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Verfahren zur Herstellung von Polyschwefelsäureestern des Chitosans
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polyschwefelsäureestern des
Chitosans durch Sulfatierung von Chitosan.
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Die Sulfatierung von Chitosan nach dem üblichten Verfahren mittels
Chlorsulfonsäure in Gegenwart von Pyridin verläuft sehr schlecht. So erhält man
nur eine geringe Ausbeute an Chitosanpolyschwefelsäureester, wenn man Chitosan in
ein heißes Gemisch von Pyridin und Chlorsulfonsäure (3 : 1 Raumteile) einträgt.
Auch bei längerem Erhitzen von Chitosan in Pyridin, um es in einen gequollenen Zustand
überzuführen, und anschließender Behandlung mit dem Pyridin-Chlorsulfonsäure-Gemisch
werden keine wesentlich besseren Ergebnisse erzielt. Überdies ist diese Methode
zeitraubend, umständlich und in größerem Maßstab praktisch undurchführbar.
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Es wurde nun gefunden, daß die Sulfatierung von Chitosan sich leicht
beu:erkstelligen läßt, wenn das Chitosan vor der Sulfatierung in Lösung gebracht
wird, indem man das Chitosan gemäß der Erfindung in Form seiner Salze in Formamid
löst.
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Dementsprechend besteht das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
von Polyschwefelsäureestern des Chitosans darin, daß man Chitosan in ein Salz überführt,
dieses Salz in Formamid löst und auf diese Lösung Chlorsulfonsäure oder ein Gemisch
von Pyridin mit Chlorsulfonsäure einwirken läßt.
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Nach Helv. Chim. Acta, 35 (I952), 5. 574 bis 588, insbesondere 5.
577, ist Chitosan mit Gemischen aus S Q und S 03 oder S 02 und Cl O, H sulfatiert
worden. Aus der deutschen Patentschrift 870094 ist ferner bekannt, Polyschwefelsäureester
des Chondroitins durch Behandlung mit Cl 5 03 H in Formamid herzustellen. Wie schon
eingangs festgestellt, verläuft die Sulfatierung von Chitosan nach den üblichen
Verfahren mittels Chlorsulfonsäure und Pyridin sehr schlecht. Es ist deshalb erstaunlich,
daß sich die Salze des Chitosans in Formamid lösen und - im Gegensatz zu den vorbekannten
Methoden - gut steuerbar und in ausgezeichneter Ausbeute sulfatieren lassen.
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Neben dem Sulfatierungsvorgang inFormamid findet auch eine Formylierung
statt, die zu stabileren Verfahrensprodukten führt, als sie die nach vorbekannter
Weise erhältlichen unformylierten Chitosanpolyschwefelsäureester darstellen.
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Die erfindungsgemäße Umsetzung der gelösten Chitosansalze mit der
Chlorsulfonsäure verläuft homogen und läßt sich mit Leichtigkeit so leiten, daß
alle gewünschten Sulfatierungsgrade in reproduzierbarer Weise erzielt werden können.
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Die gemäß der Erfindung erhaltenen Chitosanpolyschwefelsäureester
sind blutgerinnungshemmende Substanzen mit heparinähnlicher Aktivität und sind in
jenen Fällen, in denen die blutgerinnungshemmende Wirkung des Heparins erwünscht
ist, für therapeutische Zwecke verwendbar. Die niedermolekularen Fraktionen der
erhaltenen Chitosanpolyschwefelsäureester können zum Klären von lipämischem Plasma
verwendet werden.
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Zweckmäßig wird das erfindungsgemäße Verfahren im einzelnen wie folgt
durchgeführt: Käufliches, vorzugsweise carbonatfreies Chitin wird durch Alkalischmelze
nach den Angaben von L ö w y (Biochem. Zeitschrift, 23, 5. 47 [I9I0]) entacetyiiert
(Dissertation Bruno C a m e r i n o, Zürich I945, S. 36). Das entstandene, von Alkali
befreite Chitosan wird in wäßrigen anorganischen oder organischen Säuren, vorzugsweise
einbasischen Säuren, wie z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure,
Ameisensäure, Essigsäure, gelöst und durch Zusatz von mit Wasser mischbaren Fällungsmitteln,
wie z. B.
