DE2217911A1

DE2217911A1 - Verfahren zur Herstellung von Desoxyribonucleinsäuren mit erhöhtem Molekulargewicht

Info

Publication number: DE2217911A1
Application number: DE19722217911
Authority: DE
Inventors: Karl Niederurnen Christen (Schweiz). C07f9-12
Original assignee: Rephamac AG, Niederurnen (Schweiz)
Priority date: 1971-04-16
Filing date: 1972-04-13
Publication date: 1972-11-09
Also published as: IT986015B; IE36280L; NL7204889A; CH529769A; CA961034A; LU65120A1; CA981475A; ES401831A1; DK131294B; DK131294C; US3838148A; BE781609A; IE36280B1; FR2133634A1; SE386187B; GB1392330A; FR2133634B1; JPS4848500A

Description

DIPL.-ING. R. SPLANEMANN dipu-chem. dr. B. REITZNER - dipl-ing. J. RICHTER

MÜNCHEN H A M B U R ■

Firma eooo munchen s 13. April 1972

ΤαΙ13

REPHAMAC A. G. Telefon (0811) 226207/226209 Telegramme: Inventius München

8867 Niederurnsn (Schweiz)
Brunnernstraße 15

Unsere Akte; 4210 - I - 7753 Ihr Zeichen:

Patentanmeldung

Verfahren zur Herstellung von Desoxyribonucleinsäure mit erhöhtem Molekulargewicht

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Desoxyribonucleinsäure, d.h. von hochpolymerer DITS.

Das industriell am häufigsten verwendete Ausgangsmaterial ist Fischmilch, deren hoher Gehalt an Desoxyribonucleinsäure seit langem bekannt ist. In den Spermatozoen ist die DWS an basische Proteine, Histone oder Protamine gebunden, von denen es leicht abgetrennt werden kann,, Es ist üblich, die Lipide durch die klassischen lösungsmittel, wie 90 $-igen Alkohol und Aceton, abzutrennen und die Proteine durch Natriumcarbonat oder Natriumchlorid in hoher Konzentration anzubauen. Einige industrielle Verfahren benutzen darüber hinaus die Einwirkung von Wärme, um die Proteine abzutrennen, aber es wird schwierig, die der Einwirkung von Wärme anhaftenden Risiken bei der Abtrennung der beiden Ketten des Moleküls der DNS durch Spaltung der Basen, die unter sich Brücken bilden, zu vermeiden, selbst wenn man anschließend abkühlt, um eine Wiedervereinigung zu den beiden Ketten des Moleküls zu erreichen, ein Vorgang, der schwer unter Kontrolle zu halten ist.

209846/1243

Es ist ferner allgemein bekannt, daß die Anwesenheit von Phenol die Trennung von Proteinen, verglichen mit Nucleinsäuren, begünstigt, und daß man DNS im Laboratoriumsmaßstab durch Behandlung von Suspensionen von Nucleo-Proteiden mit einem gleichen Volumen an reinem Phenol gewinnen konnte. Jedoch erlauben die Reaktionsbedingungen im Laboratorium keine einigermaßen wirtschaftliche und praktische technische Fabrikation, um.eine industrielle Anwendung zu rechtfertigen.

Die der Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen ergaben gewisse Bedingungen, unter denen befriedigende industrielle Ausbeuten erzielt werden können.

Die behandelten Substanzen werden, nachdem sie von ihren Lipiden befreit und mit Natriumchlorid vorbehandelt wurden, erfindungsgemäß wie folgt behandelt.

Um die DNS in Freiheit zu setzen, benutzt man als Deproteinisie· rungsmittel Phenol, und zwar nicht mehr rein und in großem Überschuß, wie bei gewissen Laboratoriumsraethoden, sondern nur in einer Menge, die ausreicht, damit die Masse, die die Nucleoproteide in Suspension enthält, an Phenol gesättigt ist, zuzüglich eines kleinen Überschusses. Ein kleiner Überschuß an Phenol, den man dieser so gesättigten Mischung zugibt, erleichtert die Denaturierung und die langsame Ausfällung des freigesetzten Proteins und den Lösungsvorgang der DiiSo

Die behandelte Substanz wird vor der Deproteinisierung durch das Phenol mit einer 2-molaren Lösung von Natriumchlorid behandelt, die vorzugsweise mit einer kleinen Menge Natriumfluorid versetzt wurde, das als Nucleaseinhibitor wirkt.

209846/1243

_ 3 —

Diese Behandlung durch die Salze bewirkt die Freisetzung der Nucleoproteidmoleküle und begünstigt die spätere Einwirkung von Phenol.

Nach der Phenolbehandlung wird die viskose Lösung der DNS, die in Suspension das denaturierte Protein enthält, mit einer Substanz, wie Bentonit, Kieselgur (Celite), einer Infusdriaierde oder ähnlichem, versetzt, um die Trennung durch physikalische Mittel, wie Sedimentation, Filtration über Druckfilter oder Zentrifugation, zu erleichtern,, Vorzugsweise verwendet man Kieselgur bzw. ein Filterhilfsmittel auf Kieselgurbasis in Gegenwart von Bentonit, wobei letzerer einen Schutzeffekt gegenüber den Nucleasen besitzt.

Während des gesamten Prozesses liegt die Temperatur vorzugsweise unter 25°C und in jedem Fall weit unterhalb der Temperatur, die einen Abbau des Moleküls bewirken würde (etwa 8O⁰C).

Die Erfindung ist durch das nachstehende Beispiel erläutert.

Beispiel

100 kg Heringsmilch, die bei -25°C tiefgefroren wurden, werden grob zerhackt und mit der Hälfte ihres Volumens mit 95 $-igem Alkohol versetzt. Der Alkohol trennt eine wichtige Lipidfraktion ab, die je nach der Fischart,aus der man die Milch gewinnt, veränderlich ist.

