DE1468964A1 - Sulfatierte Amylopektine und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

Ge D. Searle & Co.
Chicago 80, 111., V.St.A.

Sulfatierte Amylopektine und Verfahren zu deren Herstellung.

Die vorliegende Erfindung betrifft wasserlösliche anionische Polysaccharidderivate, insbesondere sulfatierte Amylopektine, die im wesentlichen eine bis eindreiviertel Sulfatgruppen pro Glucoseeinheit enthalten, sowie das Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die aus irgendeiner der üblichen Quellen, z.B_e aus Kartoffeln, erhaltene Stärke enthält zwei verschiedene und trennbare Komponenten, nämlich Amylose, die nur lineare Ketten aufweist, und Amylopektin, das sowohl lineare als auch verzweigte Ketten besitzt. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften jeder Komponente hängen ab von der Quelle, aus der die Stärke stammt, wie auch von dem bei der Trennung angewandten Fraktionierver— fahren« Ein besonderes Charakteriatikum ist die Molekülgröße, die sich aus Messungen von Molekulargewicht und Molekülform ergibt«, Die Bestimmungen erfolgen durch Lichtstreuungs- und Viskosität smesaungen·

Im Amylopektinmolekül sind die linearen Ketten, die durch

Uniprlaaen. (*t. 7 ν /au :w. ι ζ-.·_Λ

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1,4-Glycosidbindungen verbundene, sich wiederholende Glukoseein-· heiten enthalten, an der Verästelung beteiligt, wobei sie typischerweise durch 1,6-Glycosidbindungen vernetzt sind. Diejenigen Glucoseeinheiten, die nur die 1,4-Bindurig .-aufweisen, besitzen drei potentiell reaktionsfähige Hydroxylgruppen, wahrend die Einheiten, die auch die 1,6-Bindung aufweisen, nur zwei Hydroxylgruppen für Umsetzungen verfügbar haben. Aus der Tatsache, daß nur etwa 2 bis 4 # der Glucoseeinheiten im Amylopektin über Seitenketten verbunden sind, ergibt sich jedoch, daß durchschnittlich fast drei potentiell reaktionsfähige Hydroxylgruppen pro Glucoseeinheit vorliegen. So kann durch kontrollierte Vereste— rung der verfügbaren Hydroxylgruppen der Substitutionsgrad vari-

e iert werden» Nach dem vorliegenden Verfahren werden sulfatierte Antylopektine mit unterschiedlichem Substitutionsgrad (d.h. im wesentlichen mit ein bis zwei Sulfatgruppen pro Glukoseeinheit) hergestellt.

Das vorliegende Verfahren zur Herstellung von hochgradig und rasch wasserlöslichen sulfatierten Amylopektinen mit im wesentlichen 1 bis 1 3/4 Sulfatgruppen pro Glukoseeinheit und Molekulargewichten von mehr als 1 X 1OX besteht darin, daß man min jmal abgebautes Amylopektin mit einem Sulfatierungsmittel zusammenbringt, das imstande ist, Hydroxylgruppen zu sulfatieren. Bei der Wahl des Ausgangsmaterials wurde festgestellt, daß Molekulargewicht und der Grad der bei der Fraktionierung erfolgten Depolymerisation besonders wichtige Kriterien darstellen. Ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 10 bis 3x10 ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders geeignet (in der vorliegenden Beschreibung ist unter "Molekulargewicht" stets ein mittleres Molekulargewicht zu verstehen). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist das aus Kartoffelstärke (ζ·Β· durch selektive Ausfällung mit gewissen anorganischen Salzen naoh dem Verfahren der U.S„-Patentschrift Nr. 2.829.987) erhaltene Amylopektin ein speziell bevorzugtes Ausgangsmaterial, offensichtlich weil sein Molekulargewicht von der Größenordnung

6x10* innerhalb des optimalen Bereichs liegt«, Die bevorzugten sulfatierten Produkte gemäß vorliegender Erfindung sind durch

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ein Molekulargewicht derselben Größenordnung gekennzeichnet, das sich aus deni mit minimalem Abbau verbundenen Sulfatierunge— bedingungen: ergibt. Stärkefraktionen mit niedrigerem Molekulargewicht (z.B. aus Mais hergestellte Amylosen oder Amylopektine) ergeben Produkte, die — ungeachtet der angewandten Sulfatierungsmethode - für die 2wecke der vorliegenden Erfindung, nämlich zur therapeutisch wirksamen Pepsin-Inhibierung, weniger geeignet sind· Auch das nach dem Verfahren des österreichischen Patents 220»294 erhältliche Produkt 1st dadurch mit Nachteilen behaftet, daß es einer molekularen Zersetzung unterliegt (die sich in einer Viskositätsänderung äußert) und dementsprechend auch die biologische Wirkung nicht reproduzierbar und die pharmakologische Wirkung nicht voraussehbar ist. I

