DE2734427A1 - Verfahren zur gewinnung von thrombinartigen enzymen aus schlangengiften - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von thrombinartigen enzymen aus schlangengiften

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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

Verfahren zur Gewinnung von thrombi.nartJ.gcn Enzymen aus
Schlangengiften
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vorfahren zur Gewinnung von thrombinavtigen proteolytischen Enzymen aus den Giften von Schlangen der Familie der Crotalidae, insbesondere der Gattungen Agkistrodon, Bothrops, Crotalus und Trimeresurus.
Thrombinartige proteolytische Enzyme sind Proteasen, welche z.B. aus gewissen Schlangengiften gewonnen werden und welche, wie das Thrombin, aus Fibrinogen Fibrlnopeptid A und/oder Fibrinopeptid B abspalten, sich jedoch von Thrombin dadurch unterscheiden, dass sie eine grössere Substratspezifizität aufweisen [siehe z.B. D.L. Aronson in Thrombos.Haemostas, (Stuttg.), 1976, 36, Selten 9-13, und 1976, 35, Seite 477].
Thrombinartige Schlangengiftenzyme werden als Reagenzien zur Untersuchung von Blutgerinnungsvorgängen, als
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antihaemorrhagische Arzneimittel sowie als Mittel zur experimentellen und therapeutischen Defibrinogenierung und somit zur Antikoagulation verwendet.
In der nachfolgenden Tabelle sind für die thrombinartigen Enzyme aus den Giften einiger Schlangenarten die Verwendung und die diesbezüglichen Literaturhinweise angegeben.
TABELLE 1
Gift der Arten: Verwendung für: Literatur:
Agkistrodon
contortrix
Agkistrodon
rhodostoma
Bothrops
atrox
Blutuntersuchung
Defibrinogenierung
Defibrinogenierung
Blutstillung
Blutuntersuchung
809808/0670 Herzig, R.M., Ratnoff, O.D.. u. Shainoff, Y.R.: Studies on a procoagulant fraction of southern copperhead snake venom: The preferential release of fibrinopeptide B. J. Lab. and Clin. Med. 76, 451-465 (1970)
Sharp, A.A., Warren, B.A., Pax ton, A.M. u. Allington, M.J.: Anticoagulant therapy with a purified fraction from Malayan pit viper venom. Lancet I, 49>499 (1968)
Egberg, N.: Experimental and clinical studies on the thrombin-like enzyme from the venom of Bothrops atrox. On the primary structure of fragment E.
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Berger, E., Laurent, A.J. u.
Stocker, K.F.: The prophylactic and therapeutic use of Reptilase.
Praxis 57, No. 17, 6II-616
(1968) ~~
Punk, C, GmUr, J., Herold, R. u. Sträub, P.W.: Reptilase-R. A new reagent in blood coagulation.
Bothrops jararaca
Crotalus adamanteus
Trimeresurus gramlneus
(Fortsetzung der Tabelle 1)
Blutstillung
Defibrinogenierung
Defibrinogenierung
Brit.J. Haematol. 2JL, 43-52 (1971)
Mauro, C.: Sulla azlone emocoagulante del veleno di Bothrops jararaca. Glorn.Ital. di Chirurgia 8, 448 (1949)
Markland, F.S. u. Damus, P.S.: Purification and properties
of a thrombin-like enzyme from the venom of Crotalus adamanteus.
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Ouyang, C. u. Yang, F.Y.: Purification and properties
of the thrombin-like enzyme from Trimeresurus gramineus venom.
Biochim. et Biophys. Acta,
251, J45-363 (1974).
Die genannten proteolytischen Enzyme sind Glykopeptide mit Molekulargewichten von 181OOO bis 551OOO; aufgrund ihrer Hemmbarkeit durch Diisopropylfluorophosphat sind sie der Gruppe der Serinproteasen zuzuordnen. Wie Thrombin bewirken thrombinartige Schlangengiftenzyme durch Fibrinopeptidabspaltung die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin, sie unterscheiden sich aber von Thrombin in ihrem Verhalten gegenüber anderen Blutgerinnungsfaktoren, gegenüber Thrombozyten und Insbesondere dadurch, dass ihre koagulierende Aktivität gegenüber Plasma durch Thrombininhibitoren wie Heparin, Hirudin, Antithrombin III und durch Heparinoide nicht signifikant gehemmt wird [siehe D.L. Aronson in Thrombos. Haemostas. (Stuttg.), 1976, 36, Seiten 9-I5]. 8Ο98Οβ/Οβ7Ο
