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Verfahren zur Herstellung hochmolekularer Phosphorsäureester von Steroidhormonen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung hochmolekularer Phosphorsäureester von Steroidhormonen, die mindestens eine Hydroxylgruppe oder eine enolisierbare Ketogruppe enthalten. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Herstellung von Verbindungen der genannten Art, die im Organismus eine biologische Wirkung des in den Phosphorsäureester eingehenden Steroidhormons aufrechterhalten können, welche, verglichen mit den bisher erzielbaren Wirkungen, längere Zeit anhält.
Es ist bekannt, dass der Hormoninhalt eines hormonproduzierenden Organs in jedem Zeitpunkt im Verhältnis zu denjenigen Hormonmengen, die dem Organismus zur Erzielung einer eindeutigen Hormonwirkung zugeführt werden müssen, niedrig ist. Dies ist sowohl durch Tierversuche als auch durch klinische Anwendung der betreffenden Hormone nachgewiesen worden. Daraus lässt sich folgen, dass Hormone an den Produktionsstellen nicht angesammelt werden, sondern von diesen kontinuierlich abgesondert werden. Die beste Substitutionstherapie wird somit darin bestehen, dieses natürliche, biologische Verhältnis nach Möglichkeit nachzuahmen ; zu diesem Zweck hat man versucht, Hormonpräparate mit kontinuierlicher und verlängerter Wirksamkeit herzustellen.
Die bisher zur Erzielung einer verlängerten Wirkung von Steroidhormonpraparaten angewendeten Methoden lassen sich in drei Gruppen zusammenfassen : a) Verabfolgung von Derivaten der Steroidhonnone, vorwiegend Estern, wie z. B. Tcstosteronpropionat und Östradiolbenzoat, wobei die prolongierte Wirkung darauf beruht, dass die Substanz im Organismus hydrolysiert werden muss, bevor eine biologische Wirkung eintreten kann. b) Verabfolgung des Hormons in Öldepots, aus denen es nur langsam resorbiert wird.
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rung der Öldepots beruht. c) Verabfolgung des Hormons in fester, amorpher Form als Suspension oder Adsorbat, z. B. an Kohle oder Aluminiumphosphat, wobei eine Suspension von Mikrokristallen oder Tabletten von Mikrokristallen, die sogenannten "Pellets", implantiert werden.
Keine der genannten Methoden ergibt besonders zufriedenstellende Ergebnisse. So muss die Injektion des Hormons in Öl relativ oft wiederholt werden, wodurch unangenehme Öldepots zurückbleiben, die der Organismus nicht oder nur mit Schwierigkeit beseitigen kann. Präparate, welche z. B. an Aluminiumphosphat adsorbierte Steroidhormone enthalten, erzeugen inflammatorische Reaktionen und andere Nebenwirkungen. Beim Implantieren der sogenannten Pellets stellt man oft einen diskontinuierlichen Verlauf des Resorptionsprozesses fest. Dabei ist das Implantat oft lästig ; in gewissen Fällen wird es an der Implantationsstelle ausgestossen. Bei den unter b) und c) genannten Methoden ist es ausserdem meist schwierig, volle Sterilität zu sichern.
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die vorgenannten Mängel zu vermeiden und hochmolekulare Phosphorsäureester von Steroidhormonen zu schaffen, aus denen Hormonpräparate mit verlängerter, vielfach sogar beträchtlich verlängerter Wirksamkeit hergestellt werden können.
Die erfindungsgemäss hergestellten, hochmolekularen Phosphorsäureester bestehen aus kettenförmigen Molekülen, deren Einzelglieder durch Phosphorsäuregruppen verknüpft sind und in denen das Steroidhor-
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mon in Form von Steuidphosphorsäuregruppen enthalten ist.
Unter der Bezeichnung"Phosphorsäuregruppen"sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung sowohl Phosphat-als auch Phosphit- und Thiophosphatgruppen zu verstehen, während der Ausdruck"kettenför- mige Moleküle" sowohl gerade als auch verzweigte Moleküle umfasst.