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Aceton oder Methanol, zur Abscheidung gebracht.
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Sodann wird das Chitosansalz in Formamid gelöst, die Lösung unter
Kühlung mit Chlorsulfonw säure versetzt und die Mischung während längerer Zeit gerührt.
Das Reaktionsgemisch wird in der weiter unten beschriebenen Weise aufgearbeitet.
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Die auf diese Art hergestellten Produkte zeichnen sich dadurch aus,
daß sie noch freie Aminogruppen enthalten, wie sich durch Stickstoffanalysen nach
V a n S ly k e beweisen läßt. Die Zahl der freien Aminogruppen ist insbesondere
dann groß, wenn Chitosansalze starker Säuren, z. B. das Hydrochlorid oder das Perchlorat,
verwendet werden.
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Nach einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann man die Lösung des Chitosansalzes in Formamid in ein heißes Gemisch von Pyridin
und Chlorsulfonsäure eintragen und die Sulfatierung bei einer beliebigen Temperatur
zwischen 20 und I00° durchführen. Verfahrensprodukte dieserArt besitzen im allgemeinen
eine niedrigere Zahl von freien Aminogruppen.
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Es wurde festgestellt, daß bei der Sulfatierung des Chitosansalzes
in Formamid gleichzeitig eine Formylierung eines Teiles der freien Aminogruppen
stattfindet, so daß je nach den Reaktionsbedingungen Produkte mit einer größeren
oder kleineren Zahl von formylierten Aminogruppen entstehen. Ester mit vielen freien
Aminogruppen enthalten wenig Formyl, und umgekehrt. Somit kann die Beeinflussung
des Gehaltes an Formylgruppen durch die angegebenen Maßnahmen, wie z. B. Sulfatierung
von Salzen des Chitosans mit starken Säuren, mit oder ohne Pyridin, oder auch Sulfatierung
von Salzen des Chitosans mit schwachen Säuren, mit oder ohne Pyridin. erfolgen.
Einen niedrigen Formylgehalt (etwa 1,5 0/0 Formylgruppen) erzielt man beispielsweise
durch Sulfatierung des Chitosanhydrochlorid s ohne Pyridin, während man einen hohen
Formylgehalt (etwa 9 ovo Formylgruppen) durch Sulfatieren des Chitosanformiates
mit Pyridin erhält.
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Durch das neue Verfahren ist es also möglich. den Gehalt der Endprodukte
an freien Aminogruppen mit Hilfe von Salzen starker Säuren und wechselnder Mengen
Pyridin nach Wunsch zu steuern.
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Der Schwefelgehalt der Endprodukte des neuen Verfahrens ist abhängig
von der verwendeten Menge Chlorsulfonsäure sowie der Sulfatierungstemperatur und
der Sulfatierungsdauer und läßt sich nach Wunsch in weiten Grenzen variieren.
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Je nach den physikalischen Eigenschaften. die das Endprodukt besitzen
soll, kann man nach erfolgter Salzbildung entweder vor oder nach der Sulfatierung
in bekannter Weise einen partiellen Abbau der Chitosanmoleküle, z. B. mittels wä13-rigen
Wasserstoffsuperoxyds oder h- drols tisch mittels Säuren oder Alkalien, vornehmen.
Durch einen solchen Abbau werden Endprodukte erhalten deren Polymerisationsgrad,
verglichen mit demjenigen der Ausgangsprodukte, vermindert ist.
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Die blutgerinnungshemmende Wirkung der Endprodukte ist eine Funktion
des Schwefelgehaltes und des Polymerisationsgrades. Für solche Chitosanpolyschwefelsäureester,
di!e als Antikoagulantia Verwendung finden sollen, wird man einen hohen Schwefelgehalt,
z.B. von etwa I2 bis I60/o und einen hohen Polymerisationsgrad wählen. Es hat sich
nun überraschenderweise gezeigt, daß niedrigpolymere Chitosanpolyschwefelsäureester,
die praktisch keine oder nur eine schwache gerinnungshemmende Wirksamkeit zeigen,
eine gute Klärwirkung gegenüber lipämischem Plasma aufweisen und so-
mit
als Mittel gegen Arteriosklerose verwendet werden können. Es ist also möglich, ausgehend
von ein und demselben polymeren Grundskelett, mit dem neuen Verfahren durch Variation
der Kettenlänge zu biologisch verschieden wirksamen Polymerhomologen zu gelangen.
