DE1618857A1 - Verfahren zur Herstellung von Chondroitinpolysulfat - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von ChondroitinpolysulfatInfo
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Description
MDNCHEN HAMBURG I D I O OO /
TELEFON: 555476 8000 MÖNCHEN 15, 1. März 19β7
TELEGRAMME: KARPATENT NUSSBAUMSTRASSE 10
w. Ij) 019/67 13/Nie
Seikagaku Kogyo Co., Ltd. Tokyo (Japan)
Verfahren zur Herstellung von Chondroitinpolysulfat
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
von Chondroitinpolysulfat.
das
Es ist bekannt, daß, wenn Chondroitinpalysulfat/durch chemische
Behandlung von Chondroitinmonosulfat erhalten wurde, wobei letzteres aus einer natürlichen Substanz {auptsächlich
Knorpeln von Tieren) extrahiert wurde, ein geeignetes Molekulargewicht
und einen geeigneten Schwefelgehalt aufweist, es verschiedene physiologische Aktivitäten, insbesondere eine heparino-
Blutllide Antikoagulanzaktivität und eine Lipämie-Klärungs-Aktivität
(liperaia clearing activity) besitzt.
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*■· cL ~
Untersuchungen bezüglich der Sulfatierung von Chondroitinmonosulfat wurden von K.H. Mey^'er und anderen
in HeIv. chira. Acta, 35, Seiten 574 - 588, 1952, und in
der deutschen Patentschrift 968 752 (entsprechend der
britischen Patentschrift 704 516) beschrieben. In der
ersteren Veröffentlichung findet sich ein Bericht über die heparinoiden Aktivitäten von verschiedenen Chondroitinpolysulfaten
mit verschiedenen Sehwefelgehalten, wobei als Sulfatierungsmittel von Chondroitinmonosulfat (1) flüssiges
SO2 und SO,, (2) flüssiges SO2 und ClSO^H, (3) Pyridin und
SO-*, (4) ClSO^H allein oder (5) Dioxan und SO-, verwendet
wurden. Die letztere Veröffentlichung beschriebt ein Verfahren
zur Herstellung von Chondroitinpolysulfat, bei welchem Chondroitinmonosulfat mit z.B. Salzsäure teilweise
hydrolysiert wird, um dasselbe abzubauen, das abgebaute
Produkt isoliert und anschließend dieses Produkt nach einem an sich bekannten Verfahren, beispielsweise mit Pyridin und
ClSO3H sulfatiert wird.
Es wurde gefunden, daß man Chondroitinpolysulfat mit ausgezeichneteren physiologischen Aktivitäten und einer
niedrigeren Toxizität aus Chondroitinmonosulfat in einfacher Weise nach einem Verfahren herstellen kann, bei.welchem
man Chondroitinmonosulfat oder dessen Salz in konzentrierter Schwefelsäure mit einer Konzentration von wenigstens 85 Gew.-^
bei einer Temperatur innerhalb des Bereichs Von —j50 bis +50 C
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löst, die erhaltene Lösung bei einer Temperatur innerhalb
des angegebenen Bereichs beibehält und das gewünschte
Produkt aus der Reaktionsmischung in Form einer freien Säure
oder von deren Salz gewinnt.
Das als Ausgangsmaterial verwendete Chondroitinmono'-sulfat
kann z.B. nach der Arbeitsweise von K.H. Meyer u.a. in HeIv. chim. acta j51, 1402, 1949, hergestellt werden.
Ein typisches Monosulfat ist Chondroitin-4-sulfat (bezeichnet
als Chondroitinsulfat A), das durch eine sich wiederholende Einheit der nachstehenden Formel
| (JOOH ι |
\ E,'' |
\ HOjSO > \ < |
CH0OH | .Q |
| OH | HO | H | / | |
| t H |
||||
| ι H |
I NHCOOCH |
dargeäellt wird und Chondroitin-6-sulfat (bezeichnet als
Chondroitinsulfat C), das durch eine sich wiederholende Einheit der nachstehenden Formel
NHCOOCH, H
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dargestellt wird. Die hier verwendete Bezeichnung "Chondroitinmonosulfat" betrifft ein Chondroitinsulfat,
das in seinem Natriumsalz 6,6 Gew.-^ oder weniger Schwefelgehalt
aufweist.'