Die hochmolekularen Phosphorsäureester von Steroidhormonen, die mindestens eine Hydroxylgruppe oder eine enolisierbare Ketogruppe enthalten, werden erfindungsgemäss dadurch hergestellt, dass man auf die Steroide, gegebenenfalls in Gegenwart von aromatischen Di- oder Polyaminen, Dii cder Polyphenolen bzw. Aminophenole mit zwei nichtbenachbarten phosphorylierbaren Gruppen als Kupplungsstoff, ein Phosphorylierungsmittel so lange einwirken lässt, bis ein nicht dialysierbares hochmolekulares Umsetzungsprodukt mit einem mittleren Molekulargewicht von mindestens etwa 2000 entstanden ist, und dieses Produkt einer Hydrolyse bis zur Wasser- bzw. Alkalilöslichkeit unterwirft.
Es ist anzunehmen, dass die prolongierte Wirkung der neuen Verbindungen dadurch entsteht, dass der Organismus die Verbindungen stückweise, vermutlich durch Enzymwirkung, abbaut.
Wenn man die Bedingungen variiert, unter denen die Phosphorylierung erfolgt, kann man Erzeugnisse mit verschiedener Molekülgrösse und hiedurch mit einer mehr oder weniger protrahierten Wirkung der Verbindungen erzielen. In der Regel wird die Reaktion vorteilhaft bei Temperaturen unter 00 C durchgeführt ; im Falle eines trägen Reaktionsverlaufes kann es aber zweckmässig sein, die Reaktionstemperatur, unter Umständen bis gegen 1000 C, zu erhöhen.
Wenn die Reaktion eine angemessene Stufe erreicht hat, was z. B. durch Prüfung der Dialysierbarkeit des Produktes kontrolliert werden kann, unterbricht man sie. Die Unterbrechung der Reaktion kann durch eine Hydrolyse herbeigeführt werden. So kann man z. B. die Reaktion dadurch zum Abschluss bringen, dass man der Reaktionsmischung zerkleinertes Eis zusetzt oder die Mischung in Eiswasser giesst.
Nach einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Steroid mit einer Menge des Phosphorylierungsmittels behandelt, welche die dem Steroid oder dem Steroid und dem Kupplungsstoff äquimolare Menge nicht wesentlich übersteigt.
Durch die erwähnte Begrenzung des Phosphorylierungsmittels fördert man den Aufbau kettemörmiger Moleküle, indem die einzelnen Moleküle des Phosphorylierungsmittels dadurch eine grössere Möglichkeit erhalten, mit verschiedenen Molekülen des Steroids und bzw. oder des Kupplungsstoffes gleichzeitig zu reagieren.
Ein Diphosphorsäureester aus Östradiol ist bekanrt ; er behält aber, wie die oben unter Gruppe a) erwähnten Ester. seine Hormonwirkung im Organismus nur eine relativ kurze Zeit nach der Injektion bei.
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östrogene Wirkung. In Anbetracht dieser Tatsachen war es nicht vorauszusehen, dass hochmolekulare Phosphorsäureester von Steroidhormonen, in denen Steroidhormongruppen durch Veresterung mit Phosphorsäuregruppen kondensiert sind, eine hohe, protrahierte Hormonwirkung aufweisen würden. Es war vielmehr zu erwarten, dass sie wie das Monophosphat des Östradiols nur eine geringe Hormonwirkung aufweisen würden.
Als Phosphorylierungsmittel werden im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens vorzugsweise Phosphoroxyhalogenid, Phosphortrihalogenid oder Thiophosphorylhalogenid, insbesondere die entsprechenden Chloride, verwendet. Es lassen sich aber auch andere Phosphorylierungsmittel, gegebenenfalls in Kombination mit den vorgenannten, anwenden, z. B. Phenylphosphoryldichlorid.
