EP0815211A1 - Neue, definierte enzymmischungen zur zellgewinnung und für die wundbehandlung - Google Patents

Neue, definierte enzymmischungen zur zellgewinnung und für die wundbehandlung

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EP0815211A1
EP0815211A1 EP96907436A EP96907436A EP0815211A1 EP 0815211 A1 EP0815211 A1 EP 0815211A1 EP 96907436 A EP96907436 A EP 96907436A EP 96907436 A EP96907436 A EP 96907436A EP 0815211 A1 EP0815211 A1 EP 0815211A1
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EP
European Patent Office
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collagenase
cells
gly
pro
enzymes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96907436A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Claus Otto Markert
Hans Thom
Jürgen Weymann
Wolfgang Zahn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott GmbH and Co KG
Original Assignee
Knoll GmbH
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Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19532906A external-priority patent/DE19532906A1/de
Application filed by Knoll GmbH filed Critical Knoll GmbH
Publication of EP0815211A1 publication Critical patent/EP0815211A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the use of defined mixtures of purified enzymes from Clostridium histolyticum for the reproducible, standardized extraction of cells or tissue fragments from human or animal tissue and the use of these purified enzymes for wound treatment.
  • the normally used and recommended collagenase-containing preparations (2) are obtained from culture filtrates of the bacterial strain Clostridium histolyticum and, in addition to various collagenases and proteases (3a), (3b), also contain cleavage products of these enzymes formed by proteolysis, as well as others, some of which are harmful acting and unknown components.
  • Collagenase fraction and purified trypsin from bovine pancreas isolated.
  • the collagenase fraction used was enriched However, 2 was not defined in terms of its content of various enzymes and also contained, for example, small amounts of clostripain.
  • the success of the isolation was not significantly different from that which was obtained when using undefined compositions containing collagenase. Satisfactory tissue disintegration could not be achieved with individual components of the mixture.
  • trypsin for cell isolation is not without problems, since this proteolytic enzyme attacks membrane proteins. For example, insulin binding to liver membranes and adipocytes is negatively influenced (5).
  • Hefley (6), (7) used mixtures of purified collagenase fractions to isolate bone cells from the skull cap of mice (6). Earlier (7) the author described that a mixture of a purified collagenase fraction can be used together with a neutral protease to successfully isolate these cells. In both studies, however, eluates from column fractionations were used, whose content of various collagenases, which differ in their substrate specificity, and of other components was not known.
  • the invention relates to the individual enzymes collagenase HP, collagenase AZ and elastase, in high purity and mixtures thereof.
  • Collagenase HP has a specific activity of at least 20 U / mg, preferably at least 50 U / mg in the Grclumann and Nordwig (11) test with the synthetic hexapeptide Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala as substrate. For pharmaceutical purposes, it preferably has a specific activity of 100 U / mg or more.
  • Collagenase AZ has a specific activity of at least 10 U / mg, preferably at least 30 U / mg in the test according to Mandl et al. (12) using azocoll as substrate. For phar a- for therapeutic purposes, it preferably has a specific activity of 50 U / mg or more.
  • Elastase has a specific activity of at least 2 U / mg, preferably at least 5 U / mg in the test with elastin from the neck band of the cattle as a substrate. For pharmaceutical purposes, it preferably has a specific activity of 12 U / mg or more.
  • the invention further relates to the use of a mixture of collagenase HP and elastase, optionally with the addition of collagenase AZ and / or clostripain, for the isolation of cells or tissue fragments from human or animal tissue.
  • the invention further relates to the direct or indirect use of these enzymes, alone or as a component of mixtures, for medical applications, e.g. in wound treatment.
  • the mixtures can, for example, be packaged in vials in lyophilized form in such a way that they are sufficient for disintegration from an individual rat liver (approx. 9-11 g wet weight of the organ).
  • Suitable mixtures are those which consist of at least two of the purified enzymes collagenase HP (50-300 U; preferably 70-170 U) and elastase (5-70 U, preferably 10-25 U) and optionally an addition of collagenase AZ (1-20, preferably 2-8 U) and / or clostripain (10-280 U, preferably 20-50 U) contain.
  • the numbers given indicate the amounts in one unit of the mixture - for example in a vial - available.
  • the purity criterion for the enzymes used is their respective specific activity and their uniformity detection in the electrophoretic methods commonly used for this purpose (SDS gel electrophoresis, isoelectric focusing and electrophoresis on agarose gel).
  • the specific activity of the purified enzymes is up to 100 times higher than that of the starting material.
  • a major advantage is that a time-consuming and costly inspection of batches is no longer necessary, since the production of purified enzymes is based on known properties. This eliminates the workload that is necessary for the functional characterization of the cells, or at least it is reduced. For these reasons, the number of animal experiments can be reduced in many areas.
  • tissue fragments and / or cells are suitable for the use of the mixtures of purified enzymes according to the invention:
  • the biliary tract the blood system, glands, the vascular system, the brain, the skin, the heart, the intes inu, Langerhans' islets, the liver, the lungs, the stomach, the spleen, muscles, the Umbilical cord, nerves, the kidney, the pancreas, the spinal cord, the thyroid, the terminal ileum, tumor tissue, the uterus, the digestive tract and the tongue.
  • the cells or tissue fragments isolated with the aid of the mixtures described are particularly suitable for use in cell and tissue transplantation, as well as in gene therapy (e.g. islets of Langerhans, islet cells, hepatocytes, tumor cells, adipocytes), in immunotherapy or in Wound treatment.
  • gene therapy e.g. islets of Langerhans, islet cells, hepatocytes, tumor cells, adipocytes
  • immunotherapy e.g. islets of Langerhans, islet cells, hepatocytes, tumor cells, adipocytes
  • Wound treatment e.g. islets of Langerhans, islet cells, hepatocytes, tumor cells, adipocytes
  • hybrids according to the invention are particularly advantageous.
  • a well-defined mixture of 2 collagenases with different substrate specificity and one elastase has proven to be ideally suited for the isolation of hepatocytes from rat liver (application examples A, D, E) and human liver (application example F) from bile duct epithelial cells
  • Rat livers application example G
  • endothelial cells from human umbilical cords
  • application examples I and islet cells from porcine pancreas
  • Another main area of application is wound treatment.
  • the enzymes are used in the highest possible purity.
  • collagenase HP and collagenase AZ were collected in separate fractions.
  • the two separate enzyme fractions of collagenase HP and collagenase AZ were concentrated to 50-100 ml with the aid of an ultrafiltration membrane (cutoff limit 10,000 Da), then dialyzed against water and again through an ultrafiltration membrane (cutoff limit 10,000 Da) to approx. 10 liters concentrated.
  • the collagenase HP was eluted from the column with buffer C (20 mM TRIS / HCl + 200 mM NaCl, pH 7.5) in purified form.
  • Collagenase HP got its name * HP "because of its property to break down the hexapeptide Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala particularly well. It is therefore suitable for a specific detection of the activity.
  • Collagenase HP is characterized in that it can only convert denatured collagens such as gelatin or azocoll to a small extent, but it attacks bovine tendon collagen and cleaves the synthetic peptides mentioned in Example 2b between glycine and glycine or between any amino acid and glycine with high conversion.
  • collagenase HP together with collagenase AZ (vice-versa, i.e. also any mixture of at least collagenase HP and AZ) has an over-additive effect on the degradation of native collagen. This synergistic effect in vitro is also important when used for tissue integration (e.g. application example G).
  • the specific activity of collagenase HP is a maximum of 146 U / mg in the test with the synthetic substrate Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala (11). This corresponds to an approximately 100-fold increase in their specific activity compared to the starting material.
  • the collagenase HP purified in this way forms only a single band both in SDS gel electrophoresis and in isoelectric focusing and electrophoresis on agarose gel.
  • the fine purification of collagenase AZ was carried out on the anion exchanger Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) and with the aid of the FPLC device from Pharmacia.
  • a mixture of 1 ml of buffer D and 1 ml of the fraction containing collagenase AZ (from the metal chelate described above) was added to the column, which had been equilibrated with buffer D (20 mM calcium acetate, pH 7.2). Affinity chromatography).
  • collagenase AZ was eluted from the column with buffer E (20 mM calcium acetate, pH 5.0).
  • the collagenase AZ received its designation * AZ "due to its property of degrading the substrate azocolla particularly well. It is characterized in that it converts denatured collagens such as gelatin or azocolla, but also bovine tendon collagen well. However, it is capable of small synthetic peptides such as 2 -Furanacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala, 4-phenyl-azobenzyloxy-carbonyl-Pro Leu-Gly-Pro-Arg and Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala.
  • collagenase AZ The specific activity of collagenase AZ is a maximum of 82 U / mg in that of Mandl et al. (12) developed test using Azokoll as substrate. This corresponds to an approximately 80-fold increase in their specific activity compared to the starting material.
  • the collagenase AZ purified in this way forms only a single band both in SDS gel electrophoresis and in isoelectric focusing and electrophoresis on agarose gel. Its molecular weight determined by SDS gel electrophoresis is 111,000 Da. Their isoelectric point is at pH 5.9-6.1.
  • the first cleaning step of elastase was carried out by protein precipitation with ammonium sulfate, as described under l.a. described.
  • the protein precipitate AI is dissolved in 1 L of water, concentrated to about 170 mL via an ultrafiltration membrane (cutoff limit 10,000 Da) and dialyzed against a 0.1 mM calcium acetate solution. The enzyme solution was then again concentrated over an ultrafiltration membrane (cut-off limit 10,000 Da) to approximately 50 mL and then lyophilized.
  • the fine purification was carried out by gel chromatography on SEPHADEX G100 or G200 (Pharmacia).
  • the elastase is characterized in that it can break down elastin with high conversion. Their specific activity (see 3.c.) was 18 U / mg. This corresponds to an approximately 80-fold increase in their specific activity compared to the starting material.
