kaiser, E T V J Amer -Chem.

Soc, 100, 7670 ( 1978), Kaiser, E T, et alo Adv In Che-

mistry Series, N 191, Biomimetic Chemistry, 1980; et Ot-

suki, T; Nakagawa, Y et Kaiser, Eo T, J C S Chem Ccmm.

11.457 ( 1978) D'autres exemple d'une telle modification enzymatique sont donnés dans l'article: Wilson, M Eo et

Whitesides, G M, Jo Amero Chem Soco, 100, 306 ' ( 1978).

Une autre tentative encore pour changer la spéci-

fité des enzymes est l'immobilisation d'une enzyme naturel-

le dans une matrice de gel Par exemple, on a immobilisé l'enzyme trypsine dans un gel de polyacrylamide Le gel de

polyacrylamide permet aux esters des amino-acides de dif-

fuser à travers la matrice de gel pour réagir avec l'enzyme

mais il ne permet pas la diffusion à travers lui de proté-

ines plus grosses Ainsi, la spécificité de l'enzyme est

changée par l'élimination de l'accès de l'une des molécu-

les du substrat à l'enzyme.

L'immobilisation des enzymes naturelles est bien connue des spécialistes On connait également des exemples

de changements de la spécificité des enzymes par immobili-

sation Aussi bien l'immobilisation que les changements de la spécificité des enzymes sont décrites dans Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 3 Ed, 9, 148 ( 1980) publiée par Wiley and Son, Inc. Deux autres procédés concernant l'immobilisation des enzymes sont décrits dans les brevets US 3 802 997 et

3.930 950 Dans le brevet US 3 o 802 997, on décrit un procé-

dé de stabilisation des enzymes en liant les enzymes à des supports minéraux, en présence de leurs substrats, de sorte _ 4 _ que l'enzyme est immobilisée Dans le brevet US 3 930 950, on décrit un procédé d'immobilisation des enzymes selon lequel on fournit un élément de support actif capable de

réagir avec une enzyme pour devenir chimiquement lié à cet-

te dernière Ultérieurement, on met en contact le support actif avec un complexe enzyme/substrat qui a été formé par mélange de l'enzyme avec un substrat spécifique, tout en

réduisant au minimum la transformation du substrat en pro-

duit Ainsi le composant enzyme du complexe est chimique-

ment lié à l'élément de support.

On savait également qu'une mono-oxygénase de lysine naturelle pouvait être mise en réaction pour bloquer les groupes sulfhydryle sur l'enzyme Quand on traite ainsi l'enzyme spécifique mono-oxygénase de lysine, elle fait

preuve d'une nouvelle activité catalytique envers les amino-

acides et elle catalyse la désamination par voie d'oxyda-

tion au lieu de sa décarboxylation naturelle par voie d'oxy-

génation Cependant les spécialistes ne peuvent pas expli-

quer ce comportement modifié Voir par exemple l'article de

Yamauchi, T; Yamamoto, S et Hayaishi, O, dans The jour-

nal of Biological Chemistry, 248, 10, 3750-3752 ( 1973) On

a également indiqué que si l'on fait réagir une enzyme na-

turelle, par exemple la trypsine, avec son inhibiteur na-

turel et qu'ensuite on réticule l'enzyme, son activité sur ces substrats naturels sera modifiée Voir l'article de Beaven, G H et Gratzer, W B dans Int J Peptide Res,

, 215-18 ( 1873).

En outre on a synthétisé des protéines synthétiques

par l'ancrage d'un résidu d'amino-acide sur un support so-

lide et ensuite l'addition de résidus d'amino-acides les

uns après les autres.

On a également synthétisé des protéines semi-synthé-

tiques par un procédé selon lequel on soumet une protéine

naturelle à une hydrolyse limitée pour produire des frag-

ments de protéine On soumet ensuite les fragments de la -5- protéine naturelle à un procédé par lequel on ajoute un ou

plusieurs restes d'amino-acides aux fragments, ou on élimi-

ne de ceux-ci un ou plusieurs de ces restes, pour obtenir

ainsi des fragments modifiés Les fragments modifiés ré-

sultants sont ensuite fixés à nouveau pour former la pro-

téine semi-synthétique avec une composition altérée de res-

tes d'amino-acides Comme exemples des technologies concer-

nant les protéines synthétiques et semi-synthétiques, qui ont été citées immédiatement ci-dessus, on peut mentionner le livre Semisynthetic Protein 8 par R E Offord, édité par

John Wiley and Sons Ltd, copyright 1980.

Alors que ces techniques conviennent pour de nom-

breuses applications, il existe un besoin pour un procédé simple, efficace, économique et systématique permettant de modifier chimiquement une protéine naturelle peu co teuse et disponible dans le'commerce pour produire une protéine

modifiée analogue à une enzyme La protéine peut faire preu-

ve d'une activité catalytique enzymatique pour une réaction

chimique désirée, qui n'était pas jusqu'à présent une réac-

tion d'intérêt industriel, avec catalyse par une enzyme na-

turelle, ladite réaction nouvelle pouvant être prédétermi-

née sur un mode systématique Les procédés décrits dans les références mentionnées plus haut consistent simplement à soumettre une enzyme à une série de conditions et à tenter d'élucider son comportement Ces procédés ne constituent

pas un procédé systématique permettant de modifier les ca-

ractéristiques de la protéine.

La présente invention fournit une protéine modifiée

analogue à une enzyme par conversion d'une protéine natu-

relle en une protéine modifiée analogue à une enzyme faisant

preuve de caractéristiques différentes de celles de la pro-

téine naturelle de départ.

Dans un mode de mise en oeuvre de l'invention, on dénature partiellement une protéine naturelle en présence d'un inhibiteur pour l'enzyme-modèle prédéterminée, dont -6-

l'activité doit être reproduite Ensuite, on dépose la pro-

téine naturelle partiellement dénaturée, en présence de l'inhibiteur de l'enzyme-modèle, sur un support solide et

on réticule pour définir une nouvelle protéine modifiée ana-

logue à une enzyme dont la conformation est définie par

l'inhibiteur de l'enzyme-modèle et on la conserve sur un mo-

de immobilisé sur un véhicule ou un support solide.

Ultérieurement, on élimine l'inhibiteur de l'enzyme-

modèle et tout excès de l'agent de réticulation de la pro-

téine modifiée immobilisée analogue à une enzyme, nouvel-

lement formée, pour obtenir un produit stable fonctionnel,

facile à traiter et à isoler, analogue à l'enzyme-modèle.

La protéine modifiée ainsi obtenue fait preuve des caracté-

ristiques d'activité de l'enzyme-modèle.

Lors de l'obtention des avantages de l'invention, on a constaté qu'une protéine pouvait être modifiée depuis sa conformation naturelle en une conformation modifiée par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention Le nouvel état de conformation définit une protéine modifiée analogue

à une enzyme.

Dans le présent mémoire, le terme "enzyme" désigne une protéine possédant une activité catalytique bien connue vis-à-vis de substrats particuliers Le terme "protéine" est

utilisé ici dans son sens généralement admis dans ce domai-

ne, à savoir un popypeptide formé d'amino-acides pour obte-

nir une molécule biologique.

Le procédé selon l'invention consiste à modifier

chimiquement une protéine naturelle depuis une première con-

formation, son état naturel, à une seconde conformation, un

nouvel état modifié Le procédé permet d'obtenir une nouvel-

le protéine modifiée analogue à une enzyme dont la produc-

tion et l'immobilisation ont lieu à peu près simultanément pour donner une nouvelle protéine stable, modifiée, analogue

à une enzyme qui reproduit une ou plusieurs des caractéris-

tiques d'activité enzymatique de l'enzyme-modèle choisie.

-7- L'auteur de la présente invention a découvert qu'on peut convertir une protéine naturelle en une protéine modifiée et l'immobiliser à peu près en même temps sans pratiquement aucun effet adverse-sur le procédé de conversion ou sur le procédé d'immobilisation Aucun problème stérique fâcheux ou autre problème structural ne s'oppose à la préparation de la nouvelle protéine modifiée analogue à une enzyme,

quand on se conforme au nouveau procédé de la-présente inven-

tion.

Dans le mode de mise en oeuvre préféré de l'inven-

tion, on choisit une protéine naturelle qui doit être chimi-

quement modifiée pour donner une nouvelle protéine modifiée

analogue à une enzyme et analogue à l'enzyme-modèle désirée.

Le procédé selon la présente invention convertit la protéine

naturelle soluble, qui ne possède pas l'activité catalyti-

que désirée, à savoir le comportement catalytique enzymati-

que de l'enzyme-modèle, en une protéine modifiée analogue à

une enzyme, immobilisée et stable et qui reproduit les ca-

ractéristiques d'activité catalytique biologique de l'enzy-

me-modèle.

Un procédé préféré pour la mise en oeuvre de la pré-

sente invention en vue de modifier chimiquement une protéine naturelle pour obtenir une protéine modifiée analogue à une enzyme, prédéterminée et immobilisée, consiste à dénaturer

partiellement la protéine naturelle en présence d'un inhibi-

teur pour l'enzyme-modèle prédéterminée; à mettre en con-

tact la protéine naturelle partiellement dénaturée, liée à

l'inhibiteur, avec un support solide d'immobilisation pen-

dant une durée suffisante et à une température suffisante pour obtenir un complexe de protéine naturelle immobilisée par adsorption et d'un inhibiteur et ensuite à réticuler le

complexe inhibiteur-protéine partiellement dénaturée, adsor-

bée sur son support pour former la nouvelle protéine modi-

fiée et immobilisée analogue à une enzyme On élimine tout excès d'agent de réticulation et d'inhibiteur de la protéine

modifiée immobilisée nouvellement créée pour isoler la pro-

téine modifiée analogue à une enzyme et catalytiquement ac-

tive, du type nouveau.

