DE4002166A1 - Verfahren zur herstellung einer suspension zur rekonstruktion von zellmembranen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Biochemie und betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer Suspension zur Rekonstruktion von Zellmembranen.

Diese Suspension zur Rekonstruktion von Zellmembranen kann in der experimetellen Biologie und Medizin verwendet wer­ den.

Die Ursache für die Entstehung vieler pathologischer Zu­ stände liegt in der Verletzung biologischer Membranen und ihrer Fermentsysteme. Dabei erfolgt in der Regel die Zer­ störung der Phospholipid-Bioschicht, was mit der anschlie­ ßenden Inaktivierung von Membranfermenten und Fermentsyste­ men verbunden ist.

Bekanntlich stellt die Suspension zur Rekonstruktion von Zellmembranen eine Suspension von Phospholipiden dar, die die Hauptkomponenten der biologischen Membranen sind. Sie ist für den Transport der Phospholipide zu den verletzten Zellmembranen und für ihre Reparatur geeignet, wodurch die Funktionen der mit den Membranen verbundenen Fermentsysteme wiederhergestellt werden können.

Es gibt eine Reihe von Verfahren zur Herstellung einer Suspension zur Rekonstruktion von Zellmembranen. Eines dieser Verfahren besteht darin, Phosphatidylcholin der Sojabohne mit einer wäßrigen Detergenslösung zu vermischen. Als Detergens verwendet man Salze der Gallensäure. Hier­ durch erhält man eine Suspension zu Rekonstruktion von Membranen, insbesondere von Leberzellen. Die nach diesem Verfahren hergestellte Suspension unterhält den Ionenaus­ tausch in den Zellen eines lebenden Organismus, beeinflußt die Fixierung von Atmungsfermenten in Mitochondrien und die oxidative Phosphorylierung beim energetischen Zellstoff­ wechsel und beim Fettstoffwechsel von Zellen, regeneriert die Verletzung der Mitochondrie, reaktiviert die verletzten Fermentsysteme und normalisiert somit die Fuktion der Leber und ihre Detoxikationsrolle (Arzneim. Forsch., V.29, 1979, Zierenberg O., Betzing H., Influence of essential phospho­ lipids on some properties of plasmatic membranes of hepato­ cytes in chronic liver diseases, S. 494-503).

Diese Suspension verursacht jedoch keine Verlangsamung der Inaktivierung des Zytochroms P-450 und keine Vergrößerung der fuktionellen Aktivität von Membranen des endoplasmi­ schen Retikulums. Das ist auf die vorhandenen Salze der Gallensäuren im Präparat zurückzuführen, die die Eigen­ schaften von Detergenzien aufweisen und die die Inaktivie­ rung von Fermenten hervorrufen können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein solches Verfahren zur Herstellung einer Suspension zur Rekonstruk­ tion von Zellmembranen zu entwickeln, durch das eine Sus­ pension mit erhöhter Effektivität der reparierenden Wirkung des Phosphatidylcholins hergestellt werden kann.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein solches Verfah­ ren zur Herstellung einer Suspension vorgeschlagen wird, in dem das Phosphatidylcholin mit einer Pufferlösung eines Detergens vermischt wird, wobei erfindungsgemäß als Deter­ gens Salze der Glyzyrrhisinsäure bei einem Gewichtsverhält­ nis des Phospatidylcholins zu einem Salz der Glyzyrrhisin­ säure von 1 : 0,1 bis 1 : 0,4 verwendet werden und anschließend das angefallene Gemisch mit Ultraschall in einem Tempera­ turbereich von 4 bis 10°C bearbeitet wird.

Als Phosphatidylcholin kann man Phosphatidylcholin aus Baumwolle, Sojabohnen und Eigelb verwenden. Eine besonders ausgeprägte Wirkung weist das Phosphatidylcholin der Baum­ wolle auf, das durch den Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren eine geringere Viskosität aufweist, effektiver in die Membranen eindringt und zu ihrer Rekonstruktion beiträgt.

