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Verfahren zur Herstellung enzymhemmender Stoffe durch Phosphorylierung
von Glykosiden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Stoffen
mit enzymhemmenden Eigenschaften, besonders gegenüber Hyaluronidase.
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Frühere Untersuchungen der Anmelderin haben erwiesen, daß man durch
Phosphorylierung von Di-und Polyoxyflavonen oder -flavanonen oder den genannten
Di- oder Polyoxyflavanonen entsprechenden Di- oder Polyoxychalkonen oder Dihydroderivaten
mehr oder weniger hochmolekulare Verbindungen erhalten kann, die als Ergebnis einer
Kondensationspolymerisation entstehen. Die so erhaltenen Verbindungen sind stark
negativ geladen und sind jedenfalls bei neutraler oder alkalischer Reaktion im Wasser
löslich. Sie besitzen eine antienzymatische Wirkung gegenüber gewissen Enzymen,
besonders Hyaluronidase. Bei einigen der genannten Ausgangsmaterialien, z. B. Phloretin,
läßt sich eine solche Wirkung auch dann feststellen, wenn sie nicht phosphoryliert
sind, aber sie ist bei den genannten Polymerisationsprodukten mit Phosphorsäure
im Vergleich zu denen des entsprechenden Ausgangsmaterials stark erhöht.
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J. M. Beiler und G. J. Martin (Journal of Biological Chemistry, 174,
31, 1948) haben gefunden, daß die Einführung von Phosphorsäure- und Schwefelsäuregruppen
in einigen Fällen die Wirkung der enzymhemmenden Stoffe erhöhen kann. So kann man
z. B. bei einem phosphorylierten Hesperidin,
das eine Mischung von
Penta- und Tetraphosphaten darstellt, eine Erhöhung der hemmenden Wirkung dieses
Produktes auf Hyaluronidase feststellen, aber die erzielte Wirkung ist kleiner als
diejenige, die durch schon bekannte Stoffe, wie z. B. Suramin, erzielt werden kann.
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Es hat sich nunmehr gezeigt, daß eine stärkere enzymhemmende Wirkung
mit solchen Stoffen verbunden ist, die aus höher polymeren Phosphorsäure-bzw. Thiophosphorsäureverbindungen
bestehen, in denen die Phosphorsäurereste miteinander durch organische Gruppen von
Stoffen verbunden sind, welche Glykoside aus Di- oder Polyoxyverbindungen der Flavon-
oder Flavanonreihe sind, wie z. B. Phloridzin, p-Phloridzin, Naringin, Hesperidin
und Rutin, und worin die polymeren Verbindungen ein Molekulargemricht von mindestens
2ooo haben, wenn ihre Löslichkeit im Wasser oder Alkali erhalten bleibt.
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Erfindungsgemäß werden zur Herstellung solcher verbesserter enzymhemmender
Kondensationsprodukte Glykoside von Di- oder Polyoxyverbindungen der Flavon- oder
Flavanonreihe bzw. Glykoside der entsprechenden Chalkon- und Dihydrochalkonderivate
mit Phosphorylierungs- oder Thiophosphorylierungsmitteln so lange umgesetzt, bis
die polymeren Kondensationsprodukte nach der darauffolgenden Hydrolyse ein Molekulargewicht
von mindestens 2ooo aufweisen, wobei die Hydrolyse, falls die Produkte nicht mehr
wasser- oder alkalilöslich sind, so weit getrieben wird, daß eine Depolymerisation
bis zur Löslichkeit der Produkte erreicht wird.
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Die Ausgangsstoffe, die dabei in Betracht kommen und aus denen polymere
Phosphorsäure- bzw. Thiophosphorsäureverbindungen gebildet werden, sind in erster
Reihe Glykoside aus Stoffen mit folgender Formel
worin R Wasserstoff oder eine oder mehrere Oxy-oder Alkoxygruppen bezeichnet. Mindestens
eine der Oxygruppen beteiligt sich an der Glykosidbildung, und darüber hinaus enthält
die Mehrzahl dieser Glykoside mindestens zwei Oxygruppen, welche kerngebunden sind.
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Flavanone können bekanntlich auch in Form von Chalkonen vorliegen,
die sich leicht wieder in Flavanone überführen lassen. Dasselbe gilt auch von ihren
Glykosiden. Für die vorliegende Erfindung ist es belanglos, ob die Stoffe als Flavanone
oder als Chalkone vorliegen, was z. B. daraus hervorgeht, daß hydrierte Chalkonglykoside
sich sehr gut für die erfindungsgemäße Umsetzung eignen. So läßt sich Naringin durch
Hydrieren in alkalischer Lösung in das entsprechende Phloretinglykosid überführen,
das sich nur in bezug auf den Zuckerteil und dessen Stellung von dem in der Natur
vorkommenden Phloridzin unterscheidet.
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Ausgangsstoffe, die erfindungsgemäß verwendbar sind, umfassen daher
auch Glykoside von solchen Chalkonderivaten, die sich leicht in Flavanone überführen
lassen, und deren Dihydroderivate. Die genannten Glykoside aus Di- oder Polyoxyverbindungen
der Flavone, Flavanone und Chalkonderivate und deren Dihydroderivate sind in dem
Vorhergehenden und dem Folgenden unter der Bezeichnung Glykoside aus Di- oder Polyoxyverbindungen
der Flavon- oder Flavanonreihe zusammengefaßt.