Alors que dans le mode de mise en oeuvre préféré, on convertit une protéine naturelle non enzymatique en une

protéine modifiée analogue à une enzyme, immobilisée et en-

zymatiquement réactive, on envisage également la possibili-

té de convertir une protéine naturelle quelconque en une

protéine modifiée analogue à une enzyme, analogue à l'enzy-

me-modèle.

Dans le présent mémoire, l'expression "dénaturation partielle" désigne un changement de la conformation d'une

protéine de façon à perturber sa forme naturelle ou sa con-

formation sans provoquer de dénaturation majeure irréversi-

ble de la protéine Dans le présent contexte, le terme

"conformation" est utilisé dans son sens généralement ac-

cepté, à savoir la combinaison d'une structure d'amino-

acides secondaires et tertiaires produisant une forme de-

protéine caractéristique.

La dénaturation partielle des protéines est bien connue des spécialistes et est étudiée en détail dans les textes de référence ci-après: le livre Biochemistry par A L Lehninger, Worth Publishers, inc, New York, New York,

1970, pg 58; l'article sur P L Privalov intitulé "Stabi-

lity of Proteins" dans Advances in Protein Chemistry, Vol.

33, pg 167-192; l'article par C Sanford intitulé "Pro-

tein Denaturation, Partie C" dans Advances in Protein Che-

mistry, Vol 24 pg 2-97; l'article par F R N Gurd, et ai intitulé "Motions in Proteins" dans Advances in Protein Chemistry, Vol 33, pg 74-166; l'article par O Jardetzky dans BBA, Vol 621, pg 227-232; l'article par R Hubert dans TIBS, Decembre 1979, pg 271, et l'article sur D S. Markovich, et al dans Molekulyarnaya Biologiya, Vol 8,

N 6, pg 857-863.

L'expression "agent dénaturant" utilisée dans le 99 _ présent mémoire désigne des conditions opératoires ou des

réactifs qui provoquent la dénaturation partielle d'une pro-

téine Par exemple, on peut réaliser la dénaturation par-

tielle d'une protéine en immergeant la protéine dans une so-

lution aqueuse, à température élevée, par exemple de 25 à 600 C Pour la plupart des protéines, une température entre et 60 C perturbera la structure de la conformation de

la protéine à un degré suffisant pour provoquer la dénatu-

ration partielle de la protéine Il est cependant bien con-

nu dans l'art que certaines protéines provenant de sources bactériennes thermophiles sont stables jusqu'au voisinage

du point d'ébullition de l'eau et nécessitent donc des tem-

pératures encore plus élevées que celles indiquées ci-des-

sus. La dénaturation partielle d'une protéine peut se faire en immergeant la protéine dans une solution aqueuse qui contient un sel minéral, un acide organique ou minéral

ou un solvant organique miscible avec l'eau.

Les sels minéraux appropriés qui servent à déstabi-

liser la structure de la protéine en vue de sa dénaturation partielle sont notamment: Na F, (NH 4)2 SO 41 (CH 3)4 N Cl, (CH 3)4 N Br, KCH 3 COO, NH 4 l, K Cl, Na CI, Cs Cl, Li Cl, K Br, Na Br, KNO 3, Mg C 12, Na NO 3 Ca C 12, KSCN, Na SCN, Ba C 12, Na I et Li I. Parmi les acides minéraux appropriés, on citera les acides chlorhydrique, nitrique, sulfurique, phosphorique et

des acides forts similaires donneurs de protons.

Parmi les acides organiques convenables, on citera

les acides acétique, formique, propionique et citrique.

Les solvants appropriés miscibles avec l'eau pour la dénaturation des protéines sont notamment le t-butanol,

l'acétonitrile, le dioxanne F l'acétone, le méthanol, l'étha-

nol et le diméthylsulfoxyde,

Dans le présent mémoire, le terme ",inhibiteur" dé-

signe un composé quelconque ayant une similitude structu-

rale suffisante avec le substrat naturel d'une enzyme-modèle -

pour servir de modèle au site catalytique de la protéine mo-

difiée analogue à l'enzyme Dans le mode de réalisation pré-

féré de la préparation d'une protéine modifiée analogue à une enzyme, l'inhibiteur est l'un des inhibiteurs classiques connus pour une enzymemodèle donnée Cependant, dans le

présent contexte, le terme "inhibiteur" englobe toute molé-

cule ayant une similitude structurelle suffisante avec

l'inhibiteur classique pour préserver sur la protéine modi-

fiée un site analogue à l'inhibiteur Le substrat naturel de l'enzymemodèle peut agir comme inhibiteur ou modèle

pour la protéine modifiée dans de nombreux cas En général-

les inhibiteurs ne sont pas détériorés par l'enzyme comme

les substrats et ils servent à préserver un site catalyti-

que plus facilement que le substrat naturel Un exemple de la similitude structurelle d'un inhibiteur d'enzyme et du

substrat naturel d'une enzyme est le cas de la glucose-

oxydase Le glucose est le substrat naturel de la glucose-

oxydase alors que le D-glucal est l'inhibiteur pour la glu-

cose-oxydase Le glucose et le D-glucal sont très similaire

sur le plan structurel.

Dans le mode de mise en oeuvre préféré de la pré-

sente invention, la protéine modifiée similaire à une enzy-

me en cours de formation est immobilisée sur un support so-

lide dont la composition est en général minérale On préfère spécialement les supports minéraux insolubles dans l'eau,

tels que des oxydes céramiques réfractaires Parmi les oxy-

des céramiques appropriés, on citera les oxydes céramiques poreux particulaires qu'on peut préparer par agglomération et frittage de poudres d'oxydes céramiques réfractaires, telles qu'une poudre d'alumine, une poudre de zircone, une poudre de magnésie, une poudre de silice et une poudre de thorine On préfère particulièrement la poudre d'alumine en raison de sa durabilité chimique et de son prix modique La préparation et l'utilisation d'une telle alumine céramique et d'autres supports oxydes céramiques sont décrites dans 11 -

le brevet US 4 001 o 085.

Dans le présent mémoire, l'expression "réticulation" désigne la formation de liaisons covalentes entre les sites

réactifs sur une-protéine En généralg on réalise la réti-

culation des protéines à l'aide de réactifs polyfonction- nels tels que le glutaraldéhyde Comme autres exemples de réactifs appropriés de réticulation permettant de réticuler

* une protéine, on peut mentionner la 2-amino-4,6-dichloro-

s-triazine; les sels de diazonium; le N-hydroxysuccinami-

de; le p-benzoylazide et les réactifs mentionnés dans les

références suivantes: Wold, F, Methods Enzymol, 11, édi-

té par C Ho Wo Hirs, Co Ho W', Academic Press, 1967, 617; Fasold, H et al, Augen Chem, Int Ed o Engl, 10, 795,

197 et Keyes, M Ho, dans Kirk-Othmer Encyclopedia Of Che-

mical Technology, 9, 3 ème Ed, 1980, Jo Wiley & Sons, Inc, 148-172 o Dans un mode de réalisation modifié de réticulation

de la protéine partiellement dénaturée, après la déna-tura-

tion partielle de la protéine et sa mise en contact avec l'inhibiteur, la réticulation peut être effectuée par un ré-arrangement de disulfure lorsque-la protéine naturelle qui est convertie en une protéine modifiée analogue à une

enzyme-modèle est riche en ponts disulfures Ce ré-arrange-

ment de disulfures se fait en soumettant la protéine natu-

relle riche en ponts disulfures à un p H à peu près neutre,

à l'action de divers réactifs pour rompre les ponts disul-

fures et obtenir des groupes sulfhydryle Un réactif pré-

féré est le -mercaptoéthanol Ce 5-mercaptoéthanol provo-

que le clivage des ponts disulfures en rendant ainsi plus

lâche la structure de conformation de la protéine et en dé-

naturant partiellement la protéine par la formation de grou-

pes sulfhydryleo Une fois que la protéine a été mise en

contact avec l'inhibiteur de l'enzyme-modèle, on peut rame-

ner les groupes sulfhydryle à la forme de disulfure pour lier à nouveau la protéine en une nouvelle protéine stable 12 - modifiée et analogue à une enzyme Ce rétablissement de la liaison des groupes sulfhydryle en disulfures peut se faire

facilement en portant à uoevaleur élevée le p H de la pro-

téine contenant les groupes sulfhydryle Un p H de 9 à 10 environ est en général parfaitement acceptable Cependant il convient de remarquer que l'oxygène moléculaire est en général un réactif dans une réaction du sulfhydryle pour former des ponts disulfures de sorte qu'une réaction à p H

élevé doit avoir lieu en présence d'oxygène moléculaire.

D'autres agents oxydants connus pour oxyder les fonctions

sulfhydryle en disulfures correspondants conviennent éga-

lement.

Dans le mode de mise en oeuvre préféré de l'inven-

tion, on convertit chimiquement une protéine naturelle ou

une protéine hôte présentant peu ou pas d'activité cataly-

tique par le procédé de la présente invention en une pro-

téine modifiée analogue à une enzyme-modèle De nombreuses

enzymes peuvent servir de modèle dans le procédé de l'in-

vention pour donner des protéines modifiées analogues à

des enzymes enpartant de protéines naturelles choisies.