Die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendete
konzentrierte Schwefelsäure reagiert unmittelbar mit Chondroitinmonosulfat
als Sulfatierungsmittel und dient gleicfe zeitig als Lösungsmittel für den Reaktionsteilnehme:pünd das
Reaktionsprodukt. Die zu verwendende konzentrierte Schwefelsäure muß wenigstens 85 Gew.-% H2SO^ enthalten. Je höher der
Wassergehalt ist, umso geringer wird die Sulfatierungswirksamkeit
und es schreitet lediglüi die Depolymerisation fort;
daher ist die Verwendung einer konzentrierten Schwefelsäure mit einem Gehalt von wenigstens 95 Gew.-% H2S(K besonders
vorteilhaft. Bei Verwendung einer Schwefelsäure mit einer
Konzentration von unterhalb etwa 75 Gew.-% schreitet die
Sulfatierung nicht wesentlich fort, sondern es ist lediglich ein Portschreiten der Depolymerisation vorhanden. Die
bei dem Verfahren gemäß der Erfindung als Sulfatierungsmittel verwendete konzentrierte Schwefelsäure kann auch ein
weiteres Sulfatierungsmittel, wie SO·* oder ClSO-JI, enthalten. Wenn jedoch ein derartiges Reaktionsmedium zur Anwendung
gelangt, wird jLfäjL&jLXftfi Als an der Sulfatierungsreaktion
gemäß der Erfindung teilnehmende Substanz Schwefelsäure
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aliein angesehen. Dies ist darauf zurückzuführen, weil
offensichtlich die Wirksamkeit einer SuIfatierungsreaktion
aufgrund eines derartigen Reaktionsmediums im wesentlichen von derjenigen aufgrund von konzentrierter Schwefelsäure
allein nicht verschieden ist,
per Einfluß der Reaktionstemperatur bei dem Verfahren
gemäß der Erfindung ist wesentlich und der Einfluß erscheint Λ
lediglieh bei der Depolymerisation. Jelöher die Reaktionsteperötur
ist, umso mehr söhreitet die Depolymerisation
fort. Im Gegensatz dazu scheint das fortschreiten der
Schwefelsäureveresterung duroh die Reaktionstemperätur nicht
wesentlich beeinflußt zu werden. Eine Reaktionstemperatur
von oberhalb 50 0G muß vermieden werden, da eine unerwünschte
Carbonisierung und Zersetzung von Chondroitinmonosulfat
und dem Produkt dadurch beschleunigt werden. Wenn die Sulfonierung insbesondere unter Hemmung einer Erniedrigung
des Molekulargewichts bis auf einen geringen Grad ausgeführt wird, wird vorzugsweise eine Reaktionstemperatur ναα
-30° bis -20°C verwendet. Bei einer Reaktion, die bei einer
zu niedrigen Temperatur us geführt wird, ist es zur Aufrechterhaltung
des Reaktionsmediums im flüssigen Zustand erforderlich, den Gefrierpunkt der konzentrierten Schwefelsäure
zu erniedrigen. Zu diesem Zweck wird der konzentrierten Schwefelsäure ein aliphatischer e-ey mit bis zu 8
Kohlenstoffatomen in angemessener Menge von bis zu 50 Gew.-^,
BAD ORIGJNAU
108830/1803
bezogen auf das flüssige Reakfcionsmedium in geeigneter
Weise zugesetzt. Beisjtele für geeignete Äther sind
acyclische aliphatische Äther, wie Diäthyläther, Diisopropyläther,
Di-n-propyläther und Äthylenglykoldimethyläther sowie cyclische aliphatische Äther, wie Tetrahydrofuran
und Dioxan. .
Wenn z.B. Ohondroitin-6-aulfat (mittleres Molekulargewicht
t 67200} mit eine? konzentrierten Schwefelsftre bei
einer Temperatur von -6 bis -7°Öwährend 2 Stunden umgesetzt
wird, werden zwei Iraktionen, die jeweils einen
dem Giiondroitindisulfat entsprechenden Sulfatgehalt und
ein mittleres Molekulargewicht von etwa 10 000 bzw. 4 000
aufweisen, erzeugt. Im Gegensatz dazu wird bei Umsetzung von Chondroitin-6-sulfat in konzentrierter Schwefelsäure mit
einem Gehalt von 14 # Tetrahydrofuran bei -300C während der
gleichen Zeitdauer eine Fraktion mit einem Sehwefel/rfgehalt
entsprechend dem Chondroltindisulfat und einem mittleren Molekulargewicht von etwa 50 000 erzeugt.
Die Reaktionsdauer bei dem Verfahren gemäß der Erfindung übt anscheinend einen Einfluß auf den Abbau und den
Grad der Schwefelsäureveresterung aus. Bei dem Verfahren, bei welchem Chondroitinmonosulfat einer konzentrierten
Schwefelsäure zugesetzt und unter gleichförmiger Dispergierung gelöst wird, scheint die primäre Schwefelsäureveresterung
und eine Erniedrigung des Molekulargewichts fortzuschreiten,
109830/180 3
BAD ORIGINAL.