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Zur Erläuterung des strukturellen Aufbaues solcher Produkte sei das
Produkt herangezogen, das durch Phosphorylieren eines derartigen Glykosids, in dessen
aromatischen Kernen sich zwei phosphorylierbare Hydroxylgruppen befinden, erhalten
werden kann. Dieses Produkt besteht vor allem aus Ketten vom Typ
worin Z gleiche oder verschiedene Glykoside und Y entweder Sauerstoff oder Schwefel
bezeichnet.
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In diesen Ketten kann aber die dritte Valenz der Phosphoratome, die
in der Formeldarstellung als an freie Hydroxylgruppen gebunden gezeigt sind, welche,
wenn der Stoff sich in Lösung befindet, dissoziert sind, bei einigen derselben an
Z-Gruppen gekoppelt sein, wodurch die Ketten verzweigt werden.
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In die Glykoside können andere Substituenten eingeführt sein als diejenigen,
die, wie erwähnt, zur Bildung der polymeren Struktur der Phosphorsäuregruppen dienen.
So ist es von besonderer Bedeutung, daß die Verbindungen zugleich saure Phosphat-
oder Sulfatgruppen besonders in dem Zuckerteil enthalten können, wodurch die Löslichkeit
im Wasser erhöht wird und wodurch also lösliche Produkte mit höherem Polymerisationsgrad
erzielt werden können, als wenn diese Gruppen nicht vorhanden wären. Statt in die
Hydroxylgruppen einzugehen, können solche von den der Bildung der polymeren Struktur
dienenden Phosphorsäuregruppen abweichenden Substituenten auch an die Kohlenstoffatome
des Kohlenstoffgerippes, z. B. in die aromatischen Kerne, eingehen. Als Beispiel
des Aglykons der Grundsubstanz seien genannt Apigenin und Diosmetin, welche beide
Polyoxyflavone sind, und Kaempferol, Fisetin, Ouercetin und Myricetin, welche alle
Polyoxyflavonole sind, an welche einige Äther sich gesellen, wie Rhamnetin
und
Rhamnasin. Ferner seien als Beispiele der Flavanone zu nennen Naringenin und Hesperetin.
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Die Glykoside können mit Glukose, Rutinose, Arabinose, Galaktose und
Rhamnose sowie mit anderen glykosidbildenden Zuckerarten und deren Derivaten, z.
B. Desoxyhexose, gebildet sein.
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In den Fällen, wo es von besonderer Bedeutung ist, stabile Produkte
zu erzielen, hat es sich zweckmäßig erwiesen, gewisse Glykoside zu vermeiden, die
von Di- oder Polyoxyflavanonen abgeleitet sind, z. B. Hesperidin, weil dieselben
Produkte von geringerer Stabilität ergeben.
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Von wesentlicher Bedeutung für eine hohe Antienzymwirkung ist, daß
der Polymerisationsgrad genügend hoch ist. So haben dialysierbare Verbindungen nur
eine ganz unbedeutende Antienzymwirkung. Die untere Grenze des Molekülgewichtes
ist demzufolge etwa 20oo. Die obere Grenze wird dadurch bestimmt, daß die Produkte
in neutralen oder alkalischen wäßrigen Lösungen noch löslich sein sollen.
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Die Herstellung der Produkte kann in der Weise erfolgen, daß ein Phosphorylierungsmittel,
wie Phosphoroxychlorid, Thiophosphorylchlorid oder eine Mischung einer solchen Verbindung
mit Phenylphosphoryldichlorid, unter Kondensationsbedingungen, vorwiegend in Gegenwart
eines tertiären Amins als halogenwasserstoffbindendes Mittel, auf ein oder mehrere
Glykoside oder Glykosidderivate obiger Art zur Einwirkung gebracht wird, wonach
die gebildeten Kondensationsprodukte einer Hydrolyse unterworfen werden. Durch die
Hydrolyse werden die Gruppen, z. B. Chloratome, entfernt, die in dem angewandten
Phosphorylierungsmittel mit dem Phosphorsäurerest verbunden sind und welche nicht
während der Kondensierung durch Bindungen an die organischen Radikale ersetzt werden;
dabei werden diese Halogenatome durch Hydroxylgruppen ersetzt, so daß sich in dem
Kondensationsprodukt freie Phosphorsäuregruppen, d. h. solche Gruppen bilden, von
denen eine oder zwei der Valenzen des Phosphors durch Sauerstoff mit der organischen
Gruppe verbunden sind, während die restlichen Valenzen (zwei oder eine) an Hydroxylgruppen
gebunden sind, wodurch das Produkt einen stark sauren Charakter bekommt und Salze
bilden kann, von denen die Alkalisalze im Wasser löslich sein können.
