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Verfahren zur Herstellung von die adrenocortlcotrope Wirkung verzögernden und enzymhemmenden Verbindungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Substanzen mit starker, besonders gegen- über Hyaluronidase ausgeprägter, enzymhemmender Wirkung. Diese Substanzen bewirken u. a. eine Verlängerung und Erhöhung der Hormonwirkung der adrenocorticotropen Hormone, die weiterhin als "ACTH" bezeichnet werden, und deren ACTH-aktiven Peptide.
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass man unter entsprechenden Bedingungen durch Phosphorylierung von Di- und Polyoxyflavonen oder-flavanonen, Di-und Polyoxychalkonen oder deren den Dioxyoder Polyoxyflavanonen entsprechenden Dihydroderivaten mehr oder weniger hochmolekulare Verbindungen mit enzymhemmender Wirkung für bestimmte Enzyme, besonders Hyaluronidase, erhält, welche durch eine Kondensationspolymerisation gebildet werden. Wenn sie in Wasser, worin sie bei neutraler oder alkalischer Reaktion löslich sind, dissoziiert sind, bilden sie stark negativ geladene Ionen.
Andere Untersuchungen haben zur Herstellung von enzymhemmenden Substanzen geführt, die Polymerisationsprodukte von Phosphorsäure oder Thiophosphorsäure mit einer oder mehreren aromatischen Hydroxylverbindungen sind.
Die vorliegende Erfindung hat die Herstellung neuer Kondensationspolymerisate mit den oben erwähnten enzymhemmenden Wirkungen zum Ziel, die aus einfacheren Ausgangsverbindungen gewonnen werden und gleichzeitig die Eigenschaft haben, Verbindungen mit ACTH und seinen Peptiden einzugehen ; dabei wird eine verzögernde ACTH-Wirkung erreicht, die derjenigen der vorbekannten Verbindungen, z. B. der Verbindung von ACTH mit Protaminen, überlegen ist.
Das Verfahren gemäss der Erfindung besteht darin, dass zweikernige aromatische Verbindungen, welche zwei, durch eine Kohlenstoffbrücke mit nicht mehr als drei Kohlenstoffatomen verbundene Benzolkerne enthalten und Hydroxylgruppen in p-Stellung zu dieser Kohlenstoffbrücke aufweisen, mit einem Phosphorylierungsmittel so lange umgesetzt werden, bis das Molekulargewicht mehr als 2000 beträgt, aber nicht so hoch ist, dass die Verbindung in wässerigem Alkali unlöslich wird, worauf das Reaktionsprodukt hydrolysiert und gegebenenfalls in Salze übergeführt wird.
Die beim erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Verbindungen bestehen aus Phosphorsäureresten, die untereinander durch organische Reste unter Bildung von Molekülen verbunden sind, in denen die Phosphorsäurereste mittels P-O-Bindungen an 1-3 zweikernige aromatische Reste geknüpft sind. Diese bestehen aus zwei Benzolkernen, die durch eine Kohlenstoffbrücke mit nicht mehr als drei Kohlenstoffatomen miteinander verbunden sind, wobei die zu den P-O-Bindungen gehörenden Sauerstoffatome in den Benzolkernen in p-Stellung zur Kohlenstoffbrücke stehen. Die Anzahl der Hydroxylgruppen der Phosphorsäure, welche an der P-O-Bindung beteiligt ist, ist dabei geringer als die Gesamtzahl der Hydroxylgruppen der Phosphorsäurereste.
Die Mannigfaltigkeit der chemischen Struktur der neuen Substanzen wird der Einfachheit halber an dem durch Phosphorylierung der Ausgangsverbindungen Hydrochinon oder Resorcin erhaltenen Produkt erläutert, obgleich es sich dabei nicht um ein Verfahrensprodukt gemäss der Erfindung handelt. Dieses Produkt besteht zur Hauptsache aus Ketten der folgenden Art :
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In einigen Fällen kann in diesen Ketten jene Valenz der Phosphoratome, die in der angeführten Formel durch freie, in Lösung dissoziierte Hydroxylgruppen abgesättigt ist, mit einem weiteren Hydrochinonoder Resorcinmolekül verbunden sein, wodurch die Ketten verzweigt werden.