Wie oben erwähnt, werden zur Steigerung der Effektivität der Rekonstruktion von Zellmembranen als Detergens Salze der Glyzyrrhisinsäure verwendet, die weiche Detergenzien natürlicher Herkunft darstellen und deshalb ein rascheres Eindringen des Phosphatidylcholins in größeren Mengen in die jeweiligen Membrane fördern.

Das gewählte Verhältnis der Komponenten des Gemisches ist optimal, da bei einer Verringerung der Salzmenge der Gly­ zyrrhisinsäure unter die genannte Grenze die Effektivität der Rekonstruktion von Zellmembranen sinkt, da eine gerin­ gere Menge an Phospatidylcholin in die Membranen eindringt; bei einer Vergrößerung der Salzmenge der Glyzyrrhisinsäure über die genannte Grenze nimmt die Effektivität der Rekon­ struktion von Zellmembranen infolge des Auftretens ihrer Detergenseigenschaften ebenfalls ab.

Die Bedingungen der Ultraschall-Bearbeitung können unter­ schiedlich sein, ihre Funktionsweise ist jedoch die gleiche wie für andere Lipidpräparate auch: je größer die Leistung, desto kürzer die Behandlungsdauer. Es wird empfohlen, das Gemisch 6 bis 10 Minuten bei 4 bis 10°C mit Ultraschall mit einer Durchschnittsleistung zu behandeln.

Beim Ersetzen des Phosphatidylcholins der Baumwollpflanze durch Phosphatidylcholin aus anderen Quellen wird die Dauer der Ultraschallbehandlung einer Suspension verlängert und die Effektivität der Suspensionswirkung wird stark herabge­ setzt.

Zur Untersuchung des Einflusses verschiedenartiger Phospho­ lipid-Suspensionen zur Rekonstruktion von Zellmembranen auf intakte und verletzte Membranen verwendete man als Scree­ ningtest die Inaktivierung des Zytochroms P-450, eines Schlüsselferments eines Detoxikationsmembranensystems des endoplasmatischen Leber-Retikulums, das im wiederherge­ stellten Zustand leicht in eine inaktive Form, das Zyto­ chrom P-420 übergeht.

Bei in-vitro-Versuchen inkubiert man die Membranen mit den im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Suspensionen zur Rekonstruktion von Zellmembranen. Die verletzten Mem­ branen des endoplasmatischen Retikulums scheidet man aus der Leber von Ratten aus, die mit Phenobarbital bzw. mit Heliotrin vergiftet wurden. Die Membranen (2 mg Eiweiß in 1 ml Pufferlösung) vermischt man mit 1 ml Suspension zur Rekonstruktion von Zellmembranen, die nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren hergestellt wird, inkubiert 60 Minuten bei 4°C und registriert dann die Geschwindigkeit der Inak­ tivierung des Zytochroms P-450. Als Kontrolle verwendet man Membranen des endoplasmatischen Retikulums intakter Tiere. Die Effektivität des Rekonstruktion bewertet man im Ver­ gleich zur reparierenden Wirkung eines Essentiale-Präpara­ tes der Firma Nattermann, BRD.

Bei intakten Membranen dauert die Halbinaktivierung des Zytochroms P-450 30 Minuten. Die Zeit der Halbinaktivierung des Hämoproteins in den Membranen des endoplasmatischen Retikulums aus der Leber von Ratten, denen Phenobarbital bzw. Heliotrin verabreicht wurde, betrug 4 bis 5 Minuten.

Nach der Inkubation der verletzten Membranen mit der erfin­ dungsgemäß hergestellten Suspension zur Rekonstruktion von Zellmembranen vergrößert sich die Dauer der Halbinaktivie­ rung auf 25 bis 27 Minuten. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung des Phosphatidylcholins aus Sojabohnen erzielt. Die Inkubation der verletzten Membranen mit dem Essentiale- Präparat führt zu keiner merklichen Änderung der Zeit der Halbinaktivierung des Fermentes und bleibt fast gleich (6 Minuten).