Bs wurde gefunden, daß bei der Durchführung des erfindungsgemäßeDL Verfahrens das Ausmaß der Sulfatierung des Amylopektinmoleküle durch Auswahl geeigneter Reaktionsbedingungen, wie Auswahl des Sulfatierungsmittels. Verhältnis von SuIfatierungsmittel zu Polyeaooharid, Zeit_r Temperatur und pH-Wert des Reaktionsgemische s, beliebig gesteuert werden kann. Zu der Vielzahl von Verbindungen, die für die Sulfatierung verwendet werden können, gehören Chloreulfonsäure, Alkalimetallchlorsulfonate, Sulfaminsäuren Sulfurylchlorid, gasförmiges Schwefeltrioxyd, eine Mischung von Natriumnitrit und Natriumbisulfit und Komplexe von Schwefeltrioxyd mit einer organischen Base, (a.B_e Schwefeltrioxyd-Trimethylamin, Sohwefeltrioxyd-Triäthylamin, Schwefeltrioxyd-Pyridin, Schwefeltrioxyd*· Dioxan, Schwefeltrioxyd-Dimethylanilin und Schwe· feltrioxyd~!is-(2~chloräthyl)-äther)· Mit der Auswahl des geeigneten Sulfatierungsmittels ergeben sioh entsprechende Reaktionsbedingungen (wie Zeit, Temperatur, pH-Wert und Lösungsmittel) für den Fachmann von selbst. Ein Fachmann wird beispielsweise die Notwendigkeit erkennen, die außerordentlich hydrolytische oder abbauende Wirkung gewisser Sulfatierungsmittel durch Verwendung eines ausgleichenden Lösungsmittels zu mildern, z.B. kann Chlorsulfonsäure zweckmäßig in Pyridin oder formamid verwendet werden. Die Anwendung eines großen Überschusses an einem starken 3ulfa~ tierungsmittel, z.B. Chlorsulfonsäure unter den durch P. Bernfeld u.a. J. BiQl. Ohem. Band 225, Seite 2852 (1960) beachriebe-

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nen Bedingungen sollte vermieden werden, da hierbei Verbindungen erhalten werden,, die nicht wasserlöslich und infolgedessen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unerwünscht sind.

Bin besonders brauchbares Sulfatierungsmittel ist der Schwefeltrioxyd-Trimethylamin—Komplex. Das Verfahren kann ¥ bei Verwendung dieses Reagens bequem in Wasser in Gegenwart eines Alkalis und vorzugsweise bei einer Temperatur von 0 bis einschließlich 100°C in 2 bis 100 Stunden durchgeführt werden,, Da Temperatur und Reaktionsdauer sich wechselseitig beeinflussen» erfordert die Anwendung einer niedrigeren Reaktionstemperatur eine längere Reaktionszeit. Die Verbindungen, die unter den hier ^ beschriebenen Bedingungen hergestellt werden, gaben keinen spektrophotometrisehen Hinweis auf Schwefelbrücken-Vernetzung.

Den erfindungSjgemäßen Amylopektinsulfaten gleichwertig sind die pharmazeutisch verwertbaren, nicht-giftigen Salze dieser Verbindungen, die bequem mit einer Vielzahl von metallischen Kationen, Ammonium!onen und organischen Basen gebildet werden kÖnnen_e Derartige Salze werden mit metallischen Kationen wie Alkalime— tallkationen, vorzugsweise Natrium, mit Ammoniumionen und mit organischen Basen, wie Aminen, zweckmäßigerweise Trimethylamin und Triäthylamin, und mit verwendeten Salzen gebildet·

Geeignete Verfahren zur Isolierung und Reinigung der er— ) findungsgemäßen sulfatierten Amylopektine und ihrer Salze sind unter anderem die folgenden, für sich oder in Kombination miteinander ι Zentrifugieren, Lyophilisieren, d.h. Gefriertrocknung, Dialyse, Trocknung, Alkoholfällung und Fällung mittels quaternärer Ammoniumsalze·