Parmi les enzymes-modèles soumises à la préparation d'ana-

logues protéiques modifiés analogues à des enzymes, on peut citer les enzymes hydrolytiques, les enzymes redox et les

enzymes transferases A titre d'exemple: le premier grou-

pe, c'est-à-dire les enzymes hydrolytiques, comprend les enzymes protéolytiques qui hydrolysent les protéines, par exemple la papaine, la ficine, la pepsine, la trypsine, la

chymotrypsine, la broméline, la kératinase; les carbohy-

drases qui hydrolysent les hydrates de carbone, par exem-

ple cellulase, l'amylase, la maltase,-la pectinase, la chitanase; les estérases qui hydrolysent les esters, par exemple la lipase, la cholinestérase, la lécithinase, les

phosphatases alcalines et acides; les nucléases qui hydro-

lysent l'acide nucléique, par exemple la ribonucléase, la désoxyribonucléase; et les amidases qui hydrolysent les 13 -

amines, par exemple l'arginase, l'asparaginase, la glutina-

se, l Jhistidase et l'uréase Le second groupe est consti-

tué par les enzymes redox qui catalysent -les réactions

d'oxydation ou de réduction On citera les composés sui-

vants: glucose-oxydase, xanthine-oxydase, catalase, pero- xydase, lipoxydase et cytochrome-réductase Le troisième groupe comprend les enzymes transférases qui transfèrent

des groupes d'une molécule à une autre On citera notam-

ment la transaminase glutamique-pyruvique, la transaminase

glutamique-oxalacétique, la transméthylase et la transphos-

phorylase phosphopyruvique, Dans la pratique usuelle de l'invention, on choisit une première enzyme ou enzyme-modèle, Puis on choisit une seconde protéine naturelle hôte devant être modifiée pour reproduire l'enzymemodèle et obtenir ainsi une protéine modifiée analogue à une enzyme Dans de nombreux cas, la protéine naturelle est elle-même enzymatiquement active puisque de nombreuses enzymes courantes sont disponibles en grosses quantités à des prix assez bas sous forme

d'échantillons homogènes Cependant, les protéines non-

enzymatiques conviennent également quand on peut les puri-

fier pour les utiliser dans le procédé de la présente in-

vention Un exemple d'une telle protéine non-enzymatique qu'on peut utiliser comme protéine naturelle de départ est le séro-albumine bovine (SAB) La SAB est disponible sous

une forme relativement pure et à un prix relativement mo-

dique à partir de nombreuses sources industrielles.

Par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on peut convertir à la demande la protéine naturelle en une forme de protéine modifiée similaire à une enzyme, stable, immobilisée différente, possédant les propriétés d-'activité

catalytique de l'enzyme ayant servi de modèle La possibi-

lité de modifier à la demande une protéine naturelle pour établir une activité catalytique prédéterminée procure de

grands avantages dans un large domaine d'applications chi-

14 -

miques et industrielles Par exemple, si l'on désire uti-

liser une enzyme peu abondante, très chère ou très diffici-

le à isoler et/ou à purifier, cette enzyme peut servir

d'enzyme-modèle pour la préparation d'un analogue protéi-

que modifié semblable à une enzyme par le présent procédé,

pour reproduire son activité.

La présente invention convertit avantageusement une protéine naturelle par une séquence virtuellement simulta-

née de stades de conversion et d'immobilisation, en une forme protéique modifiée, immobilisée, stable, facilement récupérable et reproduisant les caractéristiques désirées

de l'enzyme-modèle.

Ainsi une protéine naturelle très abondante sur le marché ou très bon marché peut être reformée ou modifiée par le procédé selon l'invention pour convertir la protéine

naturelle disponible en une forme protéique modifiée analo-

gue à une-enzyme d'une enzyme moins abondante et/ou plus chère.

Dans le mode de mise en òuvre préféré de l'inven-

tion, on purifie la protéine naturelle et on la dissout dans un solvant aqueux proche de la neutralité en présence d'un tampon convenable pour maintenir la solution proche de

la neutralité On dénature ensuite partiellement la proté-

ine naturelle par l'un quelconque des moyens décrits plus haut, par exemple l'abaissement-du p H ou l'utilisation d'agents de dénaturation partielle, pour obtenir une forme

soluble partiellement dénaturée de la protéine naturelle.

Ultérieurement, on mélange un inhibiteur de l'enzyme-modèle avec la protéine partiellement dénaturée On mélange encore un support, par exemple une alumine poreuse particulaire,

avec la protéine naturelle partiellement dénaturée en pré-

sence de l'inhibiteur de l'enzyme-modèle Un temps suffi-

sant et une température suffisante sont prévus pour qu'un

complexe de la protéine partiellement dénaturée et de l'in-

hibiteur puisse se former et être absorbé par la surface -

du support particulaire poreux Ultérieurement, pour pré-

server la nouvelle protéine modifiée analogue-à une enzy-

me, on doit stabiliser le complexe de la protéine naturel-

le partiellement dénaturée et de l'inhibiteur_ On stabilise la nouvelle protéine par réticulation de la protéine pour obtenir une protéine modifiée analogue

à une enzyme Fréquemment, on effectue la réticulation com-

me décrit plus haut à l'aide de glutaraldéhyde comme agent

de réticulation ou par un ré-arrangement des groupes sul-

fhydryle puisque les deux techniques sont relativement bon

marché Cependant, on peut utiliser efficacement et de-fa-

çon classique l'un quelconque des agents de réticulation

décrits plus haut.

Dans une variante de réalisation de la préparation et de l'immobilisation simultanées d'une protéine modifiée analogue à une enzyme, on adsorbe une protéine naturelle qui n'est pas partiellement dénaturée sur la surface à l'intérieur et/ou à l'extérieur, d'un support poreux en

oxyde céramique particulaire Ensuite, on soumet la proté-

ine naturelle immobilisée à une dénaturation partielle, en

utilisant l'un quelconque des réactifs indiqués plus haut.

Ensuite, on mélange la protéine partiellement dénaturée et

immobilisée par adsorption avec l'inhibiteur-de l'enzyme-

modèle pour obtenir un complexe protéine partiellement dé-

naturée-inhibiteur Après la formation de ce complexe, qui

est déjà immobilisé sur le support, on effectue la réticu-

lation comme décrit plus haut.

Dans un autre mode de mise en oeuvre de l'invention,

on a constaté que la protéine naturelle pouvait être par-

tiellement dénaturée, être adsorbée sur un support parti-

culaire poreux et ainsi être immobilisée, avec une mise en

contact ultérieure de l'inhibiteur avec la protéine immobi-

lisée partiellement dénaturée On réticule ensuite le com-

plexe protéine partiellement dénaturée-inhibiteur pour ob-

tenir ainsi une nouvelle protéine modifiée analogue à une 16 - enzyme. Dans un autre mode de mise en òuvre de l'invention, on a constaté qu'on peut produire les protéines modifiées, immobilisées et stables, analogues à des enzymes, selon l'invention en mélangeant ensemble une protéine naturelle partiellement dénaturée et l'inhibiteur de l'enzyme-modèle pour ainsi former un complexe soluble protéine naturelle

partiellement dénaturée-inhibiteur Ce complexe est ulté-

rieurement adsorbé sur le support Ensuite, on réticule le

complexe pour obtenir la nouvelle protéine modifiée analo-

gue à une enzyme selon la présente invention.

On a constaté, selon la présente invention, qu'on peut encore préparer une protéine modifiée analogue à une enzyme au moyen d'un autre mode de mise en oeuvreo On a constaté qu'on peut faire réagir une protéine naturelle avec l'anhydride succinique, à un p H faible, par exemple

d'environ 4, pour établir des sites à charge négative d'aci-

de carboxylique sur la protéine Les sites d'acide carboxy-

lique obtenus par la réaction avec l'anhydride succinique sont formés par la réaction-de la fonction anhydride de l'anhydride succinique avec des groupes amines libres de

la protéine Cette réaction convertit les groupes amino po-

sitifs de la protéine en fragments négatifs d'acide carbo-

xylique Une telle conversion est avantageuse puisque les

supports en oxydes céramiques en général, qui sont les sup-

ports préférés de l'invention, sont positivement chargés à

un faible p H Si l'on forme des groupes à charge plus néga-

tive sur la surface de la protéine naturelle, la réaction électrostatique sera plus grande que celle qui existe entre le support et la protéine à immobiliser, ce qui contribue

à la formation et au maintien de l'immobilisation des pro-

téines. On a également découvert qu'on peut augmenter la production des protéines modifiées analogues à des enzymes si l'on utilise divers groupes de pontage placés entre les 17 - restes d'acides carboxyliques sur la protéine pour faciliter

la réticulation de la protéine (que les groupes carboxyli-

ques soient naturels à la protéine ou soient des dérivés d'anhydride) pour former une nouvelle structure protéique modifiée stable analogue à une enzyme Un tel groupe de pon-

tage est le diaminopropane-H Cl en présence d'un carbodi-

imide Parmi les carbodi-imides appropriés, on peut citer

l'éthyl-3-( 3-diméthylaminopropyl)-carbodi-imide Le diami-

nopropane fournit des groupes amino qui réagissent avec les groupes carboxyliques naturels ou nouvellement formés à partir de l'anhydride succinique, sur la protéine naturelle pour établir des liaisons covalentes En conséquence, les groupes carboxyliques formés par l'anhydride succinique sur la protéine ne servent pas seulement à bloquer la protéine sur son support du point de vue électrostatique, mais une portion de ces groupes fournit également des sites réactifs pour réticuler la protéine par réaction avec les groupes

amino du diaminopropane.

On a également découvert que la production des pro-

téines modifiées analogues à des enzymes est améliorée par l'emploi des carbodi-imideso Ces carbodi-imides réagissent

avec les fonctions amine et acide carboxylique de la proté-

ine pour former des liaisons covalentes Cette formation de liaisons peptides contribue à la réticulation de la protéine

modifiée nouvellement formée pour stabiliser sa structure.

On a également découvert, selon la présente iiven-

tion, qu'il n'est pas spécialement critique de mélanger l'anhydride succinique et le diaminopropane dans un ordre

particulier quelconque avec la protéine naturelle Par exem-

ple, on peut faire réagir la protéine naturelle avec l'anhy-

dride succinique pour obtenir des groupes carboxyliques, l'immobiliser, la faire réagir avec le diaminopropane et,

ensuite, avec un carbodi-imide pour obtenir une protéine mo-

difiée réticulée analogue à une enzyme En variante, on peut

faire réagir la protéine naturelle avec l'anhydride succini-

18 - que puis avec le diaminopropane, ensuite l'immobiliser et

finalement la faire réagir avec le carbodi-imide.