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Das Glykosid kann sich während der Phosphorylierung zweckmäßig in
einem Lösungsmittel befinden, das gegenüber dem Phosphorylierungsmittel inert ist
und das ganz oder teilweise aus dem Kondensationsmittel selbst bestehen kann, je
nach den Methoden, die in der Regel beim Phosphorylieren organischer Stoffe angewandt
werden. Eine zweckmäßige Ausbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens, durch welche
man mit besonders großer Sicherheit Produkte mit guten enzymhemmenden Eigenschaften
erhält, ist dadurch gekennzeichnet, daß man durch Abkühlung während der Phosphorylierung,
durch langsames Zusetzen des Phosphorylierungs- oder -des Kondensationsmittels,
durch unterbrochene Zusetzung derselben, durch Stehenlassen oder andere, ähnliche
Maßnahmen. für die Kondensation günstige Bedingungen in dem wasserfreien Medium
so lange aufrechterhält, bis mindestens der gewünschte Kondensationsgrad erzielt
worden ist, und danach die Kondensation unterbricht und, falls dieselbe zu weit
gegangen ist, das gewonnene Produkt z. B. durch Einwirkung von Wasser, Säure oder
Alkali und nötigenfalls Erwärmung hydrolysiert, bis der Kondensationsgrad auf den
gewünschten Wert herabgebracht ist.
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Zur Erzielung einer genügenden Kondensation ist es zweckmäßig, daß
kein zu großer Überschuß an dem Phosphorylierungsmittel angewandt wird. So ist es
besonders zweckmäßig, daß 1/2 bis st Mol Phosphorylierungsmittel j e Mol Glykosid
angewandt wird, wo n die Zahl der Hydroxylgruppen des Aglykons des Glykosides angibt.
Ferner ist es zweckmäßig, daß man das Phosphorylierungsmittel zu einer Lösung der
Grundsubstanz setzt und nicht umgekehrt, weil das Phosphorylierungsmittel im letzteren
Falle zum Beginn des Prozesses in sehr großem Überschuß zugegen sein würde, und
die Phosphorylierung könnte dann abgeschlossen werden, ohne daß eine genügende Kondensation
mit den Molekülen der Grundsubstanz erfolgen würde. Eine gewisse, begrenzte Menge
des Phosphorylierungsmittels, die derjenigen Menge Phosphor entspricht, die in die
endgültige Verbindung eingehen soll, wenn sie einen solchen Aufbau hat, wie oben
definiert, kann jedoch auch zum Beginn des Prozesses in Mischung mit der Grundsubstanz
und einem etwaigen Lösungsmittel zugegen sein, indem man dann vorsichtig die Phosphorylierung
durch gradweise Zusetzung des Kondensationsmittels bewerkstelligt. Schließlich läßt
sich die Phosphorylierung ganz ohne Anwendung eines Kondensationsmittels durchführen,
aber sie erfolgt dann sehr lahgsam. Als Kondensationsmittel wird in an sich bekannter
Weise ein Stoff angewandt, der imstande ist, in dem wasserfreien Medium die durch
die Kondensation resultierende Komponente, z. B. Chlorwasserstoff, zu binden, wenn
man als Phosphorylierungsmittel Phosphoroxychlorid, Thiophosphorylchlorid oder Phenylphosphoryldichlorid
verwendet.
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Durch Variation der Reaktionsbedingungen, z. B. des Reaktionsmediums,
der Art der Zusetzung, der Geschwindigkeit derselben, der Menge des Phosphorylierungsmittels.iuld
anderer denkbaren variablen Faktoren, können Produkte entstehen, deren Eigenschaften
variieren.
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Das Lösungsmittel kann, wie erwähnt, ein Mittel sein, das während
des Prozesses indifferent ist. Zu diesem Zweck eignen sich z. B. Äther, Dioxan,
Aceton, oder andere Ketonlösungsmittel.
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Doch läßt sich als Lösungsmittel auch das während des Prozesses angewandte
Kondensationsmittel selbst benutzen, z. B. ein tertiäres Amin, von denen Pyridin,
Pikolin, Lutidin, Chinolin und Dimethylanilin als gut geeignet anzusehen sind. In
einigen Fällen ist es auch zweckmäßig, solche Kondensationsmittel in Mischung mit
indifferenten Lösungsmitteln zu verwenden.
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Da die Phosphorylierung unter Wärmeentwicklung erfolgt, ist es in
der Regel zweckmäßig, ziemlich stark abzukühlen, um den Prozeß zu regulieren und
um sichern zu können, daß gute Bedingungen für die
Kondensation
auch während der ersten Zeit der Phosphorylierung bestehen, wo noch ein großer Überschuß
von Grundsubstanzmolekülen vorhanden ist, deren reaktionsfähige Gruppen sämtlich
frei, d. h. nicht an Phosphor gebunden sind. Zu diesem Zweck kann die Reaktionsmasse
mit abgekühlten Wänden in Berührung sein, und zur Abkühlung derselben kann man beliebige
Kühlmittel, z. B. eine abgekühlte Salzlösung, verwenden. In vielen Fällen ist es
jedoch auch zweckmäßig, daß die Lösung, in welcher das Phosphorylxerungsmittel zur
Reaktion mit der Grundsubstanz gebracht werden soll, schon vor der Reaktion stark
abgekühlt ist, z. B. auf -io bis -20°. Während der Reaktion ist dann eine niedere
Temperatur einzuhalten, die praktisch immer die Zimmertemperatur oder darunter sein
kann, und nur in den Fällen, wo die Phosphorylierung unter diesen Umständen zu langsam
erfolgt, läßt man die Temperatur auf einen angemessenen höheren Wert ansteigen.
