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Verfahren zur Isolierung von Antitoxinen und verwandten Eiweißkörpern
Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden zur Reinigung und Isolierung bestimmter
Eiweißkörper und Gruppen solcher sind durchweg sehr umständlich und außerdem auch
noch mit dem Mangel behaftet, daß sie das angestrebte Ziel völliger Einheitlichkeit
dieser Eiweißkörper nicht erreichen lassen. Dies gilt sowohl für die Fällungsmethoden
mit verschiedenen Salzkonzentrationen, wie Ammoniumsulfat, wie auch für elektrophoretische
Trennungsmethoden und solche mit der Ultrazentrifuge, indem dabei immer Verunreinigungen
zumindestens an verwandten Eiweißgruppen mitgerissen werden, wie z. B. von Beta
2 Globulin bei der Elektrophorese und Ultrazentrifugierung von Gamma-Globulin. Spezifische
Fällungsverfahren brauchbarer Art, wie solche zur Trennung verschiedener niedermolekularer
Stoffe häufig Anwendung finden, standen bisher in der Proteinchemie überhaupt nicht
zur Verfügung. Es sind wohl Reagenzien, wie z. B. Trichloressigsäure, bekannt, welche
sämtliche Proteine durch Fällung von anderen Stoffen trennen lassen, und ferner
andere Fällungsmittel, wie z. B. konzentrierte Salzlösungen und organischeLösungsmittel,
bekannt, welche bei Anwendung, in zunehmender Konzentration sämtliche Proteine nacheinander
zum Ausfällen bringen lassen. Möglichkeiten, ein bestimmtes Protein oder eine bestimmte
Gruppe von Proteinen durch spezifische Fällungsmittel von einem anderen Protein
oder einer
Gruppe von anderen Proteinen zu trennen, standen jedoch,
wie bereits gesagt, in der Proteinchemie bisher nicht zur Verfügung.
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Es wurde demgegenüber gemäß der vorliegenden Erfindung nunmehr die
überraschende Feststellung gemacht, daß gewisse Proteine, nämlich Antitoxine, wie
insbesondere Tetanus- und Diphtherie-Antitoxine, und verwandte Eiweißkörper, wie
Gamma-Plasmocyptomeiweißkörper, Viruseiweißkörper u. dgl., die bisher nicht bekannte
und auch nach allen bisherigen Anschauungen nicht zu vermutende Eigenschaft besitzen,
bei einer Fällung mit Uranylionen und anderen, wie solche wirkenden Fällungsmitteln,
wie Chromisalze oder Cadmiumsulfat, von welchen man ebenso wie von den sonstigen
Fällungsmitteln bisher annahm, daß sie nur eine unspezifische oder eine von der
angewandten Salzkonzentration abhängige Fällung sämtlicher Proteine bewirken können,
nicht gefällt zu werden, sondern im Gegensatz zu allen sonstigen neben ihnen vorhandenen
2roteinen in Lösung bleiben.
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Darauf aufbauend besteht das erfindungsgemäße Verfahren zur Konzentration
von Antitoxinen, insbesondere Tetanus- und Diphtherie-Antitoxinen, und verwandten
Eiweißkörpern, wie Gamma-Plasmocytomeiweißkörpern, Viruseiweißkörpern u. dgl., darin,
daß die Ausgangsproteine einer Behandlung mit Uranylionen, vorzugsweise in Form
von Uranylazetat oder anderen, die Antitoxine und ihnen verwandten Eiweißkörper
nicht fällenden Protein-Fällungsmitteln, wie Chromisalze oder Cadmiumsulfat, versetzt
und von den dadurch ausgefällten, therapeutisch unerwünschten und/oder ihre Isolierung
hemmenden Begleitproteinen abgetrennt werden.
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Auf diesem Wege lassen sich so erstmalig Antitoxine und verwandte
Eiweißkörper auf einfachem und wohlfeilem Wege konzentrieren bzw. isolieren und
ist diese erfindungsgemäß gegebene Möglichkeit dabei um so wertvoller, als zu den
auf diese Weise zu isolierenden Proteinen Stoffe gehören, deren Abtrennung von anderen
Proteinen auch ein immer mehr wachsendes technisches Interesse besitzt. Hierher
gehören insbesondere Antitoxine, wie z. B. Tetanus- und Diphtherie-Antitoxin, Proteine
und Eiweißkörper, die bei bösartigen Krankheiten auftreten (Antikörper), wie Gamma-Plasmocytomeiweiß,
Virusproteine und Insulin. Ausführungsbeispiele i. Konzentration von Gamma-Plasmocytomeiweißkörpern
i Teil Serum wird mit 3 Teilen 'destilliertem Wasser und i Teil i,55o/oiger wäßriger
Uranylacetatlösung versetzt und filtriert.
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a) Für den Nachweis von Gamma-Plasmocytomeiweiß im Serum wird das
Filtrat mit einigen Tropfen 2o°/oiger Sulfosalicylsäurelösung versetzt, und eine
Trübung zeigt die Anwesenheit des Proteins an.
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b) Zur Isolierung erfolgt eine Dialyse des Uranylacetatfiltrates und
ein Einengen im Vakuum bei niedriger Temperatur bis zur gewünschten Konzentration.