Die Erfindung schafft auch die Möglichkeit, die Geschwindigkeit zu variieren, mit der das Steroid dem Organismus zur Verfügung gestellt wird. Zu diesem Zweck kann man das Steroid phosphorylieren oder thiophosphorylieren und über die Phosphorsäuregruppe oder-gruppen mit einem besonderen Kupplungsstoff verknüpfen. So können hochmolekulare Phosphorsäureester von Steroidhormonen aufgebaut werden, in denen nur einige der durch die Phosphorsäuregruppen verknüpften Gruppen, z. B. jede zweite, Steroidcharakter haben, so dass die Hormonfreisetzung in entsprechendem Grad verzögert wird. Beispiele für solche besondere Kupplungsstoffe sind Phloroglucin, Phloretin, Phloridzin und Phloramin. Eine grosse Zahl anderer natürlicher oder synthetisch hergestellter Stoffe mit ähnlichem Charakter sind als Kupplungsstoffe geeignet.
Die Anwendung eines Kupplungsstoffes ermöglicht ferner den Aufbau hochmolekularer Phosphorsäureester von Steroidhormonen mit nur einer Hydroxylgruppe oder enolisierbaren Ketogruppe im Molekül, während es ohne Anwendung eines Kupplungsstoffes notwendig ist, dass das angewendete Steroid mindestens zwei solche Gruppen im Molekül enthält, um die für die Herstellung hochmolekularer Verbindungen erforderliche Kettenbildung erzielen zu können.
Ein Steroid mit nur einer Hydroxylgruppe oder durch Enolisierung einer Ketogruppe entstandenen
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Hydroxylgruppe im Molekül kann erfindungsgemäss mit einem Phosphorylierungsmittel unter Anwendung eines Kupplungsstoffes mit mindestens drei Amino-oder Hydroxylgruppen oder beiderlei Gruppen umgesetzt werden, wobei die Moleküle dieses Kupplungsstoffes vor, während oder nach der unter Phosphorylerung erfolgenden Umsetzung der steroidhaltigen Gruppe verknüpft werden können. Zwei der Amino- oder Hydroxylgruppen dienen somit dem Aufbau einer Kette, deren Glieder mittels Phosphorsäuregruppen verbunden sind, und eine dritte Amino-oder Hydroxylgruppe bindet mittels der Phosphorsäuregruppe das Steroid an die Kette.
Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kann man so verfahren, dass man zuerst das Steroidhormon mit der äquimolaren Menge oder vorzugsweise mit einem kleinen Überschuss des Phosphorylierungsmittels phosphoryliert. Mit Phosphoroxychlorid als Phosphorylierungsmittel bilden sich hiedurch Verbindungen des Types ROP (0) Cl, worin R die Steroidgruppe bezeichnet. Dann wird der Kupplungsstoff zugesetzt, wodurch sich Diester des Types ROP(O)(Cl)-OR, worinR die Kupplungsstoffgruppe ist, oder entsprechende Esteramide, bilden. Danach wird eine neue Menge Phosphorylierungsmittel zugesetzt, und da R mindestens zwei an der Diester- oder Esteramidbildung nicht beteiligte Hydroxyl- oder Aminogruppen enthält, kann unter geeigneten Reaktionsbedingungen eine Kupplung mit Phosphorsäuregruppen zu hochmolekularen Verbindungen erfolgen.
Man kann auch so verfahren, dass man unmittelbar Steroidhormon und Kupplungsstoff mischt und dann diese Mischung phosphoryliert, oder man kann zunächst den Kupplungsstoff phosphorylieren und dann das phosphorylierte oder nicht-phosphorylierte Steroidhormon und Phosphorylierungsmittel zusetzen.
Zur Forderung der Bildung hochmolekularer Verbindungen kann man erfindungsgemäss ein Kondensationsmittel, wie ein tertiäres Amin, z. B. Pyridin oder Chinolin, verwenden. Das Kondensationsmittel
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Beispiele von Steroidhormonen, welche unmittelbar unter Bildung von hochmolekularen Verbindungen phosphoryliert werden können und also mindestens zwei Hydroxylgruppen oder durch Enolisierung von Ketogruppen gebildete Hydroxylgruppen enthalten, sind Östradiol, Methylandrostendiol, östriol, Testosteron und Pregnandiol. Beispiele von Steroiden, die nur eine Hydroxylgruppe oder enolisierbare Ketogruppe haben und daher mittels eines Kupplungsstoffes zum Aufbau hochmolekularer Verbindungen verwendet werden können, sind Östron, Progesteron, Testosteron und 19-Nortestosteron.