De même on peut partiellement dénaturer la protéine naturelle, la mettre en contact avec l'inhibiteur, puis l'immobiliser et ensuite la faire réagir par un procédé en

un seul stade avec un réactif combiné d'anhydride succini-

que et de carbodi-imide pour obtenir la nouvelle protéine

modifiée et réticulée analogue à une enzyme.

Le procédé selon la présente invention donne une

nouvelle protéine modifiée analogue à une enzyme qui pos-

sède un certain nombre d'avantages et de possibilités d'em-

ploi Grâce aux découvertes de la présente invention, on peut préparer une protéine modifiée et immobilisée analogue à une enzyme, qui est stable, facile à récupérer, peut être

recyclée, et possède en outre une nouvelle activité cataly-

tique analogue à une enzyme qui n'existait pas dans la pro-

téine naturelle Ces protéines modifiées ayant un comporte-

ment catalytique analogue à une enzyme sont utilisées pour les réactions catalytiques anaboliques et cataboliques à

la place d'une enzyme naturelle.

Dans tous les modes de réalisation de la présente invention, on élimine l'inhibiteur de l'enzyme-modèle après

la synthèse de la protéine modifiée analogue à une enzyme.

Normalement, des lavages répétés de la protéine modifiée, immobilisée, suffisent pour éliminer l'inhibiteur On peut aussi employer une solution aqueuse tamponnée pour éliminer l'inhibiteur, les tampons étant énumérés plus loin à titre

d'exemples.

Pour une raison de commodité, tous les brevets et

toutes les publications dont il a été question sont incor-

porés à titre de référence dans la présente demande.

Les exemples suivants, dans lesquels toutes les pro-

portions et tous les rapports sont en poids, sauf indica-

tion contraire, servent à illustrer l'invention sans aucu-

nement en limiter la portée: 19 a

EXEMPLE 1

On lave à trois reprises avec de l'eau distillée g de "Kimal" qui est un support d'immobilisation poreux d'alumine particulaire fabriqué par OwensIllinois, Inc,, et dont la granulométrie est comprise entre 0,17 et 0,15 mm.

On peut préparer des particules d'un support réfrac-

taire, poreux, inerte, rigidedimensionnellement stable et perméable aux fluides en agglomérant de telles poudres d'oxydes réfractaires pour obtenir un "aggloméré vert"

ayant la configuration désirée On cuit ensuite les agglo-

mérés verts pendant une durée et à une température suffisan-

tes pour le frittage afin d'obtenir un support particulai-

re réfractaire, poreux, inerte, rigide, dimensionnellement stable et perméable aux fluides, Le frittage ne doit pas

avoir lieu à une température ou pendant une durée de natu-

re à provoquer l'aplatissement ou la coalescence des parti-

cules, ce qui donnerait un corps non-poreux Une indication commode du degré de frittage est une comparaison entre la

densité réelle de l'aggloméré cuit et la densité théori-

que de l'oxyde soumis à la cuisson Parmi les nombreux

oxydes utilisables dans le but envisagé, on préfère 19 alu-

mine en raison de sa durabilité chimique et de sa facilité

de fabrication.

Pour former le support particulaire à partir de l'oxyde réfractaire en poudre, on choisit la granulométrie de la poudre de manière à obtenir un aggloméré fritté dont

la porosité et la grosseur des pores sont dans les inter-

valles désirés Les techniques d'agglomération et de frit-

tage des supports poreux sont bien connues des spécialis-

tes et ne font pas partie de la présente invention Il suf-

fira de dire que des pressions d'agglomération de l'ordre de 70 à 700 bars et des températures de frittage de 1300 à

1700 'C sont commodes sur le plan industriel D'autres dé-

tails concernant l'agglomération et le frittage des oxydes réfractaires peuvent être obtenus d'après l'ouvrage "Oxide - Ceramics" par E Ryshkewitch, publié par Academic Presse,

New York, en 1960.

On dissout ensuite 0,5 g de séro-albumine bovine (SAB) fabriqué par Sigma Chemical Company (Sigma) Type A-6003, lot 110 F-9305, dans 50 ml de tampon de tris, qui est le 2-amino-2-(hydroxyméthyl)-1,3-propanediol, de 1 m M (concentration ionique) à p H 7,5 On ajoute 50 ml de la solution au support d'alumine lavé et on obtient un p H de 7,5 L'absorbance à 280 nm est de 6,62 On ajoute ensuite 0,5 ml d'une solution 0,2 M de mercaptoéthanol (<ME) à la solution au dessus du support d'alumine "Kimal" et on secoue la solution résultante pendant 30 minutes Au bout de 30 minutes, le p H est de 7 On ajoute ensuite 0,333 g d'un inhibiteur de tryptamine pour l'estérase et on obtient

un p H de 7,2 On agite ensuite la solution pendant 30 minu-

tes et on élève le p H à 8,7 avec Na OH 0,01 M.

On secoue la solution pendant encore 1,5 heure.

Après cette période d'agitation, le support portant liée sur lui la protéine modifiée analogue à une estérase est lavé à cinq reprises en utilisant du tampon de tris 1 m M à p H 7,5 qui contient 1 % d'inhibiteur de tryptamine et

% de saccharose et il est emmagasiné dans la même solu-

tion jusqu'à utilisation.

On titre comme suit la protéine modifiée analogue à

l'estérase préparée ci-dessus: on prépare 25 ml d'une so-

lution de L-tryptophane 1-m M en dissolvant 0,005 g dans l'eau distillée et en ajustant au volume dans une fiole jaugée de 25 ml On prépare ensuite 25 ml d'un substrat qui est l'ester méthylique du L-tryptophane 0, 01 M (EMT) en dissolvant 0,0637 g dans l'eau distillée et en ajustant

au volume dans une fiole jaugée de 25 ml On prépare 1 li-

tre de tampon de tris 1 m M en amenant 1 litre d'eau dis-

tillée à p H 3 avec du H Cl normal puis en amenant à p H 7,5 avec le tampon de tris On prépare 3 litres d'acétate 0,03 M à titre d'éluant en dissolvant 12 g d'acétate de sodium 21 - trihydraté et 0,2 ml d'acide acétique glacial dans 3 litres d'eau distillée Le p H de la solution résultante d'éluant

est de 6.

On effectue le titrage par chromatographie à phase liquide sous haute pression On garnit la colonne de silice

poreuse contenant des cha Tnes latérales carboxyliques (pro-

duit de Baker Chemical Co) L'échantillon injecté est four-

ni à partir d'une boucle d'échantillon de 0,02 ml.

Les durées de rétention dans la colonne pour le L-tryptophase 1 m M, pour le EMT 0,01 M et pour un mélange

/50 des deux sont déterminées comme étalons.

On prépare ensuite une solution témoin pour le ti-

trage en mélangeant 1 ml de EMT 0,1 M avec 9 ml de tampon

de tris 1 m M à p H 7,0 Le p H de la solution est de 5,8.

On prépare une solution de l'échantillon de 10 ml en ajoutant 0,5 à 1 g (poids sec) de la protéine modifiée, immobilisée, analogue à une enzyme, préparée ci-dessus à 9 ml de tampon de tris 1 m M à p H 9,0 et 1 ml de EMT 0,1 M.

Le p H de la solution est de 5,8.

Le p H de la solution de l'échantillon et de la so-

lution témoin doit être le même pour un titrage chromato-

graphique En général l'échantillon présente un p H plus éle-

vé que le témoin après stockage sous réfrigération pendant

un certain temps On peut abaisser ce p H plus élevé en dé-

cantant la solution du support solide et en la remplaçant par une nouvelle solution témoin On répète cette opération jusqu'à ce que les p H de l'échantillon et du témoin soient sensiblement les mêmes Etant donné que la nouvelle protéine modifiée analogue à l'enzyme estérase est immobilisée sur le

support, aucun effet fâcheux n'est provoqué par les change-

ments multiples de la solution,

On injecte l'échantillon et le témoin dans la co-

lonne On porte la concentration de L-tryptophane sur l'axe des ordonnées et on porte le temps d'élution sur l'axe des

abscisses d'un graphique.

22 -

On calcule l'activité de la protéine modifiée simi-

laire à l'enzyme estérase et immobilisée sur le support se-

lon l'équation suivante: Activité l(changement de S+Z 6 m) x 10-l l 10 + 6 l lt 02 l Activite =- poids sec du support en g 2,6 dans laquelle: l'activité est en Unités/ml du support;

le changement de S est le changement de la pente de mola-

rité;

* Zm est la somme de l'écart type des pentes pour l'échantil-

lon et le témoin; + 6 106 est en micromoles; 10-2 est le volume de l'échantillon dans 1 litre;

2,6 est la masse spécifique du support en g/ml; et-

U est en micromoles/minute.

Les résultats du-titrage sont: Substrat EMT (U/ml support) Activité initiale 0,00 Activité finale Titrage 1 3,9 + 1,9 x 10 3 Titrage 2 5,3 + 0,61 x 10 3 Titrage 3 8,8 + 1,19 x 10-3 Titrage 4 4,9 + 1,14 x 10 3

Les résultats montrent que la protéine modifiée ana-

logue à l'enzyme estérase, préparée selon l'invention, fait preuve d'une activité vis-à-vis du substrat d'estérase EMT alors qu'aucune activité n'a été précédemment détectée dans la SAB naturelle On démontre ainsi la conversion d'un type de protéine non-enzymatique (une albumine) en un autre type de protéine (protéine modifiée analogue à l'enzyme estérase

et enzymatiquement active).