-7- 1618867
worauf im Verlauf der Zeit die sekundäre Schwefelsäureveresterung
und Erniedrigung des Molekulargewichts stattfinden. Wen#z.B. Chondroitinmonosulfat (mittleres Molekuargewicht
67 200) mit einer konzentrierten Schwefelsäure umgesetzt wird, werden nach Verlauf von 1 Stunde bei einer
Reaktionstemperatur von 4 - 5°C die Reaktionsprodukte von zwei Fraktionen mit jeweils einem Schwefelgehalt, entsprechend^
dem Chondroitindisulfat, Und einem mittleren Molekulargewicht von 7 000 bzw. J5 ^00 erzeugt, während nach
Verlauf von & Stunden ein Reaktionsprodukt mit einem Schwefelgehalt, entsprechend dem Chondroitintetrasulfat,
und einem mittleren Molekulargewicht von 2200 erzeugt wird. D.h« die Reaktionsdauer beeinflußt sowohl die Schwefelsäureveresterung als auch die Erniedrigung des Molekulargewichts
und beeinflußt insbesondere bemerkenswert das Fortschreiten der Schwefelsäureveresterung.
Nach Vervollständigung der Umsetzung ist es besonders wichtig, das gewünsahte Produkt von der Reaktionsmischung
in wirksamer Weise abzutrennen. Es wurde gefunden«, daß
bei Zusatz einer ausreichenden Menge eines aliphatischen Äthers mit einem Gehalt bis zu 8 Kohlenstoffatomen zu der
Rdaktionsmischung,vährend diese gekühlt wird, das gewünschte
Produkt als freier Ester nahezu quantitativ ausfällt* Beispiele für geeignete aliphatisch^ Äther sind die gleichen,
wie vorstehend als Gefrierpunktserniedrigungsmittel für die konzentrierte Schwefelsäure angegeben. Beispielsweise
109830/1803
BAD ORIGINAL
wird diese Ausfällung durch Filtrieren durch ein Glasfilter,
oder durch Zentrifugalkraft abgetrennt und wenn die abgetrennte Ausfällung mit dem glichen Äther gewaschen
wird, ergibt sich ein nahezu reines Chondroitinpoaysulfat
in Form eines freien Esters. Da dieses eine allgemein hygroskopische und stark saure Substanz, die zur Zersetzung
neigt, ist, wird diese zweckmäßig durch■ Neutral!-
^ sation des freien Esters augenblicklich mit einer geeigneten
Base (Alkali- und Erdalkalihydroxyden, Alkali- und Erdalkalicarbonaten und organischen Basen).in ein
Salz übergeführt. »
Gemäß einer anderen Arbeitsweise zur Abtrennung des
gewünschten Produkts von der Reaktionsmischungwird die
Reaktionsmischung in einer großen überschüssigen Menge von kaltem Wasser oder einer wäßrigen Lösung einer alkalischen Substanz, z.B. eines Alkalihydroxyds oder -carbonate,
gelöst, anschließend aus der wäßrigen Lösung die darin vor-
W- handenen anorganischen Bchwefelsäureionen durch Dialyse
oder durch Ausfällen, beisptffllsweise als Bariumsulfat, abgetrennte Bei Konzentrierung der auf diese Weise von anorganischen
Schwefelsäureionen befreiten Lösung unfl^ anschlieflender
Zugabe eines Nichtlösungsmittels für das Produkt, beispielsweise von Äthanol, kann das gewünschte Produkt
gewonnen werden. Dieses Gewinnungsverfahren für das Produkt ist vorteilhaft zur Trennung des Produkts aus der
10 9 8 3 0/1803
BAD ORIGINAL ?ä?.«aik
Reaktionsmischung ,die nach, einem Verfahrenerhalten
wurde, bei welchem eine möglichstgeringe Menge an konzentrierter
Schwefelsäure verwendet würde. So kann gemäß
einem besonderen Merkmal der Erfindung Chondroitinpoly-.
sulfat dadurch erzeugt werden, daß man Chondroitinnionosulfat
oder dessen Salz mit 200 bis 400 Vo lument eilen*
bezogen auf lOO Gew.-Teile des Chondroitinmonosulfats,
eines flüssigen Reaktiohsmediums mischt, in welchem wenigstens
50 Gew.-^ einerkoneentrierten Schwefelsäure
mit einer Konzentration 70η wenigstens 85 Gew.-# bei
einer Temperatur innerhalb des Bereichs von -JO Ms +500C
vorliegt, um eine viskose Paste zu bilden, die erhaltene
Paste bei einer^ Temperaturinnerhalb des angegebenen Bereichs
beibehält, die erhaltene Reaktionsmischung in einer übersehüssigen
Menge Wasser löst, die darin vorhandenen anorganischen
Schwefelsäureionen aus der wäßrigen Lesung entfernt und das gewünschte Produkt abtrennt. Das Reaktionsmedium kann aus einer konzentrieiJtenSchwefelsaure mit
einer Konzentration von wenigstens 85 Gewv-$,sofern diese
bei der Reaktionstemperatur flüssig ist, oder aus einem Gemisch der konzentrierten Schwefelsäure und bis zu 50 Gew.-%
des vorstehend angegebenen aliphatischen Äthers bestehen.