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2. Konzentration von Antitoxinen, z. B. Tetanus-oder Diphtherieantitoxin
i Teil der im Handel erhältlichen Antitoxinlösung wird mit 3 Teilen destilliertem
Wasser und i Teil i,55a/oiger wäßriger Uranylacetatlösung versetzt und filtriert.
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a) Nachweis der Antitoxine erfolgt wie unter i a. b) Isolierung geschieht
wie unter i b.
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Im einschlägigen Schrifttum ist bereits der Vorschlag gemacht worden,.
zur Entfernung von Eiweißstoffen aus Flüssigkeiten, wie z. B. Seren, dieselben mit
metallsauren Verbindungen, insbesondere Vanadaten bzw. deren Lösungen, und mit organischen
Säuren, insbesondere Essigsäure, zu behandeln und gegebenenfalls von dann noch vorhandenen
Anteilen an metallsauren Verbindungen zu befreien. Als für solche Zwecke verwendbare
metallsaure Verbindungen werden dabei auch Uranate und Chromate genannt. Auch bei
einer Anwendung solcher für die erwähnten, im Schrifttum genannten Zwecke werden
dieselben aber zusammen mit organischen Säuren und zur Entfernung von Eiweißstoffen
aus Flüssigkeiten, nicht aber zur Isolierung von Antitoxinen verwendet und fehlt
bei alledem auch völlig die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Feststellung,
daß Antitoxine gegenüber gewissen und als solchen bekannten Protein-Fällungsmitteln
eine Sonderstellung einnehmen, indem sie von solchen im Gegensatz zu anderen Proteinen,
wie den neben Antitoxinen in Ausgangsproteinen enthaltenen Begleitproteinen, nicht
gefällt werden und daher auch aus Flüssigkeiten nicht entfernt werden können, und
daß so unter Ausnutzung dieser Sonderstellung der Antitoxine eine Isolierung derselben
möglich ist. Dieser im Schrifttum gemachte Vorschlag offenbart also nicht nur nicht
die vorliegende Erfindung, sondern erweist geradezu auch deren überraschenden Charakter,
denn nach den Angaben über diesen sich nur mit der Entfernung von Eiweißstoffen
aus Flüssigkeiten beschäftigenden Vorschlag hätte man auch nur annehmen können,
daß auch Antitoxine ebenso wie sonstige Eiweißstoffe durch Behandlung mit metallsauren
Verbindungen ausgefällt bzw. entfernt werden, nicht aber daraus herleiten können,
daß sie bei einer Behandlung im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht ausgefällt
und dadurch isoliert werden können.
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Weiterhin ist im einschlägigen Schrifttum auch bereits ein Verfahren
zur Konzentrierung der wirksamen Stoffe in Heil- oder Immunstoffe enthaltenden Eiweißlösungen
beschrieben worden, welches darin besteht, daß derartige Eiweißlösungen verdünnt
oder unverdünnt, mit oder ohne Temperaturwechsel, mit nur so viel eines gelösten
Salzes eines Schwermetalls oder eines Edel- oder Halbedelmetalls, welches lösliche
Eiweißniederschläge gibt, versetzt werden, daß die erzielten Niederschläge, soweit
sie mehr Heil- oder Immunstoff auf die Eiweißeinheit enthalten als das Ausgangsmaterial.
unmittelbar
in alkalischem, saurem oder neutralem Wasser zu mindestens einprozentigen, klaren,
höchstens schwach opaleszierenden Eiweißlösungen löslich sind.
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Bei diesem Verfahren handelt es sich somit um ein typisches Beispiel
für die bereits in Absatz z als bekannt vorausgesetzten Fällungsmethoden mit verschiedenen
Salzkonzentrationen, bei welchen Metallsalze als Eiweißfällungsmittel zur fraktionierten
Fällung in der Weise verwendet werden, daß von den gewonnenen zahlreichen Niederschlägen
diejenigen, welche - auf die Gewichtseinheit des Eiweißes bezogen - reicher an Antitoxin
als das Ausgangsmaterial sind, so wenig. vom Fällungsmittel enthalten, daß sie ohne
weitere Behandlung leicht gelöst werden können.
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Das erfindungsgemäße Verfahren arbeitet nicht mit einer solchen fraktionierten
Fällung und zielt nicht auf dem Ausgangsmaterial gegenüber antitoxinreichere Niederschläge
ab, sondern erstrebt und erreicht in einer einstufigen Behandlung eine Isolierung
der Antitoxine von deren therapeutisch unerwünschten Begleitproteinen durch ganz
spezielle, nur die letzteren im Gegensatz zu dem ersteren erfassenden, die ersteren
also in Lösung belassenden Fällungsmittel.
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Beide Verfahren unterscheiden sich also grundsätzlich voneinander,
und erweist sich dies im übrigen auch schon daraus, daß Fällungsmittel der für das
vorliegende einstufige Verfahren einzig und allein in Betracht kommenden Art, nämlich
Uranylionen, vorzugsweise in Form von Uranylazetat, oder andere, die Antitoxine
nicht fällende Protein-Fällungsmittel, wie Chromisalze oder Cadmiumsulfat, bei der
Schilderung des bekannten Verfahrens nicht genannt werden, sondern diese umgekehrt
nur Protein-Fällungsmittel nennt, welche für die Zwecke des erfindungsgemäßen Verfahrens
nicht in Betracht kommen.