Um aus den Schlangengiften, welche Jeweils Gemische von bis über 20 verschiedenen pharmakologisch aktiven Polypeptiden darstellen, die thrombinartigen Enzyme anzureichern, wurden nach Deutsch (Deutsch, E.: Blutgerinnungsfaktoren, Verlag Deuticke, Wisn 1955) Ballaststoffe durch SSure- und Hitzefällur.gen aun gelöstem Rohgift ausgefällt und aus der verbleibenden flüssigen Phase die thrombinartigen Enzyme duz-ch Lösungsmittel- oder SalzfSllungen als angereicherte Fraktion gewonnen. Banerjee et al. beschreiben die dreissigfache Anreicherung des thrombinartigen Enzyms von Bothropsjararaca-Gift durch Ammoniumsulfatfällung aus einer 0,5#igen Rohgift-Lösung, Wärmebehandlung des gelösten Präzipitates bei 65CC, Abtrennung von gefällten Ballaststoffen durch Zentrifugation, Adsorption des thrombinartigen Enzyms an Calciumphosphatgel, Eluierung mit Natriumphosphatpuffer bei pH 7,2, erneute fraktionierte Ammoniumsulfatfällung und schliesslich Dialyse gegen Veronalpuffer (siehe Banerjee, E., Devi, Α., Sarkar, N.: Isolation and purification of a coagulant from snake venom of the species Bothrops jararaca and the study of its properties. Thromb. Diath. Haem. 5_, 296-303 (i960). Die britischen Patentschriften 1,094,301 und 1,177,506 beschreiben die Gewinnung des thrombinartigen Enzyms aus dem Gift von Agkistrodon rhodostoma durch Chromatographie an Triäthylaminoäthylcellulose und nachfolgende Reinigung durch Gelchromatographie; so werden 2 g rohes Agkistrodon-rhodostoma-Gift an einer Säule von 35 χ 3,9 cm TEAE-Cellulose (= 417 ml)
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und hierauf an einer Säule von 97 x 6 cm Sephadex G-IOO (= 2826 ml) chromatographiert. Bonilla [Thromb. Res. 6, 151-169 (1975)] beschreibt die Gewinnung des thrombinartigen Enzyms aus dem Gift von Crotalus horridus durch Chromatographie von 20 g Rohgift an einer Kolonne von 1766 ml Sephadex G-IOO, nachfolgende Chromatographie der aktiven Fraktion an einer Kolonne von 883 ml Diaminoä'thylcellulose, nachfolgende Chromatographie an 883 ml Carboxymethylcellulose und eine letzte Reinigung durch Chromatographie an einer Kolonne von 2,5 χ 36 cm (176 ml) DEAE-Cellulose unter Verwendung eines linear zunehmenden Pufferkonzentrationsgradienten und nachfolgende Chromatographie an einer Kolonne von 2,5 χ 33 °ή Sephadex G-200. Die genannten unter Anwendung der Ionenaustausch- und Gelchromatographie durchgeführten Verfahren ermöglichen zwar die Erzielung einer weit höheren Reinheit als das eingangs beschriebene Adsorptionsverfahren, sie sind jedoch zeitraubend und unwirtschaftlich, da nur geringe Rohgiftmengen auf relativ grossen Kolonnen chromatographiert werden können. Das aktive Eluat enthält ferner eine relativ geringe Menge Enzym in einem grossen Flüssigkeitsvolumen und muss daher entweder durch Ultrafiltration oder Vakuumdestillation eingeengt werden. Nach dem USA-Patent Nr. 3,849,252 wird das thrombinartige Enzym von Bothrops-atrox-Gift dadurch gewonnen, dass man aus 20 g Rohgift Ballaststoffe durch Ansäuern ausfällt, hierauf das Enzym durch Bildung eines schwerlöslichen Komplexes mit Phenol oder einem Phenolderivat zur
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Fällung bringt, diesen Komplex zerlegt, das derart angereicherte Enzym an einer Kolonne von 200 ml DEAE-Sephadex chromatographiert und hierauf an einer Kolonne von 1,8 χ 92 cm (2)3 ml) Sephadex G-IOO reinigt. Durch die in diesem Verfahren angewandte Fällung des thrombinartigen Enzyms als Phenol- oder Phenolderivat-Komplex werden zwar die chromatographischen Reinigungsstufen bedeutend leistungsfähiger als bei der direkten Chromatographie von Rohigft, dennoch erfordern die zahlreichen Stufen dieses Verfahrens einen beträchtlichen Arbeitsaufwand und liefern ein Produkt von ungenügender Reinheit, welches mit prothrombinfreiem Plasma in Anwesenheit von Calcium ein in Monochloressigsäure unlösliches Gerinnsel bildet und daher Faktor XIII aktiviert. Hollemann und Weiss [J. Biol. Chem. 251, I665-I669 (1976)] erzielten die Isolierung und Reinigung des thrombinartigen Enzyms von Bothrops-atrox-Gift durch Affinitätschromatographie von 2 g Rohgift an einer Kolonne von 2,5 χ 56 cm (274 ml) p-Amlnobenzamidin-succinyl-diaminodipropylamino-agarose, bei 40C, unter Verwendung von 0,15 M Benzamidin in Natriumcitrat/NaCl-Puffer mit pH 9,0 und nachfolgende Entfernung des Benzamidins aus dem Eluat durch Dialyse. Sie erhielten so ein Produkt, welches Faktor XIII nicht aktivierte. Dieses Verfahren liefert zwar ein Produkt von genügender Reinheit in nur wenigen Stufen, erfordert aber eine verhältnismässig grosse Kolonne eines kompliziert herzustellenden Adsorbens und benötigt ausserdem zur Eluierung Benz-
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amidin, welches wegen seiner Eigenschaft, UV-Licht zu absorbieren, die UV-photometrische Ueberwachung des Chromatographieverlaufs verunmSglicht und welches, da es eine beträchtliche ToxizitSt aufweist, restlos aus den Eluaten entfernt werden muss, was wiederum eine zeitraubende Dialyse erfordert.