Die bei dem erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt verwendeten Ausgangsverbindungen haben nachstehende allgemeine Formel :
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worin X eine Kohlenstoffbrücke mit 1-3 Kohlenstoffatomen ist und Rl und R jeweils Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeuten.
Die Wasserstoffatome am Kohlenstoffatom oder-atomen in der Kohlenstoffbrücke können durch eine oder mehrere Alkyl-, Alkenyl-oder Alkylidengruppen substituiert sein, wobei die Anzahl der Kohlenstoffatome in jedem Substituenten 1, 2 oder 3 betragen kann.
Beispiele geeigneter organischer Ausgangsverbindungen für die gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellten Substanzen sind:4,4'-Dioxy-3-methyl-diphenylemthan,Bis-(p-oxyphenyl)-isopropyl-methan, Bis- (p-oxyphenyl)-äthyliden-methan, Bis- (4-oxy-3-methylphenyl)-äthyl-n-propyl-methan, 4, 4' -Di -
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-Dioxy-ct-methyl- B-n-propylstilben,4, 4'-Dioxy-a B=diäthyl-γ-methyl-diphenylpropan.
Die Umsetzung des Phosphorylierungsmittels, wie Phosphoroxychlorid, mit einer oder mehreren der Ausgangsverbindungen, wird vorzugsweise in Gegenwart eines tertiären Amins als Chlorwasserstoff-bindendes Mittel vorgenommen. Bei der anschliessenden Hydrolyse der Kondensationsprodukte werden Gruppen, z. B. Chloratome, abgespalten, die in dem phosphorylierenden Mittel an die Phosphorsäurereste ge- ) unden sind und während des Kondensationsprozesses nicht durch die organischen Reste ersetzt wurden.
Diese Gruppen werden durch Hydroxylgruppen ersetzt, wodurch sich freie Phosphorsäuregruppen bilden, so lass schliesslich ein oder zwei Valenzen des Phosphors über Sauerstoff mit einer organischen Gruppe vermnden sind, während die restlichen ein oder zwei Valenzen durch Hydroxylgruppen abgesättigt sind. Die Produkte werden dadurch stark sauer und zur Salzbildung, z. B. zur Bildung löslicher Alkalisalze, befä- dgt.
Während der Phosphorylierung werden die Ausgangsverbindungen zweckmässig in einem Lösungsmitel gelöst, welches nicht mit dem Phosphorylierungsmittel reagiert. Eine vorteilhafte Ausführungsform ür dieses Verfahren, bei der man insbesondere mit Sicherheit Produkte mit beträchtlichen enzymhemnenden Eigenschaften erhält, besteht darin, dass man das wasserfreie Medium während der Phosphorylie- ung kühlt und das Phosphorylierungsmittel oder das Kondensationsmittel langsam in Abständen zusetzt, worauf man die Reaktionsmischung vor der Hydrolyse für einige Zeit stehen lässt, bis schliesslich der getünschte Kondensationsgrad erreicht ist, und dann die Kondensation unterbricht.
Um einen ausreichenden Kondensationsgrad zu erreichen, ist es angebracht, nicht zu hohe Mengen an Phosphorylierungsmittel zu 'erwenden ; bei Phosphoroxychlorid werden vorzugsweise 0, 7-1, 1 Mol des phosphorylierenden Mittels pro iol der Ausgangsverbindung verwendet. Das Phosphorylierungsmittel soll daher einer Lösung der Aus- ; angsverbindung zugesetzt werden. Im umgekehrten Falle wäre das Phosphorylierungsmittel bei Beginn es Verfahrens in zu hohem Überschuss vorhanden.