Eine verlängerte Wirksamkeit von Steroidhormonen lässt sich am leichtesten durch Tierversuche nachweisen. So verwendet man bei Untersuchungen der Wirksamkeit der Östrogene die sogenannte Vaginalschabetechnik, d. h. man misst die Dauer der Brunstveländexungen an der Vagina von Versuchstieren (kastrierten Mäusen). Bei Untersuchungen der Stärke der Androgene kann man die Gewichtszunahme der Prostata und bei der Prüfung der anabolischen Wirkung die Gewichtszunahme des M. levator ani als Massstab anwenden.
Die Ergebnisse solcher Tierversuche sind in der Zeichnung dargestellt.
In Fig. 1 zeigen die Kurven A, B, C, D die Wirkung von Injektionen mit Östradiolbenzoat, bzw.
Äthinylöstradiol, Östradioldiphosphat und einem nach der Erfindung hergestellten Polyöstradiolphosphat.
Auf den Ordinaten der Kurven ist der prozentuale Anteil der Versuchstiere, die auf die Hormoninjektion eine Reaktion zeigen und auf den Abszissen die Anzahl der Tage nach der Injektion aufgetragen. Als Massstab der Hormonwirkung dient die Anzahl der Tage, an welchen mindestens 50 % der Versuchstiere Brunstveränderungen an der Vagina zeigen. Die 50 So-Grenze ist in Fig. 1 strichliert dargestellt.
Beim Östradioldiphosphat wurden 200 r und bei den übrigen Produkten 20 y, gelöst in der gleichen Menge Propylenglykol, angewendet. Aus den Kurven geht hervor, dass die Wirkung der Östradiolbenzoat-, Äthinylöstradiol- und Östradioldiphosphatinjektionen ungefähr 4, bzw. 4 und 3 Tage, die Wirkung des Polyöstradiolphosphates dagegen ungefähr 26 Tage andauerte. Das Östradiol wird somit kontinuierlich und sehr langsam aus dem Polyöstradiolphosphat freigemacht, wobei eine der natürlichen Hormonproduktion möglichst nahekommende Wirkung erreicht wird.
Entsprechende Versuche mit ganz analogen Resultaten sind mit dem Polyöstronphloretinphosphat ausgeführt worden. Die bei den Tierversuchen erzielten Ergebnisse wurden durch klinische Untersuchungen bestätigt.
Die Kurven I, II und III der Fig. 2 stellen die Wirkung von Injektionen des Testosteroapropionats in Öl und einem erfindungsgemässen Polytestosteronphloretinphosphat, im Vergleich zu Koncollversúchen, dar. Kurve I zeigt das Gewicht der ventralen Prostata zu verschiedenen Zeiten nach der Verabfolgung von 3, 75 mg Testosteronpropionat in Öl an kastrierte Ratten ; Kurve II bezieht sich auf entsprechende Versuche mit 3, 75 mg Polytestosteronphloretinphosphat und Kurve III auf unbehandelte Kontrolltiere. Auf der Or-
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dinate ist in Fig. 2 das Gewicht der ventralen Prostata in Milligramm und auf der Abszisse die Anzahl djr Tage nach der Injektion angegeben. Jeder Punkt der Kurven stellt den Mittelwert aus Messergebnissen bei jeweils fünf Tieren dar.
Aus den Kurven ergibt sich, dass man mit Polytestosteronphloretinphosphat eine sehr einheitliche und stark prolongierte Wirkung erzielt. Obwohl die in Form von Polytestosteronphloretinphosphat zugeführte Testosteronmenge nur halb so gross wie die in Form von Testosteronpropionat zugcführte Testosteronmenge ist, und obgleich das erfindungsgemäss hergestellte Präparat in Form einer wässerigen Lösung, das Propionat hingegen im Öldepot zugeführt wurde, übersteigt die Hormonwirkung des erfindungsgemäss hergestellten Präparates nach 16 Tagen jene des Testosteronpropionats.