Es wurde nun gefunden, dass thrombinartige Schlangengiftenzyme, obwohl ihre Gerinnungsaktivität unter den für Blutgerinnungstests üblichen pH-, Ionenstärke- und Temperaturbedingungen durch Heparin nicht gehemmt wird, erstaunlicherweise eine ausgeprägte Affinität zu an einem Träger gebundenem insolubilisiertem Heparin aufweisen und daher durch Affinitätschromatographie an insolubilisiertem Heparin aus Rohgift von Schlangen oder Fraktionen desselben isoliert und gereinigt werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen proteolytischen Enzymen aus Schlangengiften bzw. Schlangengiftfraktionen, welches dadurch gekennzeichnet 1st, dass man das Schlangengift bzw. die Schlangengiftfraktion in einem wässrigen Medium mit an einem in Wasser unlöslichen Träger gebundenem insolubilisiertem Heparin in Berührung bringt, um das thrombinartige Enzym an das insolubilisierte Heparin zu binden, die unerwünschten Begleitstoffe des Schlangengiftes entfernt und das thrombinartige Enzym mit einem wässrigen Medium vom irsοIrbilisierten Heparin abspaltet.
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Als Ausgangsmaterialien für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignen sich einerseits klar filtrierte oder zentrifugierte wässrige Lösungen des rohen Giftes von Schlangen der Familie der Crotalidae, insbesondere der Gattungen Agkistrodon, Bothrops, Crotalus und Trimeresurus. Als Ausgangsmaterialien eignen sich andererseits auch klar filtrierte oder zentrifugierte Schlangengiftfraktionen, welche das thrombinartige Enzym angereichert enthalten und aus welchen Ballaststoffe durch Säure- oder Hitzefällungen entfernt worden sind. Als Ausgangsmaterialien eignen sich ferner rohe Präparate der thrombinartigen Schlangengif tenzyme, welche z.B. nach dem im USA-Patent Nr. 3,849,252 beschriebenen Verfahren durch Fällung mit Phenol oder einem Phenolderivat aus Rohgift gewonnen wurden.
Insolubilisiertes Heparin kann dadurch gewonnen werden, dass man Heparin nach einer an sich bekannten Methode über seine Aminogruppen mit den reaktiven Gruppen einer polymeren wasserunlöslichen Trägersubstanz zur Reaktion bringt und dadurch kovalent an den Träger bindet. Das insolubilisierte Heparin kann z.B. nach einem der von Schmer beschriebenen Verfahren durch Bindung von Heparin an Agarose nach der Cyanogenbromidmethode, durch Bindung an Putrescinagarose nach der Thiophosgenmethode oder durch Bindung an Epsilonaminocaproylagarose nach der Carbodiimidmethode gewonnen werden [s. G. Schmer: The biological activity of covalently immobilized heparin, Trans. Am. Soc. Artificial Int. Org.
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l8, 321-325 (1972)]. Man kann als Trägersubstanz auch Cellulose und die entsprechenden Derivate, d.h. Putrescincellulose und Epsilonaminocaproylcellulose, verwenden. Insolubilisiertes Heparin kann zweckmSssigerweise auch durch Umsetzung von Heparin mit in Form von Perlen genormter Grosse käuflich erhältlicher quervernetzter Cyanogenbromidagarose (z.B. CNBr-Sepharose 4B von der Firma AB Pharmacia, Uppsala, Schweden) hergestellt werden.
Die Behandlung des Ausgangsmaterials mit dem insolubilisierten Heparin (d.h. die Bindung des thrombinartigen Schlangengiftenzyms an das Heparin) und die Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin kann chargenmässlg durch Ausrühren des in Wasser, einer wässrigen Pufferlösung, einer wässrigen Elektrolytlösung ohne oder höchstens mit schwacher Pufferwirkung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz, z.B. Natriumchlorid, enthaltenden wässrigen Lösung gelösten Ausgangsmaterials mit dem Affinitätsadsorbens (d.h. dem insolubilisierten Heparin) und nachfolgende Filtration,oder aber vorzugsweise durch Affinitätschromatographie an einer Säule durchgeführt werden. Als Elektrolyte eignen sich anorganische und organische Salze, z.B. Natriumchlorid, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat, Calciumchlorid, Ammoniumbicarbonat, Ammoniumformiat, Natriumacetat oder Triäthylamin-hydrochlorid; oder organische Säuren, z.B. Essigsäure, Weinsäure oder Zitronensäure; oder Basen, z.B. Ammoniumhydroxyd, Trimethyl-
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amin oder TriSthylamin. Bei der Affinitätschromatographie wird das insolubilisierte Heparin in eine Sä'ule, deren Durchmesser etwa einem Zehntel ihrer Höhe entspricht, eingefüllt und mit demselben wässrigen Medium, in welchem auch das Ausgangsmaterial gelöst ist, äquilibriert. Der Säulenauslauf ist zweckmSssigerweise mit einem Durchflussphotometer verbunden, welches die optische Dichte der ausfliessenden Eluate bei einer geeigneten Wellenlänge (üblicherweise 280 nm oder 254 nm) misst und automatisch registriert. Die Eluate werdenvorzugsweise mittels eines automatischen Fraktionensammlers in Fraktionen unterteilt und gesammelt.