  • the elastase purified in this way forms only a single band in SDS gel electrophoresis as well as in isoelectric focusing and electrophoresis on agarose gel.
  • the molecular weight of the elastase determined by SDS electrophoresis is 35,000 Da. c. Activity determination
  • the factor F is determined by completely dissolving 10 mg elastin of a certain batch with the aid of elastase and measuring the corresponding extinction difference ⁇ E.
  • the multiplication of this factor F by the extinction difference ⁇ E gives the dissolved milligram amount of elastin per mL test batch.
  • Clostripain was isolated by the method described by Ullmann and Jakubke (14).
  • the thiol protease clostripain is characterized in that it cleaves specifically behind the amino acid L-arginine in polypeptide chains and in synthetically produced substrates.
  • Hepatocytes were isolated using the standard Berry and Friend method (9) and the modification by Seglen (16).
  • Wistar rats 200-280 g were anesthetized by ip injection of nembutal (35 mg pentobarbital / kg body weight).
  • the vena portae was cannulated, and the following carbogen-gassed solutions with a pH value of 7.4 ⁇ were subjected to constant hydrostatic pressure (12 cm water column, variable flow rate) 0.05 infused at a temperature of 36-36.8 ° C after opening of the inferior vena cava:
  • Carbogen gas mixture of 95% 0 2 and 5% C0 2 (v / v)
  • the enzyme mixture was a lyophilizate of 130 U collagenase HP, 5 U collagenase AZ and 21 U elastase, which was dissolved in 87.5 mL cell buffer.
  • the proportion of vital hepatocytes, hepatocyte-cell pairs or multicellular aggregates from hepatocytes was determined microscopically after resuspension of the cell precipitate obtained in a Burker count (staining with 0.08% trypan blue, for 2 minutes). Result
  • the enzyme mixture used was a lyophilisate of 130 U collagenase HP, 5 U collagenase AZ and 21 U elastase, which was in 87.5 ml cell buffer (analogous to example A).
  • the success of the isolation of hepatocytes was measured using the following five parameters: 1. microscopic determination of the proportion of vital hepatocytes (in% of the total number of hepatocytes in the cell suspension obtained by means of a trypan blue exclusion test), 2. determination of the total number of isolated hepatocytes, 3. determination measurement of the total number of hepatocytes isolated per gram of animal weight, 4. determination of the proportion of single cells (in% based on all forms of aggression in the cell suspension obtained, ie compared to two and multiple aggregates of hepatocytes), and 5. recording of the success rate Tissue disintegration necessary perfusion time with the collagenase solution.
  • Hepatocytes were isolated using the standard Berry and Friend method (9) and the modification by Seglen (16).
  • the enzyme mixture used was a lyophilizate of 130 U.
  • the quality of the cell suspension obtained was further characterized with regard to the function of the hepatocytes (21, 22) by the following parameters: ATP content, energy charge (EC), lidocaine metabolism to monoethylglycine xylidide (MEGX), and absorption of cholyItaurin ((3 ⁇ , 7 ⁇ , 12 ⁇ -trihydroxy-5ß-cholan-24-oyD-2-aminoethanesulfonic acid) at a substrate concentration of 21 ⁇ -M.
  • the hepatocytes isolated with an enzyme mixture according to the invention not only after assessment by the simple isolation success, but also after evaluation of various cell functions, e.g. certain functions of differentiated mass transport, or certain metabolic performances of cytochrome P450-dependent enzymes of the hepatocytes, are completely intact.
  • Hepatocytes were isolated by the Berry and Friend method (9) and the modifications by Seglen (16) using a Biopsy perfusion technique (21).
  • the enzyme mixture used was a lyophilizate of 130 U collagenase HP, 5 U collagenase AZ and 21 U elastase, which was dissolved in 50 mL cell buffer.
  • the success of the isolation of human hepatocytes was determined according to the following parameters: proportion of vital cells after the trypan blue exclusion test and cell yield per g of liver.
  • biliary epithelial cells from the rat liver were isolated according to the method described in reference (18).
  • hepatocytes were first removed enzymatically from the tissue, and in a second step biliary epithelial cells were isolated from the remaining tissue with trypsin.
  • the enzyme mixture for removing the hepatocytes was a lyophilizate of 130 U collagenase HP, 5 U collagenase AZ and 21 U elastase, which was dissolved in 87.5 mL cell buffer.
  • the use of the enzyme mixture described made it extremely easy to isolate biliary epithelial cells from the remaining vascular system using trypsin, since the residual tissue obtained after the first step was practically free of hepatocytes.
  • Human umbilical vein endothelial cells were isolated using the method of Jaffe (17). For this purpose, the umbilical cords (20 - 30 cm long) were halved, filled in pairs with the respective enzyme solution and incubated for 15 min at 37 ° C and 5% CO 2 in the incubator. The detached cells were removed and kept in primary culture for evaluation. The yield of living and Divisible cells were determined after washing the non-adherent cells after four days in culture.
  • the enzyme mixture was a lyophilizate of 130 U collagenase HP, 5 U collagenase AZ and 21 U elastase, which was dissolved in 87.5 mL cell isolation buffer.
  • the confluent cell lawn consists of over 95% endothelial cells, such as FACS studies with antibodies against factor VIII-related antigen (Von Willebrand factor) or two endothelium-specific surface antigens (EN-4, PAL-E) or with a fluorescent ligand of the scavenger receptor (dil-Ac-LDL).
  • the yield (n 2) achieved with the above-mentioned mixture of purified enzymes exceeded that which had been obtained with enzyme preparations containing collagenase and having an undefined composition.
  • the cell density after 4 days was 1.8 x IO 4 per cm 2 . If you use previously known methods, you get a cell density that is significantly lower. The confluence of the monolayer was reached earlier (already after 5-6 days) when using the above mixture.
  • the prepared cells were functionally checked in the first passage (endothelin production, release of LDH). All values were within the normal range. The functions of the cells were therefore indistinguishable from results from control experiments in which cells with preparations containing collagenase containing an undefined composition were isolated.
  • Tumor cells were isolated from human tumors according to protocol (23).
  • the enzyme mixture used was a lyophilizate of 130 U
  • Collagenase HP 5 U collagenase AZ and 21 U elastase, which was dissolved in 28.4 L cell isolation buffer (Ringer's lactate / PBS).
  • the success of the isolation was determined on the basis of the proportion of vital cells after the trypan blue exclusion test and counting of the number of lymphocytes. Directly comparative cell isolations were carried out using the enzyme mixture according to the invention and a preparation of an undefined composition containing collagenase, which is very suitable for this purpose, in 4 different tumor tissues.
  • the enzyme mixture according to the invention can be used very well to isolate tumor cells from human tumors.
  • the collagenase solution acts on the pancreatic tissue for a long time after infusion through the pancreatic duct under particularly well-standardized conditions.
  • the islands which have already been detached are continuously discharged into a reservoir at a lower temperature, and after the disintegration has ended, the islands which have already been partially freed from their matrix in the pancreatic tissue are completely detached and isolated using light mechanical treatment.
  • the success of the isolation can be determined on the basis of the size distribution of the intact cell aggregates obtained and other customary parameters.
  • mixtures could also be used successfully, for example those composed of collagenase HP (3-48 U / cm 2 ) and elastase (1-12 U / cm 2 ).
  • Example K The results obtained on the degrading effect of the necrotic tissue (Example K) were characterized further in an in vitro model.
  • the release of 4-hydroxyproline (20) was determined after 2, 4, 6 and 24 hours by the action of collagenase HP, collagenase AZ and / or elastase on the burn scab mentioned in Example K.
  • the purified enzymes and enzyme mixtures according to the invention can also be used in therapeutic areas, such as in wound treatment or for the treatment of keloids or fibrils. They can be applied externally or injected.

Abstract

Die Erfindung betrifft die Anwendung von definiert zusammengesetzten Mischungen aus gereinigten Enzymen aus Clostridium histolyticum zur reproduzierbaren, standardisierten Gewinnung von Zellen oder Gewebefragmenten aus humanen oder tierischen Geweben, sowie diese Enzyme und deren Mischungen; darüber hinaus betrifft sie die direkte oder indirekte medizinische Anwendung dieser Enzyme, allein oder als Bestandteil von Mischungen, z.B. in der Wundbehandlung.

Description

Neue, definierte Enzymmischungen zur Zellgewinnung und für die Wundbehandlung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung definierter Mischungen von gereinigten Enzymen aus Clostridium histolyticum zur reproduzierbaren, standardisierten Gewinnung von Zellen oder Gewebefragmenten aus humanem oder tierischem Gewebe und die An¬ wendung dieser gereinigten Enzyme zur Wundbehandlung.
Methoden zur Isolierung von Zellen aus Geweben sollten reprodu¬ zierbar durchführbar sein und eine möglichst geringe Schädigung der gewonnenen Zellen garantieren. Hierfür werden bisher im allgemeinen Undefiniert zusammengesetzte, Kollagenase enthaltende Präparate aus Clostridium histolyticum verwendet, mit denen diese Ziele nicht sicher zu erreichen sind. Der Einsatz anderer Enzym- präparate, oder nicht-enzymatischer Methoden, ist nicht üblich oder liefert nur schlechte Isolierungserfolge (1), (9).
Die normalerweise benutzten und zur Benutzung empfohlenen Kollagenase enthaltenden Präparate (2) werden aus Kulturfiltraten des Bakterienstammes Clostridium histolyticum gewonnen und ent- halten neben verschiedenen Kollagenasen und Proteasen (3a), (3b) noch durch Proteolyse gebildete Spaltprodukte dieser Enzyme sowie weitere, zum Teil schädlich wirkende und unbekannte Bestandteile.