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Die Zeit, die für den primären Phosphorylierungsprozeß angewandt wird,
kann man - wie schon erwähnt - besonders dadurch variieren, daß man die Geschwindigkeit
variiert, mit welcher entweder das Phosphorylierungsmittel oder das Kondensationsmittel
zugesetzt wird. In den meisten Fällen ist es zweckmäßig, daß diese Zeit nicht unter
etwa 30 Sekunden liegt, aber in vielen Fällen kann man sie doch mit Vorteil
erheblich verlängern, wie aus den folgenden Beispielen zu ersehen ist. So kann die
Zeit der Zusetzung zweckmäßig gegen i Stunde betragen, aber in den meisten Fällen
ist es möglich, ohne Nachteile das Zusetzen im Laufe von 1/2 bis 25 Minuten durchzuführen.
In gewissen Fällen kann es zweckmäßig sein, das Zusetzen in mehreren Zeitabschnitten
mit dazwischenliegenden Ruhepausen vorzunehmen, in welchen die Temperatur dann eventuell
erhöht wird, z. B. auf die Zimmertemperatur oder auf eine Temperatur zwischen der
Zimmertemperatur und 50°, wenn es notwendig ist, um innerhalb einer angemessenen
Zeit eine genügende Kondensation zu erzielen. Wenn das Zusetzen dann wieder fortgesetzt
wird, muß man wieder für eine solche Abkühlung Sorge tragen, daß nicht so hohe Temperaturen
vorkommen, daß der Prozeß ohne Kontrolle verläuft.
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Wenn das Zusetzen beendigt ist, wird es, wenn auch eine bedeutende
Kondensation schon während desselben eingetreten ist, in der Regel notwendig oder
zweckmäßig sein, das Reaktionsprodukt während kürzerer oder längerer Zeit stehenzulassen,
damit die Kondensation mindestens den Wert erreichen kann, die sie in. dem fertigen
Produkt haben soll, d. h. daß das Molekülgewicht 2000 oder mehr sein soll und daß
das Produkt nicht dialysierbar ist. In vielen Fällen ist es zweckmäßig, daß das
Abstellen bei Zimmertemperatur, etwa 15 bis 2o°, erfolgt, und wie aus den folgenden
Beispielen zu ersehen, wird eine angemessene :Kondensationszeit dann im allgemeinen
1/2 bis 24 Stunden betragen. Es leuchtet ein, daß man die Zeit des Stehenlassens
durch Erhöhung der Temperatur kürzen kann, und in der Regel scheinen keine Nachteile
damit verbunden zu sein, die Temperatur bis auf etwa 5o° steigen zu lassen. Die
Erfindung umfaßt jedoch auch die Anwendung noch höherer Temperaturen in den Fällen,
wo dieselben keine Hindernisse bilden, um geeignete erfindungsgemäße Produkte zu
erzielen.
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Falls man durch das Phosphorylieren und die im Anschluß daran verlaufende
Kondensation unmittelbar Produkte erzielt hat, die nach der Hydrolyse im wäßrigen
Alkali löslich sind, weisen diese eine gute antienzymische Wirkung auf.
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Man unterbricht nunmehr die Reaktion durch Verdünnung mit Eiswasser,
wodurch auch nicht umgesetztes Phosphorylierungsmittel zersetzt wird.
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Die hergestellte polymere Verbindung liegt jetzt als wäßrige Lösung
zusammen mit dem Hydrochlorid des angewandten tertiären Amins vor. Je nach den Eigenschaften
der so hergestellten Stoffe können diese nach verschiedenen Verfahren gereinigt
werden. Die wichtigste der Eigenschaften, die dafür entscheidend sind, welche Behandlungsmethode
man verwendet, ist die Stabilität der Verbindungen in wäßriger Lösung.
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Wenn die Verbindung von guter Stabilität ist, besteht eine vorteilhafte
Reinigungsmethode in der Dialyse, eventuell mit nachfolgender Eindampfung bis zur
Trockenheit.
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Wenn die Stoffe aber eine geringere Stabilität in wäßriger Lösung
aufweisen, können die Produkte dadurch isoliert werden, daß man die nach der Reaktion
erzielte wäßrige Lösung ohne vorhergehende Dialyse zur Trockne eindampft. Hierdurch
erzielt man im allgemeinen ein farbloses Pulver oder eine halbfeste Masse. Die Reinigung
derselben kann z. B. dann durch wechselweise Auflösung in Alkali und Fällung mit
Säure, die mit Kochsalz gesättigt ist, und eventuell mit Äthanol geschehen.
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Als Maß der durch die neuen Stoffe erzielten Hemmung der Enzymwirkung
ist in den nachfolgenden Beispielen die >>0/, -Hemmung« angegeben, und zwar gemäß
der Formel
worin Hl die erforderliche Zeit ist, bei der eine gegebene Hyaluronidaselösung die
Viskosität einer als Substrat geeigneten, gegebenen Hyaluronsäurelösung halbiert,
während H2 die Reaktionszeit ist, die erforderlich ist zur Erzielung der Halbierung
der Viskosität bei der Einwirkung der Hyaluronidase auf eine Mischung derselben
Hyaluronsäurelösung mit zugemischtem Stoff von Antihyaluronidasewirkung. Die Zeichnung
zeigt als Beispiel ein Diagramm, in welchem die Abzisse die Einwirkungsdauer der
Hyaluronidase oder der Mischung derselben mit dem zu prüfenden Stoff auf eine Standard-Hyaluronsäurelösung
und die Ordinate die Durchströmungsdauer in einem Ostwald-Viskosimeter angibt.