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Ein partieller Abbau läßt sich insbesondere in bekannter Weise dadurch
erreichen, daß man das Chitosansalz oder die Chitosanpolyschwefelsäureester mit
Wasserstoffpernxyd behandelt, wobei sich durch Variation des Peroxydgehaltes, der
Temperatur und der Reaktionszeit verschiedene Abbaugrade erhalten lassen. Ebenso
läßt sich ein Abbau hydrolytisch, entweder mit Säuren oder Alkalien; in bekannter
Weise herbeiführen. Eine weitere Möglichkeit, die Kettenlänge zu beeinflussen, besteht
prinzipiell in der Variation der Sulfatierungstemperatur, indem im allgemeinen ein
um so stärkerer Abbau eintritt, je höher die Sulfatierungstemperatur gewählt wird.
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Der Abbaugrad der Polymerisate wird viskosimetrisch charakterisiert
durch die sogenannte Viskositätszahl (intrinsic viscosity) [g], die durch folgende
Gleichung definiert ist: [#] = lim flspez. e+O C wobei #spez. = #L - #0/#0 = #rel.
- I bedeuten soll und t/L die Viskosität der Lösung, ilo die Viskosität des Lösungsmittels
und c die Konzentration in g/Ioo ccm darstellt. Der Grenzwert {j wird aus verschiedenen
Konzentrationen graphisch bestimmt, indem man beispielsweise 91Spez*/C gegen c aufträgt.
Die Viskositätsmessungen werden mit Ostwaldschen Viskosimetern bei 250 ausgeführt.
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Die nach dem neuen Verfahren erhaltenen Chitosanpolyschwefelsäureester
sind ihrer Natur nach poiydispers. Insbesondere dann, wenn eine Abbaustufe eingeschaltet
wird, ist es daher zwecks mäßig, nach erfolgter Salzbildung vor oder nach der Sulfatierung,
jedenfalls aber nach dem Abbau, eine Fraktionierung der erhaltenen Produkte vor
zunehmen und diejenigen Fraktionen auszuwählen, die nach Überführung in die Endprodukte
die erwünschten Eigenschaften aufweisen. Dies wird dadurch erreicht, daß man entweder
das Chitosan in Form seiner Salze oder die Chitosanpolyschwefelsäureester, vorzugsweise
in Form der Alkalisalze, in bekannter Weise fraktioniert. Zur Gewinnung von gerinnungshemmenden
höhermolekularen Chitosanpolyschwefelsäureestern wird man aus dem polydispersen
Gemisch die niedermolekularen Anteile abtrennen, während zur Gewinnung von für die
Arteriosklerosetherapie verwendbaren niedermolekularen Chitosanschwefelsäureestern
die höher molekularen Anteile entfernt werden müssen.
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Die Aufarbeitung der gebildeten Chitosanpolyschwefelsäureester nimmt
man zweckmäßigerweise so vor, daß der polymere Anteil des Sulfatierungsproduktes
mit Methanol, gegebenenfalls unter Zusatz von Natriumacetat zwecks Erleichterung
der Ausfällung, oder mit einem anderen geeigneten Fällungsmittel, wie Äthanol oder
Aceton, zur Abscheidung gebracht wird. Das Ausgefällte wird mit dem Fällungsmittel
gewaschen und in wenig Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Alkali auf p1I 9 eingestellt.
Dieser Lösung des rohen Alkalisalzes wird zwecks Fällung erneut Methanol, gegebenenfalls
unter Zusatz von Natriumacetat, zugesetzt. Das ausgefällte Produkt wird erneut in
Wasser gelöst, mit Eis versetzt und unter Rühren mittels konzentrierter Narkotinhydrochloridlösung
oder einer anderen geeigneten Alkaloidsalzlösung in das Narkotin- bzw. in das entsprechende
Alkaloidsalz übergeführt: Dieses Salz wird durch Zentrifugieren oder Filtrieren
isoliert, mit Wasser gut ausgewaschen und durch Eintragen in Alkalicarbonatlösung
entweder bei Zimmertemperatur oder auch bei etwas höherer Temperatur in das Alkalisalz
zurückverwandelt. Das ausgeschiedene Alkaloid wird abfiltriert und gut gewaschen.