Mit einem einzelnen Enzym aus Clostridium histolyticum ist es nach bisherigem Kenntnisstand nicht möglich, lebensfähige Zellen in guter Ausbeute zu erhalten. Vielmehr müssen unterschiedliche Enzyme aus diesem Bakterium zusammenwirken, um einen effektiven Gewebeabbau zu erzielen. Es ist allerdings bisher nicht bekannt gewesen, welches Mengenverhältnis an Enzymen dazu erforderlich ist. Definierte Gemische von Enzymen aus Clostridium histolyticum sind bisher für den Anwender auch nicht erhältlich.
Aus der dargestellten Problematik heraus haben verschiedene Ar¬ beitsgruppen versucht, gereinigte Enzyme für die Isolierung von Zellen aus Geweben einzusetzen. Dabei wurden jedoch nie einheit¬ liche Enzyme und damit auch keine klar definierten Mischlingen verwendet.
Von Suggs et al. (4) wurden menschliche Venen-Endothelzellen mit Hilfe einer Mischung, bestehend aus einer gereinigten
Kollagenasefraktion und gereinigtem Trypsin aus Rinder-Pankreas, isoliert. Die eingesetzte angereicherte Kollagenase-Fraktion war 2 jedoch nicht definiert in ihrem Gehalt an verschiedenen Enzymen und enthielt z.B. auch noch geringe Mengen an Clostripain. Der Isolierungserfolg war nicht signifikant verschieden von demjeni¬ gen, der bei Verwendung von Undefiniert zusammengesetzten, Kollagenase enthaltenden Präparaten erhalten worden war. Mit ein¬ zelnen Komponenten der Mischung konnte keine befriedigende Gewebedesintegration erreicht werden. Der Einsatz von Trypsin zur Zellisolierung ist jedoch nicht unproblematisch, da dieses proteolytische Enzym Membranproteine angreift. So wird z.B. die Insulin-Bindung an Lebermembranen und an Adipozyten negativ be¬ einflußt (5).
Von Hefley (6), (7) wurden zur Isolierung von Knochenzellen aus der Schadeldecke von Mäusen Mischungen gereinigter Kollagenase- fraktionen eingesetzt (6). Früher (7) beschrieb der Autor, daß zur erfolgreichen Isolierung dieser Zellen ein Gemisch aus einer gereinigten Kollagenasefraktion zusammen mit einer neutralen Protease eingesetzt werden kann. In beiden Arbeiten wurden jedoch Eluate aus Säulenfraktionierungen eingesetzt, deren Gehalt an verschiedenen, in ihrer Substratspezifität sich unterscheidenden Kollagenasen und an sonstigen Komponenten nicht bekannt war.
Von Wolters et al. (8) wurden zur Isolierung von Inselzellen aus Ratten-Pankreas Mischungen aus neutraler Protease und "Kollagenase Typ VII* der Firma Sigma verwendet, von.der jedoch nicht bekannt ist, welche Arten und Mengen an verschiedenen Kollagenasen sie enthielt. Außerdem wies sie einen geringen Gehalt an Clostripain und "unspezifischer Protease* auf. Die neu¬ trale Protease wurde in einer hochgereinigten Form eingesetzt. Mischungen der beiden genannten Komponenten ergaben gute Ausbeu¬ ten an lebensfähigen Inselzellen.
Gegenstand der Erfindung sind die einzelnen Enzyme Kollagenase HP, Kollagenase AZ und Elastase, in hoher Reinheit und deren Mischungen.
Kollagenase HP besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 20 U/mg, vorzugsweise mindestens 50 U/mg im Test nach Graßmann und Nordwig (11) mit dem synthetischen Hexapeptid Z-Gly-Pro-Gly- Gly-Pro-Ala als Substrat. Für pharmazeutische Zwecke besitzt sie vorzugsweise eine spezifische Aktivität von 100 U/mg oder mehr.
Kollagenase AZ besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 10 U/mg, vorzugsweise mindestens 30 U/mg im Test nach Mandl et al. (12) unter Verwendung von Azokoll als Substrat. Für phar a- zeutische Zwecke besitzt sie vorzugsweise eine spezifische Aktivität von 50 U/mg oder mehr.
Elastase besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens 2 U/mg, vorzugsweise mindestens 5 U/mg im Test mit Elastin aus dem Nackenband des Rindes als Substrat. Für pharmazeutische Zwecke besitzt sie vorzugsweise eine spezifische Aktivität von 12 U/mg oder mehr.
Gegenstand der Erfindung ist weiter die Verwendung einer Mischung aus Kollagenase HP und Elastase, ggf. unter Zusatz von Kollagenase AZ oder/und Clostripain zur Isolierung von Zellen oder Gewebefragmenten aus humanem oder tierischem Gewebe.
Weiter betrifft die Erfindung die direkte oder indirekte Verwendung dieser Enzyme, allein oder als Bestandteil von Mischungen, für medizinische Anwendungen, z.B. in der Wundbehand¬ lung.
Für die Anwendung zur Gewebedesintegration können die Mischungen beispielsweise in solchen Mengen in Vials in lyophilisierter Form konfektioniert werden, daß sie zur Desintegration von einer ein¬ zelnen Ratten-Leber (ca. 9-11 g Feuchtgewicht des Organs) ausrei¬ chen.
Als Mischungen kommen solche in Betracht, welche aus mindestens zwei der gereinigten Enzyme Kollagenase HP (50-300 U; bevorzugt 70-170 U) und Elastase (5-70 U, bevorzugt 10-25 U) bestehen und gegebenenfalls einen Zusatz von Kollagenase AZ (1-20, bevorzugt 2-8 U) und/oder Clostripain (10-280 U, bevorzugt 20-50 U) enthal¬ ten. Die angegebenen Zahlen geben die Mengen an, die in einer Einheit der Mischung - beispielsweise in einem Vial - vorliegen.
Reinheitskriterium für die verwendeten Enzyme ist ihre jeweilige spezifische Aktivität und ihr Einheitlichkeitsnachweis in den für diesen Zweck üblicherweise verwendeten elektrophoretischen Metho¬ den (SDS-Gel-Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung und Elektrophorese auf Agarosegel). Die spezifische Aktivität der ge¬ reinigten Enzyme erreicht bis zu lOOfach höhere Werte im Ver- gleich zum Ausgangsmaterial.
Für die Herstellung der Mischungen werden gereinigte Enzyme mit den folgenden spezifischen Aktivitäten eingesetzt: Kollagenase HP mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 20 U/mg, Elastase mit mindestens 2 U/mg, Kollagenase AZ mit mindestens 10 U/mg und Clostripain mit mindestens 10 U/mg. 4
Die Mischungen zeichnen sich dadurch aus, daß sie, aufgrund ihrer definierten Zusammensetzung aus Synergistisch wirkenden kollage- nolytischen, sowie elastinoloytischen und proteolytisehen Enzy¬ men, besonders geeignet sind für eine schonende und effektive Isolierung von Zellen oder von Gewebefragmenten aus tierischen und humanen Geweben.
Ein wesentlicher Vorteil ist, daß eine Zeit- und kostenaufwendige Prüfung von Chargen nicht mehr erforderlich ist, da für die Her- Stellung von gereinigten Enzymen mit jeweils bekannten Eigen¬ schaften ausgegangen wird. Dadurch entfällt der Arbeitsaufwand, welcher zur funktionellen Charakter sierung der Zellen notwendig ist, oder er wird zumindest geringer. Aus diesen Gründen kann die Anzahl von Tierversuchen in vielen Bereichen vermindert werden.
Die Verwendung von weniger gut gereinigten Enzymen, oder eine Verwendung von Enzymen mit geringerer spezifischer Aktivität, führt in der Regel zu schlechteren Zellausbeuten bei den genann¬ ten Anwendungen, und ist darüberhinaus von den üblichen Problemen der mangelnden Reproduzierbarkeit des Isolierungserfolges, einer mangelnden Chargen-Konstanz und dem Vorhandensein unbekannter, möglicherweise negativ wirkender Bestandteile behaftet.
Viele in der Literatur beschriebene Versuchsergebnisse sind wegen des bei der Herstellung, Reinigung oder der Charakterisierung auftretenden Abbaus der Enzyme durch Begleitproteasen schwierig zu interpretieren. Die Aufklärung des Beitrages der einzelnen En¬ zyme zum Versuchserfolg bei der Zellisolierung wurde auch dadurch erschwert, daß die aus den Kollagenasen, der Elastase und den Proteasen entstehenden Bruchstücke teilweise ihre enzymatische Aktivität behalten. Inwieweit sich die Substratspezifitäten dabei ändern, ist jedoch noch nicht geklärt. Auch in vielen kommerzi¬ ellen Kollagenase-haltigen Präparaten sind manchmal nur Abbaupro¬ dukte der ursprünglichen Kollagenasen enthalten. Nach dem bishe- rigen Stand der Technik war also eine eindeutige Standardisierung von Kollagenase-hal igen Präparaten sowohl für die Präparate-Her¬ steller als auch für die Anwender von Zeilisolierungsmethoden nicht möglich.
Für die Anwendung der erfindungsgemäßen Mischungen aus gereinig¬ ten Enzymen kommen wegen ihrer breiten gewebeabbauenden Aktivität alle menschlichen und tierischen Gewebe und Zellen in Frage, vor¬ zugsweise Gewebefragmente und/oder Zellen aus:
dem biliären Trakt, dem Blutsystem, Drüsen, dem Gefäßsystem, dem Gehirn, der Haut, dem Herzen, dem Intes inu , Langerhans'sehen Inseln, der Leber, der Lunge, dem Magen, der Milz, Muskeln, der Nabelschnur, Nerven, der Niere, dem Pankreas, dem Rückenmark, der Schilddrüse, dem terminalen Ileum, Tumorgewebe, dem Uterus, dem Verdauungstrakt und der Zunge.