* Der"Schwefelgehalt in einem nach dem Verfahren gemäß
der Erfindung erhaltenen Natriumsalz von Chondrüitlnpoly-■
sulfat kommt einem We.pt entsprechend, dein Disulfat (10,6 /^) j
BAD ORiGINAi
Trisulfat (IJ,5 ίο), oder Tetrasulfat (15,8 %) sehr nahe.
Es wird aus dieser Tatsache angenommen, daß der Schwefelgehalt
des Produkts von den Reaktionsbedingungen abhängt und unte^estimmten Bedingungen hauptsächlich das Disulfat,
unäe^anderen Bedingungen hauptsächlich das Trisulfat und
unter noch anderen Bedingungen hauptsächlich das Tetrasulfat
gebildet wird. Das nach dem Verfahren gemäß der
Erfindung erhaltene Disulfat wird als Chondroitin-4,6-disulfat
angenommen, da gemäß einer Infrarotanalyse es bekannt ist, daß ein aus Chondroitin-6-sulfat erhaltenes
Disulfat und ein aus Chondroitin-4-sulfat erhaltenes
Disulfat im wesentlichen die gleiche Struktur aufweisen. Diese Tatsache bedeutet ferner, daß die nach dem Verfahren
gemäß der Erfindung erhaltenen Produkte die Sulfatgruppen in einer innermolekularen Homogeniet . verteilt enthalten.
Es wird angenommen, daß die Stellung einer dritten Suifatgruppe
in dem nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Chondroitintrisulfat in der 2- oder ^-Stellung
der D-Glucuronsäureeinheit vorliegt. In ähnlicher Weise
v;erden die dritte und vierte Sulfatgruppe des Tetrasulfats
in der 2-SfceU.ung und der jj-Stellung der D-Glucuronsäureeinheit
angenommen.
Ein weiteres Merkmal des nach dem Verfahren gemäß
der Erfindung erhaltenen Produkts ist die gleichförmige
Verteilung von Schwefel unter den Molekülen und die Homoge-
109Ö30/1 8 0 3
BAD ORIGINAL
-' 11 -
nität der MOlekulargewiehtsverteilung. Wenn Hatrium-
, . " das ■ -"" ,. - ' ■ ;■■ ■".
chondrQltinpolysulfat^/naeh dem Verfahrenjgemäß der
Erfindung erhalten wurde t dialysiert wird, wird in
einem bestimmten Fall eine aus dem'Dialysierflim austretende Fraktion von:geringem Molekulargewicht erhalten
und in einem gewissen anderen Fall eine den Dialysierfilm
durchschreitende- Fraktion von geringem Molekulargewicht
und eine Fraktion von hohem Molekülargewicht, die nicht.
durch den Dialysierfilm hindürehgeht* erhalten. Jede
dieser Fraktionen wirkt: bei Papierelektrophorese als
unterscheidbare Einzelkompönente, woraus ersichtlich istj
daß jede Fraktion eine verhältnismäßig gleichförmige '
Molekulargewichtsverteilung und Schwefelverteilung unter
den Molekülen aufweist.- Diese.Homogenitä|r können mittels
lonenaustaüschchromatographie und Sephadex-Säulenchromatographie
bestätigt werden. :
In unerwarteter leise würde gefunden, daß das nach
dem Verfahren gemäß der Rrfindung erhaltene produkt eine
überlegene Blut-Antikoagulanz-Äktivität in vitro und in vivo
und eine geringere Toxizität, verglichen mit dem Produkt
mit einem im wesentlichen, glichen Schwefelgehalt Und mittleren
Molekulargewicht * das^ nach dem üblichen Verfahren (ein
Sulfatierungsverfahren mittels Pyridin-GISQ-JH) erhalten
wurde, aufweist.- '-_'
Die Krfindung Wird nachstehend anhand von Beispielen
naher erläutert,
1098 30/18 03
50 ml eines technisch erhältlichen Reagenzes von konzentrierter SchwefelsauWsSterfiualitlit (first class
concentrated sulfonic acid) mit einer Konzentration von mindestens 95 % wurden auf eine Temperatur von 4 bis 5°C
gekühlt, worauf 5 g Natriumchondroltin-6-sulfat (mittleres
Molekulargewicht 67 200) zugegeben und gelöst wurden·
^ Die Mischung wurde bei der gleichen Temperatur während 1
Stunde unter Rühren umgesetzt. Anschließend würden unter Beibehaltung der Reaktionsmischung bei einer Temperatur von
-5° bis 00C 250 ml Ä'thyläther zugesetzt, um das Reaktionsprodukt
auszufällen. Nach Abfiltrieren der Ausfällung durch ein Glasfilter und Waschen mit Äthyläfcher wurde Chondroitinpolyschwefeisäure
In Form eines weißen hygroskopischen Pulvers erhalten, das in kaltem Wasser gelöst wurde. Der pH-Wert
der Lösung wurde mittels einer NatriumjfidroxydltJsung
auf 6,5 eingeteilt, worauf unter Verwendung einer Dialyse-
* folie oder eines Dialysefilms (technisch erhältlicher
Visking-Schlauch 36/32) die Lösung in destilliertem Wasser dialysiert wurde (wobei 3 Mal 300 ml je Zei^ieetlllietes
Wasser alle 24 Stunden ersetzt wurden). Wenn die Flüssigkeit
innerhalb des Diplysefilms oder der Dialysefolie unter
verringertem Ourck konzentriert und filtriert wurde und die
sich ergebende Flüssigkeit (etwa,30 ml) mit 150 ml Äthanol
zur Abtrennung einer Ausscheidung versetzt wurde und an-
109830/18 03
BAD ORfGINAL
schließend die erhaltene Ausfällung durch ein Filter
filtriert und nacheinander mit Äthanol und Äthyläther gewaschen wurde, ergab sich Nätrium-ehondroitinpolysulfat
in Form eines weißen Pulvers. Das Pulver wurde bei 850G
unter verringertem/ftuck während 2Stunden getrocknet.