Beispiele für als Lösungsmittel geeignete Ketone sind : Methyläthylketon, Methyl-n-propylketon, ) iäthylketon, Hexanon-2, Pinakolin und Di-n-propylketon, während als Beispiele für Chlor enthaltende
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Lösungsmittel Chloroform, Äthylenchlorid und Äthylidenchlorid zu nennen sind.
Die Lösungsmittel können allein oder als Mischungen verwendet werden. Das Lösungsmittel kann auch aus dem beim Verfahren verwendeten Kondensationsmittel bestehen, z. B. aus einem tertiären Amin, wie
Pyridin, Picolin, Lutidin, Chinolin und Dimethylanilin. Solche Kondensationsmittel können auch in Mi- schung mit indifferenten Lösungsmitteln verwendet werden.
Da sich während der Phosphorylierung Wärme entwickelt, ist es meist vorteilhaft, zur Regelung des
Prozesses stark zu kühlen.
Im allgemeinen wird die Reaktionsmischung vor der Hydrolyse für kürzere oder längere Zeit stehen gelassen, damit die Kondensation den für das Endprodukt erwünschten Grad erreicht. Es kann zweckmässig sein, die Mischung bei Temperaturen zwischen etwa 15 und 200 C 1/2 Stunde bis 24 Stunden stehen zu lassen. Dieser Zeitraum kann durch Erhöhung der Temperatur abgekürzt werden ; im allgemeinen kann die
Temperatur ohne Nachteile während des Stehens auf ungefähr 500 C erhöht werden.
Die Reaktion wird dann durch Verdünnung des Reaktionsgemisches mit Eiswasser beendet, wodurch auch jeder Überschuss des phosphorylierenden Mittels beseitigt wird.
Bei einem Molgewicht von ungefähr 2000-was bedeutet, dass etwa 6-8 organische Reste in der oben beschriebenen Weise miteinander verbunden sind-ist die enzymhemmende Wirkung der neuen Substan- zen stark im Vergleich zu derjenigen der entsprechenden monomeren Mono- und Diphosphate. Durch Er- höhung des Molgewichtes auf Werte zwischen 10000 und 30000, z. B. durch Erhöhung der Reaktionszeit für die Phosphorylierung der Ausgangsverbindung, erhält man Produkte, die durch eine Cellophanmembrane nicht mehr dialysieren und eine sehr viel stärkere enzymhemmende Wirkung haben. Diese hochmoleku- laren Substanzen sind als Verfahrensprodukte gemäss der Erfindung besonders erwünscht. Durch weitere Er- höhung der Reaktionszeit erhält man Produkte mit noch grösserem Molgewicht, wobei jedoch die enzym- hemmende Wirkung nicht weiter ansteigt.
Wenn die Ausgangsverbindungen östrogene oder cytostatische Wirkungen haben, zeigen die daraus hergestellten neuen Substanzen stark verzögernde Wirkungen. Eine östrogene Wirkung kann auch bei
ACTH-aktiven Präparaten vorteilhaft sein.
Die erzielbare verzögerte ACTH-Wirkung wird an Hand der folgenden Gegenüberstellung erläutert :
Bei intramuskulärer Anwendung einer entsprechenden Dosis, z. B. 20 i. E. gewöhnlichen ACTHs, stellt man fest, dass die Anzahl der eosinophilen Zellen innerhalb 2-4 Stunden auf ein Minimum, z. B. bis auf 360b des Wertes vor Anwendung des ACTHs, absinkt. Bereits 8 Stunden nach der Injektion ist aber die Anzahl der eosinophilen Zellen im allgemeinen wieder bis auf 50% des ursprünglichen Wertes ange- stiegen und in den folgenden zwei Stunden nimmt die Anzahl der eosinophilen Zellen weiterhin beträcht- lich zu. Wird jedoch ACTH in Verbindung mit einer der neuen erfindungsgemäss hergestellten Substanzen in einer 20 i. E.
