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Verfahren zur Gewinnung von koagulationshindernden Mitteln Die Erfindung
bezieht sich auf die Herstellung von koagulationshindernden Mitteln mit schwacher
toxischer Wirkung für die Verwendung bei Blut und Plasma und betrifft in erster
Linie ein Herstellungsverfahren, mit dem diese Stoffe auf einfachem Wege in großem
Maßstab hergestellt werden können.
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Es ist z. B. aus der französischen Patentschrift 914 844 bekannt,
koagn.lationshindernde Mittel durch Veresterung von Dextran mit einem den 5 O3H-Rest
abgebenden Mittel und Überführung des Dextransulfates in ein wasserlösliches Salz,
beispielsweise Alkali- oder Erdalkalisalz, zu gewinnen.
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Diese durch bekannte Verfahren erzeugten koagulationshindernden Mittel
auf Dextranbasis haben jedoch den Nachteil, daß sie wegen ihrer erheblichen toxischen
Wirkung im lebenden, insbesondere im menschlichen Organismus nicht ohne schädliche
Nebenwirkung verwendbar' sind. Der Grund für diese schädlichen Eigenschaften besteht
darin, daß das Molekulargewicht des dort verwendeten Dextrans in einer Größenordnung
von 200000 liegt, wobei als bekannt vorausgesetzt wird, daß die Toxizität von. Dextransulfat
mit zunehmender Größe seiner Moleküle ansteigt.
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Der einzige bisher angegebene kuagulationshindernde Stoff, dessen
toxis ehe Wirkung für die Anwendung »in vivo« schwach genug ist, ist Heparin.
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Er ist je!doch sehr teuer, da er nur aus Tierkavern in sehr geringen
Mengen gewonnen werden kann. Als Ersatz für Heparin dient
meistens
Natriumcitrat, das jedoch für diesen Zweck nicht als. vollweftig gelten kann.
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Ferner besitzen verschiedene Polysaccharide mit Sulfatgruppen koagulationschindernde
Eigenschaf tee ähnlich. denjenigen des Heparin, aber keines wurde als brauchbar
zur Anwendung »in vivo« erachtet.
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Eine kürzlich für die Verwendung als koagulationshindernder Stoff
vorgeschlagene Verbindung (vgl. Upsala Läkareförenings Förhandlinger, N.F.
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Bd. 50, Heft 5 und 6, S. 397 bis 404) ist ein Schwefelsäureester von
teilweise hydrolysiertem Dextran.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren. zur - Gewinnung von koagulationshindernden
Mitteln durch Veresterung von Dextran mit einem den SO;H-Relst a,bgebenden. Mittel
zu einem sauren Dextran sulfat, dessen Schwefelgehalt, bezogen auf sein Natriumsalz,
mehr als 9% beträgt, und Überführung des Dextransulfats in ein wasserlösliches Salz
und besteht im wesentlichen darin, daß als Ausgangsstoff ein Dextran mit einer Eingenviskosität
unter o,I2 verwendet wird, d:as durch Abbau eines Dextrans von hohlem Molekulargewicht
erhalten worden und frei von größeren Molekülen- ist.
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Gegenüber dem obenerwähnten bekannten Schwefelsäureester von teilweise
hydrolysiertem Dextran bestehen hinsichtlich der Eigenviskosität sowie der daraus
abgeleiteten Molekulargewichte folgende Unterschiede: Während das. im Fall der Erfindung
verwendete Dextran. bei einer Eigen-. viskosität unter O,I2 ein Molekulargewicht
von weniger als 22 ooo besitzt, hat das für die bekannten Dextransulfate verwendete
Dextran ein Molekulargewicht von 22 000 bis 200 000 und eine Eigenviskosität von
o, I2 an aufwärts, und zwar um so höher, je größer das Molekulargewicht ist.
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Bei der Gewinnung des für die Veresterung nach der Erfindung erforderlichen
Dextrans durch Abbau und anschließende Fraktionierung bzw. Spaltung eines Dextrans
von hohem Molekulargewicht werden Abbau und Spaltung vorzugsweise so weit getrieben,
daß die Eigenviskosität des Erzeugnisses zwischen 0,022 und 0,034, im Mittel bei
0,03, liegt.
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Für praktische Anwendung wird das gewonnene Reaktionsprodukt in ein
wasserlosliches Salz, beispielsweise das Salz eines Alkali- oder Erdalkalimetalls,
übergeführt. Einer wäßrigen Lösung des so erhaltenen gewonnenen Salzes kann ein
Puffer gegen Änderung des pE-Wertes, beispielsweise Natriumbicarbonat, zugesetzt
werden, so daß das Salz dann ohne Gefahr der Zersetzung in Autoklaven sterilisiert
werden kann. Bei einer 20°/oigen wäßrigen Dextransulfatnatriumlösung empfiehlt sich
ein Zusatz von 0,72% Natriumchlorid und 0,24% Natriumbicarbonat.
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Nachstehend wird die Erfindung an einem Ausführungsbeispiel erläutert:
I. Abbau eines Dextrans von hohem Molekulargewicht I 1 einer 6%igen wäßrigen Dextranlösung
wurde mit 100 ccm normaler Schwefelsäure versetzt und 4 Stunden unter Rückfluß gekocht.