T>ie Ausbeute betrug '2,4 g, der Schwefelgehalt war
11*35 %· nas Produkt besaß ein mittleres Molekulargewicht
(gemäß der Kndgruppenahalyse) von 7Ö10>
Die Flüssigkeit auSerhalb des.Dialysefilms (etwa 900 ml) wurde mit einer Bariumacetatlösung zur Ausfällung
von anorganischen Schwefelsäureionen als Bariumsulfat versetzt und der Niederschlag wurde abzehtrifugiert, worauf
die überstehende Flüssigkeit unterverringertem Druck bis
auf eine Menge von etwa 30 ml konzöntriert wurde. Nach
Abtrennen einer geringen Menge an Verunreinigungen durch Filtration oder Zentrifugieren der kpnzentrierten Flüssigkeit
wurde die tslüssigkeit mit 240 ml Äthanol versetzt, um eine
Ausfällung abzutrennen. Nach filtration der Ausfällung
durch ein Filter und aufeinanderfolgendes Waschen mit Äianol
und Äthyläther wurdet Natriumchondroitinpolysulfat in Form
eines Weißen Pulvers erhalten, das bei 850C unter verringertem
nuj?ck während 2 Stunden getrocknet wurde. Die
Ausbeute betrug 1,85 g. Der Schwefelgehalt war 11,69 ^,
Das Produkt besaß ein mittleres Molekulargewicht (aufgrund
der Kndgruppenanalyse) von 3.420.
BAD ORIGINAU
.109830/1803;:- -
50 ml eines Im Handel erhältlichen Reagenzes
von konzentrierter Schwefelsäure erster Qualität, deren Konzentration wenigstens 95 3» betrug, wurden auf eine
Temperatur von 4 - 50C gekühlt, wozu 5 g Natriumchondroitin-6-sulfat
(mittleres Molekulargewicht: 67 200) zugegeben
und gdslöst wurden. Die Mischung wurde bei dieser Temperatur
während 4 Stunden unter Rühren umgesetzt. Anschließend
wurden unter Beibehaltung der Reaktionsmischung bei einer Temperatur von -5 bis 0°C 250 ml Äthyläther zugegeben,
um das Reaktionsprodutat auszufällen. Nach Filtration der Ausfällung durch ein Glasfilter und Waschen mit Ä'thyläther
wurde Chondroitinpolysehwefelsäure in Form eines grauweißen hygroskopischen Pulvers erhalten. Das Pulver
wurde in kaltem Wasser gelöst, der pH-Wert der Lösung wurde
mittels Natriumhydroxydlösung auf 6,5 eingestellt, worauf unter Verwendung eines Dialysefilms (im Handel erhältlicher
Viking-Schlauch 36/32) die Lösung in destilliertem Wasser
dialysiert wurde (3 Mal 300 ml je Zeit destilliertes Wasser
wurden alle 24 Stunden ersetzt). In der Flüssigkeit innerhalb des Dialysefilms lag keine Chondroitinpolyschwefelsäure vor.
Die Flüssigkeit außerhalb des Dialysefilms (etwa 900 ml)
wurde mit einer Bariumacetatlösung versetzt, um anorganische Schwefelsäureionen als Bariumsulfat auszufällen, Nach-dem
die Ausfällung abzentrifuglert wurde, wurde die überstehende
BADORIGINAL : 10983071803 .