EXEMPLE 2:

On dissout dans 100 ml d'eau distillée 60 mg de ri-

23 - bonucléase (Sigma, N R 5503 Type 1 AS, lot 20-F 81001) La solution résultante est à p H 4,7 et son absorbance à 280 nm est de 0,313 D Ensuite, on ajoute 0,3 ml de disulfure de e-mercaptoéthanol 0,2 M qui est un réactif de clivage des ponts, le p H de la solution étant abaissé à 4, 4 On ramène ensuite le p H de la solution à 7,0 en ajoutant 1,3 ml de Na OH 0,01 N et on le maintient pendant 2 heures Au bout de

2 heures, on ajoute 40 mg d'indole inhibiteur, ce qui né-

cessite 1,25 heure pour la dissolution On ajoute également 3 microlitres de Na OH 0,01 N pour maintenir le p H à 7,0 O On élève ensuite le p H de la solution'à 9,45 avec

l'addition de 4,7 ml de Na OH 0,01-Mo On maintient la solu-

tion à p H 9,45 pendant 3 heures, ce qui nécessite l'addi-

tion de 0,9 ml de Na OH' 0,01 M au cours d'une période de 3 heures On ajoute ensuite 20 g de "Kimal" (granulométrie

0,17 à 0,15 mm) à la moitié de la solution ci-dessus, En-

suite on ajoute 0,4 g de Na OH 0,01 N pour porter le p H du mélange résultant protéine-support à 9,45 Apres cela, on ajoute à la solution 0, 01 ml du réactif acide succinique lm M (servant à rétablir la liaison des groupes sulfhydryle

en ponts disulfures) et 0,025 g d'éthyl-3-( 3-diméthylamino-

propyl)-carbodi-imide (EDC) (agent de réticulation) Après minutes, le p H de la solution est de 7,15 o Au bout de la période de 15 minutes, on ajoute 5 ml de EDC à 5 %'(pds/pds)

à raison de 0,1 ml par minute On laisse la solution réagir.

pendant 17 heures environ sur une secoueuse froide ( O à 5 C)o

Après la'durée de la réaction, le p H de la solution conte-

nant la protéine modifiée analogue à une enzyme, immobili-

sée, réticulée et nouvellement synthétisée est de 6,4 On ramène le p H à 7 en ajoutant 0,4 ml de Na OH 0,01 No On lave à cinq reprises la,protéine modifiée et immobilisée analogue à une enzyme avec un tampon de tris 1 m M à p H 7 contenant

0,04 % d'indole inhibiteuro On pense que la solution d'inhi-

biteur stabilise la conformation désirée de la protéine mo-

difiée nouvellement synthétisée analogue à une enzyme au 24 -

cours du stockage.

On effectue le titrage de l'activité enzymatique de la nouvelle protéine synthétisée analogue à une enzyme par

chromatographie en phase liquide sous haute pression L'ana-

lyse est identique à celle indiquée dans l'exemple 1, sauf que l'éluant est le tampon de tris 5 m M à p H 8,0 et que le substrat est le EMT 0, 0115 M. Les résultats du titrage sont comme suit: Substrats EMT (U/ml support) Activité initiale 0,00 Activité finale après 1 jour 0,51 après 2 jours 0,43 Ces résultats démontrent que la protéine modifiée analogue à l'estérase préparée selon la présente invention

fait preuve d'une activité enzymatique par rapport au subs-

trat EMT d'estérase Aucune activité de ce genre n'a été précédemment détectée dans la ribonucléase naturelle On

démontre ainsi la conversion d'un type d'enzyme (une nuclé-

ase) en un autre type de protéine (protéine modifiée analo-

gue à l'enzyme estérase).

EXEMPLE 3:

On dissout dans 50 ml d'eau distillée 60 mg de ri-

bonucléase (Sigma, Type R-5000-IIA, lot 110-F 02051) Le p H initial de la solution de ribonucléase est de 4,6 avec une absorbance à 280 nm de 0,693 Après une période d'attente de 15 minutes, on ajoute 0,1 ml d'une solution de OME 0,1 M avec une lente agitation à 25 C On élève immédiatement le p H de la solution à 7,0 avec l'addition de Na OH 0,1 M On

agite la solution neutre résultante pendant 1 heure à envi-

ron 25 C Ensuite on ajoute 10 mg d'un indole inhibiteur et on agite la solution pendant 1,5 heureo Au cours de cette période d'agitation, on élève lentement le p H de la solution à 8,2 par une addition goutte à goutte de Na OH 0,1 M Après la période d'agitation de 1,5 heure, on élève lentement le p H de la solution à 9,45 en l'espace d'une heure et on le -

maintient à cette valeur pendant encore 2 heures par ad-

dition goutte à goutte de Na OH 0,1 M. On ajoute ensuite 10 g de support d'lalumine "Kimal" (granulométrie 0,17 à 0,15 mm) à la solution de l'enzyme partiellement dénaturée et liée à l'inhibiteur On place le mélange résultant sur une secoueuse froide à 0-5 C Quand la température de la solution atteint 5 Cç on ajoute 0,1 ml

d'une solution à 8 % de glutaraldéhyde On laisse le mélan-

ge réagir pendant environ 17 heures à O -5 C avec une agi-

tation par secousses lentes.

On effectue le titrage pour l'activité enzymatique de la protéine modifiée nouvellement synthétisée analogue à l'enzyme estérase, préparée selon la présente invention,

par chromatographie en phase liquide sous haute pression.

La technique utilisée est la même que celle dans l'exemple 1.

Les résultats du titrage sont: Substrat EMT (U/ml support) Activité initiale 0,00 Activité finale 0,52

Ces résultats montrent que la protéine modifiée ana-

logue à l'enzyme estérase préparée selon la présente inven-

tion fait preuve d'une activité enzymatique vis-à-vis du substrat estérase EMT Aucune activité de ce genre n'a été détectée dans la ribonucléase naturelle On démontre ainsi la conversion d'un type d'enzyme (une nucléase) en un second

type de protéine (protéine modifiée analogue à l'enzyme es-

térase) o

EXEMPLE 4:

On dissout dans 100 ml d'eau distillée 60 g de ri-

bonucléase (Sigma, lot N 20 F-81001) L'absorbance à 280 nm est de 0,333 avec un p H de 4,6 Ensuite on ajoute 0,3 ml de ME 0,2 M On laisse la solution au repos pendant 5 minutes et après ce laps de temps, le p H est de 4,7 On règle alors la solution à p H 7 en ajoutant 2,8 ml de Na OH 0, 01 N On 26 - maintient la solution à p H 7 pendant 2 heures en ajoutant Na OH 0,01 N Cette addition est parfois inutile en raison

de la montée naturelle du p H d'environ 7 à environ 7,2 Ce-

pendant, si le p H ne monte pas spontanément, l'addition de Na OH est nécessaire On ajoute ensuite 20 g de "Kimal" lavé (granulométrie 0,17 à 0, 15 mm) à la solution à p H 7,2 Le p H de la solution monte lentement à 7, 7 après l'addition du

support solide d'alumine.

L'enzyme ribonucléase en présence du support d'alu-

mine est liée à liinhibiteur de l'enzyme-modèle comme suit on ajoute environ 0,04 g d'indole inhibiteur à la solution

à p H 7,7 On maintient la solution à p H 7,7 pendant 15 mi-

nutes, puis on élève le p H de la solution 9,45 en ajoutant ml de Na OH 0, 01 N. On réticule l'enzyme partiellement dénaturée liée

au support, en présence de l'indole inhibiteur, en mainte-

nant la solution à p H 9,45 pendant 2 heures à la tempéra-

ture ordinaire La période de 2 heures à p H élevé permet le réarrangement des groupes sulfhydryle pour former des ponts disulfure afin de réticuler par voie intramoléculaire la

protéine modifiée analogue à l'estérase nouvellement syn-

thétisée.

Après une période de 2 heures, on décante la solu-

tion qui contient la protéine modifiée et immobilisée ana-

logue à l'estérase et on lave le support ainsi que la nou-

velle protéine analogue à une enzyme liée à ce support, de façon répétée, avec 2 litres d'une solution 1 m M de tampon

de tris, à p H 7, contenant 0,04 % d'indole La protéine mo-

difiée analogue à l'estérase, liée au support solide, ainsi

obtenue peut être emmagasinée sous réfrigération dans la so-

lution de tampon de tris indole jusqu'à utilisation.

L'activité de la protéine modifiée analogue à l'es-

térase, immobilisée sur son support, préparée selon la pré-

sente invention est déterminée par chromatographie en phase

liquide sous haute pression La technique utilisée pour dé-

27 - terminer l'activité de la protéine modifiée analogue à une

enzyme, nouvellement synthétisée selon la présente inven-

tion, dans cet exemple, est la-même que dans l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats du titrage sont Substrat EMT (U/mi support) Activité initiale 0, 00 Activité finale (jours) 1 11,97 + 0,937 x 103 3 5,78 + 1,64 x 10-3 8 7, 56 ±1 90 x 10 7,22 + 1,80 x 10-3 -3 11 8,65 * 1,60 x 10 Ces résultats démontrent que la protéine modifiée analogue à l'enzyme d'estérase, préparée selon la présente invention, possède une activité enzymatique vis-à-vis du substrat dlestérase EMT Aucune activité de ce genre n'a été détectée dans la ribonucléase naturelle On représente ainsi la conversion d'une espèce enzymatique, à savoir une nucléase, en une seconde espèce de protéine à savoir une protéine modifiée analogue à l'estéraseo

-EXEMPLE 5

On dissout 500 mg d'enzyme catalase de foie de boeuf, fabriquée par Sigma, type C-40, lot 109 C-7370, dans 200 ml d'eau distillée désionisée avec une agitation lente, à 25 Co Le p H de la solution résultante est de 6,5 Ensuite, pour dénaturer partiellement l'enzyme catalase, on dissout 10 mg d'anhydride succinique dans 1 ml d'acétone On ajoute 300

microlitres de la solution d'anhydride succinique dans l'acé-

tone à la solution de catalase toutes les 10 minutes Après

l'addition complète de la totalité de la solution d'anhydri-

de succinique dans l'acétone, le p H de la solution résultan-

te est de 4,0 et la solution est légèrement trouble.