In Fig. 3 wird durch Kurve I die Wirkung von einem in wässeriger Lösung verabfolgten Polymethylandrostendiolphosphat auf die Gewichtszunahme des M. levator ani bei kastrierten. Ratten, und durch Kurve II die Wirkung derselben Dosis Testosteronpropionats in Öl dargestellt. Punkt III bezieht sich auf einen Kontrollversuch. Auf der Ordinate ist die Gewichtszunahme des M. levator ani in Milligramm pro 100 g Versuchstiere und auf der Abszisse die Menge des verabfolgten Hormonpräparates in Milligramm angegeben. Jeder Punkt der Kurven stellt Mittelwerte aus Versuchen an fünf Tieren und Bestimmungen, die am 13. Tage nach den Injektionen vorgenommen worden sind, dar. Aus den Versuchen geht hervor, dass das Polymethylandrostendiolphosphat eine starke und ausserdem beträchtlich verlängerte anabolische Wirkung aufweist.
Dass bei den erfindungsgemässen Präparaten die Depotwirkung nicht, wie dies bei den schon bekannten Hormonpräparaten mit prolongierter Wirkung der Fall ist, lediglich an der Injektionsstelle auftritt, wurue durch einen Versuch nachgewiesen, bei dem zur Herstellung der hochmolekularen Phosphorsäureester von Steroidhormonen ein Phosphorylierungsmittel angewendet wurde, welches radioaktiven Phosphor ( ?'") enthielt. Diese Versuche zeigten, dass die hochmolekularen Phosphorsäureverbindungen unter anderem im Blut und in der Leber zurückgehalten werden. In Übereinstimmung mit dem hohen Molekulargewicht und dem Charakter der Stoffe als Polyanionen ist es wahrscheinlich, dass sie im Organismus mit Eiweissstoffeii gekuppelt vorliegen.
Die Erfindung wird nachstehend durch einige Beispiele näher erläutert : Beispiel 1 : 3 göstradiol werden in 75 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf-10 C abgekühlt, wonach unter Umschütteln eine Lösung von l, l ml Phosphoroxychlorid in 10 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Nach der Z'tgabe, die 7 Minuten daueit, hält man die Reaktionsmischung noch 3 Stunden bei-10 C und danach während 15 Stunden bei Zimmertemperatur. Hiedurch entsteht eine klare Lösung, welcher feinzerkleinertes Eis zugesetzt wird. Die so gewonnene Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Nach Trocknung in einem Vakuumexsiccator erhält man 3, 8 g eines weissen Pulvers.
Dasselbe wird in 2 ml Pyridin aufgeschlemmt und dann werden 25 ml 0, 5 n-Natronlauge zugesetzt, wodurch man eine Lösung erhält, die mit Wasser auf 100 ml verdünnt wird. Danach wird durch eine Zellophanmembrane gegen 4 l Wasser während 10 Stunden unter Umrühren dialysieit. Die Dialysierung wird noch zweimal mit neuem Wasser wiederholt. Der dialysierten Lösung werden 2m1n-Salzsäure zugesetzt, wodurch Polyöstradiolphosphat in Form einer weissen, voluminösen Fällung ausgefällt wird.
Diese wird abzentrifugiert und wiederholt mit 0. l n-Salzsäure gewaschen. Dann wird im Vakuumexsiccator getrocknet. Die Ausbeute beträgt 3 g Polyöstradiolphosphat. Die Analyse ergab 0, 65 % Feuchtigkeit, 1, 35 % Pyridin und 9, 3 % Phosphor (auf die trockene Probe berechnet).