ACTH entsprechenden Menge verabfolgt, so fällt der Anteil an eosinophilen Zellen im
Blut während der ersten 4 Stunden genau wie zuvor ab, sinkt dann aber weiter, bis er nach 8-14 Stunden einen Wert erreicht hat, der in den meisten Fällen unter einem 10% des Normalwertes betragenden Wert liegt. Selbst 24 Stunden nach der Verabfolgung ist der eosinophile Anteil der Zellen im allgemeinen noch nicht bis auf 50% des ursprünglichen Wertes angestiegen.
Durch Anwendung einer der erfindungsgemässen Substanzen ist es demgemäss möglich, klinische Behandlungen mit nur einer Injektion während je 24 - 48 Stunden erfolgreich durchzuführen. Nach der An- zahl der eosinophilen Zellen zu urteilen, ist die ACTH-Wirkung durch die neuen Substanzen nicht nur verzögert, sondern auch erhöht worden.
Die enzymhemmenden Eigenschaften der erfindungsgemässen Substanzen werden nachstehend durch die Zahl gekennzeichnet, die angibt, zu wieviel Prozent die fragliche Substanz in einer bestimmten Konzentration das Hyaluronsäure-Hyaluronidase-Enzym-System hemmt. Als Mass für die enzymhemmenden Eigenschaften wird in den folgenden Beispielen die"prozentuelle Hemmung"verwendet, berechnet nach der Formel
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wobei Hl bei einer vorgegebenen Hyaluronidaselösung diejenige Reaktionszeit angibt, die zur Herabsetzung der Viskosität einer als Substrat geeigneten vorgegebenen Hyaluronsäurelösung auf die Hälfte notwendig ist, während H2 diejenige Reaktionszeit darstellt, die bei Einwirkung von Hyaluronidase zur Herabsetzung der Viskosität einer gleichen,
aber mit einer Substanz mit hyaluronidasehemmender Wirkung versetzten Hyaluronsäurelösung auf die Hälfte erforderlich ist.
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stossenem Eis hydrolysiert und 2 Stunden lang auf e C erhitzt, wodurch man eine klare Lösung erhält.
Diese wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in 20 cm* In-Natronlauge gelöst und die erhaltene Lösung unter Rühren zu 25 cm3 5n-Salzsäure zugesetzt, wodurch man einen weissen Niederschlag erhält.
Ausbeute in getrocknetem Zustand : 2, 9g. Hemmung (4y/4 cm*) : 50%.
Beispiel 6: 1.33 g 4,4'-Dioxy-γ-#-diphenyl-ss-#-hexadien werden in 20 cms wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf-140 C gekühlt, worauf eine Lösung von 0. 31 cms Phosphoroxychlorid in 5 cm* wasserfreiem Pyridin tropfenweise unter Schütteln während eines Zeitraums von 3 min zugesetzt wird. Während des Zusetzens findet eine unwesentliche Erwärmung statt. Die Mischung wird für weitere drei Stunden im Kältebad und dann für 20 Stunden bei 0 C belassen. Nach dieser Zeit ist die Mischung gelartig geworden. Sie wird dann mit feingestossenem Eis hydrolysiert, wodurch man eine klare Lösung erhält.
Dieser Lösung werden 75 cm* 5n-Salzsäure zugesetzt, wodurch man nach Trocknung 1, 6 g eines hell beigefarbigen (cremefarbigen) Pulvers erhält. Dieses Produkt ist in einer Lösung von Natriumbikarbonat schwer löslich, aber gut löslich in Natronlauge. Hemmung (20y/4 cm : 95%.
Beispiel 7: 2.94 g 4,4'-Dioxy-3,3'-dimethyl-γ.#-diphenyl-ss,#-hexadien werden in 60 cm3 wasserfreiem Pyridin gelöst. Bei-15 C wird eine Lösung von 1 cm3 Phosphoroxychlorid in 10 cm8 was- serfreiem Pyridin während eines Zeitraumes von 5 min tropfenweise unter Schütteln zugesetzt.