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Die Kurve i bezeichnet den Zusammenhang zwischen der Reaktionszeit
und der Viskosität bei Anwendung von boviner Hyaluronidase. Zur Anwendung kommt
o,i ccm einer Enzymlösung, welche 2 VRE enthält (viskositätsreduzierende Einheit,
als diejenige Enzymmenge definiert, die die Viskosität der angewandten Substratlösung
auf die Hälfte im Laufe von io Minuten reduziert). Als Substrat verwendet man Hyaluronsäure,
die
aus Nabelsträngen nach einem von Jeanloz und Forchielli angegebenen Verfahren (J.
Biol. Chem., 186, 495, 195o) hergestellt ist. Die Lösung enthält 0,3% dieser Hyaluronsäure
in einer MeIlvaine-Puffermischung mit pH 7. Die Enzymlösung wird mit 3 ccm Substratlösung
und o,9 ccm Puffer gemischt.
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Die Kurve 2 zeigt den Zusammenhang zwischen der Reaktionszeit und
der Viskosität einer ähnlichen Mischung, die zugleich den in Betracht kommenden
Stoff enthält, dessen Antihyaluronidasewirkung untersucht werden soll. Das Mischungsverhältnis
ist o,i ccm Enzym, 0,7 ccm Puffer und o,2 ccm einer neutralen wäßrigen Lösung des
Stoffes sowie 3 ccm Substrat. Die Werte Hl und H2 werden durch die Schnittpunkte
mit der horizontalen Linie A bestimmt, deren Ordinate als die Hälfte der Summe der
Durchströmungszeit von der Pufferlösung bzw. der Substratlösung, mit der Pufferlösung
im Verhältnis 3 : 1 verdünnt, festgelegt ist.
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Aus den folgenden Beispielen geht hervor, welche »0[,-Hemmung« bei
verschiedenen erfindungsgemäß hergestellten Stoffen erreichbar ist. Zum Vergleich
sei eiwähnt, daß man nach demselben Verfahren »0/,-Hemmung« bei Suramin, welches
nach Angabe von J. M. Beiler und G. J. Martin höhere hemmende Wirkung .haben soll
als die von diesen Forschern hergestellten Sulfatierungs- und Phosphorylierungsprodukte,
auf o0/0 bei Anwendung von 4o Y je 4M1 und auf 430/0 bei Anwendung von 16o y je
4 ml bestimmt. Beispiel i 4,4 g wasserfreies Phloridzin werden in 25 ccm wasserfreiem
Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf -1o0 abgekühlt, wonach unter Kühlung und Umschütteln
eine Lösung von i ccm Phosphoroxychlorid in io ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt
wird. Zusatzdauer 3 Minuten. Die Mischung wird 3 Stunden im Kühlbad stehengelassen
und dann etwa 15 Stunden bei Zimmertemperatur gehalten, wobei sich eine zähe Fällung
absetzt. Jetzt wird mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert, wobei das Gefällte nach
und nach in Lösung geht. Die Lösung wird im Vakuum eingedampft, wonach der Rest
mit 2 n-Salzsäure, die mit Kochsalz gesättigt ist, behandelt wird. Dadurch erhält
man eine halbfeste Masse, die in gesättigter Natriumbicarbonatlösung aufgelöst wird.
Die Lösung wird filtriert und in die gleiche Menge 2 n-Salzsäure -mit Kochsalz gesättigt
- gegossen. Dadurch erhält man eine halbfeste Masse, die über Phosphorpentoxyd und
Kaliumhydroxyd getrocknet wird. Danach kann das Produkt gepulvert werden. Die Ausbeute
ist 4,7 g, und die Hemmung ist 950/0 (20'Y14 ml) beginnt die Lösung trübe zu werden.
Nach einer weiteren Stunde im Kältebad wird mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert,
wodurch alles in Lösung geht. Die Lösung wird gemäß Beispiel i weiterbehandelt.
Die Ausbeute an dem Produkt ist 5,15 g, und die Hemmung ist g50/0 (2o Y/4 ml). Beispiel
3 4,4 g wasserfreies Phloridzin werden in 25 ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Die
Lösung wird auf -io° abgekühlt, wonach unter fortgesetzter Kühlung und Umschütteln
eine Lösung von 2 ccm Phosphoroxychlorid in io ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt
wird. Zusatzdauer 4 Minuten. Nach 15 Minuten im Kältebad ist die Lösung dick geworden
und beginnt trübe zu werden. Nach weiteren 5 Minuten wird mit feinzerquetschtem
Eis hydrolysiert, wodurch fast alles in Lösung geht. Die Lösung wird gemäß Beispiel
i weiterbehandelt. Die Ausbeute an dem Produkt ist 5,35 g, und die Hemmung ist 9i
°% (2o y/4 ml). Beispiel 4 2,2 g wasserfreies Phloridzin werden in 2o ccm wasserfreiem
Pyridin gelöst. Bei -io° wird tropfenweise unter Umschütteln und Kühlung eine Lösung
von 1,5 ccm Phosphoroxychlorid in 5 ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Zusatzdauer
2 Minuten. Nach weiteren 8 Minuten im Kältebad ist die Lösung trübe geworden. 7
Minuten später wird mit feinzerquetschtem Eis hydrqlysiert, wodurch fast alles in
Lösung geht. Die Lösung wird gemäß Beispiel i weiterbehandelt. Die Ausbeute an dem
Produkt ist 2,5 g, und die Hemmung ist 56 °/° (2o y/4 ml). Beispiel 5 2,2 g wasserfreies
Phloridzin werden in 2o ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Bei -io° wird tropfenweise
unter Umschütteln und Kühlung eine Lösung von 2,5 ccm Phosphoroxychlorid in io ccm
wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Zusatzdauer 5 Minuten. Nach weiteren 3 Minuten im
Kältebad ist die Lösung trübe. 7 Minuten später wird mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert,
wodurch fast alles in Lösung geht. Die Lösung wird gemäß Beispiel. i weiterbehandelt.