On ajoute ensuite à la solution ci-dessus l'inhibi-

teur de la galactosidase, à savoir le D-galactal, comme suit: 28 - on ajoute 250 mg de D-galactal, fabriqué par Koch-Light Laboratories, Ltd lot 56129, code 2836 h, et on agite la solution pendant 15 minutes à 25 C Ensuite, on ajoute 25 g de support d'alumine solide "Kimal" (granulométrie 0,19 à 0,18 mm) fabriqué par Owens-Illinois, Inc Toledo, Ohio, enrobé avec le diéthylaminoéthyl-dextrane (DEAE-dextrane) et on agite le mélange doucement par secousses pendant 30

minutes à 25 C.

On prépare le support enrobé de DEAE-dextrane comme

suit: on lave de façon répétée avec de l'eau distillée d sionisée jusqu'à la disparition totale des fines, 200 g d'alumine poreuse

("Kimal" d'une granulométrie de 0,37 à 0,25 mm) de Owens-Illinois, Inc) On dissout ensuite 20 g de sulfate de sodium dans 500 ml d'eau distillée désionisée et on mélange avec les 200 g de support d'alumine, tout en

agitant, à 25 C On dissout ensuite 10 g d'hydroxyde de so-

dium dans 250 ml d'eau distillée désionisée et on ajoute lentement 32 g de DEAE-dextrane (Sigma, type 0-4885, lot 87-C-0139) On mélange ensuite le mélange alumine-sulfate

de sodium et la solution de DEAE-dextrane et on secoue dou-

cement pendant 2 heures à 25 C Ensuite on dissout 10 g

d'hydroxyde de sodium dans 250 ml d'eau distillée et désio-

nisée et on ajoute 40 ml d'épichlorhydrine en agitant à 25 C.

On mélange ensuite la solution d'épichlorhydrine avec le mélange DEAEdextrane-support d'alumine, puis on secoue doucement tout le mélange pendant 24 heures à 25 C Après l'agitation par secousses pendant 24 heures, on lave à fond la préparation avec de l'eau distillée désionisée jusqu'à ce

qu'elle soit limpide Le support nouvellement formé d'alumi-

ne enrobé de DEAE-dextrane peut être emmagasiné sous réfri-

gération ( O à 5 C) dans l'eau distillée désionisée jusqu'au

moment de son utilisation.

Après l'addition de l'inhibiteur et l'absorption de l'enzyme catalase naturelle partiellement dénaturée sur le support d'alumine, on réticule la catalase sur le support, 29 - comme suit: on dissout 10 mg de chlorhydrate de diaminopropane dans 25 ml d'eau désionisée distillée On ajoute ensuite 1-ml de cette solution à la préparation qui contient le support et on secoue pendant 1 heure On élève le p H de la

préparation d'environ 4,0 à environ 7,0 par l'addition gout-

te à goutte de Na OH 0,1 Mo Le support d'alumine enrobé de DEAE-dextrane est de couleur verte et le trouble du liquide

surnageant disparaît On ajoute ensuite 500 mg de chlorhy-

drate de 1-éthyl-3-( 3-diméthylaminopropyl)-carbodi-imide (EDC) et on laisse réagir pendant'3 heures à 25 C avec une

agitation par secousses douces Après la période de réac-

tion de 3 heures, le liquide surnageant est limpide Ensui-

te on lave le support portant la protéine modifiée analogue à une enzyme, immobilisée et réticulée, avec 1 litre d'eau distillée et désionisée, puis avec 1 litre d'une solution

0,2 M de (NH 4)2 SO 4 et finalement avec 1 litre d'eau distil-

lée désionisée On emmagasine la préparation sous une solu-

tion à 1 % d'inhibiteur D-galactal à 0-5 C, p H 6, pour sta-

biliser la protéine modifiée analogue à une enzyme nouvel-

lement formée qui est réticulée et immobilisée sur le sup-

port comme précédemment expliqué.

Le titrage de l'activité de la protéine modifiée analogue à une enzyme se fait comme suit on prépare une solution réactionnelle pour le titrage en mélangeant 10 ml d'un tampon de phosphate de sodium 0,002 M, à p H 7,5, avec ml d'eau distillée désionisée et 5 ml d'une solution de substrat 0, 014 M de o-nitrophényl--D-galactoside dans un

bécher de 50 ml.

On place ensuite 3 ml de la solution dans une cuvet-

te et on installe la cuvette dans un spectrophotomètre (Beckman Instruments-Company, Modèle ACTA III) dans lequel une ligne de base est enregistrée pendant 3 minutes à 405 nm

pour établir une ligne de base stable On lave ensuite envi-

ron 1 g de la protéine modifiée et immobilisée analogue à - une enzyme préparée selon la présente invention avec de l'eau distillée désionisée et on ajoute à la solution du

substrat Toutes les minutes, on prélève 3 ml de la solu-

tion de substrat et on mesure l'absorbance à 405 nm, et les résultats sont enregistrés On remet les 3 ml de la solution

de substrat dans le ballon laboratoire On répète cette opé-

ration six fois La pente résultante due à l'augmentation

de l'absorbance par minute indique une activité pour la pro-

téine modifiée analogue à une enzyme préparée selon la pré-

sence invention vis-à-vis de l'o-nitrophényl--D-galactosi-

de L'augmentation de l'absorbance au cours d'une période

de 6 minutes est mesurée et on trouve 0,015.

Le titrage témoin pour le support d'alumine enrobé de DEAE vis-à-vis de l'o-nitrophényl--D-galactoside est

identique au procédé ci-dessus sauf qu'on remplace la pro-

téine modifiée immobilisée par 1 g de "Kimal" enrobé de DEAE.

On ne constate aucun changement de l'absorbance au cours de

minutes.

On calcule l'activité de la protéine modifiée ana-

logue à la galactosidase, immobilisée sur son support en utilisant l'équation ci-après: Activité = (changement en A/minute)-( 106) (Vs) ( 2, 6) ( 3200) (poids de l'échantillon) dans laquelle: changement en A/minute est le changement de l'absorbance par minute; 106 est exprimé en micromoles/mole; Vs est le volume de l'échantillon en litres; 2,6 est la masse spécifique de l'alumine en g/litre; et 3200 est le coefficient d'extinction de l'o-nitrophénol en litres/mole. Les résultats du titrage sont: 31 - Substrat Galactoside (U/m I support} Activité initiale 0,0 Activité finale 0,59 Ces résultats montrent que la protéine modifiée analogue à la galactoside, préparée selon la présente invention,

possède une activité enzymatique vis-à-vis du substrat o-

nitrophényl-e-D-galactoside Aucune activité n'a été précé-

demment détectée dans la catalase naturelle On montre ainsi

la conversion d'un type d'enzyme (catalase bovine de la fa-

mille des oxydoréductases) en une protéine modifiée analogue

à l'enzyme galactosidase.

EXEMPLE 6:

On dissout dans 200 ml d'eau distillée désionisée

250 mg de catalase (Sigma, type C-40, lot 109 C-7370) En-

suite on ajoute à la catalase 250 mg de l'inhibiteur D-ga-

lactal pour la galactosidase provenant de Koch-Light Labo-

ratories, Ltd lot 56129, code 2836 ho On agite lentement la solution pendant 1 heure à 25 C, le p H résultant étant

de 6,5.

On soumet la solution catalase naturelle-inhibiteur à des conditions d'une dénaturation partielle comme suit on dissout 50 mg d'anhydride succinique dans 1 ml d'acétone, puis on ajoute 0,3 ml de la solution d'anhydride succinique à la solution enzyme-inhibiteur préparée ci-dessus avec une

agitation lente, à 25 Co On maintient la solution sous agi-

tation lente pendant 1 heure, temps au cours duquel la so-

lution vire au vert Ensuite, on ajoute 7,5 mg de diamino-

propane-H Cl et on détermine le p H comme étant de 4,7 On

laisse la solution sous agitation pendant 1 heure de plus.

On immobilise comme suit l'enzyme liée à l'inhibi-

teur et partiellement dénaturée préparée ci-dessus On élè-

ve le p H de la solution ci-dessus à 7 en 15 minutes par

l'addition d'environ 3 ml de Na OH 0,1 M Au cours de l'heu-

re suivante, on élève le p H à 8 par l'addition goutte à 32 - goutte d'environ 2 ml de Na OH 0,1 M On lave ensuite à

l'eau distillée désionisée 25 g de support de "Kimal", alu-

mine-DEAE-dextrane (granulométrie 0,37 à 0,25 mm) fabriqué par OwensIllinois, Inc, Toledo, Ohio (préparé comme dans l'Exemple 5) et on élève le p H du liquide surnageant sur l'alumine à 8 à l'aide de Na OH 0,01 M On mélange ensuite

la solution contenant l'enzyme et le support d'alumine en-

robé de DEAE-dextrane et on agite lentement par secousses

pendant 1 heure environ Ensuite on ajoute 700 mg de chlo-

rhydrate de 1-éthyl-3-( 3-diméthylaminopropyl)-carbodi-imide (EDC) et on place le mélange résultant dans un bain-marie

à 0-5 C On agite lentement par secousses la solution pen-

dant 1 heure environ, la température de la solution descen-

dant à environ 3 C au cours de cette heure On ajoute en-

suite encore 1 g de EDC On laisse réagir le mélange résul-

tant pendant 17 heures environ et on lave à l'eau distillée

et désionisée puis on titre l'activité enzymatique.