Die Mischung wird für eine Stunde im Kältebad und dann für 24 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Dann wird sie mit feingestossenem Eis hydrolysiert, wodurch man eine klare Lösung erhält. Diese wird im Vakuum auf 1/4 ihres Volumens eingedampft. Der viskose Rückstand wird in ungefähr 40 cms In-Natronlauge gelöst (auf PH = 7). Die Lösung wird unter fliessendem Wasser 5 Tage lang dialysiert und dann unter Rühren zu 20 cms 5n-Salzsäure zugesetzt, wodurch man einen weissen Niederschlag erhält.
Dieser wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumexsiccator über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute : 3, 5 g. Hemmung (3y/4 cml) : 45%.
Beispiel 8: 13,3 g 4,4'-Dioxy-α,γ-diäthylstiiben werden in 300 cm* wasserfreiem Pyridin ge- löst. Bei -150 C wird eine Lösung von 5, 0 cms Phosphoroxychlorid in 35 cm* wasserfreiem Pyridin während eines Zeitraumes von 15 min tropfenweise unter Schütteln zugesetzt. Die Mischung wird für eine Stunde im Kältebad und dann für 20 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Sie wird dann mit 200 g feingestossenem Eis hydrolysiert, wodurch man eine klare Lösung erhält. Diese wird im Vakuum auf ein Viertel ihres Volumens eingedampft. Der viskose Rückstand wird in zirka 200 cm3 In-Natronlauge (zu PH = 7) gelöst. Die Lösung wird 5 Tage lang in fliessendem Wasser dialysiert und wird dan. unter Rühren zu 60 cm* 5n-Salzsäure zugefügt, wodurch man einen weissen Niederschlag erhält.
Dieser wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumexsiccator über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute : 16, 1 g eines weissen Pulvers, das gut in Natronlauge löslich ist. Hemmung (4y/4 cm*) : 51%.
Beispiel 9: 2,68 g 4,4'-Dioxy-α-methyl-ss-n-propylstilben werden in 30 cm'wasserfreiem Pyridin gelöst. Bei-10 C wird eine Lösung von 0, 92 cm3 Phosphoroxychlorid in 5 cm* Pyridin während eines Zeitraums von 2 min tropfenweise unter Schütteln zugesetzt. Die Mischung wird für 20 min bei Zimmertemperatur belassen, wonach sie gelartig geworden ist. Dann wird sie mit gestossenem Eis hydrolysiert und für 3 Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen, worauf man eine klare Lösung erhält. Dieser Lösung werden 150 cm3 5n-Salzsäure zugesetzt. Ausbeute nach Trocknung:3,1 g eines weissen Pulvers.
Hemmung (5y /4 cm3): 49%.
Beispiel 10 : 2, 54 g 4, 4'-Dioxy-a-isopropylstilben werden in 60 cm3 wasserfreiem Pyridin gelöst. Bei-15 C wird eine Lösung von 1, 2 cms Phosphoroxychlorid in 10 cm3 wasserfreiem Pyridin während eines Zeitraums von 5 min tropfenweise unter Schütteln zugesetzt. Nach einer Stunde im Kältebad und 20 Stunden bei Zimmertemperatur wird die klare Lösung mit gestossenem Eis hydrolysiert und im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in 20 cm'In-Natronlauge gelöst und die erhaltene Lösung wird unter Rühren zu 25 cm* 5n-Salzsäure zugesetzt, wodurch man einen weissen Niederschlag erhält. Ausbeute nach Trocknung : 3,0 g. Hemmung (4y /4 cm93: 60%.