Flüssigkeit unter verringertem Druck Tbis auf Menge s/cw '.
eJwct 4o ml konzentriert wurde β Nach Entgernui^einer
geringen Menge:, an Verunreinigungen durch Filtration oder Zentrifugieren der konzentrierten Flüssigkeit
wurde die Flüssigkeit mit 500 ml Äthanol versetzt, um die Ausfällung abzutrennen* Nach Filtration U-- *"
der Ausfällung mit einem. Filter und" aufeinanderfolgendes
V/aschen mit Äthanol und Äthyläther wurde ,Natrium- '
ohondroitinpolysulfat in Form eines weißen Pulvers
erhalten, das "bei 850O unter verringertem Druck während
2 Stunden getrocknet wurde, Die Ausbeute betrug ,4,1'g·
Der Schwefelgehalt war 35,35$»-Das Produkt t besaß- ein
mittleres Molekulargewicht (aufgrund der Endgruppenana-'
lyse) von 2200. ■ · \ * - , ' '· ■
100 ml eines im Handel - erhältlichen Reagenzes von konzentrierter Schwefelsäure erster" Qualität, deren
Konzentration wenigstens 95 $> betrug, wurden auf
eine Temperatur von -7 bis -80O gekühlt, wozu 10 g ' Katriumchondroitin-ö-sulfat (mittleres Molekulargewicht
: 67 200) zugegeben und.gelöst wurden. Die Mischung wurde bei dieser Temperatur-wahren 4&-t^i^^kw
unter Rühren umgesetzte Anschließend wurden unter Halten der Reaktionsmischung auf einer Temperatur unterhalb
-50C 500 ml Xthyläther zugegeben, um das Reaktionsprodukt auszufällen. Na'ch Filtration der Ausfällung
109830/1803
BAD ORIGINAL
durch ein Glasfilter-und"Waschen mit ithpJyläther '
wurde Chondroitinpolyschwefelsäure in Form eines ' weißen hyöroskopischen Pulvers erhaltene DaB--Pulver ■"_ ■
wurde in kaltem Wasser gelöst', der pH-Wert wurde mittels JJatriumhydr oxy dlösung auf 6,5 eingestellt, .
worauf unter Verwendung eines Dialysefilms (im Handel erhältlicher Visking-Schlauch 36/32) die wäßrige lösung
in destilliertem Wasser dialysiert wurde (3 Mal jewels
500 ml /:=■ ,.. ■■../« destilliertes Wasser wurden alle 24
Stunden ersetzt),
'. ;" Wenn die Flüssigkeit inner hall) des Dialysefilms,
oder der JSiälysefölie unter verringertem Druck konzentriert
und filtriert wurde und die sich ergebende Flüssigkeit (etwa 50 ml) mit 300 ml Äthanol zur Abtrennung
einer Ausscheidung, versetzt wurde und anschliessend
die Ausfällung mit' einem Filter filtriert und
mit 'Äthanol und Jjthyläth'er nacheinander gewaschen wurde,
ergab sich l\Tatriumehondroitinpolysülfat in Form <.■
eines weißen Pulvers.- Das Pulver wurde bei 850O während
2 Stunden unter verringertem Druck getrocknet. Die Ausbeute betrug 7,6 g, der Schwefelgehalt war 11,10 $.
Das Produkt besaß ein mittleres Molekulargewicht "(ge- "
maß der Endgruppenanalyse) von 10 540·
Die Flüssigkeit außerhalb des Dialysefilms (1-500 ml)
wurde mit einer Bariumacetatlösung zur Ausfällung von anorganischen Schwefelsäureionen als Bariumsulfat
versetzt und das Sulfat wurde abzentrifugiert, worauf
109830/1803 .
BAD ORfGfNAt
die überstehend^Flüssigkeit unter verringertem Druck
"bis. auf eine Menge von etwa 30 ml konzentriert wurde..
Mach Entfernung einer geringen Meage an Verunreinigungen
durch liltration oder Zentrifugieren der konzentrier—
■'ten Flüssigkeit wurde die·. Flüssigkeit mit 250 ml ; ·■..
Äthanol, versetzt, um eine Ausfällung alDzutrennen.. Nach
Filtration der der Ausfällung 'durch ein Filter und aufeinanderfolgendes Waschen mit -Ithanol und Xthyl-.