Die mit Hilfe der beschriebenen Mischungen isolierten Zellen oder Gewebefragmente eignen sich ganz besonders für den Einsatz in der Zeil- und Gewebetransplantation, sowie in der Gentherapie (z.B. Langerhans'sehe Inseln, Inselzellen, Hepatozyten, Tumorzellen, Adipozyten) , in der Immuntherapie oder in der Wundbehandlung.
Von besonderer Bedeutung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Mischlingen bei der Isolierung von Hepatozyten, Langerhans'sehen Inselzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, Adipozyten, Oozyten und Tumorzellen. In diesen Anwendungsbereichen ist eine Standar- disierung und Verbesserung der Methodik in besonderem Maß vor¬ teilhaft.
Zum Beispiel hat sich eine definiert zusammengesetzte Mischung aus 2 Kollagenasen mit unterschiedlicher Substratspezifität und einer Elastase als hervorragend geeignet für die Isolierung von Hepatozyten aus Ra ten-Leber (Anwendungsbeispiele A, D, E) und Human-Leber (Anwendungsbeispiel F) , von Gallengangsepithelzellen aus Ratten-Lebern (Anwendungsbeispiel G) , von Endothelzellen aus menschlichen Nabelschnüren (Anwendungsbeispiele H) , sowie zur Isolierung von Tumorzellen aus Human-Tumoren (Anwendungsbeispiel I) und Inselzellen aus Schweine-Pankreas (Anwendungsbeispiel J) erwiesen.
Im Vergleich zu den besten Undefiniert zusammengesetzten, Kolla- genase-haltigen Enzympräparaten wird ein besserer oder zumindest gleich guter Isolierungserfolg erzielt.
Die erfindungsgemäßen Mischungen können als Ersatz für alle üblicherweise benutzten Kollagenase-haltigen Präparate verwendet werden, da sie die für eine Gewebedesintegration notwendigen Kom¬ ponenten aufweisen. Die Nachteile der bisher verwendeten Kollage¬ nase-haltigen Präparate werden u.a. aufgrund der konstanten Zusammensetzung der Mischungen vermieden.
Ein wichtiges Einsatzgebiet für die genannten Mischungen ist die reproduzierbare, standardisierte Gewinnung von Hepatozyten aus der Leber nach der anerkannten Methode von Berry und Friend (9), (10) , bei der bislang mit Undefiniert zusammengesetzten, Kollage¬ nase-haltigen Enzympräparaten gearbeitet wurde, sowie die durch Einsatz der genannten Mischungen nach dem Stand der Technik ver- 6 besserte Gewinnung von Inselzellen in intakter Form aus Pankreas- Gewebe.
Ein weiteres Hauptanwendungsgebiet ist die Wundbehandlung. Hier- für werden die Enzyme in möglichst hoher Reinheit verwendet.
I. Präparation und Charakterisierung der Enzyme aus Clostridium histolyticum
1. Kollagenase HP
a. Herstellung
Fraktionierte Proteinfällung mit Ammoniumsulfat
Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchge¬ führt.
200 g Rohkollagenase wurden in 3 L Wasser gelöst und in die erhaltene Lösung zunächst 680 g pulverisiertes Ammoniumsulfat eingetragen. Der ausgefallene Proteinniederschlag AI wurde durch Zentrifugation abgetrennt; zum Oberstand wurden weitere 420 g Ammoniumsulfat gegeben. Die hierbei ausgefällte Proteinfraktion A2 wurde abgeschleudert, der Niederschlag in 1 L Wasser gelöst und gegen Wasser dialysiert. Danach wurde über eine Ultrafiltra¬ tionsmembran (Ausschlußgrenze 10.000 Da) auf etwa 100 mL konzen¬ triert. Das Konzentrat wurde dann lyophilisiert. Die so gewonnene pulverförmige Proteinfraktion A2 enthielt Kollagenase HP und Kollagenase AZ als Hauptkomponenten.
Chromatographische Trennung von HP und Kollagenase AZ mittels Me- tallchelat-Äffinitätsehromatographie
Die chromatographische Trennung von Kollagenase HP und Kollage- nase AZ erfolgte an Zn2+-beladener Chelating Sepharose 6B. Dazu wurde dieses Material in einer Schichthöhe von 70 cm in eine Säule (5 x 100 cm) gepackt und mit Startpuffer (500 mM Natrium- acetat + 20 mM Calciumacetat, pH 8,0) äquilibriert. Dann wurden ca. 1,2 g der Proteinfraktion A2, gelöst in 15 mL Startpuffer, dessen pH-Wert mit TRIS [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan] auf 8,4 korrigiert worden war, auf die Säule aufgetragen und mit Startpuffer verschiedene Bestandteile der Proteinfraktion A2 aus der Säule gewaschen. Bei der nachfolgenden Elution mit dem Puffer A (500 mM Natriumacetat + 20 mM Calciumacetat, mit Essigsäure auf pH 6,3 korrigiert) wurde zunächst Kollagenase AZ und dann Kollagenase HP in getrennten Fraktionen aufgefangen. Die beiden getrennten Enzymfraktionen von Kollagenase HP und Kollagenase AZ wurden mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10.000 Da) auf 50-100 mL konzentriert, anschlie¬ ßend gegen Wasser dialysiert und wieder über eine Ultrafiltrati- onsmembran (Ausschlußgrenze 10.000 Da) auf ca. 10 L konzen¬ triert.
Feinreinigung von Kollagenase HP
Die Feinreinigung von Kollagenase HP erfolgte an dem Anionen- austauscher Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) mittels des FPLC-Gerätes der Fa. Pharmacia. Dazu wurde auf die Säule, die mit Puffer B (20 mM TRIS/HCl pH 7,5) äquilibriert worden war, ein Gemisch aus 1 mL Puffer B und 2 mL der Kollagenase HP enthaltenden Fraktion aus dem vorhergehenden Chromatographieschritt aufgetragen.
Nach Waschen mit Puffer B wurde die Kollagenase HP mit dem Puffer C (20 mM TRIS/HCl + 200 mM NaCl, pH 7,5) in gereinigter Form von der Säule eluiert.
b. Eigenschaften
Die Kollagenase HP erhielt ihre Bezeichnung *HP" aufgrund ihrer Eigenschaft, das Hexapeptid Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala besonders gut abzubauen. Es ist daher für einen spezifischen Nachweis der Aktivität geeignet. Kollagenase HP ist dadurch charakterisiert, daß sie denaturierte Kollagene wie Gelatine oder Azokoll nur in geringem Maße umsetzen kann. Sie greift jedoch Rindersehnen¬ kollagen an und spaltet mit hohem Umsatz die im Beispiel 2b ge- nannten synthetischen Peptide zwischen Glycin und Glycin bzw. zwischen einer beliebigen Aminosäure und Glycin.
Besonders hervorzuheben ist, daß Kollagenase HP zusammen mit Kollagenase AZ (vice-versa, d.h. damit auch jegliche Mischungen aus mindestens Kollagenase HP und AZ) einen über-additiven Effekt auf den Abbau von nativem Kollagen besitzt. Diesem synergisti¬ schen Effekt in-vitro kommt auch beim Einsatz zur Gewebedes¬ integration Bedeutung zu (z.B. Anwendungsbeispiel G) .
Die spezifische Aktivität der Kollagenase HP liegt bei maximal 146 U/mg im Test mit dem synthetischen Substrat Z-Gly-Pro-Gly- Gly-Pro-Ala (11) . Dies entspricht einer etwa lOOfachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial. Die so gereinigte Kollagenase HP bildet sowohl bei der SDS-Gel- elektrophorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande.
Ihr mittels SDS-Elektrophorese ermitteltes Molekulargewicht liegt bei 106.000 Da. Ihr isoelektrischer Punkt liegt bei pH 5,8-6,0.
2. Kollagenase AZ
a. Herstellung
Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchge¬ führt. Die beiden ersten Reinigungsschritte von Kollagenase AZ (fraktionierte Proteinfällung und Metallchelat-Affinitatschroma- tographie) sind unter 1. beschrieben.
Feinreinigung von Kollagenase AZ
Die Feinreinigung von Kollagenase AZ wurde an dem Anionen- austauscher Mono Q (HR 10/10, Pharmacia) und unter Zuhilfenahme des FPLC-Gerätes der Fa. Pharmacia durchgeführt. Dazu wurde auf die Säule, die mit Puffer D (20 mM Calcium-acetat, pH 7,2) äquilibriert worden war, ein Gemisch aus 1 mL Puffer D und 1 mL der Kollagenase AZ enthaltenden Fraktion (aus der oben beschrie- benen Metallchelat-Affinitätschromatographie) aufgetragen.
Nach Waschen mit Puffer D wurde die Kollagenase AZ mit dem Puffer E (20 mM Calciumacetat, pH 5,0) von der Säule eluiert.
b. Eigenschaften
Die Kollagenase AZ erhielt ihre Bezeichnung *AZ" aufgrund ihrer Eigenschaft, das Substrat Azokoll besonders gut abzubauen. Sie ist dadurch charakterisiert, daß sie denaturierte Kollagene wie Gelatine oder Azokoll, aber auch Rindersehnenkollagen gut um¬ setzt. Sie vermag jedoch kleine synthetische Peptide wie 2-Fura- nacryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala, 4-Phenyl-azobenzyloxy-carbonyl-Pro- Leu-Gly-Pro-Arg und Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala nicht anzugreifen.
Die spezifische Aktivität der Kollagenase AZ liegt bei maximal 82 U/mg in dem von Mandl et al. (12) entwickelten Test unter Verwendung von Azokoll als Substrat. Dies entspricht einer ca. 80fachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial. Die so gereinigte Kollagenase AZ bildet sowohl bei der SDS-Gel- elektrophorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande. Ihr mittels SDS-Gelelektrophorese ermitteltes Molekulargewicht liegt bei 111.000 Da. Ihr isoelektrischer Punkt liegt bei pH 5,9-6,1.