Die Affinitätschromatographie kann im einzelnen wie folgt durchgeführt werden:
Das Ausgangsmaterial (Schlangenrohgift oder
Schlangengiftfraktion) wird in Wasser, einer wässrigen Pufferlösung oder einer wässrigen Elektrolytlösung, z.B. einer Natriumchloridlösung, oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz, z.B. Natriumchlorid, enthaltenden wässrigen Lösung gelöst. Die Lösung wird klar filtriert oder zentrifugiert und dann auf die Chromatographiesäule gegeben. Die Säule wird mit dem gleichen wässrigen Medium wie dasjenige, in welchem das Ausgangsmaterial gelöst worden ist, so lange gewaschen, bis im auslaufenden Eluat keine UV-absorbierenden Substanzen mehr nachweisbar sind. Nun wird die Säule mit einem wässrigen Eluierungsmittel, z.B. einer Pufferlösung oder einer Elektrolytlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz, z.B. Natriumchlorid, enthaltenden Lösung, deren
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Konzentration grosser ist als diejenige des wässrigen Mediums, in welchem das Ausgangsmaterial gelöst wurde, gewaschen, um das thrombinartlge Schlangengiftenzym von dem lnsolubilislerten Heparin abzuspalten. Es wird so lange gewaschen, bis kein UV-absorbierendes Material mehr eluiert wird. Schliesslich wird die Säule mit einer Pufferlösung oder einer Elektrolytlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz, z.B. Natriumchlorid, enthaltenden Lösung von so hoher Konzentration nachgewaschen, dass auch Substanzen, die stärker an das insolubilisierte Heparin gebunden sind als die thrombinartigen Enzyme, restlos aus der Kolonne entfernt werden, so dass das Affinitätsadsorbens nach Aequilibrierung mit dem gleichen Aequilibrierungsmlttel wieder regeneriert wird und somit für einen neuen Arbeitsgang bereit ist.
Als Pufferlösungen eignen sich wässrige Lösungen von Salzen anorganischer oder organischer Basen mit anorganischen oder organischen Säuren oder Salze von amphoteren Substanzen mit anorganischen oder organischen Säuren oder Basen, welche eine Pufferwirkung innerhalb des pH-Bereichs von 4 bis 10 entfalten. Besonders geeignet sind untoxische Substanzen oder Substanzgemische, die keine aromatischen Gruppen aufweisen, daher Licht von einer Wellenlänge von 280 bzw. 254 nm nicht absorbieren und somit die UV-photometrische Ueberwachung des Chromatographieverlaufs nicht stören, insbesondere Glycin/NaOH-, Essigsäure/NaOH-, Zitro-
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nensäure/NaOH-, Triäthanolamin/HCl-, Lysin/HCl-, Glycylglycin-HCl-, Natriumphosphatpuffer sowie auch vakuumflüchtige Puffersysteme wie Ammoniumformiat-, Ammoniumacetat- und Aethylendiamintetraacetatpuffer. Für das chargenmässige Arbeiten eignen sich ferner Natriumhydrogencarbonat- und Ammoniumhydrogencarbonatpuffer, die Jedoch wegen COg-Entwicklung für das chromatographische Verfahren unbrauchbar sind, Die thrombinartigen Enzyme verschiedener Schlangengifte besitzen eine unterschiedliche Affinität gegenüber dem an einen unlöslichen Träger gebundenen insolubilisierten Heparin; dementsprechend muss auch die Zusammensetzung der Puffer der biologischen Herkunft der zu isolierenden Enzyme angepasst werden. Je geringer die Konzentration der Puffer- oder Elektrolytlösung oder der Puffer-Neutralsalz-Lösung ist, umso besser wird das Enzym an insolubilisiertes Heparin gebunden. Da aber bei geringer Konzentration auch das unspezifische Bindungsvermögen des Heparins für Proteine am grössten ist, müssen Konzentrationen gewählt werden, bei welchen das thrombinartige Enzym gebunden wird, andere Proteine Jedoch die Kolonne ungehindert durchlaufen. Für Jedes Gift können die optimalen Konzentrationsbedingungen durch einfache Vorversuche ermittelt werden. Die Bindung aller untersuchten thrombinartigen Schlangengiftenzyme erfolgt bei Konzentrationen der Pufferlösungen oder Elektrolytlösungen oder Puffer-Neutralsalz-Lösungen, die Je nach Giftart in einem Molaritätsbereich von 0,01 bis 0,5 liegen, und bei einem pH von 4 bis 10. Zur Abspaltung der an insolubilisiertes Heparin gebundenen thrombinartigen
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Schlangengiftenzyme werden Pufferlösungen oder Elektrolytlösungen oder Puffer-Neutralsalz-Losungen verwendet, die eine höhere Konzentration aufweisen als die zur Bindung des Enzyms an das insolubllislerte Heparin verwendete Losung. Vorzugsweise verwendet man die gleiche Pufferlösung wie diejenige, welche zur Bindung des Enzyms an das insolublllsierte Heparin verwendet wurde, erhöht jedoch deren Konzentration durch Zusatz eines stark dissoziierenden Neutralsalzes, vorzugsweise Natriumchlorid, derart, dass das gebundene Enzym von dem insolubilisierten Heparin abgespalten wird. Da in einigen Schlangengiften auch andere Substanzen mit einer AffinitSt gegenüber insolubilislertem Heparin vorhanden sind, wird die Konzentration der zur Eluierung verwendeten Lösung vorzugsweise so eingestellt, dass das thrombinartige Enzym abgespalten wird, andere Substanzen mit höherer Affinität jedoch an dem insolubilisierten Heparin gebunden bleiben. Die Abspaltung aller an insolubllisiertes Heparin gebundenen thrombinartigen Schlangengiftenzyme wird vorzugsweise bei Konzentrationen, die zwischen 0,1 und 2 Mol liegen, und in einem pH-Bereich von 4 bis 10 durchgeführt. Die restlose Entfernung aller am insolubilisierten Heparin gebundenen Giftbestandteile mit einer Heparinaffinität, die stärker als diejenige der thrombinartigen Enzyme ist, wird zweckmässigerweise mit Pufferlösungen oder Elektrolytlösungen oder Puffer-Neutralsa-lz-Lösungen, die ein pH von 4 bis 10 und eine Molarlfeät
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von 0,5 bis 2 aufweisen, durchgeführt. Vorzugsweise wird wiederum die erste Pufferlosung, welche zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendet wurde, durch Zusatz eines Neutralsalzes, vorzugsweise Natriumchlorid, auf die gewünschte Konzentration gebracht. Das Affinitatsadsorbens kann nun durch Waschung mit der ersten Pufferlösung, welche zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin diente, wieder in den gebrauchsfertigen Zustand versetzt werden.