' äther wurde latriumchondroitinpolysulfat ih· Form eines
weißen Pulvers -erhalten, das Taei 850O während 2 -S-üun-r-- -.- τ
den unter;verringerteffl, Druck getrocloiet wurde, Die
Ausbeute betrug 2^05 g, .der Schwefelgehalt war 10,28 ' fo
und das Produkt tesaß ein :λ mittleres Molekulargewicht-(aufgrund
der Endgruppenanalyse) von 5360»
Beispiel 4 '" :
50 ml eines im Handel· erhältlichen.Reagenzes
von konzentrierter Schwefelsäure erster Qualität mit ·
. einer Konzentration von mindestens 95$ wurden^ auf
eine Temperatur you..-6 bis -70O gekühlt, 'worauf 5 g V
ITatriumchondroitin-^sulfat (mittleres Molekulargewicht
36970); zugegeben und gelöst wurden. Die Mischung wurde bei der gleichen Temperatur während 2"Stunden
unter Rühren umgesetzt» Anschließend wurden unter: Halten der Reaktionsmischung auf einer Temperatur
1 09 8 3Ü/1
BAD
von unterhalb -50O- 250 ml Äthlyäther zugesetzt, um
das Reaktionsgemisch auszufällen« lach Abfiltrieren -der
Ausfällung durch ein Glasfilter und Waschen mit Äthyl-äther
wurde Chondroitinpolyschwefelsäure in Form eines weißen hygroskopischen Pulvers erhalten, das in
kaltem Wasser·" gelöst wurde. Der pH-Wert der Lösung wurde mittels einer Natriumhydroxydlösung auf 6,5
eingestellt? worauf unter Verwendung einer 'Dialysefolie
oder eines !Dialysefilms (im Handel erhältlicher TTiking-
'■.'■
■ Schlauch 36/32) die wäßrige Lösung in destilliertem-
Wasser.djalysiert wurde (wobei 3 Mal 300 ml jeWdU^
destilliertes V/aaser alle 24 Stunden ersetzt wurden)·
Wenn die Flüssigkeit innerhalb des Dialysefilms
• unter venangertem Druck konzentriert "und.filtriert
wurde und die sich ergebende Flüssigkeit (etwa 30 ml)
mit 150 ml .Äthanol zur Abtrennung einer Ausfällung
versetzt wurde und anschließend die erhaltene Ausfällung filtriert und nacheinander mit A'thanol und
,Athyläther gewaschen wurde, ergab sich Natriumchon- ·
droitinpolysulfät in Form eines weißen Pulvers, das bei 850O während 2 Stunden unter verringertem Druck
.getrocknet wurde. Die Ausbeute betrug 3,2 g, Der Schwefelgehalt war 10,70$«,. Das Produkt besaß ein
mittleres Molekulargewicht (gemäß der Endgruppenanalyse)
von 10960. - ·. . "
109830/1803
BAD ORiGfNAL
ie "Flüssigkeit außerhalb des Diaiysefilras
(etwa 900;ml) wurde'mit einer Bariumacetatlösung zur
Ausfällung von anorganischen Schwefelsäureionen als .
Bariumsulfat versetzt,welches· a"b zentrifugiert wurde,
worauf die überstehende Flüssigkeit unter verringertem
Druck "bis auf eine Menge von etwa 30 ml konzentriert wurde β Hach Entfernung von einer geringen Menge an . ·
Verunreinigungen durch Filtrieren oder Zentrifugieren der konzentrierten .Flüssigkeit wurde die Flüssigkeit
mit 250 ml Äthanol versetzt', um eine Ausfällung abzutrennen.
Nach Filtration der Ausfällung durch ein.-, filter und aufeinanderfolgendes ¥aschen mit Äthanol
und Äthyläther wurde Natriumchondroitinpolysulfat · in Form eines weißen" Pulvers erhalten, das bei 85 0 unter
•verringertem Druck während 2 Stunden getrocknet wurde. Die Ausbeute "betrug 1,05 go'Der Schwefelgehalt war
11,05\$o' Das Produkt "besaß ein mittleres Molekulargewicht
(aufgrund der Sndgruppenanalyse) von 4150»'
■ ■ Beipiel 5 -'-\ ■■■[...'/:\ .\ '' '■■/: ■;":. ■ : 'IV."
75 ml eines im SandelVerhaltlichen Reagenzes von
konzentrierter Schwefelsäure erster Qualität mit einer
Konzentration von mindestens 95'-$«■ wurden mit 25 ml
letrahydrofuran versetzt. Danach wurde die Mischung
mittels . •.TrQcjce.ne'isaceton gekühlt und die Innentem—
peratur "bei -30o0gehältene Dieser tlischung wurden ·
5 g- HatriumchOndroitin-o-sulfaii (mittleres Molekulargewicht 67200=) zugegeben und die Mischung'ti ei der vorstehend angegebenen temperatur während 2 Stunden unter:
Rühren umgfä$%$\'t ^^Ni^P'^
■ · , . -20- ■ t '
auf -3O0G gehalten wurde, wurde sie mit 400 ml Äthylätner
zur Ausfällung des Reaktionsprodukte, versetzt.
Each Abfiltrieren der 'Ausfällung durch ein Glasfilter
und Waschen mit Äthyläther wurde Chondroitinpoly- · '; schwefelsäure in Form eines weißen hygroskopischen
Pulvers erhalten. Dieses Pulver wurde in kaltem .Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mittels *
einer liatriumhydroxydlösung auf 6,5 eingestellt ,■ worauf
unter Verwendung.einer Dialysefolie oder eines
Dialysefilms (im Handel erhältlicher Visking-Schlauch 36/22)·
'ws 13 ΐ* i £? θ
die/Lösung in destilliertem Wasser (500 ml) dialysiert wurde.. In der Flüssigkeit außerhalb des Dialysefilms befand sich keine Chondroitinschwefelsäure..
die/Lösung in destilliertem Wasser (500 ml) dialysiert wurde.. In der Flüssigkeit außerhalb des Dialysefilms befand sich keine Chondroitinschwefelsäure..