3. Elastase
a. Herstellung
Alle Operationen bei der Enzymreinigung wurden bei 4-8°C durchge¬ führt.
Der erste Reinigungsschritt von Elastase erfolgte durch Protein¬ fällung mit Ammoniumsulfat, wie unter l.a. beschrieben.
Der Proteinniederschlag AI wird in 1 L Wasser gelöst, über eine Ultrafiltrationsmembran (Ausschlußgrenze 10.000 Da) auf etwa 170 mL eingeengt und gegen eine 0,1 mM Calciumacetat-Lösung dialy¬ siert. Anschließend wurde die Enzymlösung erneut über eine Ultra¬ filtrationsmembran (Ausschlußgrenze 10.000 Da) auf ca. 50 mL kon¬ zentriert und dann lyophilisiert.
Die Feinreinigunge erfolgte durch Gelchromatographie an SEPHADEX G100 oder G200 (Pharmacia).
b. Eigenschaften
Die Elastase ist dadurch charakterisiert, daß sie Elastin mit ho¬ hem Umsatz abbauen kann. Ihre spezifische Aktivität (s. 3.c.) lag bei 18 U/mg. Dies entspricht einer ca. 80fachen Erhöhung ihrer spezifischen Aktivität gegenüber dem Ausgangsmaterial. Die so gereinigte Elastase bildet sowohl bei der SDS-Gelelektro- phorese als auch bei der isoelektrischen Fokussierung und der Elektrophorese auf Agarosegel nur eine einzige Bande.
Das mittels SDS-Elektrophorese ermittelte Molekulargewicht der Elastase liegt bei 35.000 Da. c. Aktivitätsbestimmung
Die Bestimmung der Enzymaktivitat erfolgte mit Hilfe des Substra¬ tes Elastin.
20 mg fein pulverisiertes Elastin aus dem Nackenband des Rindes (Sigma) wurden in 0,4 mL Puffer (50 mM TRIS/HCl + 10 M Calcium¬ acetat, pH 7,2) 5 min im Wasserbad bei 37°C unter Schütteln vor- inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von Elastase, ge- löst in 0,1 mL Puffer, gestartet und 10 min bei 37°C weiter ge¬ schüttelt (Hubhöhe 25mm, Frequenz 150 min-1) . Anschließend wurden 3,5 mL eiskaltes Wasser zugesetzt und das nicht umgesetzte Ela¬ stin sofort über einen Filter entfernt. Die Extinktion E des Fil- trates wurde spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen. Als Blindwert diente der in einem gleichartig durchgeführten Versuch erhaltene Extinktionswert EB» bei dem die Elastaselösung dem Ansatz jedoch erst nach Entfernung des Ela- stins zugesetzt worden war. Die Extinktion EB dieses Filtrates wurde dann ebenfalls bei 280 nm bestimmt.
Die Elastaseaktivität wird in Units [U] ausgedrückt. Als 1 U wird diejenige Enzymaktivitat definiert, die unter den gegebenen Versuchsbedingungen 1 mg Elastin pro Minute auflöst. Die aufgelö¬ ste Menge an Elastin wurde im Filtrat des Testansatzes durch Mes- 5 sen der Extinktion bei 280 nm bestimmt.
Die Berechnung der spezifischen Aktivität erfolgte nach folgender Formel:
° Δ E x F x Testvolumen x Verdünnungsfaktor
U/mg = min x mg Elastase im Testansatz
ΔE = E - EB 5 F = 1,376
Der Faktor F wird ermittelt, indem 10 mg Elastin einer bestimmten Charge mit Hilfe von Elastase vollständig aufgelöst und die ent¬ sprechende Extinktionsdifferenz ΔE gemessen wird. Die Multiplika- 0 tion dieses Faktors F mit der Extinktionsdifferenz ΔE ergibt die aufgelöste Milligramm-Menge an Elastin pro mL Testansatz.
5 4. Clostripain
a. Herstellung
Die Isolierung von Clostripain erfolgte nach der von Ullmann und Jakubke beschriebenen Methode (14).
Die Bestimmung ihrer spezifischen Enzymaktivität erfolgte mit Hilfe des synthetischen Substrates α-N-Benzoyl-L-arginin-ethyl- ester (= BAEE) nach vorheriger 3stündiger Aktivierung der
Clostripainlösung mit 2 mM 1,4-Dithioerythrit-Lösung (15). Sie lag bei ca. 83 U/mg.
b. Eigenschaften
Die Thiolprotease Clostripain ist dadurch charakterisiert, daß sie in Polypeptidketten und in synthetisch hergestellten Substra¬ ten spezifisch hinter der Aminosäure L-Arginin spaltet.
Ihr mittels SDS-Elektrophorese ermitteltes Molekulargewicht liegt bei 55.000 Da.
II. Anwendungsbeispiele
Die folgenden Beispiele A-J zeigen exemplarisch die besondere
Eignung einiger Mischungen der gereinigten Enzyme für die Isolie¬ rung von Zellen und Gewebefragmenten aus tierischem und humanem Gewebe. Die Beispiele K und L zeigen exemplarisch die Eignung der gereinigten Enzyme für eine Anwendung in der Wundbehandlung.
Die Erfindung ist nicht auf diese Anwendungsbeispiele be¬ schränkt.
Beispiel A
Isolierung von Hepatozyten der Leber mit Mischungen aus drei En¬ zymen
Hepatozyten wurden nach der Standardmethode von Berry und Friend (9) und den Modifikationen nach Seglen (16) isoliert. Wistar-Rat- ten (200-280 g) wurden durch i.p. Injektion von Nembutal (35 mg Pentobarbital/kg Körpergewicht) betäubt. Nach der Eröffnung der Bauchraumes wurde die Vena portae kanüliert, und unter konstantem hydrostatischem Druck (12 cm Wassersäule, variable Flußrate) die folgenden, Carbogen-begasten Lösungen mit einem pH-Wert von 7.4 ± 0.05 bei einer Temperatur von 36-36.8 °C nach Eröffnung der Vena cava inferior infundiert:
Perfusion:
1. 5 min ca 100 mL Zellpuffer ohne Ca2+
2. 5 min ca 100 mL Zellpuffer ohne Ca2+ mit EGTA (0,42mM)
3. 8 min ca 200 mL Zellpuffer ohne Ca2+
4. 5-30 min ca 100-600 mL Zellpuffer, in dem die lyophilisierten Mischungen der gereinigten Enzyme gelöst worden waren.
Zellpuffer:
120,0 mM NaCl 1,29 mM CaCl2
5,50 mM D(+)-Glucose 1.19 mM KH2P04 4,81 mM KC1 1.20 mM MgS0 15,0 mM NaHC03 10,0 mM HEPES
Carbogen: Gasgemisch aus 95 % 02 und 5 % C02 (v/v)
Die Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 87,5 mL Zellpuffer gelöst wurde.
Die Perfusion wurde beim Weichwerden des Lebergewebes beendet. Nach Ablösung der Glisson'sehen Kapsel wurden die Hepatozyten aus dem Lebergewebe ausgeschüttelt und durch ein Siebgewebe (100 μm Maschenweite) filtriert. Nach der Filtration wurden die Zellen unter Carbogen-Atmosphäre in einem Wasserbad 20 min lang bei 37°c geschüttelt, intakte Hepatozyten wurden durch drei 2minütige Zen- trifugationsvorgange in Zellpuffer bei 50facher Erdbeschleunigung angereichert. Der Oberstand, in dem sich vorwiegend tote Zellen befinden, wurde nach jeder Zentrifugation verworfen. Der Anteil an vitalen Hepatozyten, Hepatozyten-Zellpaaren oder vielzelligen Aggregaten aus Hepatozyten wurde nach Resuspension des erhaltenen Zellniederschlages in einer Burker-Zählkam er mikroskopisch be¬ stimmt (Färbung mit 0.08%igem Trypanblau, 2 min lang) . Ergebnis
In einer Versuchsserie (n=4) wurden unter Verwendung der be¬ schriebenen Enzymmischung Zellsuspensionen erhalten, welche durchschnittlich 88,7 % vitale Zellen bei einer Ausbeute von 360 x IO6 Zellen pro Leber enthielten.
Vergleichsversuche mit einem Kollagenase-haltigen Präparat Unde¬ finierter Zusammensetzung mit besonders hoher spezifischer kolla- genolytischer Aktivität führte zu starken ZeilSchädigungen und nur zu 72,5 % vitalen Zellen (n=4).
Beispiel B
Isolierung von Hepatozyten der Leber mit einer Mischung aus zwei Enzymen
Es wurde analog Beispiel A gearbeitet, aber unter Einsatz der folgenden Enzymmischung: 60 U Kollagenase HP und 3 U Elastase. Es wurden Zellsuspensionen erhalten, welche durchschnittlich
90,5 % vitale Zellen bei einer Ausbeute von 263 x 106 Zellen ent¬ hielten (n=2) .
Beispiel C
Isolierung von Hepatozyten der Leber mit einer Mischling aus vier Enzymen
Es wurde analog Beispiel A gearbeitet, aber unter Einsatz der folgenden Enzymmischung: 30 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ, 3 U Elastase und 16 U Clostripain.
Es wurden Zellsuspensionen erhalten, welche durchschnittlich 83 % vitale Zellen bei einer Ausbeute von 232 x IO6 Zellen enthielten (n=2).