Die Ausbeute an dem Produkt ist 2,1 g, und die Hemmung ist 22 °/° (2o y/4 ml). Wenn
die doppelte Menge Phosphoroxychlorid an Stelle der genannten Menge angewandt wird,
erhält man ein. Produkt, das in der Konzentration 2o Y/4 ml nicht hemmt. Beispiel
6 Beispiel 2 4,4 g wasserfreies Phloridzin werden in 25 ccm wasserfreiem Pyridin
gelöst. Die Lösung wird auf -io° abgekühlt, wonach unter Kühlung und Umschütteln
eine Lösung von 1,5 ccm Phosphoroxychlorid in io ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt
wird. Zusatzdauer 3 Minuten. Die Mischung wird im Kühlbad stehengelassen. Nach Verlauf
von 40 Minuten 15 ccm wasserfreies Pyridin werden im Kältebad auf -io° abgekühlt.
Unter Kühlung und Umschütteln werden vorsichtig 2,7 ccm Chlorsulfonsäure zugesetzt.
Danach wird bei -io° eine Lösung von 8,7 g wasserfreiem Phloridzin in 5o ccm wasserfreiem
Pyridin zugesetzt. Die Mischung wird langsam auf Wasserbad bis 9o0 erwärmt und dann
bei Zimmertemperatur 15 Stunden stehengelassen. Danach wirddie Mischung
auf
-io° abgekühlt, und eine Lösung von 2 ccm Phosphoroxychlorid in io ccm wasserfreiem
Pyridin wird unter Kühlung und Umschütteln zugesetzt. Die Mischung läßt man 48 Stunden
bei Zimmertemperatur stehen, wonach mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert wird,
wodurch man eine klare Lösung erhält. Es wird Natriumcarbonatlösung bis pH 9 zugesetzt,
wonach mit destilliertem Wasser 48 Stunden dialysiert wird. Daraufhin wird die Lösung
im Vakuum zu einem farblosen Pulver eingedampft. Dasselbe wird im Vakuum über Phosphorpentoxyd
getrocknet. Die Ausbeute ist 11,4 g, und die Hemmung ist 85 °/o (2o y/4 ml). Eine
Analyse des Produktes ergibt folgende Werte: 4,4°M P, 8,9°/o S. Das Produkt enthält
also etwa 2 Schwefelatome je Phosphoratom. Die Schwefelsäuregruppen befinden sich
natürlich in dem Grlykosidteil. Beispiel 7 2,2 g wasserfreies Dihydronaringinchalkon
werden in 25 ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf -io° abgekühlt,
wonach unter Kühlung und Umschütteln eine Lösung von 0,5 ccm Phosphoroxychlorid
in 5 ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer 2,5 Minuten. Nach etwa
5 Stunden im Kältebad ist die Lösung dick geworden, und sie wird jetzt mit feinzerquetschtem
Eis hydrolysiert, wodurch fast alles in Lösung geht. Die Lösung wird gemäß Beispiel
i weiterbehandelt. Die Ausbeute ist an dem Produkt 2,6 g, und die Hemmung ist 22
°/o (2o y/4 ml). Beispiel 8 2,2 g wasserfreies Dihydronaringinchalkon werden in
25 ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf -io° abgekühlt, wonach unter
Kühlung und Umschütteln eine Lösung von i ccm Phosphoroxychlorid in 5 ccm wasserfreiem
Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer 3 Minuten. Nach 25 Minuten im Kältebad ist die
Mischung dick und trübe geworden. Dann wird mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert,
wodurch sich eine klare Lösung bildet. Dieselbe wird im Vakuum eingedampft, wonach
der Rest mit 2 n-Salzsäure - mit Kochsalz gesättigt - behandelt wird. Man erhält
eine halbfeste Masse, die in gesättigter Natriumcarbonatlösung gelöst wird. Die
Lösung wird filtriert und in die gleiche Menge 2 n-Salzsäure - mit Kochsalz gesättigt
- gegossen. Dadurch erhält man eine farblose Fällung, welche abfiltriert und über
Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet wird. Die Ausbeute an dem Produkt
ist 3 g, und die Hemmung ist 950% (20 y/4 ml).
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Beispiel 9 2,2 g wasserfreies Dihydronaringinchalkon werden in 25
ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf -io° abgekühlt, wonach unter
Kühlung und Umschütteln eine Lösung von 1,5 ccm Phosphoroxychlorid in 5 ccm
wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer 3 Minuten. Nach i5 Minuten im Kältebad
ist die Mischung dick und trübe geworden. Dann wird mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert,
wodurch man eine klare Lösung erhält. Diese wird im Vakuum eingedampft, wonach der
Rest mit 2 n-Salzsäure - mit Kochsalz gesättigt - behandelt wird. Dadurch erhält
man eine halbfeste Masse, die in gesättigter Natriumbicarbonatlösung gelöst wird.