Beispiel 11; 2,80 g 4,4'-Dioxy-α-äthyl-ss-propenylstilben werden in 60 cm3 wasserfreiem Pyridin gelöst. Bei-150 C wird eine Lösung von 0,83 cm3 Phosphoroxychlorid in 5 cm3 wasserfreiem Pyridin während eines Zeitraums von 3min tropfenweise unter Schütteln zugesetzt. Nach einer Stunde im Kältebad und 5 Stunden bei Zimmertemperatur wird die klare Lösung mit gestossenem Eis hydrolysiert und im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in 20 cm* einer In-Natronlauge gelöst und der erhaltenen Lösung werden unter Rühren 25 cm* 5n-Salzsäure zugesetzt, wodurch man einen weissen Niederschlag erhält.
Ausbeute nach Trocknung : 3, 4 g. Hemmung (5y/4 cm*) : 45%.
Beispiel l 2 : 2,68 g 4, 4'-Dioxy- < x, ss-2-2'-tetramethylstilben werden in 30 cm3 wasserfreiem
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din während eines Zeitraums von 3 min tropfenweise unter Schütteln zugesetzt. Die Mischung wird für 20 Stunden bei Zimmertemperatur belassen, wonach sie gelartig geworden ist. Sie wird dann mit gestossenem Eis hydrolysiert und zwei Stunden lang auf 850 C erhitzt, wodurch man eine klare Lösung erhält. Diese wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in 20 cm3 In-Natronlauge gelöst und die erhaltene Lö-
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serfreiem Pyridin gelöst. Bei-150 C wird eine Lösung von Phosphoroxychlorid in 10 cms wasserfreiem Pyridin während eines Zeitraums von 10 min zugesetzt.
Die Reaktionsmischung wird 45 min im Kältebad und anschliessend 70 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Sie wird dann über 35 g feingestossenes Eis gegossen, wodurch man eine klare Lösung erhält. Nach Zusatz von 170 cm* 0, 2n-Natronlauge wird die Lösung mit 3mal je 20 1 10/piger Natriumchloridlösung während eines Zeitraums von 10 Tagen dialysiert.
Die dialysierte Lösung wird dann in 100 ems 5n-Salzsäure eingegossen, wodurch sich ein weisser Niederschlag bildet. Dieser wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Die Ausbeute beträgt 3, 1 g eines weissen Pulvers, das in Natronlauge gut löslich ist. Hemmung (8y24 cm3): 50%.
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14 : 1, 5g4, 4'-Dioxy-cc, ss-diäthyl-7-methyldiphenylpropanwerdenin25cmswasser-freiem Pyridin während eines Zeitraums von 8 min zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird 45 min im Kältebad und dann 70 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Sie wird dann auf 20 g feingesto- ssenes Eis gegossen, wodurch man eine klare Lösung erhält.
Nach Zusatz von 80cm30, 2n-Natronlauge wird eine Dialyse wie in Beispiel 13 durchgeführt. Die dialysierte Lösung wird in 50 cm3 5n-Salzsäure eingegossen, wodurch sich ein weisserNiederschlagbiIdet, der abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet wird. Die Ausbeute beträgt 1, 5 g eines weissen, in Natronlauge gut löslichen Pulvers. Hemmung (lOy/4 cm*) : 50%.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von die adrenocorticotrope Wirkung verzögernden und enzymhemmenden Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass zweikernige aromatische Verbindungen-, welche zwei, durch eine Kohlenstoffbrücke mit nicht mehr als drei Kohlenstoffatomen verbundene Benzolkerne enthalten und Hydroxylgruppen in p-Stellung zu dieser Kohlenstoffbrücke aufweisen, mit einem Phosphorylierungsmittel, zweckmässig in einer Menge von 0, 7 bis 1, 1 Mol pro Mol der zu phosphorylierenden Verbindung, vorteilhaft bei Temperaturen unter 00, so lange umgesetzt werden, bis das Molekulargewicht mehr als 2000 beträgt, aber nicht so hoch ist, dass die Verbindung in wässerigem Alkali unlöslich wird, worauf das Reaktionsprodukt hydrolysiert und gegebenenfalls in Salze übergeführt wird.
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