Das Filtrat wird mit Eisessig neutralisiert, nötigenfalls eingeengt und dann mit
Methanol oder anderen mit Wasser mischbaren Fällungsmitteln behandelt. Dieses Ausfällen
kann nötigenfalls zwecks Reinigung oder Fraktionierung der Chitosanpolyschwefelsäureester
wiederholt werden.
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Für therapeutische Zwecke werden die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltenen Chitosanpolyschwefelsäureester, die sich durch eine geringe Toxizität
auszeichnen, vorzugsweise in Form ihrer Alkalisalze zur Anwendung gebracht.
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Beispiel I Zur Herstellung von Chitosanformiat wird Chitosan in verdünnter
Ameisensäure gelöst und der viskosen Lösung Aceton zugesetzt, um eine Fällung zu
erzielen. Das ausgefällte Produkt wird abgenutscht, getrocknet und gemahlen. Das
Produkt ist gut wasserlöslich [a7] = 1,04.
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Zwecks partiellen Abbaus werden IOOg dieses Chitosanformiates in
1 1 Wasser durch Erwärmen auf dem Dampfbad gelöst. Die Lösung wird mit 25 ccm 30%iger
Wasserstoffsuperoxydlösung versetzt und 2 Stunden im Thermostaten unter Rühren auf
700 erwärmt. Nach dieser Zeit ist das Peroxyd verbraucht. Das Reaktionsgemisch wird,
nötigenfalls nach Filtrierung, im Vakuum auf 450 ccm eingedampft. Das Konzentrat
wird unter Rühren mit 3 1 Aceton ausgefällt. Nach Abdekantieren des wäßrigen Acetons
wird das ausgefällte Material zwecks Härtung mit 500 ccm frischem Aceton übergossen,
nach einigem Stehen abgenutscht und getrocknet. Ausbeute gog; [W] = o, I90.
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Zur Sulfatierung werden go g dieses abgebauten Chitosanformiates
unter Rühren in 900 ccm auf 500 erwärmten Formamids gelöst. Nun wird die Lösung
mit Eiswasser gekühlt, und bei etwa 100 werden langsam i8o ccm Chlorsulfonsäure
zugetropft. Anschließend wird das Reaktionsgemisch zur Beendigung der Reaktion über
Nacht bei Zim-
mertemperatur weitergeführt. Sodann wird das Gemisch
durch Filtercellulose genutscht und das Filtrat durch Rühren mit 31 Methanol, in
denen I20 g Natriumacetat gelöst sind, gefällt. Der Niederschlag wird isoliert und
in wenig Wasser gelöst. worauf die Lösung mit konzentriertem Alkali auf pH 9 eingestellt
und erneut mit Methanol gefällt wird. Das rohe Natriumsalz löst man in etwa I,5
1 Wasser und gibt der Lösung 500 g Eis zu. Nun wird diese Mischung unter Rühren
mit einer Lösung von 280 g Narkotinhydrochlorid in 1 1 Wasser versetzt, wobei das
Narkotinsalz ausfällt. Dieses wird durch Filtration isoliert und mit etwa 1,5 1
kaltem Wasser gewaschen. Anschließend wird das Narkotinsalz in etwa I,51 Wasser
suspendiert und die Suspension mit 60 g fester Soda versetzt und über Nacht gerührt.
Das ausgefallene Narkotin wird abgenutscht und mit etwa I 1 Wasser gewaschen. Das
Filtrat wird mit Eisessig auf p1I 5 eingestellt, unter vermindertem Druck auf etwa
450 ccm eingedampft und mit 3 1 Methanol, in denen 30 g Natriumacetat gelöst sind,
gefällt.
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Diese Prozedur wird nochmals wiederholt. Nach Trocknen unter vermindertem
Druck werden 110 g eines weißen Pulvers vom Schwefelgehalt 15,1 % und [#] = 0,072
(in 0,5 n-NaCl) erhalten; Gesamtstickstoffgehalt: 3,39%; Stickstoffgehalt nach V
a n S l y k e (freie Aminogruppen): 1,20%; Gehalt an formylgruppen: 3,2%. Dieses
Produkt wirkt sehr schwach gerinnungshemmend, zeigt aber eine gute Klärwirkung für
lipämisches Plasma.