Aus diesem Grunde zeigen die angeführten Ergebnisse, daß in Gegenwart der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herge­ stellten Suspension zur Rekonstruktion von Zellmembranen eine starke Verlangsamung der Inaktivierung des Zytochroms P-450 erfolgt. Die Zeit der Halbinaktivierung des Hämoprot­ eins war die gleiche wie in den intakten Membranen.

Bei Verwendung einer Suspension des Phophatidylcholins und des Salzes der Glyzyrrhisinsäure bei einem Verhältnis in Masseteilen von 1 : 0,05 und einer Dauer der Ultraschallbe­ handlung von 6 Minuten in in-vitro-Versuchen betrug die Zeit der Halbinaktivierung des Zytochroms P-450 in den Membranen des endoplasmatischen Retikulums der Leber von Ratten, denen Phenobarbital bzw. Heliotrin verabreicht wurde, 8 bis 10 Minuten.

Bei einem Verhältnis von Phosphatidylcholin zum Salz der Glyzyrrhisinsäure von 1 : 0,6 und einer Dauer der Ultra­ schallbehandlung von 10 Minuten beträgt die Zeit der Halb­ inaktivierung 10 bis 12 Minuten.

Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Veränderung der vorge­ schlagenen Verhältnisse der Suspensionskomponenten in Masseteilen, d.h. eine Erhöhung oder eine Verringerung, zu einer starken Senkung der Effektivität der Rekonstruktion der verletzten Membranen führt.

Bei der Rekonstruktion der Zellmembranen des endoplasmati­ schen Retikulums in in-vitro-Versuchen führt man den Rat­ ten, denen Heliotrin verabreicht wurde, intravenös drei Tage lang täglich 20 mg pro 100 g Tiergewicht einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Suspension zur Rekonstruktion der Zellmembranen ein. Danach wird in den Membranen des endoplasmatischen Retikulums der Leber die Geschwindigkeit der Inaktivierung des Zytochroms P-450, die N-Dimethylase- und p-Hydroxylase-Aktivität sowie die Akti­ vität der Fermente des Blutserums (Fructose-I-phosphat- Aldolase, alkalische Phosphatase, Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase) ermittelt. Dabei wurde nachge­ wiesen, daß die Zeit der Halbinaktivierung des Zytochroms P-450 in den verletzten Membranen 4 Minuten beträgt. bei der Einführung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Suspension zur Rekonstruktion von Zellmembra­ nen verlängert sich diese Zeit auf 20 Minuten. Die Aktivi­ tät der untersuchten Fermente ist dabei mit den Werten vergleichbar, die für intakte Tiere charakteristisch sind.

Somit kann durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Her­ stellung einer Suspension zur Rekonstruktion von Zellmem­ branen diese Suspension zur effektiveren Wiederherstellung der Zellmembranen sowohl in vivo als auch in vitro einge­ setzt werden, die Detoxikationsfunktion der Leber und das Niveau der Aktivität der Fermente im Blutserum, deren Veränderung ein Kennzeichen für nekrotische Prozesse in der Leber ist, normalisiert werden und die Überlebensrate von Tieren mit toxischer Hepatitis vergrößert werden, wodurch wiederum dieses Verfahren in der experimentellen Biologie und in der Medizin angewendet werden kann.