Die Affinität von insolubilisiertem Heparin gegenüber den thrombinartigen Schlangengiftenzymen ist bei tiefer Temperatur am grossten und nimmt mit steigender Temperatur ab. Man kann dieses Phänomen dazu nutzen, die Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin bei tiefer Temperatur, z.B. in einer mit Eiswasser gekühlten Kolonne, und die Abspaltung des Enzyms durch Erhöhung der Temperatur im Kühl- bzw. Heizmantel der Kolonne, z.B. auf 400C, unter Verwendung einer einzigen Pufferlösung von gleichbleibender Konzentration und gleichbleibendem pH zu bewirken.
Die Abspaltung des Enzyms vom insolubilisierten Heparin kann ferner bei gleichbleibender Konzentration des wässrigen Mediums an Puffer und/oder Neutralsalz durch Erhöhung oder Herabsetzung des pH über bzw. unter den Wert, bei welchem die Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin stattgefunden hat, durchgeführt werden. Der für jedes Enzym geeignete pH-Bereich lässt sich durch einfache Vorversuche ermitteln.
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Der Gehalt der bei der Kolonnenchromatographie erhaltenen Eluate an thrombinartigem Schlangengiftenzym kann durch einen Gerinnungstest, vorzugsweise an Fibrinogen, geprüft werden. Als Gerinnungstest eignet sich z.B. die Messung der Gerinnungszeit in Sekunden, nach Zusatz von 0,2 ml verdünntem Eluat zu 0,2 ml 0,4#igem Rinderfibrinogen, bei pH 7,4 und 570C. Die einfache Gerinnungszeitbestinunung eignet sich gut zur Erstellung eines Aktivitätsprofiles in chromatographischen Eluierkurven (siehe Pig. I der beiliegenden Zeichnung). Aus einer nach derselben Technik unter Verwendung eines Thrombin-Standardpräparates (z.B. US-Standard Thrombin, National Institute of Health, Bethesda, Md.) oder unter Verwendung eines Standardpräparates für das betreffende thrombinartige Schlangengiftenzym (z.B. Ancrod-Standard der Weltgesundheitsorganisation oder Batroxobin moojeni Standard, First British Standard) ermittelten Eichgeraden kann aus der Gerinnungszeit die Aktivität quantitativ in NIH-Thrombin-Einheiten bzw. in Ancrod-Einheiten oder in Batroxobin-Einheiten abgelesen werden. Der Gehalt an thrombinartigen Enzym kann aber auch in einem photometrischen Test unter Verwendung eines synthetischen chromogenen Thrombinsubstrates, wie z.B. Tos-Gly-Pro-Arg-pNA.HCl, in Enzym-Einheiten bestimmt werden. Eine Einheit (U) ist dann die Menge Enzym, welche unter den Testbedingungen innert einer Minute 1 uMol Substrat spaltet.
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Aus den vereinigten aktiven Fraktionen können unerwünschte Puffersubstanzen und Salze durch Dialyse ganz oder teilweise entfernt werden. Eine gleichzeitige Entsalzung und Konzentrierung der vereinigten aktiven Fraktionen kann durch Ultrafiltration, z.B. durch eine DiafIo-Membran UM-2 (Amlcon, Oosterhout, Holland), vorgenommen werden. Ob die das thrombinartige Schlangengiftenzym enthaltende Fraktion entsalzt und konzentriert werden soll, hängt von der Art des verwendeten Puffers, von der chromatographierten Substanzmenge und vom Verwendungszweck des Produktes ab. Bei Verwendung untoxischer Puffersysteme, wie z.B. Glycin/NaOH/NaCl, zur Gewinnung thrombinartiger Enzympräparate für die experimentelle und/oder therapeutische Defibrinogenierung muss man nicht oder nur partiell entsalzen, um aus den vereinigten aktiven Fraktionen des Eluates nach herkömmlichen Methoden eine isotonische sterile, pyrogenfrele Lösung herstellen zu können. Partielle Entsalzung genügt auch dann, wenn das in einem Eluat enthaltene thrombinartige Schlangengiftenzym zwecks weiterer Reinigung rechromatographiert werden soll; es genügt dann, die Puffer- bzw. Salzkonzentration des Eluates auf den zur Affinitätsbindung erforderlichen tieferen Wert zu reduzieren, um das Enzym erneut an lnsolubilisiertes Heparin binden zu können.
Die Natur der Bindung zwischen dem insolubilisierten Heparin und den thrombinartigen Enzymen ist nicht genau aufgeklärt worden. Sehr wahrscheinlich ist die-
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se Bindung analog der chemischen Bindung, die zwischen Enzymen und Substraten sowie zwischen Enzymen und Inhibitoren bei reversibler Hemmung auftritt (siehe S.M. Rapoport: "Medizinische Biochemie", VEB Verlag Volk und Gesundheit, Berlin, 1975, S. 155-155).