Die vorliegenden, erfindungsgemäßen sulfatierten Amylopektine und deren Salze (die im wesentlichen eine bis eindreiviertel Sulfatgruppen pro Glukoseeinhßit enthalten), sind nützlich in- ' folge ihrer wertvollem pharmakologisehen Eigenschaften· Beispiel*· weise besitzen sie eine hohe Wirksamkeit als Pepsin-Inhibitoren und antiuleerogene Mittel· Besonders wirksam sind die Alkalime-

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tall- und Ammoniumsalze,, die auch wegen ihrer erhöhten Beständigkeit und schnellen Wasserlöslichkeit bevorzugt werden» Es wurde gefunden, daß im allgemeinen solche Bedingungen, die zu Salzen mit mehr als 1,8 Sulfatgruppen pro Glukoseeinheit führen, bedeutend schlechter wasserlösliche und damit weniger erwünschte Produkte ergeben·

Von den vorliegenden Salzen sind die (12 bis 16,5 i° Schwefel enthaltenden) Natriumsalze besonders gute Pepsininhibitoren und anti-ulcerogene Mittel· Bas Natriumsalz, das im wesentlichen 1,6 Sulfatgruppen pro Glukose-Einheit enthält, ist ein ganz be- . sonders wirksames Pepsin-hemmendes und anti-ulcerogen.es Mittel. Eine bevorzugte AusfüllungsforiB der Erfindung stellen die Natriumsalze von sulfatierten Kartoffelstärke-Amylopektinen mit ca. 1,6 und ca. 1,8 Sulfatgruppen pro Glukoseeineit dar. Sie er« wiesen sich in vitro als wirksame Inhibitoren der proteolytischen Wirksamkeit des Pepsins, sowie als Inhibitoren der corticoid induzierten Geschwürbildung bei Ratten« Ferner inhibieren sie Magengeschwüre bei Pylorus-gebundenen fastenden Ratten (Shay—Ratten) völlig, ohne d;:bei die unerwünschte Atropin—artige anticholinergisehe Wirkung der bisherigen Mittel gegen Geschwüre auszuüben· Das Natriumsalz mit ca. 1,6 Sulfatgruppen pro Glukoseeinheit ist durch ein optimales Molekulargewicht von etwa 6,3*

7
10 , und das Natriumsalz mit ca. 1,8 Sulfatgruppen pro Glukoseeinheit durch ein optimales Molekulargewicht von etwa 12,5x10 gekennzeichnet·

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen auch eine mäßige anti-coagulierende Wirkung und eine vernach— lässigbare anti-lipänische Wirkung aufweisen«

Die in den folgenden Beispielen angegebenen Mengen sind Gewichteteile „ sofern nicht anders vermerkt·

Beispiel 1

Einer Suspension von 100 Teilen Amylopektin aus Kartoffelstärke in 200 bie 800 Teilen Wasser werden nacheinander 25-50

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Teile 10-50 <f> Natriumhydroxyd und 100-400 Teile des gchwefeltrjjoxyd-Trimethylamin-Komplexes zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird kräftig, etwa 12 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur und dann 1 bis 15 Stunden bei 40 bis 60 C gerührte

Das erhaltene Gemisch wird dann nach einem der vorstehend beschriebenen. Verfahren oder einer Kombination dieser Verfahren gereinigt und ergibt das Natriumsalz, des sulfatierten Kartof— felstärke-Amylopektins, das im wesentlichen 1 bis 1-3/4 Sulfatgruppen pro Glukoseeinheit enthält.

Die Verwendung von 100 Teilen Kartoffelstärke-Amylopektin, 600 Teilen Wasser, etwa 35 Teilen 10-prozentigen watriumhydroxyds und 300 Teilen des Schwefeltrioxyd-Trimethylamin-Komplexes im vorstehenden Verfahren bei Raumtemperatur für die Dauer von 18 Stunden und danach bei 50 C für die Dauer von 5 Stunden ergab nach Dialyse und Sprühtrocknung das Iiatriumsalz des sulfatierten Kartoffelstärke-Amylopektins, das im wesentlichen 1,6 SuI-fatgruppea pro Glukoseeinheit enthielt, (15,7 # S) in Form eines Pulvers, Diese Substanz ist durch ein Molekulargewicht von ca, 6*3x10 (Lichtstreuungsmethode) gekennzeichnet.