Das Verfahren zur Herstellung einer Suspension zur Rekon­ struktion von Zellmembranen ist in seiner technologischen Durchführung einfach und wird wie folgt durchgeführt:
Man stellt eine Suspension aus Phosphatidylcholin und aus dem Salz der Glyzyrrhisinsäure her. Hierfür wird in einen Rundkolben 1 Masseteil Phosphatidylcholin, das in einem organischen Lösungsmittel (Benzol, Methanol, Chloroform) gelöst wurde, aufgegeben. Dann wird der Kolben an einen Rotor-Verdampfer angeschlossen und das Lösungsmittel zur Trockne eingedampft. Man erhält einen trockenen Lipidfilm, dem man eine Pufferlösung der Glyzyrrhisinsäure zugießt. Der Gehalt an Salz der Glyzyrrhisinsäure beträgt 0,1 bis 0,4 Masseteile je Masseteil Phosphatidylcholin. Die Kompo­ nenten werden sorgfältig bis zur Auflösung des Phosphati­ dylcholins vermischt. Die erhaltene trübe Flüssigkeit wird in ein Becherglas zur Ultraschallbehandlung übertragen und in einem Ultraschalldesintegrator 6 bis 10 Minuten bei höchstens 10°C einer Ultraschalleinwirkung bei durch­ schnittlicher Leistung ausgesetzt. Wenn die Suspension klar wird, wird die Ultraschallbehandlung beendet. Die dadurch erhaltene Suspension verwendet man zur Rekonstruktion von Zellmembranen in vivo und in vitro.

Zur besseren Erläuterung der vorliegenden Erfindung werden die nachstehenden konkreten Beispiele angeführt.

Beispiel 1

20 mg Phosphatidylcholin der Baumwolle werden in 2 ml Chloroform gelöst und in einem Rotor-Verdampfer zur Trockne eingedamft. Dem erhaltenen Lipidfilm werden 2 mg Trinatri­ umsalz der Glyzyrrhisinsäure in 1 ml 100 molarem tris-HCl- Puffer bei einem pH-Wert von 7,5 zugesetzt. Das Massenver­ hältnis beträgt 1 : 0,1. Die Suspension behandelt man 6 Mi­ nuten in einem Ultraschall-Desintegrator bei 150 W und einer Frequenz von 23,3 kHz. Die Zeit der Halbinaktivierung des Zytochroms P-450 vergrößert sich in in-vitro-Versuchen von 4 bis 5 Minuten auf 25 bis 27 Minuten.

Beispiel 2

Das Verfahren wird wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch verwendet man eine Suspension aus Phosphatidylcholin der Baumwolle und ein Trikaliumsalz der Glyzyrrhisinsäure bei einem Verhältnis ihrer Masseteile von 1 : 0,4. Die Ultra­ schallbehandlung dauert dabei 10 Minuten. Die Effektivität der Rekonstruktion ist wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Das Verfahren wird wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch verwendet man eine Suspension aus Phosphatidylcholin der Sojabohnen und ein Trinatriumsalz der Glyzyrrhisinsäure in einem Verhältnis von 1 : 0,25. Die Ultraschallbehandlung dauert 20 Minuten. Bei der Verwendung dieser Suspension zur Rekonstruktion von Zellmembranen in in-vitro-Versuchen beträgt die Zeit der Halbinaktivierung des Zytochroms P-450 15 bis 17 Minuten.

Beispiel 4

Das Verfahren wird wie oben beschrieben durchgeführt, jedoch verwendet man aber eine Suspension aus Phosphatidyl­ cholin von Eigelb und ein Trinatriumsalz der Glyzyrrhisin­ säure in einem Verhältnis von 1 : 0,2. Die Ultraschallbehand­ lung dauert 30 Minuten. Die Zeit der Halbinaktivierung des Zytochroms P-450 beträgt 10 bis 12 Minuten.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung einer Suspension zur Rekonstruk­ tion von Zellmembranen, das das Vermischen des Phosphati­ dylcholins und der Pufferlösung eines Detergens vorsieht, dadurch gekennzeichnet, daß man als Detergens Salze der Glyzyrrhisinsäure bei einem Gewichts­ verhältnis von Phosphatidylcholin : Salz der Glyzyrrhisinsäu­ re von 1 : 0,1 bis 1 : 0,4 verwendet und das angefallene Ge­ misch anschließend bei 4 bis 10°C mit Ultraschall bearbei­ tet.