Beispiel D
Umfangreiche Validierung des Isolierungserfolges von Hepatozyten der Ratten-Leber mit einer Mischung aus drei Enzymen in 4 ver¬ schiedenen Labors im Vergleich zu Kollagenase-haltigen Präparaten Undefinierter Zusammensetzung
Geringe, aber für den Isolierungserfolg von Hepatozyten eventuell bedeutsame, Unterschiede sind bei der Methode der Zellisolierung von Labor zu Labor bekannt. Um unabhängig von der benutzten Me¬ thodik die Wirksamkeit der in Beispiel A genannten Mischung für die Zellisolierung zu überprüfen, wurden Hepatozyten-Isolierungen in 4 verschiedenen Labors in einer größeren Anzahl durchgeführt.
Die verwendete Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 87,5 mL Zellpuffer wurde (analog Beispiel A) .
Der Isolierungserfolg von Hepatozyten wurde anhand der folgenden fünf Parameter gemessen: 1. mikroskopische Bestimmung des Anteils vitaler Hepatozyten (in % von der Gesamtzahl Hepatozyten in der erhaltenen ZeilSuspension mittels Trypanblau-Exclusionstest) , 2. Bestimmung der Gesamtzahl der isolierten Hepatozyten, 3. Bestim¬ mung der Gesamtzahl der isolierten Hepatozyten pro Gramm Tierge¬ wicht, 4. Bestimmung des Anteils an Einzelzellen (in % bezogen auf alle Aggragationsformen in der erhaltenen Zellsuspension, d.h. gegenüber Zweier- und Mehrfach-Aggregaten von Hepatozyten) , und 5. Festhalten der zur erfolgreichen Gewebedesintegration not¬ wendigen Perfusionszeit mit der Kollagenase-Lösung.
In diesen Tests zeigten die Mischungen aus den erfindungsgemäßen Enzymen wesentlich besser reproduzierbare Ergebnisse als übliche Präparationen.
Beispiel E
Isolierung von Hepatozyten aus Ratten-Leber mit einer Mischung aus 3 Enzymen: Erhaltung der Zellfunktion
Um nicht nur die Eignung der erfindungsgemäßen Mischungen hin- sichtlich des einfachen Isolierungserfolges von Hepatozyten, son¬ dern auch unter besonderer Betrachtung der Zellfunktion zu bele¬ gen, wurden vergleichende Zellisolierungen unter Verwendung eines für diesen Zweck besonders gut geeigneten, Kollagenase-haltigen Präparates Undefinierter Zusammensetzung an Ratten-Lebern durch- geführt.
Hepatozyten wurden nach der Standardmethode von Berry und Friend (9) und den Modifikationen nach Seglen (16) isoliert.
Die verwendete Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U
Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches zur Isolierung von Hepatozyten aus Ratten-Lebern in 87,5 mL Zell¬ puffer gelöst wurde (analog Beispiel A) . Der einfache Isolierungserfolg von Ratten-Hepatozyten wurde be¬ stimmt nach folgenden Parametern: Anteil vitaler Zellen nach dem Trypanblau-Exklusionstest, Zellausbeute pro g Leber, Anteil an Einzelzellen (in %) .
Die Qualität der erhaltenen ZeilSuspension wurde in Hinsicht auf die Funktion der Hepatozyten weiter charakterisiert (21, 22) durch die folgenden Parameter: ATP-Gehalt, Energy Charge (EC), Lidocain-Metabolismus zu Monoethylglycinxylidid (MEGX) , und Auf- nähme von CholyItaurin ( (3α,7α,12α-Trihydroxy-5ß-cholan-24-oyD- 2-aminoethansulfonsäure) bei einer Substratkonzentration von 21 μ-M.
Bei allen untersuchten Parametern ergaben sich keine signifikan- ten Unterschiede zwischen beiden Kollagenase-haltigen Präparaten.
Damit konnte gezeigt werden, daß die mit einer erfindungsgemäßen Enzym-Mischung isolierten Hepatozyten nicht nur nach Beurteilung durch den einfachen Isolierungserfolg, sondern auch nach Bewer- tung verschiedener Zeilfunktionen, z.B. bestimmte Funktionen des differenzierten Stofftransportes, oder bestimmte metabolische Leistungen von Cytochrom-P450-abhängigen Enzymen der Hepatozyten, völlig intakt sind.
Beispiel F
Isolierung von Hepatozyten aus Human-Leber mit einer Mischung aus 3 Enzymen
Hepatozyten wurden nach der Methode von Berry und Friend (9) und den Modifikationen nach Seglen (16) unter Anwendung einer Biop- sie-Perfusionstechnik (21) isoliert.
Die verwendete Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 50 mL Zellpuffer gelöst wurde.
Der Isolierungserfolg von Human-Hepatozyten wurde bestimmt nach folgenden Parametern: Anteil vitaler Zellen nach dem Trypanblau- Exklusionstest und Zellausbeute pro g Leber.
Es zeigte sich, daß mit den erfindungsgemäßen Mischungen auch Hepatozyten von Hu an-Lebern erfolgreich und mit konstanten Er¬ gebnissen (Anteil an vitalen Zellen 85-90 %) isoliert werden können. Beispiel G
Isolierung von biliären Epithelzellen aus der Ratten-Leber
In einer Versuchsreihe (n=4) wurden biliäre Epithelzellen aus der Ratten-Leber nach der in Referenz (18) beschriebenen Methode iso¬ liert. Dabei wurden in einem ersten Schritt der Gewebedes¬ integration zunächst Hepatozyten enzymatisch aus dem Gewebe¬ verband entfernt, und in einem zweiten Schritt biliäre Epithel- zellen aus den verbeibenden Geweberesten mit Trypsin isoliert.
Die Enzymmischung zur Enfernung der Hepatozyten war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 87,5 mL Zellpuffer gelöst war.
Der Anteil vitaler Epithelzellen lag in allen Präparationen über 95 %, die Zellausbeute bei 4-6 x IO6 Zellen pro Leber (n=4) . Die Verwendung der beschriebenen Enzymmischung erleichterte außeror¬ dentlich die Isolierung von biliären Epithelzellen aus dem ver- bleibenden Gefäßsystem mittels Trypsin, denn das nach dem ersten Schritt erhaltene Restgewebe war praktisch frei von Hepatozyten.
Problematisch war bei den bisher verwendeten Methoden zur Gewin¬ nung von biliären Epithelzellen, daß die in der ZeilSuspension verbleibenden Hepatozyten, sowie von-Kupffer-Zellen und andere Zellsorten in der Regel schwer von den zu isolierenden Epithel¬ zellen abzutrennen waren.
Durch den Einsatz der beschriebenen Mischung aus Reinenzymen läßt sich eine klare Zeit- und Kostenersparnis erreichen, da gegenüber der bisher angewandten Methode eine eindeutig verbesserte, prak¬ tisch vollständige Desintegration des Lebergewebes erfolgt. Damit gelingt die wünschenswerte Entfernung der üblicherweise in großer Zahl vorliegenden kontaminierenden Hepatozyten.
Beispiel H
Isolierung von Endothelzellen aus menschlicher Nabelschnur mit einer Mischung aus 3 Enzymen
Menschliche Endothelzellen aus der Nabelschnurvene wurden nach der Methode von Jaffe (17) isoliert. Dazu wurden die Nabelschnüre (20 - 30 cm lang) halbiert, paarweise mit der jeweiligen Enzy - lösung gefüllt und 15 min bei 37°C und 5 % C02 im Brutschrank inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden entnommen und zur Eva¬ luierung in Primärkultur gehalten. Die Ausbeute an lebenden und teilungsfähigen Zellen wurde nach Auswaschen der nicht adhärenten Zellen nach vier Tagen in Kultur bestimmt.
Die Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 87,5 mL Zelliso- lierungspu fer gelöst war.
Am Tag nach der Aussaat der Zellen werden die nicht-adhärenten Zellen (Erythrozyten, Macrophagen, etc.) ausgewaschen. Das Medium wird am vierten Tag gewechselt. Die Konfluenz wird üblicherweise spätestens am achten Tag nach Aussaat erreicht (> 105 Zellen/cm2) . Der konfluente Zellrasen besteht zu über 95% aus Endothelzellen, wie FACS-Untersuchungen mit Antikörpern gegen Factor-VIII-Rela- ted-Antigen (Von-Willebrand-Faktor) oder zwei endothelspezifische Oberfläehenantigene (EN-4, PAL-E) bzw. mit einem fluoreszierenden Liganden des Scavenger-Receptors (dil-Ac-LDL) zeigten.
Die mit der oben genannten Mischung aus gereinigten Enzymen er¬ zielte Ausbeute (n=2) übertraf diejenige, welche mit Undefiniert zusammengesetzten, Kollagenase-haltigen Enzympräparaten erhalten worden war. Die Zelldichte nach 4 Tagen betrug 1,8 x IO4 pro cm2. Wendet man bislang bekannte Verfahren an, so erhalt man eine Zelldichte, die deutlich darunter liegt. Die Konfluenz der Mono- schicht wurde bei Verwendung der oben genannten Mischung zu einem früheren Zeitpunkt (bereits nach 5-6 Tagen) erreicht.
Bei der enzymatischen Isolierung der Endothelzellen mit den ver¬ schiedenen Enzympräparaten kam es in keinem Fall zu einer Ruptur der Nabelschnurvene. Die herausgelösten Zellen waren gut verein- zeit. Es wurden keine zytotoxischen Erscheinungen beobachtet.
Nach einer Stunde war ein Anheften von Endothelzellen festzustel¬ len.
Die präparierten Zellen wurden in der ersten Passage funktionell geprüft (Endothelin-Produktion, Freisetzung von LDH) . Dabei lagen alle Werte im Normbereich. Funktionen waren die Zellen damit ge¬ genüber Ergebnissen aus Kontrollversuchen, in denen Zellen mit Undefiniert zusammengesetzten Kollagenase-haltigen Präparaten isoliert worden waren, nicht zu unterscheiden.