B eis pi el 2 : 0. 55 g Methylandrostendiol werden in 15 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf-100 C abgekühlt, wonach unter Umschütteln eine Lösung von 0, 18 ml Phosphoroxychlorid in 5 ml wasser & eiem Pyridin innerhalb von 3 Minuten zugesetzt wird. Die Reaktionsmischung wird wie im Beispiel 1 behandelt und hydrolysiert. Die gewonnene Lösung wird eingedampft und gibt nach Trocknung im Vakuumexsiccator 0, 65 g eines gelben Pulvers. Dieses enthält 60 % von nicht dialysierbarem Poly- methy 1androstendiolphosphat.
Beispiel 3 : 0, 016g Östriol werden in 0, 8 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf - 150 C abgekühlt, wonach 0, 55 ml einer Lösung von 0, 5 ml Phosphoroxychlorid in 59 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt werden. Die Reaktionsmischung bleibt 5 Stunden bei-50 C stehen und wird danach wie nach Beispiel 2 aufgearbeitet. Die Ausbeute beträgt 0, 0125 g Polyöstriolpho.. phat.
Beispiel 4 : 0, 5 g Testosteron werden in 10 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Bei-10 C gibt man diese Lösung tropfenweise unter Umschütteln zu einer Lösung von 0, 19 ml Phosphoroxychlorid in 6 ml wasserfreiem Pyridin. Zusetzdauer : 4 Minuten. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei -10 C stehen, wonach sie unter Umschütteln und Abkühlung tropfenweise innerhalb von 2 Minuten zu einer Lösung von 0, 47 g Phloretin in 5 ml wasserfreiem Pyridin gegeben wird. Die Mischung bleibt bei-100 C während
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1/2 Stunde stehen, wonach unter Umschütteln eine Lösung von 0, 15 ml Phosphoroxychlorid in 5 m1 was- serfreiem Pyridin innerhalb 3 Minuten zugesetzt wird.
Die Mischung bleibt dann 3 Stunden bei -100 C und danach bei Zimmertemperatur noch 15 Stunden stehen. Dann wird zu der Mischung feinzerkleinertes
Eis zugesetzt und nach Abfiltrieren einer kleineren Menge von ungelöstem Stoff wird die Lösung im Va- kuum zur Trockne eingedampft. Der eingedampfte Rest wird in 1C ml2n-Natronlauge gelöst und mit
15 ml2n-Salzsäure, die mit Natriumchlorid gesättigt ist, gefällt. Das Produkt wird abfiltriert, mit ge- sättigter Natriumchloridlösung gewaschen und danach im Vakuumexsiccator getrocknet. Die Ausbeute beträgt l, 8 g ; das Produkt enthält 75 % von nicht-Jialysierbarem Polytestosteronphloretinphosphat.
Bei s pie I 5 : 0. 251 g Testosteron werden in 5ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird unter Umschütteln bei-100 C innerhalb von 2 Minuten zu einer Lösung von 0, 095 ml Phosphoroxychlorid in 3 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei-100 C stehen, wonach sie unter Umschütteln und Abkühlung tropfenweise innerhalb von 2 Minuten einer Lösung von 0, 11 g phloro- glucin in 2, 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Die Mischung bleibt 1 Stunde bei -100 C stehen, wonach ihr unter Umschütteln eine Lösung von 0, 075 ml Phosphoroxychlorid in 2, 5 ml Pyridin zugesetzt wird. Die Mischung bleibt dann 3 Stunden bei-100 C und bei Zimmertemperatur noch 15 Stunden stehen.
Danach wird feinzerkleinertes Eis zugesetzt und die gewonnene Lösung wird im Vakuum bis zur Trockne eingedampft, wonach die Aufarbeitung gemäss Beispiel 4 erfolgt. Die Ausbeute beträgt 0, 33 g ; das Pro- dukt enthält 93 % von nicht-dialysierbarem Polytestosteronphloroglucinphosphat.
