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Verfahren zur Herstellung von Dextran-Produkten für pharmazeutische
und therapeutische Präparate
Ebenso wie teilweise hydrolisiertes oder gespaltenes
Dextran ist Rohdextran polydispers, also in bezug auf sein Molekulargewicht nicht
gleichförmig, d. h. ein Gemisch aus Dextranen verschiedener Molekülgröße.
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Besonders wenn Dextranlösungen intravenös injiziert werden, z. B.
wenn teilweise gespaltenes Dextran als Plasmaergänzungsmittel verwendet wird, wurde
festgestellt, daß der physiologische Effekt der Dextranmoleküle unter anderem in
hohem Grade von der Größe dieser Moleküle abhängt. Zu große Dextranmoleküle verursachen
schädliche Wirkungen bei intravenöser Infusion, und zu kleine Dextranmoleküle können
die Blutgefäße durch die Kapillaren und durch die aus haarförmigen Geflechten bestehenden
Membranen in den Nieren zu schnell verlassen. In ähnlicher Weise wird die Viscosität
der Lösung von Dextran oder teilweise gespaltenem Dextran, wie es für pharmazeutische
Präparate benutzt wird, durch dasMolekulargewicht bestimmt. Auch wenn Dextran in
Lösungen für Funktionsprüfungen, z. B. der Nieren, angewendet wird, ist es von großem
Vorteil, Dextranpräparate zu benutzen, welche in bezug auf ihre Molekulargröße gleichmäßiger
sind.
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Die Erfindung beschäftigt sich deshalb mit der Aufgabe, aus Dextran
durch fraktionierende Behandlung Dextranfraktionen von möglichst einheitlicher Molekülgröße
zu gewinnen, die therapeutisch besonders wirksam sind. In einer früheren Veröffentlichung
ist zwar die Möglichkeit angedeutet, durch eine nicht ganz vollständige Ausfällung
mit Alkohol ein Dextran-
präparat von einem Teil der allerkleinsten
Moleküle zu befreien. Dadurch werden aber nicht scharf umrissene Fraktionen des
Dextrans in einem eindeutigen zwei- oder mehrstufigen Fraktionierungsverfahren gewonnen.
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Es ist außerdem bekannt, rohes Dextran, welches etwa 01o bakterielles
Protein enthält, von dessen größtem Teil durch wiederholte Filtration zu befreien
und schließlich Proteinspuren durch Fällung mit Alkohol zu entfernen. Sowohl das
von Protein gereinigte als auch das von einem Teil der allerkleinsten Moleküle befreite
Dextranpräparat stellt jedoch noch immer ein Gemisch von Dextrankörpern weitgehend
verschiedenen Molekulargewichtes, wenn auch gleichen chemischen Typs dar.
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Die Erfindung betrifft dagegen die Gewinnung von D extranfraktionen
möglichst einheitlicher Molekülgröße durch fraktionierende Behandlung des Dextrans
mit Mischungen aus Wasser und einem damit mischbaren Lösungsmittel, und zwar erfolgt
die Herstellung dadurch, daß man aus Dextran oder teilweise abgebautem Dextran mittels
eines Gemisches aus Wasser und einem damit mischbaren, das Dextran fällenden, aber
chemisch nicht verändernden organischen Lösungsmittel, wie z. B. Alkohol, in zwei
oder mehreren Stufen, entsprechend dem Gehalt des Gemisches an organischem Lösungsmittel,
zwei oder mehrere Dextranfraktionen von entsprechender durchschnittlicher Molekülgröße
abtrennt.
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Es ist zwar bereits bekannt, aus Lärchenholz erhaltene Polysaccharide
mittels fraktionierender Fällung mit Alkohol in verschiedene Fraktionen zu zerlegen.