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Beispiel 2 go g von gemäß Beispiel I hergestelltem Chitosanformiat
werden mit Formamid zu einem Teig verrieben und unter Rühren und Zusatz vGn insgesamt
900 ccm Formamid bei 50° gelöst. Man entfernt kleinere ungelöste Klumpen durch Filtrieren
und führt dann die Sulfatierung nach den Angaben von Beispiel 1 mit I80 ccm Chlorsulfonsäure
aus. Das Sulfatierungsgemisch wird in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise aufgearbeitet.
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Der gewonnene Chitosanpolyschwefelsäureester besitzt einen Schwefelgehalt
von 12,6%; [#] = 0,315 (in 0,5 n-NaCl); Gesamtstickstoffgehalt: 3,05%; Stickstoffgehalt
nach V a n S l y k e (freie aminogruppen): 0,5%; Gehalt an Formylgruppen: 6 /o.
Das Präparat besitzt in vivo eine gute gerinnungshemmende Wirkung und kann als Antikoagulans
verwendet werden.
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Beispiel 3 50 g Chitosan werden in etwa 1200 ccm Wasser suspendiert
und unter Rühren mit etwa 30 ccm konzentrierter Salzsäure versetzt, wobei eine hochviskose
Lösung entsteht. Aus dieser Lösung wird durch Zugabe von etwa 3 1 Aceton Chitosanhydrochlorid
ausgefällt, das abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet wird.
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Man löst 10 g dieses Chitosanhydrochlorids in 60 ccm Formamid durch
Erwärmen auf 70°. Die erhaltene Lösung wird in eine bei 70° geschmolzene Mischung
von 90 ccm Pyridin und 30 ccm Chlorsulfonsäure eingetragen, wobei die Temperatur
auf 850 steigt. Infolge Zersetzung des Formamids entsteht eine Gasentwicklung. Nun
wird das Reaktionsgemisch 2 Stunden bei 90° gerührt und die Mischung in der im Beispiel
1 beschriebenen Weise aufgearbeitet. Das erhaltene Produkt besitzt die folgenden
Eigenschaften: Schwefelgehalt: 14,8%; [#] = 0,270 (in 0,5 n-NaCl); Gesamtstickstoffgehalt:
4,26%; Stickstoffgehalt nach V a n S l y k e: 0,16%; Gehalt an Formylgruppen: 6
%.
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Beispiel 4 5 g Chitosanhydrochlorid werden in 75 ccm Formamid auf
dem Dampfbad gelöst. Die Lösung wird anschließend mit Eiswasser auf 5 bis I0° abgekühlt.
Dann läßt man langsam 15 ccm Chlorsulfonsäure zutropfen und rührt das Gemisch 24
Stunden bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird in der im Beispiel 1 beschriebenen
Weise aufgearbeitet. Das erhaltene Produkt weist die folgenden Eigenschaften auf:
[#] = 0,245; Schwefelgehalt: 16,24%; Gesamtstickstoffgehalt: 3,58 0/o; Stickstoffgehalt
nach V a n S I v k e: Z,gO 0/(> Beispiel 5 340 g nicht abgebautes Chitosanformiat
werden in 5,8 1 Formamid eingetragen und 24 Stunden bei Zimmertemperatur und anschließend
noch 5 Stunden bei 600 gerührt. Die erhaltene hochvislrose Lösung wird anschließend
in eine Schmelze von 680 ccm Chlorsulfonsäure und 2040 ccm Pyridin eingetragen.
Das Sulfatierungsgemisch wird 4 Stunden bei 90° erhitzt. Nach der im Beispiel 1
beschriebenen Aufarbeitung wird ein Chitosanpolyschwefelsäureester mit einem Schwefelgehalt
von 12,7% erhalten. [#] = 0,48 (0,5 n-NaCl); Gesamtstickstoffgehalt: 4,34%; Stickstoffgehalt
nach V a n S l y k e : 0,07%; Gehalt an Formylgruppen: 8,7%.