Beispiel 6 : 0, 235 g Östron werden in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird unter
Umschütteln Innerhalb von 3 Minuten zu einer Lösung von 0, 095 m ! Phosphoroxychlorid in 3 ml wasser- freiem Pyridin zugesetzt. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei-100 C stehen, wonach sie unter Umschütteln und Abkühlung innerhalb von 2 Minuten tropfenweise in eine Lösung von 0, 11 g phloroglucin in 2, 5 ml wasserfreiem Pyridin gegeben wird. Die Behandlung wird gemäss Beispiel 4 fortgesetzt. Die Ausbeute beträgt 0, 33 g ; das Produkt enthält 91 % von nicht-dialysierbarem Polyöstronphloroglucinphos- phat.
Beispiel 7 : 0. 47 g Östron werden in 10 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Diese Lösung wird unter Umschütteln innerhalb von 4 Minuten zu einer auf -100 C abgekühlten Lösung von 0, 18 ml Phosphoroxychlorid in 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei-10 C stehen, wo- nach sie unter Umschütteln tropfenweise innerhalb von 3 Minuten einer auf-10 C abgekühlten Lösung von 0, 47 g Phloretin in 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei. - 100 C stehen, wonach ihr unter Abkühlung und Umschütteln eine Lösung von 0, 15 ml Phosphoroxychlorid in 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Die Mischung bleibt 11/2 Stunden bei -100 C stehen, wonach feinzerkleinertes Eis zugesetzt wird.
Ein wenig Bodensatz, der nicht in Auflösung geht, wird abfiltriert und das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wonach es in derselben Weise wie im Beispiel 4 aufgearbeitet wird. Die Ausbeute beträgt 1,05 g: das Produkt enthält 95 % von nichtdialysierbarem Polyöstronphloretinphosphat.
Beispiel 8 : 0, 235g Östron werden in 5ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird unter Umschütteln innerhalb von 2 Minuten zu einer auf-100 Cabgekühlten Lösung von 0, 095 ml Phosphoroxychlorid in 3 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei -100 C stehen, wo- nach sie - wieder innerhalb von 2 Minuten - unter Umschütteln tropfenweise zu einer auf-100 C abgekühlten Lösung von 0, 264g Quercetin in 2, 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Die Mischung bleibt eine Stonde beize stehen, wonach sie unter weiterer Abkühlung und Umschüttelung zu einer Lösung von 0, 075 ml Phosphoroxychlorid in 2, 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zugabedauer : 2 Minuten. Die Mischung bleibt 3 Stunden bei -100 C stehen, wonach feinzerkleinertes Eis zugesetzt wird.
Die hiedurch gewonnene Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und gemäss Beispiel 4 aufgearbeitet. Die Ausbeute beträgt 0, 65 g und das Produkt enthält 95 ale von nicht-dialysierbarem Polyöstronqtiercetin- phosphat.
Beispiel 9 : 0, 235 g Östron werden in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Diese Lösung wird inner- halb von2 Minuten unter Umschütteln zu einer auf -10 C abgekülten Lösung von 0, 095 ml Phosphoroxychlorid in 3 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei-100 C stehen, wonach sie unter Umschütteln tropfenweise innerhalb von2 Minuten zu einer auf-10 C abgekühlten Lösung von 0, 37 g Phloridzin (wasserfrei) in 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Die Mischung bleibt 1 1/2 Stunden bei -100 C stehen, wonach unter fortgesetzter Abkühlung und Umschüttelung eine Lösung von 0, 12 ml Phosphoroxychlorid in 4 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusetzdauer : 2 Minuten. Die Mischung bleibt 2 Stunden bei-100 C stehen, wonach feinzerkleinertes Eis zugesetzt wird.
Die Aufarbeitung erfolgt dann wie im Beispiel 4. Die Ausbeute beträgt 1, 1 g ; das Produkt enthält 94 % nicht-
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dialysierbares Polyöstronphloridzinphosphat.