Bei diesen Polysacchariden liegen aber zwei Komponenten von eindeutig definierter
Konstitution, nämlich Araban und Gallaktan, vor, bei denen eine verschiedene Löslichkeit
in Alkohol ohne weiteres zu erwarten ist. Bei den Dextranfraktionen liegen dagegen
Serien der gleichen Verbindungstypen, jedoch von verschiedenem Molekulargewicht
vor, so daß deren Verhalten bei einer Behandlung mit einem Gemisch aus Wasser und
einem damit mischbaren Lösungsmittel nicht ohne weiteres vorauszusehen war.
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Das Verfahren nach der Erfindung kann in der Weise durchgeführt werden,
daß man aus wäßrigen Lösungen von Dextran oder teilweise abgebautem Dextran durch
zwei- oder mehrstufige Zugabe des organischen Fällungsmittels die entsprechenden
Dextranfraktionen abtrennt.
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Statt dessen kann man aber auch die Trennung der einzelnen Dextranfraktionen
mittels zwei- oder mehrstufiger Fraktionierauflösung von Dextran oder teilweise
abgebautem Dextran in einem Gemisch von Wasser und organischem Lösungsmittel durchführen.
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Zweckmäßig arbeitet man in mehreren Stufen, so daß man organisches
Fällungsmittel zunächst nur in einer solchen Menge zusetzt, daß eine Fällung gebildet
wird, während eine wesentliche Menge des Dextrans noch in Lösung bleibt, und die
so erhaltene, aus verhältnismäßig hochmolekularem Dextran bestehende Fraktion abtrennt.
Dann setzt man eine weitere Menge des Fällungsmittels zu, so daß eine zweite Fraktion
erhalten wird. Hierbei wird die Zusatzmenge des Fällungsmittels derart gewählt,
daß ein Teil des Dextrans von verhältnismäßig niedrigem Molekulargewicht in der
Lösung ungefällt bleibt. Die envähnte zweite, verhältnismäßig einheitliche Dextranfraktion
mittleren Molekulargewichtes wird dann isoliert und weiterverwendet.
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Auf diese Weise werden Fraktionen erhalten, die in sich bezüglich
der Molekulargröße bedeutend weniger verschieden sind als die Ausgangssubstanz,
was z. B. durch Ultrazentrifugierung und Diffusionsversuche nachgewiesen werden
kann. Je höher das Molekulargewicht einer Fraktion ist, desto höher wird dessen
Viscosität sein. Die fraktionierte Lösung des Dextrans unterscheidet sich nicht
grundsätzlich von dem fraktionierten Niederschlag, da beide, die fraktionierte Lösung
und der fraktionierte Niederschlag, dadurch entstehen, daß Dextranmoleküle von verschiedener
Größe verschiedene Löslichkeit zeigen.
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Die fraktionierte Auflösung kann dadurch ausgeführt werden, daß man
fein pulverisiertes Dextran oder teilweise gespaltenes Dextran mit einer Mischung
von Lösungsmitteln und Fällungsmitteln durchschüttelt, welche so gewählt sind, daß
ein niedriger molekularer Teil in Lösung geht und ein höhermolekularer Teil der
polydispersen Ausgangssubstanz ungelöst zurück bleibt. Wie im Falle der fraktionierten
Ausfällung werden auch hierdurch Fraktionen erreicht, welche in bezug auf die Größe
der Moleküle gleichförmiger sind als die Ausgangssubstanz.