Auf ähnliche Weise erhält man durch Verwsndung einer äquimolaren Menge Ammoniumhydroxyd anstelle des im vorstehenden, Verfahren verwendeten Natriumhydroxyds das Ammoniumsalz des sulfatierten Kartoffelstärke-Amylopektins mit im wesentlichen 1 bia 1-3/4 SulfatgruppeHi pro Glukoseeinheit, bezw, das Ammoniumsalz des sulfatierten Kartoffelstärke-Amylopektins mit im wesentlichen 1,6 Sulfatgruppen pro Glukoseeinheit·

Beispiel 2

Zu etwa 75 Teilen Pyridin werden bei 10 bis 2O⁰C innerhalb von etwa 2 Stunden 12 Teile Chlorsulfonsäure zugegeben. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch auf etwa 70⁰C erhitzt, und 2 Teile Kartoffelstärke-Amylopektin werden unter Rühren zugegeben« Daa Erhitzen und das Rühren werden etwa 2 Stunden fortgesetzt; danach wird das Rühren beendet, und das Gemisch wird abgestellt,

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7 — ! t υ υ υ υ

um das Absetzen des Produktes zu ermöglichen. Die heiße oben— schwimmende Schicht wird durch Dekantieren entfernt und verworfen. Der Fällung werden etwa 70 Teile Wasser zugesetzt, und dann wird konzentrierte Salzsäure bis zum Erreichen eines pH-Wertes von etwa 2 zugegeben» Das erhaltene wässrige saure Gemisch wird unter kräftigem Rühren zu etwa 165 Teilen 2-Propanol zugesetzt« Nach Ablauf von etwa 30 Minuten stellt man das Rühren ein und }£ läßt den Niederschlag sich absetzen. Die obensehwim— mende Flüssigkeit wird dekantiert und verworfen. Etwa 60 Teile Wasser werden der Fällung zugesetzt, und diese wässrige Mischung wird gerührt, bis sie vollständig gelöst ist. Dieser liösung wird sorgfältig 10 # wässriges Natriumhydroxyd bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 6*25 zugesetzte dann wird diese Lösung zu etwa 165 Teilen 2-Propanol zugegebene Nach etwa 10-minütigem Rühren läßt man den Niederschlag sich absetzen; die Isopropylalkoholphase wird durch Dekantieren abgetrennt und verworfen. Der Fällung werden dann etwa 40 Teile Wasser zugesetzt, und das erhaltene Ge** misch wird etwa 16 Stunden lang gerührt. Der pH-Wert wird durch die Zugabe von 10 % wässrigem Natriumhydroxyd auf etwa 8,5 eingestellt, und diese alkalische Lösung wird zu etwa 165 Teilen 2-Propanol bei einer Temperatur von etwa 10⁰C zugegeben· Nach 15 Minuten. Rühren und 10 Minuten Stehen wird die obenschwimmende 2-Propanollösung abdekantiert, und der Niederschlag wird mit etwa 60 Teilen Wasser gerührt« Dieses wässrige Gemisch wird durch Zentrifugieren geklärt; dann wird es durch Versprühung getrocknet und ergibt das Natriumsalz dee sulfatierten Kartoffeletärke-Amylopektins als ein weißes Pulver. Das Produkt enthält im wesentlichen 1 „8 Sulfatgruppen pro Glukoseeinheit (18,4 i» S) und hat ein Molekt
ungsverfahren,

hat ein Molekulargewicht von etwa 12,5x10 nach dem Lichtstreu-

Beispiel 3

Zu 284 Teilen Pyridin werden tropfenweise unter Rühren 18 Teile Chlorsulfonsäure zugesetzt, während die Temperatur bei etwa 50⁰O gehalten wird. Die Temperatur wird dann auf etwa 77⁰C erhöht, und es werden T Teile Amylopektin aus Kartoffelstärke zugegebene Rühren und Erhitzen werden etwa eine Stunde fortgesetzt

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und nach Ablauf dieser Zeit wird das Reaktionsgemisch abgestellt, damit das unlösliche Material sich absetzen kann. Die obenschwim— mende Pyridinlösung wird durch Dekantieren entfernt, und der zurückbleibende Feststoff wird in 200 Teilen Wasser gelöste Diese wässrige lösung wird durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf den pH-Wert 1,6 angesäuert und dann in 1280 Teile Äthanol gegossen. Das erhaltene Gemisch wird für etwa 16 Stunden bei 0 bis 5°C abgestellt. Nach Dekantieren: der obenschwimmenden Flüssigkeit verbleibt ein fester Rückstand, der in 200 Teilen Wasser gelöst wird· Diese wässrige lösung wird durch die Zugabe von verdünntem Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von etwa 9 alkalisch gemachte Die iyophilisierung eines Teils dieser wässrigen lösung mit dem pH-Wert 9 ergab das Natriumsalz des sulfatierten Kartoff eletärke-Amylopektins, das im wesentlichen 1,2 Sulfatgruppen pro Glukoeeeinheit (12,8 # S) enthielt.