Beispiel 10 : 0, 235 g Östron werden in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird unter Umschütteln zu einer auf-100 C abgekühlten Lösung von 0, 095 ml Phosphoroxychlorid in 3 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Zusetzdauer : 2 Minuten. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei-100 C stehen, wonach sie unter Umschütteln zu einer auf-100 C abgekühlten Lösung von 0, 53 g Rutin (wasserfrei) in 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusetzdauer : 2 Minuten. Die Mischung bleibt bei -100 C während 1 1/2 Stunden stehen, wonach ihr unter fortgesetzter Abkühlung und Umschüttelung eine Lösung von 0, 19 ml Phosphoroxychlorid in 6 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusetzdauer : 3 Minuten.
Die Mischung bleibt während 15 Minuten bei-100 C stehen, wonach feinzerkleinertes Eis zugesetzt wird. Die Aufarbeitung erfolgt wie imBeispiel4. Die Ausbeute beträgt 0, 6 g ; das Produkt enthält 90 % nicht-dialysierbares Polyöstronrutinphosphat.
Beispiel 11 : 0, 25 g Östradiol werden in 10ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Unter Abkühlung und
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15 Stunden bei Zimmertemperatur. Dann wird feinzerkleinertes Eis zugesetzt, wonach die gewonnene Lösung im Vakuum bis zur Trockne eingedampft wird. Der nach dem Eindampfen zurückbleibende Rest wird mit 2 n-Salzsäure verrieben, wonach filtriert und mit Wasser gewaschen wild, und schliesslich wird im Vakuumexsiccator getrocknet. Die Ausbeute beträgt 0. 3 g : das Produkt enthält 95 % nicht-dialysierbares Polyöstradiolthiophosphat.
Beispiel 12 : 0, 272 g Östradiol und 0, 11 g Resorcin werden in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst.
Unter Umschütteln wird bei-100 C eine Lösung von 0, 19 ml Phosphoroxychlorid in 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Zusetzdauer : 3 Minuten. Die Mischung bleibt 3 Stunden bei-100 C und danach weitere 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird feinzerkleinertes Eis zugesetzt und nach 24 Stunden Stehenlassen hat sich eine klare Lösung gebildet, die im Vakuum bis zur Trockne eingedampft wird. Das Produkt wird in 10 ml n-Natronlauge gelöst und mit 5 ml 5n-Salzsäure gefällt. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und mit einigen ml Wasser gewaschen, wonach sie im Vakuumexsiccator getrocknet wird,
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erwärmt. Nach Verlauf von 17 Stunden ist eine amorphe Masse gebildet. Die Mischung wird abgekühlt und 50 ml Wasser werden zugesetzt.
Man erhält eine Fällung, welche abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuumexsiccator getrocknet wird. Die Ausbeute ist 0, 71 g und das Produkt enthält 75 % nichtdialysierbares Polyöstradiolphosphat. Die Analyse ergibt 3, 1 % Feuchtigkeit und 8, 2 % Phosphor (in der getrockneten Probe).
Beispiel 14 : 0, 3 gTestosteron wird in 10 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Bei 20 C wird auf ein- mal 0, 11 ml Phosphoroxychlorid zugesetzt. Die Mischung bleibt 48 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, wonach sie auf dem Dampfbad während 1 Stunde erwärmt wird. Dann wird sie abgekühlt und feinzerkleinertes Eis zugesetzt. Die gebildete Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der nach dem Eindampfen verbleibende Rückstand wird mit verdünnter Salzsäure bearbeitet. Man erhält ein rötliches Pulver, das bei Dialyse einen Gehalt von 90 % nicht-dialysierbarem Polytestosteronphosphat zeigt.
Beispiel 15 : 0, 55 gÖStradiol wird in 5 ml Dioxan gelöst. Nach Zusatz von 0, 18 ml Phosphortrichlorid wird die Lösung während 25 Stunden auf dem Dampfbad unter Rückflusskühlung erwärmt. Nach Abkühlung wird feinzerkleinertes Eis zugesetzt, wodurch ein weisser Bodensatz sich bildet. Dieser wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Nach Trocknung im Vakuumexsiccator erhält man 0, 66 g eines wei- ssen Pulvers. Das Produkt enthält zirka 50 % nicht-dialysierbares Polyöstradiolphosphit. Der Phosphorgehalt beträgt 9, 3 %.