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Beispiel I Als Ausgangssubstanz wird ein teilweise gespaltenes Dextran
verwendet. 250 ml einer zeigen wäßrigen Lösung dieses Dextrans werden in eine Flasche
geschüttet, die dann in einen Thermostaten gesenkt wird. Die Flasche ist mit einem
Rührer versehen, und es wird 9601,iger Alkohol tropfenweise mit Hilfe einer Bürette
zugeführt. Die Temperatur wird auf + 200 C gehalten. Wenn genügend Alkohol zugefügt
ist, um die Lösung trüb werden zu lassen, wird die Temperatur in dem Thermostaten
auf 25 bis 30° C erhöht. Nach einigen Stunden ist der Niederschlag aufgelöst, und
das Kontaktthermometer zu dem Thermostaten wird wieder auf 200 C eingestellt. Die
Lösung wird über Nacht stehengelassen. Wenn die Temperatur fällt, bildet sich der
Niederschlag wieder von neuem und wird durch Dekantieren getrennt. Der Niederschlag
wird in Wasser aufgelöst und wieder mit Alkohol ausgefällt. Eine weitere Wiederbildung
des Niederschlags wird in derselben Weise ausgeführt. Die dekantierte Lösung wird
in die Flasche zurückgegossen und diese in den Thermostaten gesenkt. Es wird noch
einmal Alkohol mit der Bürette zugegeben.
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Der erhaltene Niederschlag wird in derselben Weise wie vorher behandelt.
Die Fraktionierung wird auf demselben Wege fortgesetzt. Im ganzen werden fünf Fraktionen
in dieser Weise entnommen. Die erhaltenen Dextranfraktionen werden getrocknet und
abgewogen, und es wird die wirkliche Viskosität [rj] für die aus diesen Fraktionen
bereiteten Lösungen in Wasser bestimmt.
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[a7] = lim. 1 spjc wenn c + o (wobei xI sp = die spezifische Viscosität
und c = die Konzentration in
Prozent ist. L] steigt, wenn das Molekulargewicht
des Dextrans höher wird). Ultrazentrifugierversuche zeigen, daß die erhaltenen Substanzen
weniger polydispers sind als die Ausgangssubstanz. Die Ergebnisse sind hier in Form
einer Tabelle angegeben: Tabelle I
| Seriennummer Alkohol Gewicht der |
| der Fraktion | in ml | Fraktion in g |
| K I 146,1 I,62 I,50 |
| K II . . 17,6 0,27 1,30 |
| K III .......... 6,5 0,16 0,92 |
| K IV ........... 13,0 0,44 0,70 |
| K V 6o,o 0,29 0,40 |
Beispiel 2 40 g teilweise gespaltenes Dextran werden in 2 1 Wasser in einem geeigneten
Gefäß aufgelöst. Bei Zimmertemperatur wird wie in Beispiel I vorsichtig Alkohol
zugefügt. Wenn sich etwas Niederschlag gebildet hat, wird die Mischung auf 40° C
erwärmt, so daß sich der Niederschlag wieder auflöst. Das Gefäß wird dann in einen
Thermostaten mit einer Temperatur von + 200 C gesenkt und über Nacht stehengelassen.
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Der gebildete Niederschlag wird durch Dekantieren abgesondert. Der
Niederschlag wird zweimal aufgelöst und wieder ausgefällt. Die Fraktionierung wird
in derselben Weise fortgesetzt, indem man die Konzentration des Alkohols nach und
nach erhöht. Wenn fünf Fraktionen erhalten worden sind, wird das Fraktionieren nicht
mehr fortgesetzt. Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle II zusammengestellt.
Die Zentrifugier- und Diffusionsversuche zeigen, daß die erhaltenen Fraktionen in
bezug auf das Molekulargewicht bedeutend gleichförmiger sind als die Ausgangssubstanz.
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Tabelle II
| Seriennummer Alkohol Gewicht der |
| der Fraktion ~ in ml Fraktion in g |
| F I ............ 1 475 sehr gering |
| F II ........... 90 2,67 0,48 |
| F III 70 3,59 0,38 |
| F IV 120 20 6,40 0,29 |
| F V ........... 150 4,16 0,25 |
Beispiel 3 Für dieses Beispiel wird ein teilweise hydrolysiertes Dextran verwendet,
welches nocht mehr als die in Beispiel 2 benutzte Substanz gespalten ist. 200 ml
2%ige wäßrige Dextranlösung wird für diesen Versuch verwendet. Das Fraktionieren
wird auf demselben Wege wie in Beispiel 2 ausgeführt, indem man die Konzentration
des Alkohols nach und nach erhöht.