Das erhaltene Gemisch wird mindestens 24 Stunden bei Zimmertemperatur im Alkohol gelassen; anschließend wird es abgetropft, dann unter Druckfiltration zentrifugiert (das Lösungsmittel wird zurückgewonnen).

209846/1243

Der Rückstand der Zentrifugation wird von neuem feiner zerkleinert und mit der dreifachen Menge seines Volumens mit einer 2-molaren Natriumchloridlösung versetzt, der 0,045 Mol Natriumfluorid zugesetzt wurden» Die schon sehr viskose Flüssigkeit wird etwa eine Stunde lang langsam gerührt. Dieses Rühren wird vor der folgenden Operation mehrere Male wiederholt:

Nach 24 bis 48 Stunden verdoppelt man das Volumen bei Zimmertemperatur mit an frisch destilliertem Phenol gesättigtem, destilliertem Wasser (75 g Phenol je Liter Wasser), dem man Phenol in einer Menge zugegeben hat, die ausreicht, um eine vollständige Sättigung des Gemisches, das aus der phenolischen Suspension besteht, zu gewährleisten, d.h. einen Überschuß an Phenol von 25 g je Liter.

Der Sättigungsgrad des mit Phenol gesättigten Wassers in Abhängigkeit von der Temperatur ist in bekannten Tabellenwerken angegeben.

Das Gemisch wird dann durch 15-minütiges Rühren sorgfältig homogenisiert. Diese Operation wird während 24 Stunden mehrere Male wiederholt.

Die viskose Lösung der DNS, die die denaturierten Proteine in Suspension enthält, wird danach mit etwas Bentonit und einer etwas größeren Menge eines Filterhilfsmittels auf der Basis von Kieselgur (Celite) versetzt, was eine langsame Ausfällung der Proteidfraktion bewirkt; man kann beispielsweise eine Mischung von 1 ¹Jo Celite und 0,5 $ Bentonit in destilliertem Wasser suspendiert verwenden, so bemessen, daß man das Gesamtvolumen auf 1000 Liter ergänzen kann.

209846/1243

Man läßt das Gemisch einen oder mehrere Tage lang stehen, so daß das denaturierte Protein sich langsam durch Sedimentation absetzen kann. Man kann diesen Prozess durch Filtration über ein Druckfilter oder durch Zentrifugation beschleunigen oder vervollständigen.

Die überstehende Flüssigkeit oder das Fiitrat, das klar oder auch leicht trüb ist, wird in ein gleiches Volumen von 95 $-igem Alkohol gegossen· Die polymerisierte DNS fällt in langen weißen Fasern aus. Diese erhaltenen Fasern werden dann mit alkoholischen Lösungen mit zunehmender Konzentration gewaschen, um das mitgegangene Natriumchlorid und den Überschuß an Phenol zu entfernen« Man beendet die Operation durch Waschen mit 95 ^-igera Alkohol und trocknet den Rückstand auf einem von Luft durchströmten Sieb durch leichtes Erwärmen oder durch teilweises Vakuunu

Die Ausbeute an polymerisierter DNS ist sehr gut. Sie bewegt sich in der Größenordnung von 5 $> der behandelten Masse, Die Analyse ergab folgende Durchschnittswerte: 15 $> Feuchtigkeit, 11,50 bis 13 $ Stickstoff, 7,1 bis 7,8 f₀ phosphor, weniger als 0,5 $ Proteinrückstand. Die spezifische UV-Absorption £/P lag in der Größenordnung von 6400 bis 6800; die Hyperchromizität lag zwischen 28 und 36 $₀ Die Molekülmasse, die durch Lichtstrennung bestimmt wurde, war immer höher als 2,5 x 10 .

- Patentansprüche -

209846/1243

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von hochpolymeren Desoxyribonucleinsäuren aus lebenden Substanzen, wie Fischmilch, die vorher von lipiden befreit und einer Behandlung durch Alkalisalze unterworfen wurden, dadurch gekennzeichnet, da2 man als Deproteini-8ierungsmittel zur Freisetzung der DNS Phenol in wäßriger Lösung verwendet, wobei die Menge an Phenol so gewählt wird, daß die das Nucleoproteid in Suspension enthaltende Masse an Phenol gesättigt und ein kleiner Überschuß an Phenol vorhanden ist.

2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Phenollösung mit etwa 75 g Phenol je liter Wasser verwendet.

3· Verfahren nach Anspruch 1,und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die gesamte Suspension des Nucleoproteids in der wäßrigen Phenollösung mit ungefähr 25 g Phenol je Liter versetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die vorausgehende Alkalisalzbehandlung eine Lösung von Natriumchlorid verwendet, die vorzugsweise mit Natriumfluorid versetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Alkalisalzbehandlung mittels einer Lösung durchführt, die etwa 2 Mol Natriumchlorid und etwa 0,045 Mol Natriumfluorid je Liter enthält.

209846/1243

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die viskose DNS-Lösung, die das denaturierte Protein suspendiert enthält, nach der Behandlung mit Phenol mit einem physikalischen Trennhilfsmittel, wie Bentonit, einem Filterhilfsmittel auf Kieselgur"basis (Gelite) oder Infusorienerde, versetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daS'man als Trennhilfsmittel ein Filterhilfsmittel auf Kieselgurbasis (Celite) verwendet, das mit einer kleineren Menge an Bentonit versetzt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Trennhilfsmittel aus etwa 1 # Celite und 0,5 i» Bentonit besteht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur während des gesamten Prozesses vorzugsweise unterhalb 25 C und auf jeden Fall unter 80⁰C gehalten wird.

R/hi