Der pH-Wert betrug vor und nach dem Erhitzen 1,4. Die Lösung wurde mit etwa 100
ccm normaler Natronlauge neutralisiert. Dabei wurden 1158 ccm einer Lösung von abgebautem
Dextran erhalten. Als rohe Konrolle für das Ausmaß des hierbei erzielten Abbaus
wurde eine Probe zu einer 3'0/oigen Dextranlösung verdünnt, die eine relative Viskosität
von I,I6 in einem Vi.skosimeter nach Ostwald zeigte. Bei anderen Präparaten wurden
Werte von 1,11 bis 1,16 erhalten.
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2. Fraktionierung des abgebauten Dextrans Zu II45 ccm der Lösung
von abgebautem Dextran wurden 985 ccm Aceton zugesetzt, und zwar langsam und unter
kräftigem Rühren bei 200.
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Von dem sich absetzenden Sirup wurde die oben schwimmende Lösung möglichst
vollständig abgetrennt. Zu dieser abgetrennten Lösung wurden 1875 ccm Aceton zugesetzt,
wiederum langsam und unter kräftigem Umrühren bei 200, so daß das Verhältnis jetzt
250 ccm Aceton auf 100 ccm Dextranlösung betrug. Der Sirup wurde .abgetrennt, in
Alkohol geschüttet, zu Pulver gemahlen, mit trockenem Äther gewaschen und im Vakuum
iiber Phosphorpentoxyd getrocknet. Die Ausbeute betrug 31 g oder 50,5%, bei einem
anderen Versuch 58,5o. Die Eigenviskosität betrug 0,03. Bei drei Präparaten wurden
Eigenviskositäten von 0,022- bis 0,034 erhalten.
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Die unter 1 und 2 beschriebenen Arbeitsweisen bilden nicht den Gegenstand
der Erfindung.
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3. Veresterung In einem Glaskolben von 1 1 Inhalt wurden 400 ccm
trockenes Pyridin unter kräftigem Rühren durch ein Trockeneis-Alkohol-Bad gekühlt
und dann 88 ccm Chlorsulfonsäure tropfenweise zugesetzt. Die ausgefällten Pyridinsalze
wurden durch Rühren in Bewegung gehalten. Örtliche Erhitzungen, die durch Auftreten
einer gelben Farbe angezeigt würden, wurden vermieden.
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Nach dem Zusetzen der gesamten Chlorsulfonsäure wurde die Temperatur
unter Verwendung eines Wasserbades auf 650 erhöht, wodurch sich ein großer Teil
des ausgefällten Niederschlages wieder auflöste. 6o g feinpulvriges Dextran mit
einer Eigenviskos.ität - unter o,I2 wurden zugesetzt und in der Reaktionsmischung
durch Rühren verteilt. Die Temperatur wurde 4 Stunden auf 65 bis 700 gehalten und
die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen.
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4. Überführung in ein wasserlösliches Salz Der erhaltenen Mi.schung
wurden 1,5 1 zerkleinertes Eis und Wasser und dann eine 40%ige Natronlauge zugesetzt,
bis eine dunkelrote Farbe entstand und sich zwei Schichten bildeten, worauf die
dunkelrote obere Schicht aus Pyridin abgetrennt wurde.
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Dann wurde zu der unteren Schicht Wasser zugesetzt, bis sich ein
Endvolumen von 2 1 ergab, das Ganze auf 370 erhitzt und 2 1 Alkohol zugesetzt.
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Der nach 10 Minuten abgesetzte Sirup wurde abgetrennt und wieder
in Wasser gelöst, so daß sich ein Endvolumen von 850 ccm ergab. Die Lösung wurde
auf 370 erhitzt und mit 250 ccm Alkohol versetzt.
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Der nach 10 Minuten abgesetzte Sirup wurde wiederum abgetrennt und
in Wasser bei 370 gelöst, so daß sich ein Endvolumen von 640 ccm ergab.
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Dann wurden 640 ccm Alkohol zugesetzt.
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Der nach 10 Minuten abgeschiedene Sirup wurde wieder in 800 ccm Wasser
gelöst, die Lösung neutralisiert und in Teilmengen von 100 ccm aufgeteilt, die in
Röhren aus regenerierter Cellulose A8 Stunden einer Dialyse gegen fließendes Leitungswasser
unterworfen wurden.
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Die Lösung wurde wiederholt bei 500 mit Holzkohle behandelt, um die
Färbung möglichst vollständig zu beseitigen. Nach Einstellung des pH-Wertes auf
7 bis 7,5 wurde das anderthalbfache Volumen Aceton zugesetzt und der entstandene
Sirup abgeschieden (eine Spur Natriumchlorid erleichterte das Ausfällen). Der Sirup
wurde unter Rühren in absoluten Alkohol geschüttet. Der abgeschiedene feste Stoff
wurde zu Pulver.gemahlen, in der Zentrifuge mit Alkohol und dann mit trok -kenem
Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Die Ausbeute betrug
115,5 g Natriumsalz von saurem Dextransulfat = 85°/o. Das Produkt enthielt I7,I5
O/o Schwefel, und seine Aktivität betrug I7 internationale Heparineinheiten je mg.
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Es ist bekannt, daß ein koagulationshinderndes Mittel für therapeutische
Zwecke beim Menschen in einer bestimmten Dosis anwendbar ist, wenn die gleichwertige
Dosis, bezogen auf das Körpergewicht, bei Einspritzung in Versuchstiere keine Neigung
zu spontaner Hämorrhagie hervorruft.
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Diese Eignung ist im vorstehenden unter nicht bzw. schwach toxischer
Wirkung gemeint.