Die Flüssigkeit innerhalb des Dialysefilms wurde bei verringertem Druck konzentriert und filtriert, die·
filtrierte flüssigkeit (ca,40 ml) -wurden'zur« Abtrennung
der Ausfällung 200 ml Äthanol zugegeben. Nach aufeinanderfolgendem
Waschen der Ausfällung· .mit Äthanol und Ithyläther
wurde Hatriumchondroitinpolysulfat in Form eines
weißen Pulvers erhalten, das bei 850C unter verringertem
Druck während 2 Stunden getrocknet wurde. Ausbeute: 4,1 g · ·
Schwefelgehalt: 9,57$ -. .
Schwefelgehalt: 9,57$ -. .
Mittleres Molekulargewicht (aufgrund der Endgruppenanalyse):
■'.'.,;■■■. ; ■.-■■". 48
ο ■■"...-■'.■■"
O0 10 ml (18/5 g) eines im Handel erhältlichen Reagenzes
o von konzentrierter Sciiwefelsäure erster Qualität wurden
^ auf eine-.Temperatur unterhalb O0C gekühlt und bei
g Zugabo von 5, g i4^t»/»«#*icHon*|ro»fi-n -6-sulfat und gleich-
SADORiGINAL
-förmigem Mischen wurde eine tr-iibe viskose Paste ".". ' / -erhalten,
die durchsichtig wurde, nachdem sie ;
30 Minuten auf einer !temperatur zwischen 0 und. -20C ;
gehalten-wurde,Diese durchsichtige Paste wurde ;
30 Minuten auf der gleichen Temperatur gehalten, anschließend in- einer kalten 5f» igen.wäßrigen HaOH^ ":
!lösung gelöst, um aus'der Paste' ©ine wäßrige-. Lösung
mit einem-pH-Wert von ungefähr 6,5>zu bilden.. - μ
Anschließend'wurden gemäß der-in Beispiel 1
■besöhriebenen Bialysierungsvorgänge Katriumohondroitinpolysulfat
mit einem mittleren Molekulargewichtvon 1028o (Ausbeute:2,9 g, Sehwefelgehalt: 10,81^)· und lfatriumcnon- :
droitinpolysulfat mit einem mittleren Molekulargewicht .
von 31Ϊ0 (Ausbeute; 1,6 gi,Sehwefelgehalt: 10;,QS°/o) erhalten. '. ·
109830/1803
Claims (1)
- Patentansprüche1» Verfahren zur Herstellung von Chondroitinpolysulfat, dadurch gekennzeichnet, daß man Chondroitinmonosulfat oder ein Salz desselben in einem flüssigen Reaktiomsmedium aus einer konzentrierten Schwefelsäure mit einer Konzentration von wenigstens 85 Grew.-$ bei einer Temperatur innerhalb des Bereichs von -300C bis +500C löst, die erhaltene Lösung bei einer Temperatur innerhalb des angegebenen Bereichs beibehält und aus der Reaktionsmischung das gewünschte Produkt in Form eines freien Esters oder dessen Salzes gewinnt,,2β Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ' man ein Reaktionsmedium mit einem Gehalt bis zu 50 Gew.-^. von einem aliphatischen Ither mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen verwendet,»3ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Auflösen des Chorpoitinmonosulfats oder dessen Alkalisalzes in dem Reaktionsmedium und nach Beibehaltung der Lösung auf dem angegebenen Temperaturbereich der Reaktionsmischung eine ausreichende Menge eines aliphatischen Äthers mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen zusetzt und dadurch die Ausfällung von GhonAroitinpolysulfat herbeiführt und das gewünschte Produkt gewinnt«109830/1803BAD ORIGINAL4β..-Verfahren nach. Anspruch 3, daäurch gekennzeichnet, daß man ein Reaktionsmedium mit einem Gehalt, "bis zu 50 Gew.-$ von einem aliphatischen Äther mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen verwendet» ■:""/ ; : ;5o Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Qhondroitinmonosulfat oder dessen Salz mit 200 bis 400 Volumenteilen je 100 Gew.-Teilen OhSindroitinnionosulfat des flüssigen, wenigstens 50 G£ew.~$ einer konzentrierten Schwefelsäure mit einer Konzentration von wenigstens 85^, besogen auf &ewi*ht, enthaltenden Reäktionsmediums bei einer Temperatur innerhalb des Bereichs von -3Ö bis+50 0 unter Bildung einer ¥isfcoeen Paste mischt, die erhaltene Paste auf einer Temperatur innerhalb des abgegebenen.Bereichs hält, die erhaltene Heaktionsmischung in einer überschüssigen Wassermenge Xost,.aus der wäßrigen Lösung die darin vorhandenen anorganischen Schwefelsäureionen entfernt und das gewünschte Produkt gewinnt*I0983Ö/1803
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| CH (1) | CH486495A (de) |
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