On titre l'échantillon préparé selon le procédé de

la présente invention pour détecter l'activité de la pro-

téine analogue à une enzyme, par le même procédé que dans l'Exemple 5 cidessus La seule différence par rapport à

l'Exemple 5 (procédé, formule et détails) est le remplace-

ment de 10 ml du tampon de phosphate de sodium 0,002 M par ml d'un tampon de phosphate de sodium 0,003 M, le p H étant de 7,5 dans les deux cas (voir Exemple 5) Tous les autres détails du titrage sont les mêmes que dans l'Exemple ci-dessus. Substrat Galactoside (U/ml support) Activité initiale 0,00 Activité finale, titrage N 1 0,66 titrage N 2 0,62

Les résultats montrent que la protéine modifiée ana-

logue à l'enzyme galactosidase, préparée selon la présente invention, fait preuve d'activité vis-à-vis du substrat de galactoside pour les enzymes galactosidases On ne détecte aucune activité dans l'enzyme catalase naturelle On montre 33 - ainsi la conversion d'un type de protéine enzymatique (une catalase de la famille des oxydoréductases) en une protéine

modifiée analogue à l'enzyme galactosidase.

EXEMPLE 7

Pour démontrer que l'enzyme ribonucléase naturelle ne possède pas d'activité catalytique vis-à-vis du substrat EMT des exemples 2 à 4 cidessus, on effectue le contrôle suivant

on dissout 60 mg d'enzyme ribonucléase (Sigma, Che-

mical Company, type R-5000, lot 20 F-2010) dans 100 ml d'un tampon de tris 1 m M, à p H 7, avec une agitation lente, à

250 C.

On dialyse ensuite la solution contenant la ribonu-

cléase-en utilisant un tube de dialyse N O 3 "Spectra/Por" (marque déposée) contre 3500 ml d'un tampon de&tris 1 m M, à p H 7, pendant 17 heures à O 50 C Ce tube No 3 présente

un seuil de rupture des poids moléculaires de 35 à 4500 dal-

tons On titre ensuite 1 ml de la solution contenant la ri-

bonucléase par rapport au substrat EMT pour détecter une activité enzymatique possible vis-à-vis du EMT On effectue ce titrage comme suit: on emploie un système de chromatographie en phase liquide sous haute pression pour le titrage La colonne est une colonne en acier inoxydable de 2 mm x 25 cm garnie de

silice poreuse qui comporte des chaînes latérales carboxy-

liques, ayant une grosseur moyenne de pores de 40 microns, fournie par Baker Chemical Co L'éluant de la colonne est

de l'acétate 0,03 M, à p H 6, et avec un débit de 7 ml/min.

L'absorbance du courant sortant de la colonne est contrôlé

à 280 nm.

On prépare comme suit la solution de l'échantillon à titrer contenant la ribonucléase naturelle On mélange 8 ml d'un tampon de tris 1 m M, p H 7, 50, avec 1 ml de EMT

0,1 M, à p H'3,2 et 1 ml de la solution de ribonucléase pré-

parée ci-dessus On prépare la solution témoin de titrage 34 - en mélangeant 8 ml de tampon de tris 1 m M, à p H 7,5, 1 ml de EMT 0,1 M à p H 3,2 et 1 ml de tampon de tris 1 m M à p H 7,0 Le p H des solutions témoin et d'échantillon à titrer

est de 5,8.

On prélève ensuite 1 ml de la solution de l'échan- tillon à titrer dans un bécher contenant l'échantillon à

l'aide d'une seringue hypodermique de 2 ml munie d'une ai-

guiole de jauge 18 et on l'injecte dans la colonne en pas-

sant par une boucle d'échantillon d'injection de 20 micro-

litres On enregistre la durée de l'injection.

On répète la même opération avec la solution témoin de titrage On chromatographie à quatre reprises les deux solutions pour obtenir un graphique de molarité de EMT en

fonction du temps aussi bien pour la solution de l'échan-

tillon que pour la solution témoin.

Une analyse statistique des données obtenues montre des pentes virtuellement identiques de 0,0620 + 0,005 aussi

bien pour la solution témoin que pour la solution de l'échan-

tillon Ainsi la ribonucléase naturelle ne possède aucune

caractéristique mesurable de l'activité catalytique vis-à-

vis du substrat EMT.

EXEMPLE 8:

Pour démontrer que la séro-albumine bovine (SAB) ne possède aucune activité catalytique vis-à-vis du substrat

EMT de l'exemple 1, on effectue le contrôle suivant.

On dissout 100 mg de SAB (Sigma Chemical Company, No 7511, lot 90 F-8351) dans 100 ml de tampon de tris 1 m M, à p H 7, avec une lente agitation à 250 C. On dialyse la solution contenant la SAB en utilisant

le tube de dialyse No 2 "Spectra/Por" contre 3500 ml de tam-

pon de tris 1 m M, à p H 7, pendant 17 heures à une tempéra-

ture de O à 50 C Le tube N O 2 possède un seuil de rupture

des poids moléculaires de 12 à 14 000 daltons On titre en-

suite 1 ml de la solution contenant la ribonucléase par rap-

port au substrat EMT pour détecter une activité enzymatique - possible vis-à-vis du EMT On effectue ce titrage comme suit. On emploie un système de chromatographie en phase liquide sous haute pression pour le titrage La colonne est en acier inoxydable ( 2 mm x 25 cm) garnie de silice poreu- se comportant des chaînes latérales carboxyliques et ayant une grosseur moyenne de pores de 40 microns, fournie par

Baker Chemical Company L'éluant de la colonne est de l'acé-

tate 0,03 M à p H 6 avec un débit de 7 ml/min L'absorbance du courant sortant de la colonne est contrôlée à 280 nmo On prépare comme suit la solution de l'échantillon à titrer renfermant la SAB naturelle On mélange 8 ml d'un tampon de tris 1 m M, à p H 7,5, avec 1 ml de EMT 0,1 M, à

p H 3,2, et 1 ml de la solution de ribonucléase préparée ci-

dessus On prépare la solution témoin de titrage en mélan-

geant 8 ml de tampon de tris 1 m M, à p H 7,5; 1 ml de EMT

0,1 M; à p H 3,2,2 et 1 ml d'un tampon de tris 1 m M, à p H 7,0.

Le p H des solutions témoin et de l'échantillon à titrer est

de 5,8.

Ensuite, on prélève 1 ml de la solution de l'échan-

tillon à titrer dans le bécher contenant l'échantillon à l'aide d'une seringue hypodermique ayant une aiguille de jauge 18 et une capacité de 2 ml, et on l'injecte dans la colonne en passant par une boucle d'échantillon d'injection

de 20 microlitreso On enregistre la durée de l'injection.

On répète cette opération en utilisant la solution témoin de titrage On chromatographie les deux solutions à quatre reprises pour obtenir ungraphique de molarité de EMT en fonction du temps pour la solution de l'échantillon et la solution témoin, Une analyse statistique des données obtenues montre des pentes virtuellement identiques de 0,06 + 0,0065 aussi

bien pour la solution témoin que pour la solution de l'échan-

tillon Ainsi la ribonucléase naturelle ne fait preuve d Dau-

* cune propriété mesurable d'activité catalytique vis-à-vis 36 -

du substrat EMT.

EXEMPLE 9:

Pour démontrer que la catalase naturelle ne fait preuve d'aucune activité catalytique pour le substrat de p nitrophényl-a-D-galactose (NAG) des exemples 5 et 6 ci-

dessus, on effectue le contrôle suivant.

On dissout 250 mg de catalase (Sigma Chemical Com-

pany, type 7275) dans 25 ml d'un tampon d'acétate 0,5 m M,

à p H 4, avec une lente agitation, à 25 C On place la so-

lution dans un tube de dialyse N 2 "Spectra-Por" et on dialyse contre 3500 ml d'un tampon d'acétate 5 m M, à p H 4, pendant 17 heures à une température de O à 5 C Le tube N 2 présente un seuil de rupture des poids moléculaires de 12

à 14 000 daltons On prélève ensuite 0,2 ml de cet échan-

tillon à titrer et on titre par rapport au substrat Na G

pour détecter une activité enzymatique possible de la ri-

bonucléase vis-à-vis du NG On effectue ce titrage comme suit. On prépare le mélange de l'échantillon à titrer en mélangeant 2,4 ml d'un tampon de phosphate de sodium 0,03 M

contenant 50 ppm d'un agent antibactérien (agent antibacté-

rien "Bioban" vendu par International Minerals and Chemi-

cals Corp) avec 0,5 ml de Na G 0,014 M dans une cuvette de

3 ml On place ensuite la cuvette dans un spectrophotomè-

tre "ACTA III" (Beckman Instruments Company) dans lequel une ligne de base droite est enregistrée pendant 3 minutes On contrôle l'absorbance à 405 nm On ajoute ensuite 0,1 ml d'une solution de catalase à la solution de substrat NG dans la cuvette On renverse la cuvette à quatre reprises pour assurer un mélange homogène dans la cuvette et on la

remet dans le spectrophotomètre pour des mesures supplémen-

taires On enregistre le changement de l'absorbance au cours d'une période expérimentale de 20 minutes, et on ne trouve aucune propriété mesurable d'activité catalytique vis-à-vis

du substrat NG dans la catalase naturelle.