Die Überlegenheit der eingesetzten Mischung aus gereinigten Enzy¬ men ergibt sich somit in der höheren möglichen Zellausbeute, einer schnelleren Ausbildung einer konfluenten Monoschicht, und einer optimalen Integrität der isolierten Zellen (Zellstruktur und -funktion) . Vergleichbar gute Ergebnisse wurden in solchen Versuchen erzielt, in denen statt der oben genannten Enzymmischung auch andere Mischungen, z.B. bestehend aus Kollagenase HP und Elastase, sowie Mischungen aus Kollagenase HP, Kollagenase AZ, Elastase und Clostripain verwendet wurden.
Beispiel I
Isolierung von Tumorzellen aus Human-Tumoren mit einer Mischung aus 3 Enzymen
Tumorzellen wurden aus Human-Tumoren nach der Vorschrift (23) isoliert.
Die verwendete Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U
Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 28,4 L Zell-Isolierungspuffer (Ringer-Lactat/PBS) gelöst wurde.
Der Isolierungserfolg wurde ermittelt anhand des Anteils ein vita- len Zellen nach dem Trypanblau-Exklusionstest und Auszählung der Lymphozyten-Zellzahl. Direkt vergleichende Zellisolierungen wur¬ den durchgeführt unter Verwendung der erfindungsgemäßen Enzym¬ mischung und eines für diesen Zweck sehr gut geeigneten, Kollagenase enthaltenden Präparates Undefinierter Zusammensetzung bei 4 verschiedenen Tumor-Geweben.
Ergebnis
Die erfindungsgemäße Enzymmischung kann sehr gut zur Isolierung von Tumor-Zellen aus Human-Tumoren eingesetzt werden.
Der Isolierungserfolg entspricht im Rahmen der experimentellen Schwankungen dem Isolierungserfolg, welcher mit ausgesuchten, be¬ sonders gut zur Tumorzell-Isolierung geeigneten, Kollagenase ent- haltenden Präparaten Undefinierter Zusammensetzung erhalten wird.
Da nach den hier vorgestellten Ergebnissen unterschiedlichste Bindegewebsstrukturen in Tumorgewebe beim Menschen mit der erfindungsgemäßen Enzymmischung stets unter Erreichen, oder unter Verbesserung des Standes der Technik (Isolierungserfolg, Qualität der isolierten Zellen, und Beibehaltung der methodischen Varia¬ blen) erfolgreich desintegriert werden können, kann die Eignung der erfindungsgemäßen Enzymmischungen für die Desintegration auch von anderen tierischen und menschlichen Geweben vorausgesetzt werden. Beispiel J
Isolierung von Inselzellen aus Schweine-Pankreas mit einer Mischung aus 3 Enzymen
Zur Isolierung von Inselzellen aus Schweine-Pankreas wurde die bekannte präparative Methode nach Ricordi unter Einführung eini¬ ger wesentlicher Modifikationen (24) u.a. zur besseren Kontrolle des Isolierungserfolges angewandt. Die Kollagenase-Lösung wirkt dabei unter besonders gut standardisierten Bedingungen auf das Pankreasgewebe nach Infusion über den Pankreasgang längere Zeit ein. Die bereits abgelösten Inseln werden kontinuierlich in ein Reservoir niedrigerer Temperatur abgeführt, und nach Ende der Desintegration werden die im Pankreasgewebe bereits teilweise von ihrer Matrix befreiten Inseln unter Anwendung leichter mechani¬ scher Behandlung vollends abgelöst und isoliert.
Die Isolierung von Inselzellen aus Pankreas stellt außerordent¬ lich hohe Anforderungen an ein Kollagenase enthaltendes Präparat, da die Grundlagen für eine erfolgreiche Isolierung von intakten Inseln aus Pankreas nicht ausreichend bekannt sind.
Im Folgenden wird exemplarisch die Eignung einer erfindungs¬ gemäßen, definierten Enzymmischung bewiesen. Damit ist auch bei diesem Gewebetypus die Eignung zu einer erfolgreichen Gewebedes¬ integration mit dem Ziel der Isolierung von großen, nativen Zel¬ laggregaten {Langerhans'sehe Inseln) übertragbar auf die Verwendung von Pankreata auch anderer Spezies (z.B. Human-Pan- kreas) . Unterstützend zu dieser Perspektive sind Erfahrungen, welche die Isolierung von Inseln aus Schweine-Pankreas i.a. als schwieriger bewerten, als aus Pankreata anderer Spezies. Bekannt ist z.B. (25), daß Inseln aus Schweine-Pankreas sehr leicht zu kleineren, unerwünschten, Fragmenten durch üblicherweise verwen¬ dete Kollagenase-haltige Präparate Undefinierter Zusammensetzung zersetzt werden. Dies wird erklärt durch die besonderen Eigen¬ schaften der Zellen in Inselaggregaten, welche viele Protease- sensitive Zell-Zell-Kontakte aufweisen, sowohl zwischen endokri¬ nen und exokrinen Zellen, und auch zwischen endokrinen Zellen und den Inseln. Ziel einer verbesserten Isolierungsmethode kann also nur sein, vermehrt intakte Insel-Zellaggregate zu erhalten, wobei Fragmentierungen zu Aggregaten <100 μ nur in kleinerem Ausmaß auftreten sollen. Die in diesem Anwendungsbeispiel zur Isolierung von Inseln aus Schweine-Pankreas verwendete Enzymmischung war ein Lyophilisat von 130 U Kollagenase HP, 5 U Kollagenase AZ und 21 U Elastase, welches in 10 mL Isolierungspuffer gelöst wurde. Dieser Lösung wurde routinemäßig Desoxyribonuclease (0,4mg/10mL, 440 Kunitz- Einheiten/mg, SIGMA) zugesetzt.
Der Isolierungserfolg läßt sich anhand der Größenverteilung der erhaltenen, intakten Zellaggregate und anderer üblicher Parameter ermitteln.
Als besonderer Vorteil der Anwendung der erfindungsgemäßen Enzym¬ mischung kann angeführt werden, daß anteilig mehr freie Inseln über 100 μm gewonnen werden können als mit üblichen Präparatio- nen.
Beispiel K
Experimentelle Untersuchungen zur Wundbehandlung in vivo
Kollagenasen sind bei der Wundheilung verantwortlich für ein ef¬ fektives Entfernen von zerstörtem Gewebe, die Rekrutierung von Zellen im Wundbereich und die Umformung der extrazellularen Ma¬ trix.
In einem experimentellen in vivo-Modell zur Wundreinigung nach Webster (19) wurde die Gewebe-abbauende Eigenschaft der gereinig¬ ten Enzyme an Ratten überprüft.
Je nach applizierter Menge der gereinigten Enzyme auf die Brand¬ wunde dritten Grades wurde ein beschleunigter Abbau des denatu¬ rierten Gewebes innerhalb der ersten 16 Stunden beobachtet. Die Enzyme wurden einzeln oder in Kombination mit anderen Enzymen ap- pliziert. Die besten Ergebnisse wurden erhalten bei Applikation von einem Gemisch aus Kollagenase HP (3-48 U/cm2, bevorzugt 16 U/cm2), Kollagenase AZ (0,2-3 U/cm2, bevorzugt 1 U/cm2) und Elastase (1-12 U/cm2, bevorzugt 3 U/cm2) . Dabei war bei 8 von 15 Tieren der Wundschorf nahezu vollständig aufgelöst, und bei 6 von 15 Tieren war eine teilweise Auflösung erreicht. In diesen Fällen ließ sich das nekrotische Gewebe äußerst leicht mechanisch ent¬ fernen, im Gegensatz zur Kontrolle. Nach einer kürzeren Applikationszeit von 4 Stunden war bei glei¬ chen verwendeten Mengen eine Erweichung des nekrotisehen Materials festzustellen, und in allen Fällen ließ sich der Wund¬ schorf gut entfernen (im Gegensatz zur Kontrolle).
Neben dieser Mischung waren auch andere Mischungen erfolgreich einsetzbar, z.B. solche aus Kollagenase HP (3-48 U/cm2) und Elastase (1-12 U/cm2) .
Beispiel L
Experimentelle Untersuchungen zur Wundbehandlung in vitro
Die erhaltenen Ergebnisse zur abbauenden Wirkung des nekrotischen Gewebes (Beispiel K) wurden in einem in vitro-Modell weiterfüh¬ rend charakterisiert. In einer geschüttelten Pufferlösung wurde durch Einwirkung von Kollagenase HP, Kollagenase AZ und/oder Elastase auf den in Beispiel K genannten Verbrennungs-Wundschorf die Freisetzung von 4-Hydroxyprolin (20) nach 2,4,6 und 24 h be- stimmt.
Es wurden solche Aktivitäten an gereinigten Enzymen eingesetzt, welche mit der relativen Aktivtat in einer wirksamen Vergleichs¬ menge eines Kollagenase-haltigen Präparates identisch war. Bei dieser experimentellen Vereinfachung wird der jeweilige Beitrag der anderen Komponenten in dem Kollagenase-haltigen Präparat zur Hydroxyprolinfreisetzung außer Acht gelassen.
Bei Einsatz der gereinigten Enyzme wurde in allen Fällen in kla- rer Abhängigkeit von der Zeit eine Freisetzung von vergleichbaren Mengen an Hydroxyprolin festgestellt, wie bei Verwendung einer entsprechenden Menge an Kollagenase-haltigem Präparat.