Die Lösung wird filtriert und in die gleiche Menge 2 n-Salzsäure - mit Kochsalz
gesättigt - gegossen. Dadurch erhält man eine farblose Fällung, welche abfiltriert
und über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet wird. Die Ausbeute an dem
Produkt ist 2,z g, und die Hemmung ist 900f, (20 y/4 ml). Beispiel io 2,2
g wasserfreies Dihydronaringinchalkon werden in 25 ccm wasserfreiem Pyridin gelöst.
Die Lösung wird auf -io° abgekühlt, wonach unter Kühlung und Umschütteln eine Lösung
von 2,5 ccm Phosphoroxychlorid in 5 ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer
a Minuten. Nach 4 Minuten im Kältebad beginnt die Lösung trübe zu werden. Nach weiteren
6 Minuten wird mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert, wodurch die Fällung nach
und nach in Lösung geht. Die gewonnene Lösung wird , gemäß Beispiel i weiterbehandelt.
Die Ausbeute an dem Produkt ist 1,7 g, und die Hemmung ist 25 % (2o y/4 ml). Beispiel
ii i,i g Naringin werden in 25 ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird
auf -io° abgekühlt, wonach unter Kühlung und Umschütteln eine Lösung von
0,5 ccm Phosphoroxychlorid in 5 ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird.
Zusatzdauer 5 Minuten. Nach 3 Stunden im Kältebad hat sich ein Niederschlag gebildet.
Man läßt die Mischung bei Zimmertemperatur i5 Stunden stehen, wonach mit feinzerquetschtem
Eis hydrolysiert wird. Nach 24 Stunden bei Zimmertemperatur ist die Lösung klar.
Diese wird im Vakuum eingedampft, und der Rest wird mit 2 n-Salzsäuremit Kochsalz
gesättigt - behandelt, wodurch man ein gelbes Pulver erhält. Dieses wird abfiltriert
und in gesättigter Natriumbicarbonatlösung gelöst. Die Lösung wird filtriert und
in die gleiche Menge 2 n-Salzsäure - mit Kochsalz gesättigt - gegossen. Man erhält
eine gelbe Fällung, welche abfiltriert und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd
getrocknet wird. Die Ausbeute an dem Produkt ist 1,5 g, und die Hemmung ist 40')1,)
(20714 ml).
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Wenn man statt 0,5 ccm Phosphoroxychlorid 0,75 ccm verwendet,
erhält man ein Produkt mit der gleichen Hemmung, während eine Menge von i,25 ccm
Phosphoroxychlorid ein Produkt ergibt, das in der Konzentration 2o y/4 ml nicht
hemmt. Beispiel 12 i,2 g Hesperidin werden in 30 ccm wasserfreiem Pyridin gelöst.
Die Lösung wird auf -io° abgekühlt, wonach unter Kühlung und Umschütteln eine Lösung
von o,25 ml Phosphoroxychlorid in 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer
1,5 Minuten. Die Mischung steht 2 Stunden im Kältebad und danach 15 Stunden bei
Zimmertemperatur. Dann wird mit
feinzerquetschtem Eis hydrolysiert,
wodurch fast alles in Lösung geht. Die Lösung wird gemäß Beispiel ii weiterbehandelt.
Die Ausbeute an dem Produkt ist i g, und die Hemmung ist 30 °/o (20714 ml).
Beispiel 13 i,- ,g Hesperidin werden in 3o ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Die
Lösung wird auf -io° abgekühlt, wonach unter Kühlung und.Umschütteln eine Lösung
von o,75 ccm Phosphoroxychlorid in io ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer
3,5 Minuten. Die Mischung steht 2 Stunden im Kältebad, wonach mit feinzerquetschtem
Eis hydrolysiert wird, wodurch fast alles in Lösung geht. Die Lösung wird gemäß
Beispiel ii weiterbehandelt. Die Ausbeute an dem Produkt ist o,9 g, und die Hemmung
ist 68 °/o (207/4m1).