37 -

Claims (49)

REVENDICATIONS

1. Procédé de modification chimique de la spécifici-

té du substrat d'une protéine naturelle afin de produire une protéine modifiée analogue à une enzyme immobilisée, caractérisé en ce qu'il consiste (a) à choisir une enzyme devant servir de modèle (b) à dénaturer partiellement une protéine naturelle en présence d'un inhibiteur de ladite enzyme-modèle pour

former un complexe de protéine naturelle partiellement dé-

naturée et d'inhibiteur de l'enzyme-modèle m (c) à mettre en contact ledit complexe de protéine

partiellement dénaturée et de l'inhibiteur de l'enzyme-

modèle avec un support solide pendant une durée suffisante

et à une température suffisante pour absorber et immobili-

ser ledit complexe de protéine partiellement dénaturée et d'inhibiteur de l'enzyme-modèle sur ledit support solide et

(d) à réticuler ledit complexe de protéine immobili-

sée et d'inhibiteur d'enzyme-modèle, absorbé, pour obtenir

une protéine modifiée analogue à l'enzyme immobilisée.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on dénature partiellement ladite protéine naturelle

en formant une solution aqueuse de ladite protéine naturel-

le et en maintenant ladite solution aqueuse à une tempéra-

ture et pendant une durée suffisantes pour dénaturer par-

tiellement ladite protéine naturelle.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce qu'on dénature partiellement ladite protéine naturel-

le en mélangeant ladite protéine naturelle avec de l'eau

pour former une solution aqueuse et en mélangeant la solu-

tion résultante avec un agent dénaturant.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé

en ce que ledit agent dénaturant est un acide minéral.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé

en ce que ledit agent dénaturant est un acide organique.

38 -

6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en

ce que ledit agent dénaturant est un sel minéral.

7. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en

ce que ledit agent dénaturant est un solvant organique mi-

scible avec l'eau.

8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit support solide est un oxyde céramique poreux

d'alumine particulaire.

9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on réticule ladite protéine immobilisée en mélangeant

ladite protéine immobilisée avec un agent de réticulation.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en

ce que ledit agent de réticulation est le glutaraldéhyde.

11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en

ce que ledit agent de réticulation est l'éthyl-3-( 3-diméthyl-

aminopropyl)-carbodi-imide.

12. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en

ce que ledit agent de réticulation est un mélange d'une dia-

mine organique et d'un carbodi-imide organique.

13 Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite diamine est le chlorhydrate de diaminopropane

et que ledit carbodi-imide est l'éthyl-3-( 3-diméthylamino-

propyl)-carbodi-imide.

14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on mélange ledit complexe de protéine partiellement

dénaturée et d'inhibiteur de l'enzyme-modèle avec un anhy-

dride d'acide organique avant de mélanger avec ledit support solide.

15. Procédé de modification chimique de la spécificité du substrat d'une protéine naturelle afin de produire une

protéine modifiée analogue à une enzyme immobilisée, carac-

térisé en ce qu'il consiste: (a) à choisir une enzyme devant servir de modèle; (b) à adsorber une protéine naturelle sur un support

solide pour immobiliser la protéine naturelle;-

(c) à dénaturer partiellement ladite protéine na-

turelle adsorbée; et

(d) à réticuler ladite protéine adsorbée partiel-

lement dénaturée en présence d'un inhibiteur de ladite en-

zyme-modèle pour obtenir une protéine modifiée analogue à

une enzyme immobilisée.

16. Procédé selon la revendication 15, caractéri-

sé en-ce qu'on dénature partiellement ladite protéine na-

turelle en formant une solution aqueuse de ladite protéine naturelle et en maintenant ladite solution aqueuse à une

température et pendant une durée suffisantes pour dénatu-

rer partiellement ladite protéine naturelle.

17. Procédé selon la revendication 15, caractéri-

se en ce qu'on dénature partiellement ladite protéine na-

turelle en la mélangeant avec de l'eau pour former une so-

lution aqueuse et en mélangeant la solution résultante

avec un agent dénaturant.

18. Procédé selon la revendication 17, caraetéri-

sé en ce que ledit agent dénaturant est un acide minéral.

19 Procédé selon la revendication 17, caractéri-

8 sé en ce que ledit agent dénaturant est un acide organique.

20. Procédé selon la revendication 17,qaractérisé

en ce que ledit agent dénaturant est un sel minéral.

21 o Procédé selon la revendication 17, caractéri-

sé en ce que ledit agent dénaturant est un solvant organi-

que miscible avec l'eau.

22. Procédé selon la revendication 15, caract 4 ri-

sé en ce que ledit support solide est un oxyde céramique

poreux d'alumine particulaire -

23 Procédé selon la revendication 15; caractéri-

sé en ce qu'on réticule ladite protéine immobilisée en la mélangeant avec un agent réticulant o

24. Procédé selon la revendication 23, earactérisé

en ce que ledit agent réticulant est le glutaraldéhyde.

25 Procédé selon la revendication 23, earactérisé

en ce que ledit agent réticulant est l'éthyl-3-( 3-diméthyl-

4O - aminopropyl)-carbodi-imide.

26. Procédé selon la revendication 23, caractérisé

en ce que ledit agent réticulant est un mélange d'une dia-

mine organique avec un carbodi-imide organique.

27 Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que ladite diamine organique est le chlorhydrate de diaminopropane et que ledit carbodi-imide organique est

l'éthyl-3-( 3-diméthylaminoprop'yl)-carbodi-imide.

28. Procédé selon la revendication 15, caractérisé

en ce qu'on mélange ladite protéine naturelle avec un anhy-

dride organique avant de la mélanger avec ledit support solide.

29. Procédé de modification chimique de la spécifi-

cité du substrat d'une protéine naturelle pour obtenir une

protéine modifiée analogue à une enzyme immobilisée, carac-

térisé en ce qu'il consiste: (a) à choisir une enzyme devant servir de modèle

(b) à dénaturer partiellement une protéine naturel-

le; (c) à mettre en contact ladite protéine naturelle partiellement dénaturée avec un support solide pendant une

durée suffisante et à une température suffisante pour ad-

sorber et immobiliser ladite protéine partiellement déna-

turée sur ledit support solide; et

(d) à réticuler ladite protéine adsorbée partiel-

lement dénaturée en présence d'un inhibiteur de ladite en-

zyme-modèle pour former une protéine modifiée analogue à

une enzyme immobilisée.

30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé

en ce qu'on dénature partiellement ladite protéine naturel-

le en formant une solution aqueuse de ladite protéine na-

turelle et en maintenant ladite solution aqueuse à une tem-

pérature et pendant une durée suffisante pour dénaturer

partiellement ladite protéine naturelle.

31 Procédé selon la revendication 29, caractérisé 41 -

en ce qu'on dénature partiellement ladite protéine naturel-

le en la mélangeant avec de l'eau pour former une solution aqueuse et en mélangeant la solution résultante avec un

agent dénaturant.

32 Procédé selon la revendication 31, caractérisé

en ce que ledit agent dénaturant est un acide minéral.

33. Procédé selon la revendication 31, caractérisé

en ce que ledit agent dénaturant est un acide organique.

34. Procédé selon la revendication 31, caractérisé

en ce que-ledit agent dénaturant est un sel minéral.

35. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que ledit agent dénaturant est un solvant organique

miscible avec l'eau.

36. Procédé selon la revendication 29, caractérisé

en ce que ledit support solide est un oxyde céramique po-

reux d'alumine particulaire.

37. Procédé selon la revendication 29, caractérisé

en ce qu'on réticule ladite protéine immobilisée en la mé-

langeant avec un agent réticulant.

38 Procédé selon la revendication 37, caractérisé

en ce que ledit agent réticulant est le glutaraldéhyde.

39. Procédé selon la revendication 37, caractérisé

en ce que ledit agent réticulant est l"éthyl-3-( 3-diméthyl-

aminopropyl)-carbodi-imide.

40 Procédé selon la revendication 37, caractérisé

en ce que ledit agent réticulant est un mélange d'une dia-

mine organique avec un carbodi-imide organique.

41. Procédé selon la revendication 40, caractérisé en ce que laditediamine organique est le chlorhydrate de diaminopropane et que ledit carbodi-imide organique est

l'éthyl-3-( 3-diméthylaminopropyl)-carbodi-imide.

42. Procédé selon la revendication 29, caractérisé

en ce qu'on mélange ladite protéine naturelle avec un anhy-

dride organique après la dénaturation partielle et avant

l'adsorption sur ledit support solide.

42 -

43. Procédé de modification chimique de la spéci-

ficité du substrat d'une protéine naturelle afin de pro-

duire une protéine modifiée analogue à une enzyme immobi-

lisée, ladite protéine naturelle contenant au moins trois groupes disulfure par molécule, caractérisé en ce qu'il consiste: (a) à choisir une enzyme devant servir de modèle (b) à mélanger ladite protéine naturelle contenant les groupes disulfure avec un agent réducteur des ponts

disulfure en présence d'un inhibiteur pour ladite enzyme-

modèle afin de former un complexe de la protéine naturelle

partiellement dénaturée et de l'inhibiteur de l'enzyme mo-

dèle;

(c) à mettre en contact ledit complexe avec un sup-

port solide pendant une durée suffisante et à une tempéra-

ture suffisante pour adsorber et immobiliser ledit complexe sur ledit support, et

(d) à mélanger ledit complexe de la protéine natu-

relle immobilisée et de l'inhibiteur de l'enzyme-modèle avec un agent d'oxydation des groupes sulfhydryle pendant une durée et à une température suffisantes pour établir des liaisons disulfure dans ladite protéine afin d'obtenir

une protéine modifiée analogue à une enzyme.

44. Procédé selon la revendication 43, caractérisé en ce que ledit agent réducteur des ponts disulfure est le 6-mercaptoéthanol.

45. Procédé selon la revendication 43, caractérisé en ce que ledit agent d'oxydation des ponts disulfure est une solution aqueuse contenant de l'oxygène moléculaire,

le p H de ladite solution étant supérieur à 7.

46. Le produit obtenu par le procédé selon la re-

vendication 1.

47. Le produit obtenu par le procédé selon la re-

vendication 15.

48 Le produit obtenu par le procédé selon la re-

t 533215 43 -

vendication 29.

49. Le produit obtenu par le procédé selon la re-

vendication 43.