Das erfindungsgemSsse Verfahren besitzt gegenüber den bekannten Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen Schlangengiftenzymen mehrere erhebliche Vorteile. Das Bindungsvermö'gen von insolubilisiertem Heparin für thromblnartige Schlangengiftenzyme ist so gross, dass an einer Chromatographiesäule von nur 20 ml Inhalt mehr als 4 g Rohgift oder eine äquivalente Menge vorgereinigte Enzymfraktion aufgetrennt werden können, wobei thrombinartige Enzyme von einem hohen Reinheitsgrad erhalten werden. Dies entspricht etwa dem 40-fachen der Leistungsfähigkeit einer Ionenaustauschchromatographie an Celluloseaustauschern, etwa dem 400-fachen der Leistungsfähigkeit einer Gelchromatographie und etwa dem 25-fachen der Leistungsfähigkeit der Affinitätschromatographie an p-Aminobenzamidin-succinyl-diaminodipropylaminoagarose. Dieses grosse Bindungsvermögen des insolubilisierten Heparins erhöht nicht nur die Trennkapazität einer relativ kleinen Chromatographieapparatur, sondern bewirkt auch, dass die aktiven Fraktionen des Eluates das Enzym lh wesentlich höheren Konzentrationen enthalten, als dies bei Ionenaustausch- und Gelchromatographie der Fall ist, wodurch viel weniger Arbeitsaufwand für Konzentrierung und Entsalzung der Eluate
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aufgebracht werden muss. Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden die thrombinartigen Schlangengiftenzyme in wenigen, leicht durchzuführenden und weitgehend automatisierbaren, gut registrierbaren Arbeitsgängen gewonnen. Eine Verwendung von toxischen Eluiermitteln ist nicht erforderlich.
Es war durchaus nicht vorauszusehen, dass man thrombinartige Enzyme durch Bindung an insolubilislertes Heparin aus Schlangengiften isolieren könnte. Es war zwar bekannt [siehe I. Danishefsky et al., Thrombosis Research 8, 134 (1976)], Thrombin durch Affinitätschromatographie an durch Bindung an ßepharose unlöslich gemachtem Heparin zu reinigen. Bei dieser Methode wird davon Gebrauch gemacht, dass Heparin Thrombin hemmt, d.h. gegenüber Thrombin eine hohe Affinität bzw. Bindungsfähigkeit aufweist. Die Entdeckung der Tatsache, dass auch thrombinartige proteolytische Schlangengiftenzyme, welche als solche durch Heparin nicht gehemmt werden, d.h. gegenüber gelöstem Heparin keine erkennbare Affinität bzw. Bindungsfähigkeit aufweisen, oder anders ausgedrückt, von gelöstem Heparin nicht gebunden werden, durch insolubilisiertes Heparin gebunden und somit durch Affinitätschromatographie an insolubilisiertem Heparin isoliert und gereinigt werden können, war sehr überraschend und nicht voraussehbar.
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Beispiel 1
9 g Heparin-Natrium mit einer spezifischen biologischen Aktivität von 162 internationalen Einheiten per mg wurden in 1 Liter 0,1-molarem Natriumbicarbonatpuffer, der 0,5 Mol/Liter Natriumchlorid enthielt und ein pH von 8,3 aufwies, gelöst. Der Losung wurden 45 g CNBr-Sepharose 4B (AB Pharmacia, Uppsala, Schweden), welche zuvor in 0,001 N Salzsäure gequollen und gewaschen worden war, zugesetzt. Die Mischung wurde während 2 Stunden gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde die Mischung durch eine Glasfilternutsche G-3 filtriert und das abfiltrierte Sepharose-Heparin fünfmal mit je 300 ml Natriumbicarbonatpuffer der oben angegebenen Zusammensetzung gewaschen. Zur Absättigung von allfällig noch vorhandenen reaktionsfähigen CNBr-Gruppen wurde das Sepharose-Heparin während 2 Stunden mit 1 Liter 0,5£igem Aethanolamin im Natriumbicarbonatpuffer der obigen Zusammensetzung gerührt. Das Sepharose-Heparin wurde wiederum auf einer Glasfilternutsche gesammelt und
noch dreimal mit je 300 ml Natriumbicarbonatpuffer gewaschen. Nun wurde das Sepharose-Heparin so lange mit 0,1-molarem Natriumacetatpuffer von pH 4,0 nachgewaschen, bis das pH des Filtrates 4,0 betrug*. Schliesslich wurde das insolubilisierte Heparin mit mehreren Portionen 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 gewaschen, in eine Kolonne von 26 mm Durchmesser eingefüllt und mit demselben Glycin/NaOH-Puffer äqullibriert. Die Kolonne, die eine H5he von 29 cm aufwies und
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somit etwa 155 ml insolubilisiertes Heparin enthielt« wurde nun zur absteigenden Chromatographie eingerichtet. Der Säulenauslauf wurde Ober ein auf die Messung bei 280 nm eingestelltes, mit einem automatischen Schreiber ausgerüstetes Durchflussphotometer an einen Fraktionensammler, der zur Sammlung von Fraktioneryfron Je 350 Tropfen eingestellt war, angeschlossen.