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Wenn man statt dessen 2,5 ml Phosphoroxychforid verwendet, erhält
man ein Produkt, das in der Konzentration 20714 ml nicht hemmt. Beispiel 14 1,2
g wasserfreies Rutin werden in 25 ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird
auf -io° abgekühlt, wonach unter Kühlung und Umschütteln eine Lösung von o,2 ccm
Phosphoroxychlorid in 5 ccm wasserfreiem Pyridin. zugesetzt wird. Zusatzdauer 5
Minuten. Nach i1/4 Stunde im Kältebad beginnt die Lösung trübe zu werden. Dann wird
mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert, wodurch fast alles in Lösung geht. Die Lösung
wird im Vakuum eingedampft, und der gebliebene Rest, der in 2 n-Salzsäure - mit
Kochsalz gesättigt - leicht löslich ist, wird mit absolutem Alkohol behandelt, wodurch
man ein gelbes Pulver erhält. Dieses wird abfiltriert, mit absolutem Alkohol gewaschen
und im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Die Ausbeute an dem Produkt ist
o,8 g, und die Hemmung ist 40°/0 (20 Y/4 ml). Beispiel 15 1,2 g wasserfreies Rutin
werden in 25 ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf -io° abgekühlt,
wonach unter Kühlung und Umschütteln eine Lösung von 0,4 ccm Phosphoroxychlorid
in 5 ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt wind. Zusatzdauer 3 Minuten. Nach 4 Minuten
im Kältebad beginnt die Lösung trübe zu werden, und nach weiteren 6 Minuten wird
mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert, wodurch fast alles in Lösung geht. Die Lösung
wird gemäß Beispiel ii weiterbehandelt. Die Ausbeute an dem Produkt ist i,i g, und
die Hemmung ist 57°/o (2o Y/4 ml). Beispiel 16 1,2 g wasserfreies Rutin werden
in 25 ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf -io° abgekühlt, wonach
unter Kühlung und Umschütteln eine Lösung von o,6 ccm Phosphoroxychlorid in 5 ccm
wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer 2 Minuten. Nach i Minute im Kältebad
beginnt die Lösung trübe zu werden, und nach weiteren 4 Minuten hat sich eine starke
Fällung gebildet. Dann wird mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert. Nach 24 Stunden
bei Zimmertemperatur ist fast alles in Lösung gegangen. Die Lösung wird gemäß Beispiel
ii weiterbehandelt. Die Ausbeute an dem Produkt ist 1,6 g, und die Hemmung ist 9o°/0
(2o Y/4 ml). Beispiel 17 1,2 g wasserfreies Rutin werden in 25 ccm wasserfreiem
Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf -io° abgekühlt, wonach unter Kühlung und Umschütteln
eine Lösung von i ccm Phosphoroxychlorid in 5 ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt
wird. Zusatzdauer ?,Minuten. Nach i Minute im Kältebad ist die Lösung sehr trübe
geworden. Dann wird mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert, wodurch fast alles in
Lösung geht. Die Lösung wird gemäß Beispiel ii weiterbehandelt. Die Ausbeute an
dem Produkt ist o,9 g, und die Hemmung ist 27°/o (2o y/4 ml). Beispiel 18
i,i g wasserfreies Phloridzin werden in 15 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung
wird auf -io° abgekühlt, wonach unter Kühlung und Umschütteln eine Lösung von o,6
ccm Thiophosphorylchlorid in io ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer
i1/2 Minute. Die Mischung steht 3 Stunden im Kältebad und danach 15 Stunden bei
Zimmertemperatur, wobei sich ein geringer Niederschlag absetzt. Dann wird mit feinzerquetschtem
Eis hydrolysiert, wodurch die Fällung nach und nach in Lösung geht. Die Lösung wird
gemäß Beispiel ii weiterbehandelt. Die Ausbeute an dem Produkt ist 1,25 g, und die
Hemmung ist ioo°/o (2o Y/4 ml). Beispiel i9 i, i g wasserfreies Phloridzin werden
in 15 ccm wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf -io° abgekühlt, wonach
unter Kühlung und Umschütteln eine Lösung von o,9 ccm Thiophosphorylchlorid in io
ccm wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer 3 Minuten. Die Mischung steht
3 Stunden im Kältebad und danach 15 Stunden bei Zimmertemperatur, wobei sich ein
geringer Niederschlag absetzt. Dann wird mit feinzerquetschtem Eis hydrolysiert,
wodurch die Fällung nach und nach in Lösung geht. Die Lösung wird gemäß Beispiel
ii weiterbehandelt. Die Ausbeute an dem Produkt ist 1,3 g, und die Hemmung ist ioo°/o
(2o y/4 ml).
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Beispiel 2o 4,36 g Phloridzin werden in 25 ccm Dioxan gelöst. Danach
werden 2,8 ccm Phosphoroxychlorid zugesetzt, wonach die Lösung auf dem Dampfbad
unter Rückflußkühlung erwärmt wird. Nach 50 Minuten hört die Entwicklung
von Chlorwasserstoff auf, es hat sich eine rötlichbraune Fällung gebildet. Die Reaktionsmischung
wird abgekühlt und mit Eis hydrolysiert. Eine 2 n-Natriumhydroxydlösung wird bis
zu alkalischer Reaktion zugesetzt, wodurch der größte Teil der durch die Phosphoryherungsreaktion
gebildeten Fällung gelöst wird. Das nicht gelöste, das aus einem sehr hochmolekulärem
Produkt besteht, wird abfiltriert, wonach das Filtrat nach Neutralisierung
mit
Salzsäure im Vakuum bis zur Trockne eingedampft wird. Der Rest wird in Wasser gelöst
und mit Salzsäure gefällt, wodurch eine rotbraune Fällung entsteht. Diese wird abfiltriert,
mit i n-Salzsäure gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Natriumhydroxyd
getrocknet. Die Ausbeute an dem Produkt ist 3,7 g eines rotbraunen Pulvers. Die
Hemmung ist 50°/0 (5o y/4 ml). Beispiel 21 5,82 g Rutin werden in 25 ccm Dioxan
gelöst, wonach 4,4 ccm Phosphoroxychlorid zugesetzt werden. Die Mischung wird auf
dem Dampfbad unter Rückflußkühlung erwärmt. Nach 30 Minuten hört die Entwicklung
von Chlorwasserstoff auf, und eine dunkle, zähe Masse hat sich ausgeschieden. Das
Produkt wird gemäß Beispiel 2o weiterbehandelt. Man erhält 6 g eines dunkelbraunen
Pulvers. Die Hemmung ist 6o°/, (5o y/4 ml).