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Ultrazentrifugierungs- und Diffusionsversuche zeigen, daß die erhaltenen
Fraktionen in bezug auf das Molekulargewicht bedeutend gleichförmiger sind als die
Muttersubstanz. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle: Tabelle III
| Seriennummer Alkohol Gewicht der |
| der Fraktion in ml Fraktion in g |
| I .............. I80 o,86 o,I8 |
| II .............. 35 I,5I 0,I3 |
| III ............. 50 o,66 0,II |
| IV ............ 10 0,41 o,og |
(Die letzte Fraktion wurde erhalten, nachdem die Lösung auf einen engen Raum konzentriert
war).
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Beispiel 4 7 7 kg teilweise gespaltenes Dextran wird in destilliertem
Wasser auf eine Lösung von 70 kg aufgelöst.
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Die Lösung wird auf einer Temperatur von ungefähr 30° C gehalten.
Zuerst wird unter Rühren 27,6 kg 95%iger Alkohol zugegeben. Die Mischung wird bei
Zimmertemperatur stehengelassen. Es bildet sich dann ein Niederschlag, welcher entfernt
wird. Hierauf werden weitere 40 kg Alkohol zugegeben, und der dann gebildete Niederschlag
wird entfernt, nachdem man die Mischung bei 20° C hat stehenlassen. Der Niederschlag
wird getrocknet und gewogen. Der in dem ersten Versuch erhaltene Niederschlag wog
I,I kg und der in dem zweiten erhaltene 4,6 kg. Von diesen zwei Fraktionen wurden
6%ige wäßrige Lösungen gebildet, worauf die Viscosität gemessen wurde. Die relative
Viscosität war für die erste Fraktion 4,9 und für die zweite 3,5. Die zweite Fraktion
(die Hauptfraktion) wurde durch Fraktionierung von einer höhermolekularen Fraktion
(Fraktion 1) befreit, während gleichzeitig ein gewisser Betrag von niedrigem molekularem
Dextran bei der Ausfällung verlorengegeben wurde. Auf diese Weise wurde eine Substanz
erhalten, welche z. B. für Infusionszwecke besser geeignet ist als die nicht fraktionierte
Ausgangssubstanz.
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Beispiel 5 3 g fein gepulvertes teilweise gespaltenes Dextran wird
in einer Mischung von 50 ml Wasser und 34 ml 96%igem Alkohol suspendiert. Die Mischung
wird 24 Stunden lang bei 25 ° C gehalten und von Zeit zu Zeit durchgeschüttelt.
Die oben befindliche Flüssigkeit wird dann abgegossen. Von dieser wird das Dextran
durch Zugabe von überschüssigem Alkohol ausgefällt. Beides, sowohl dieses Dextran
als auch dasjenige, was nicht in Lösung gegangen ist, wird bei 1050 c getrocknet.
Bei Ausführung dieser Versuche werden 2%ige Lösungen in Wasser von den beiden Proben
als auch von dem ursprünglichen teilweise gespaltenen Dextran angefertigt. Für diese
drei Lösungen wird die Viscosität bei 25° C festgestellt. Die spezifische Viscosität
für die Originalsubstanz war o,56 für das nicht aufgelöste Dextran o,58 und für
das in Lösung gegangene Dextran 0,40. Aus diesem Versuch zeigt es sich, daß man
auch auf diesem Wege eine Fraktionierung erhalten kann.
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Man kann auch aus dem ursprünglichen Material eine bestimmte Fraktion
abscheiden, welche Dextran
mit unerwünschtem Molekulargewicht enthält,
indem man zu einer Dextranlösung von einer bestimmten Konzentration ein Fällungsmittel
in einem bestimmten Verhältnis zu dem Lösungsmittel hinzufügt.