30 g Bothrops-atrox-Gift (Bothrops moojeni nach Hoge) wurden in 6OO ml destilliertem Wasser gelost. Der pH-Wert der Lösung wurde mittels IN HCl auf 3,0 und nach einer Stunde Inkubationszeit mit IN NaOH auf 7,3 eingestellt. Das dabei -entstandene flockige Produkt wurde durch Zentrifugation abgetrennt und verworfen. Dem Ueberstand wurde eine Lösung von 15 g Natriumsalicylat in 300 ml destilliertem Wasser zugesetzt. Das pH der Lösung wurde mit IN HCl auf 3,0 gestellt. Nach 60 Minuten wurde der gebildete Niederschlag abEentrifugiert, in 200 ml 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 aufgenommen und auf einem Ultrafilter (Diaflomembran UM-2, Amicon) so lange mit demselben Puffer gewaschen, bis eine Filtratprobe nach Zusatz von Eisen-III-chlorid keine violette Färbung mehr gab und daher frei von Salicylsäure war. Das auf dem Filter überstehende Konzentrat von etwa 30 ml wurde mit 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 auf ein Volumen von 50 ml eingestellt. Es enthielt dann-2240 Batroxobin-Einheiten -(BU) per ml und wurde auf die vorbereitete Sepharose-Heparin-Säule gegeben. Durch Spülung
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mit 750 ml 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer I) wurden Ballaststoffe eluiert. Hierauf wurde die Kolonne mit 0,1-Mol/Liter Natriumchlorid enthaltendem 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer II) eluiert, bis 1120 ml Flüssigkeit durchgeflossen waren, wobei erneut Ballaststoffe eluiert wurden. Nun wurde das thrombinartige Enzym in Form von zwei UV-absorbierenden und Fibrinogenkoagulierenden Zonen durch Eluierung mit 0,25 Mol/Liter Natriumchlorid enthaltendem 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer III) bis zu einem Durchflussvolumen von 900 ml aufgefangen. Schliesslich wurden noch an dem Sepharose-Heparin gebunden gebliebene Substanzen durch Eluierung mit 600 ml 1 Mol/Liter Natriumchlorid enthaltendem Glycin/NaOH-Puffer von pH 8,5 (Puffer IV) entfernt. Der Chromatographieverlauf ist in Fig. 1 der beiliegenden Zeichnung schematisch dargestellt.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, in welcher einerseits die UV-Absorption (Abs) bei 280 Nanometer und andererseits die mit Eluatproben in Verdünnung 1 : 10 erzielten Fibrinogengerinnungszeiten (Gz) in Sekunden als Funktionen der aufgefangenen Flüssigkeitsvolumina in ml aufgetragen sind. Die Absorption ist durch die ausgezogene Kurve dargestellt, während die Gerinnungsakt ivitSt durch das gestrichelte Profil dargestellt ist. - Die* geraffte Aufzeichnung der Flüssigkeitsvolumina Ist..,, ~.. durch die gestrichelten Unterbrüche in der Absorptionskurve angedeutet.
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Das throrabinartige Enzym (Batroxobin) war in 800 ml Eluat in einer Konzentration von 100 Batroxobin-Einheiten per ml enthalten. Die Ausbeute, bezogen auf die aufgetragenen 112*000 BU, betrug somit 71,2^. Das Eluat wurde auf einem Ultrafilter (Diaflomembran UM-2, Amicon) auf 80 ml eingeengt und diente als Batroxobinkonzentrat für die Herstellung eines pharmazeutischen Präparates mit einem Batroxobingehalt von 22 Batroxobin-Einheiten per ml zur therapeutischen Defibrinogenierung.
Beispiel 2
0,1 g Gift der Schlangenart Agkistrodon contortrix wurde in 1,~5 ml wässrigem 0,1-molarem Glycin/NaOH-Puffer mit pH 6,0 gelöst. Die Lösung wurde auf eine Säule (17 χ 70 mm; l6 ml) von Heparin-Sepharose gegeben. Die Säule wurde mit demselben Puffer so lange nachgewaschen, bis die abfliessende Waschflüssigkeit bei 280 nm keine Lichtabsorption mehr aufwies. Nun wurde die Säule mit 0,1-molarem Glycinpuffer mit pH 6,0, der 0,75 Mol NaCl pro Liter enthielt, gespült, bis kein UV-absorbierendes Material mehr aus der Säule ausgewaschen wurde. Dieses Ballastmaterial enthaltende Eluat wurde verworfen. Nun wurde durch Eluierung mLt 0.,1-jnalarera Glycinpuffer mit pH 6,0, der 1,0 Mol NaCl pro Liter enthielt, das thrombinartige Enzym isoliert. Es wurden 22 ml Eluat mit Gerinnungsaktivität an Fibrinogen erhalten. Gemessen am synthetischen chromogenen
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Substrat Benzoyl-Pro-Phe-Arg-p-Nitroanilid betrug die Aktivität insgesamt 6996 mE (Millieinheiten). Der totale Proteingehalt des aktiven Eluates betrug 6,2 mg. Das auf diese Weise gereinigte thrombinartige Enzym aus Agkistrodoncontortrix-Gift zeigte eine einzige Zone bei der Elektrophorese an Polyacrylamidgel in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat^ und es erwies sich, getestet auf der nichterhitzten Fibrinplatte (P. Brakman u. T. Astrup in: Thrombosis and Bleeding Disorders, verlegt von N.U. Bang, F.K. Beller, E. Deutsch u. E. Mammen, Thieme und Academic Press, Stuttgart, New York, London, 1971, S. 332) als frei von fibrinolytischer Aktivität. Das Eluat wurde auf einem Ultrafilter (Diaflomembran ÜM-2, Amicon, Oosterhout, Holland) auf 1-2 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 150 mg Lactose versetzt, mit destilliertem Wasser auf 30 ml verdünnt, in Fläschchen von Je 1,0 ml abgefüllt und lyophilisiert. Es wurden so 30 Fläschchen mit je 200 mE Enzym in stabiler, sofort loslicher Form erhalten. In dieser Form eignet sich das Präparat zur Untersuchung der Fibrinogen-Fibrin-Utnw and lung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen .
Beispiel 3
0,1 g Gift der Schlangengättung Agkistrodon rhodostoma (10*500 Ancrod-Einheiten) wurde in 1,5 ml wässrigem Ο,ΌΙ-molarem Glycinpuffer mit pH 6,0 gelöst.
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er
Die Lösung wurde auf eine mit demselben Puffer Squilibrierte Säule (17 x 70 mm; l6 mg) von Heparin-Sepharose gegeben. Die Säule wurde so lange mit demselben Puffer nachgewaschen, bis mittels Durchflussphotometer im Eluat kein UV-absorbierendes Material mehr nachweisbar war. Nun wurde die Säule mit 0,01-molarem Glycinpuffer mit pH 6,0, der 0,1 Mol NaCl pro Liter enthielt, gewaschen, um Ballastmaterial zu entfernen. Schliesslich wurde das thrombinartige Enzym (Ancrod) mit 0,01-molarem Glycinpuffer mit pH 6,0, der 0,25 Mol NaCl pro Liter enthielt, eluiert. Es wurden 120 ml einer Lösung mit 27 Ancrod-Einheiten per ml erhalten. Dieses Produkt zeigte eine einzige Zone bei der Elektrophorese an Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecy!sulfat.
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Claims (1)

  1. Patentansprüche
    1. Verfahren zur Gewinnung von thrombinartigen proteolytischen Enzymen aus Schlangengiften bzw. Schlangengif tfraktionen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Schlangengift bzw. die Schlangengiftfraktion in einem wässrigen Medium mit an einem in Wasser unlöslichen Träger gebundenem insolubilisiertem Heparin in Berührung bringt, um das thrombinartige Enzym an das insolubilisierte Heparin zu binden, die unerwünschten Begleitstoffe des Schlangengiftes entfernt und das thrombinartige Enzym mit einem wässrigen Medium vom insolubilisierten Heparin abspaltet.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete wässrige Medium Wasser ist.
    3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete wässrige Medium eine 0,01-bis 0,5-molare Pufferlösung ist, die ein pH von 4 bis 10 aufweist.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete wässrige Medium eine wässrige 0,01- bis 0,5-molare Elektrolytlösung ohne oder höchstens mit schwacher Pufferwirkung ist, die ein pH von 4 bis 10 aufweist.
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    5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrolytlösung eine wässrige Natriumchloridlösung ist.
    6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendete wässrige Medium eine sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltende wässrige Lösung ist, die eine Gesamtkonzentration von 0,01 bis 0,3 Mol/Liter und ein pH von 4 bis 10 aufweist.
    7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als insolubilisiertes Heparin ein durch Bindung von Heparin über seine Aminogruppen an die reaktiven Gruppen einer polymeren wasserunlöslichen Trägersubstanz, z.B. Agarose, Putrescinagarose, Epsilonaminocaproylagarose oder Cyanogenbromidagarose, erhaltenes Produkt verwendet.
    8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin eine wässrige Pufferlösung verwendet, welche eine molare Konzentration, die grosser ist als diejenige der zum Binden des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendeten Lösung ist und zwischen 0,1 und 1 Mol pro Liter liegt, und welche ein pH von 4 bis 10
    aufweist.
    9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8, dadurch
    gekennzeichnet, dass die-verwendete Pufferlösung ©,1 bis 1 Mol pro Liter eines Neutralsalzes, z.B. Natriumchlorid,
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    enthält und eine Gesamtkonzentration von 0,1 bis 2 Mol pro Liter aufweist.
    10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abspaltung des Enzyms von dem Insolubilisierten Heparin bei einer Temperatur durchführt, die Ober der Temperatur liegt, bei welcher das Enzym an das insolubilisierte Heparin gebunden wird.
    11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin mittels der gleichen Pufferlösung oder Puffer-NeutralsalZt-Lösung, wie sie zum Binden des Enzyms an das insolubiliserte Heparin verwendet wird, jedoch bei einem pH durchfuhrt, das unter oder über dem pH liegt, bei welchem das Enzym an das insolubilisierte Heparin gebunden wird.
    12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es chargenmässig durchgeführt wird, indem man das Schlangengift bzw. die Schlangengiftfraktion in dem zur Bindung des Enzyms an das Heparin bestimmten wässrigen Medium mit dem insolubilisierten Heparin rührt, das erhaltene Reaktionsprodukt abfiltriert und mit dem zur Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin bestimmten wässrigen Medium rührt, um das Enzym in Freiheit zu setzen.
    15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Chromatographie durchgeführt wird,
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    indem man eine Lösung des Schlangengiftes bzw. der Schlangengiftfraktion in dem zur Bindung des Enzyms an das Heparin bestimmten wässrigen Medium auf eine aus dem insolubilisierten Heparin bestehende Säule gibt, die unerwünschten Begleitstoffe des Schlangengiftes aus der Säule herauswäscht und die Säule mit dem zur Abspaltung des Enzyms von dem insolubilisierten Heparin bestimmten wässrigen Medium wäscht, um das Enzym von dem insolubilisierten Heparin abzuspalten und aus der Säule herauszuwaschen.
    14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Entfernung der genannten unerwünschten Begleitstoffe durch Eluierung derselben einerseits mit dem für die Bindung des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendeten wässrigen Medium und andererseits mit einer Puffer- und/oder Elektrolytlösung, deren Konzentration grosser als diejenige des zum Binden des Enzyms an das insolubilisierte Heparin verwendeten wässrigen Mediums, Jedoch kleiner als diejenige des zur Abspaltung des Enzyms vom insolubilisierten Heparin verwendeten wässrigen Mediums ist, durchgeführt wird.
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