Der Rest dieser wässrigen alkalischen lösung wurde etwa Minuten lang mit 3600 Umdrehungen/Minute zentrifugiert; die obenschwimmende Flüssigkeit wurde durch lyophilisieren getrocknet und ergab das Natriumsalz des sulfatierten Kartoffelstärke-Amylopektins, das im wesentlichen 1,6 Sulfatgruppen pro Glukoseeinheit enthielt (14,4 # S)·

lyophilisieren einer Suspension des Rücketands ergab das Natriumsalz des sulfatierten Kartoffelstärke-Amylopektins, das im wesentlichen eine Sulfatgruppe pro Glukoseeinheit enthielt ( 15, 4JtB).

Beispiel 4

Einer Suspension von 100 Teilen K&rtoffelstärke-AmylopektiB. in 400 Teilen Wasser werden nacheinander 35 Teile 15-prozentiges Natriumhydroxyd in 300 Teilen des Schwefeltrioxyd-Trimethylamin-Komplexes zugegeben. Das Reaktionsgemisoh wird etwa 26 Stunden lang bei Raumtemperatur und dann a&efe 14 Stunden lang bei 48° C kräftig gerührt. Der neutralen lösung wird eine quaternäre Ammoniumverbindung, wie Oetyltrimethylammoniumohlorid zugesetzt,

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Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt, um das ausfallende quaternäre Ammoniumderivat wird durch Suspendieren des Niederschlags in Wasser entfernt, getrocknet und ergibt das quaternäre Ammoniumsalz des sulfatierten Kartoffelstärke— Amylopektin»,, das im wesentlichen 1,5 Sulfatgruppen pro Glukose einheit enthält·

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Claims (7)

Betrat Patentanmeldung P 14 68 964»6 G· De- Seorle & Co, - unsere Nr. 10 675 - Patentansprüche

1. Stark wasserlösliche pepsinhemmende antiulcerogene sulfatierte Amylopektine_r die je Glukoseeinheit 1 bis 1,8 Sulfatgruppen enthalten, von Amylopektin aus Kartoffelstärke abgelei-

7 tet sind, ein Molekulargewicht von über 1 χ 10 aufweisen und bei der Sulfatierung unter einen Abbau weitestgehend ausschaltenden Bedingungen so wenig wie möglich abgebaut wurden, und deren wasserlösliche Salze.

2» Alkalimetall- und Ammoniumsalze der sulf atierten Amylopektine nach Anspruch 1»

3. Hatriumsalze der sulf atierten Amylopektine nach Anspruch 1 und 2.

4· Fatriumsalze der sulf atierten Amylopektine nach Anspruch

1 bie 3 mit im wesentlichen 1,6 Sulfatgruppen je Glukoseeinheit

7 und einem Molekulargewicht von etwa 6,3 x 10 ,

5· Natriumsalze der sulf atierten Amylopektin» nach Anspruch

1 bis 4 lait im wesentlichen 1,8 Sulfatgruppen je Glukoseeinheit

7 und einem Molekulargewicht von etwa 12,5 x 10·

6« Verfahren zur Herstellung von pepeinhemmenden und antiuloerogenen, hochgradig und schnell wasserlöslichen, «ulfatierten Aaylopektinen mit im wesentlichen 1 bis 1-3/4 Sulfatgruppen pro

7 Glukoseeinheit und Molekulargewichten von mehr als 1 χ 10 sowie

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-/·- U68964

von deren hochgradig und schnell wasserlöslichen Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß minimal abgebautes Amylopektin aus Kartoffelstärke mit einem Sulfatierungsmittel_f von dem bekannt ist, daß es Hydroxylgruppen sulfatiert, unter nur geringen Abbau verursachenden Bedingungen zusammengebracht wird, bis im wesentlichen 1 bis 1—3/4 Sulfatgruppen pro GlukOBeeinheit eingeführt worden sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Sulfatierungsmittel Schwefeltrioxyd-Trimethylamin verwendet wird.

8β Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die hochgradig und schnell wasserlöslichen Salze die Alkalimetall- und Ammoniumsalze sind»

9· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die hochgradig und schnell wasserlöslichen Salze die Ifatriumsalze sind«

pur G. D. Searle & Co. H Chicago 80, 111., V.St.A.

füll

Heclitsanwalt

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