Nach diesen Ergebnissen sind die erfindungsgemäßen gereinigten Enzyme und Enzymmischungen auch in therapeutischen Bereichen, wie in der Wundbehandlung oder zur Behandlung von Keloiden oder Fi¬ brösen einsetzbar. Sie können äußerlich angewendet oder injiziert werden. Literatur
1) Gerlach J.C., Brombacher J., Courtney J.M. und Neuhaus P. (1993) Int. J. Artif. Organs 16(9), 677-681 5 2) Blaauboer B.J., Boobis A.R. , Castell J.V. , Coecke S., Groo- thuis G.M.M., Guillouzo A. , Hall T.J., Hawksworth G.M. , Lo- renzon G. , Miltenburger H.G., Rogiers V, Skett P., Villa P. und Wiebel F.J. (1994) ATLA 22, 231-241 3a) Peterkowski B. (1982) Methods Enzymol. 82, 453-471 0 3b) Harper E. (1980) Ann. Rev. Bioche . 1063-1078
4) Suggs W. , van Wart H. und Sharefkin J.B. (1992) J. Vase. Surg. 15, 205-213
5) Cuatrecasas P. (1971) J. Biol. Chem. 246, 6522-6531
6) Hefley T.J. (1987) J. Bone Mineral Res. 2 (6), 505-516 5 7) Hefley T.J., Stern P.H. und Brand J.S. (1983) Exp. Cell Re¬ search 149, 227-236
8) Wolters G.H.J, Vos-Scheperkeuter G.H., van Deijnen J.H.M und van Schilfgaarde R. (1992) Diabetologia 35, 735-742
9) Berry, M.N. , Edwards, A.M. und Barritt, G.J. (1991) In: Iso- 20 lated hepatocytes: Preparation, properties and applications.
(Burdon, R.H., van Knippenberg, P.H., Eds.) Elsevier, Amster¬ dam, 1991
10) Berry, M.N. und Friend, D.S. (1969) J. Cell. Biol. 43, 506-520
25 11) Graßmann W. und Nordwig A. (1960) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 322, 267-272 12) Mandl I., MacLennan J.D., Howes E.L., DeBellis R.H. und Soh¬ ler A. (1953) J. Clin. Invest. 32, 1323-29
14) Ullmann D. und Jakubke H.-D. (1994) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 30 375, 89-92
15) Emöd I. und Keil B. (1977) FEBS Lett. 77, 51-66
16) Seglen P.O. (1976) Methods Cell. Biol. 13, 29-83
17) Jaffe E.A., Nachman R.L. , Becker C.C. und Minick C.R. (1973) J. Clin. Invest. 52, 2745-56
35 18) Eisenmann-Tappe I., Wizigmann S. und Gebhardt R. (1991) Cell Biol. Toxicol. 7 (4), 315-325
19) Webster M.E., Altieri P.L., Conklin D.A., Berman S., Lowent- hal J.P. und Gochenour R.B. (1962) J. Bacteriol . 83, 602-608
20) Jamall I.S., Finelli V.N. und Que Hee S.S. (1981) Anal. 40 Biochem. 112, 70-75
21) Sandker G.W., Weert B. , Olinga P., Wolters H., M.J.H. Slooff, D.K.F. Meijer und G.M.M. Groothuis (1994), Biochem. Pharmacol. 47, 2193-2200
22) Olinga P., Merema M.T. , Meijer D.K.F. , Slooff M.J.H. und 45 Groothuis G.M.M. (1993) ATLA 21, 466-468
23) Hoover H.C.Jr., Surdyke M. , Dangel R.B., Peters L.C. und Hanna M.G.Jr. (1984) Cancer Research 44, 1671-1675 24) Schrezenmeir J. , Walz S. , Marx S. und Laue C, Diabetologia (1994) 37 [Suppl 1] A216
25) Ricordi C, Socci C, Davalli A.M. , Staudacher C, Vertova A. , Baro P., Freschi M. , Gavazzi F., Bertuzzi F., Pozza G. und Di Carlo V. (1990) Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 26-30

Claims

Patentansprüche
1. Enzyme erhältlich aus Clostridium histolyticum, wobei es sich entweder um
a) eine Kollagenase mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 20 U/mg im Test nach Nordwig und Strauch mit dem synthetischen Hexapeptid Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala als Substrat handelt, die denaturierte Kollagene, wie Ge¬ latine und Azokoll nur im geringen Maße umsetzen kann, jedoch Rindersehnenkollagen angreift, deren mittels der SDS-Gelelektrophorese ermitteltes Molekulargewicht bei 106.000 Da. liegt und die einen isoelektrischen Punkt bei pH 5,8 bis 6,0 aufweist, oder um
b) eine Kollagenase mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 10 U/mg im Test nach Mandl et al unter Verwen¬ dung von Azokoll als Substrat handelt, die denaturierte Kollagene, wie Gelatine oder Azokoll, aber auch Rinder- sehnenkollagen gut umzusetzen, kleine synthetische Pro¬ teine wie 2-Furan-acryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala, 4-Phenyl- azobenzoloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg und Z-Gly-Pro- Gly-Gly-Pro-Ala jedoch nicht anzugreifen vermag, deren mittels SDS-Gelelektrophorse ermitteltes Molekulargewicht bei 111.000 Da. liegt und die einen isoelektrischen Punkt bei pH 5,9 bis 6,1 aufweist oder um
c) Elastase mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 2 U/mg im Test mit Elastin aus dem Nackenband des Rindes als Substrat handelt, deren mittels SDS-Elektrophorese ermitteltes Molekulargewicht bei 35.000 Da. liegt
oder um Gemische derselben handelt, wobei das Enzym nach a) eine spezifische Aktivität von mindestens 20 U/mg das Enzym nach b) eine Aktivität von mindestens 10 U/mg und das Enzym nach d) eine spezifische Aktivität von mindestens 2 U/mg auf¬ weist.
2. Enzymgemisch nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich die Thiolprotease Clostripain. enthält.
3. Verwendung einer Mischung nach Anspruch 1 aus Enzym nach a) und Enzym nach c) zur Isolierung von Zellen oder Gewebefrag- menten aus humanen oder tierischem Gewebe.
4. Verwendung einer Mischung nach Anspruch 1 aus Enzymen nach a) , b) und c) zur Isolierung von Zellen oder Gewebefragmenten aus humanem oder tierischem Gewebe.
5. Verwendung einer Mischung nach Anspruch 2 zur Isolierung von Zellen oder Gewebefragmenten aus humanem oder tierischem Gewebe.
6. Verwendung der Enzyme nach Anspruch 1 entweder alleine oder im Gemisch oder nach Anspruch 2 in der Wundbehandlung oder bei Erkrankungen, welche mit einem veränderten Kollagen- Stoffwechsel einhergehen.
7. Kollagenase HP in reiner Form.
8. Kollagenase AZ in reiner Form.
9. Elastase in reiner Form.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5718897A (en) * 1995-06-07 1998-02-17 Trustees Of Tufts College Enhancing keratinocyte migration and proliferation
US5830741A (en) * 1996-12-06 1998-11-03 Boehringer Mannheim Corporation Composition for tissue dissociation containing collagenase I and II from clostridium histolyticum and a neutral protease
US7364565B2 (en) 2001-07-27 2008-04-29 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Controlled enzymatic removal and retrieval of cells
KR100602308B1 (ko) * 2001-07-27 2006-07-18 더 보드 오브 수퍼바이저스 오브 루이지애나 스테이트 유니버시티 앤드 애그리컬춰럴 앤드 미케니칼 칼리지 여드름의 치료 또는 예방을 위한 보툴리눔 독소
US7811560B2 (en) * 2006-01-30 2010-10-12 Auxilium Us Holdings, Llc Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases
US8323642B2 (en) * 2006-12-13 2012-12-04 Depuy Mitek, Inc. Tissue fusion method using collagenase for repair of soft tissue
US20100159564A1 (en) * 2007-11-30 2010-06-24 Dwulet Francis E Protease resistant recombinant bacterial collagenases
WO2011071986A1 (en) 2009-12-08 2011-06-16 Healthpoint, Ltd. Enzymatic wound debriding compositions with enhanced enzymatic activity
NZ750379A (en) 2012-01-12 2022-10-28 Auxilium Int Holdings Inc Clostridium histolyticum enzymes and methods for the use thereof
BR112019018277A2 (pt) 2017-03-01 2020-06-30 Endo Ventures Limited aparelho e método para avaliar e tratar celulite
MX2019011574A (es) 2017-03-28 2019-12-19 Endo Ventures Ltd Método mejorado para producir aplicaciones relacionadas con la colagenasa.
CN109694845A (zh) * 2018-12-25 2019-04-30 中国医学科学院北京协和医院 用于分离单细胞的试剂盒及其应用
WO2023228873A1 (ja) * 2022-05-24 2023-11-30 国立研究開発法人国立成育医療研究センター 肝細胞の製造方法、肝細胞の接着性改善剤、および肝細胞

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0673456B2 (ja) * 1986-04-26 1994-09-21 三共株式会社 ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉ▼
US5162205A (en) * 1986-04-26 1992-11-10 Sankyo Company, Limited Human pancreatic elastase I
CA2138948A1 (en) * 1992-06-22 1994-01-06 Hun-Chi Lin Molecular cloning of the genes responsible for collagenase production from clostridium histolyticum
WO1996000283A1 (en) * 1994-06-24 1996-01-04 Boehringer Mannheim Corporation A purified mixture of collagenases and two other proteases obtained from clostridium histolyticum

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9628543A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ280397A3 (cs) 1998-04-15
WO1996028543A1 (de) 1996-09-19
EA199700241A1 (ru) 1998-02-26
JPH11501517A (ja) 1999-02-09
IL117479A (en) 1999-12-22
IL117479A0 (en) 1996-07-23
NO974260D0 (no) 1997-09-15
NO974260L (no) 1997-11-14
BR9607143A (pt) 1997-11-25
CA2213723A1 (en) 1996-09-19
MX9706725A (es) 1997-11-29
AU5106696A (en) 1996-10-02
US6146626A (en) 2000-11-14
PL322271A1 (en) 1998-01-19
HUP9901188A2 (hu) 1999-08-30
EA000583B1 (ru) 1999-12-29
AU702514B2 (en) 1999-02-25

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