DE914423C - Verfahren zur Herstellung von als Blutplasma-Ersatz geeigneten Zubereitungen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von als Blutplasma-Ersatz geeigneten Zubereitungen Es ist schon verschiedentlich versucht worden, Gelatine wegen ihrer günstigen kolloidchemischen und physiologischen Eigenschaften als Blutplasma-Ersatz zu verwenden, doch steht der Verabreichung größerer Mengen die zu rasche Ausscheidung aus dem Organismus und die damit verbundene Überlastung der Nierenfunktionen entgegen. Diese Erscheinung ist wohl auf die linearmolekulare Struktur dieses Eiweißstoffes zurückzuführen. Durch Einbau geeigneter Gruppen läßt sich bekanntlich eine Vernetzung der Gelatine herbeiführen, z. B. durch Umsetzung derselben mit Formaldehyd. Indessen erfährt die Gelatine durch diese Härtung infolge Polymerisationserscheinungen hinsichtlich einer Verwendung als Blutersatzflüssigkeit unerwünschte Änderungen ihrer kolloidalen Eigenschaften. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß sich aus mit Formaldehyd behandelter Gelatine als Blutplasma-Ersatz hervorragend geeignete Zubereitungen in der Weise gewinnen lassen, daß man sie mittels eiweißspaltender Agenzien einem partiellen Abbau unterwirft, wobei die Desaggregation des Makromoleküls so weit gehen soll, daß einerseits zwar die durch die Härtung mittels Formaldehyd verlorengegangene Löslichkeit bzw. Sol-Gel-Reversibilität der Gelatine wiederhergestellt wird, andererseits aber eine gewisse Vernetzung erhalten bleibt und das mittlere Molekulargewicht der Abbauprodukte höchstens bis auf den Wert von 2o ooo heruntergeht. Durch Wahl der die Abbaureaktion bestimmenden Faktoren, nämlich Art und Menge des eiweißspaltenden Mittels, Dauer seiner Einwirkung, Temperatur und PH-Wert des Milieus, hat man es in der Hand, den Vorgang so zu steuern, daß je nach Zielsetzung und Art der verwendeten Gelatine der gewünschte Dispersionsgrad innerhalb gewisser Grenzen erreicht wird. Der jeweilige Zustand läßt sich unter Anwendung geeigneter und dem Fachmann geläufiger Methoden (unter anderem Messung der Viskosität und des kolloidosmotischen Druckes) leicht verfolgen.
• Der Abbau kann sowohl mittels verdünnter Alkalien oder Säuren als auch auf dem fermentativen Wege durch Einwirkung proteolytisch wirksamer Enzyme vorgenommen werden, wobei in letzterem Falle natürlich dafür gesorgt werden muß, daß während der Proteolyse ein dem Wirkungsoptimum des jeweiligen Enzyms entsprechender pH-Bereich eingehalten wird. Als besonders günstig für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens haben sich die bei der Züchtung von Schimmelpilzen auf kohlehydrat-und eiweißhaltigen Nährböden und Aufarbeitung der Mycelien erhältlichen amylasen- und proteasenreichen Fermentgemische erwiesen. Insoweit der verfahrungsgemäß durchzuführende Abbau mit einer gewissen Streuung hinsichtlich der Molekülgröße der einzelnen Abbauprodukte behaftet ist, wird eine Fraktionierung derselben im Sinne einer gegenüber :dem Spaltungsgut vergrößerten Gleichförmigkeit in der Molekülgröße ihrer Bestandteile oft wünschenswert sein; sie kann in üblicher Weise, .z. B. durch Fällung mittels geeigneter, mit Wasser mischbarer Lösungsmittel, vorgenommen werden. Der Grad des Abbaus läßt sich auch dadurch steuern, .daß man während des Spaltungsvorganges eine Nachbehandlung mittels Formaldehyd vornimmt; häufig, z. B. bei Verwendung solcher Enzyme, deren Wirkungsbereich im alkalischen Milieu liegt, ist es möglich, von ungehärteter Gelatine selbst auszugehen und ihre Vernetzung einerseits und die Desaggregation andererseits gleichzeitig vorzunehmen. Im übrigen wird wegen :der experimentellen Einzelheiten, welche naturgemäß je nach Art der Proteolyse (unter welchem Ausdruck hier sowohl der chemische als auch der fermentative Eiweißabbau zu verstehen ist) wechseln, auf die machfolgenden Beispiele verwiesen.
• Die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen Produkte liefern nach Einstellung auf die erforderliche Konzentration, nach Zusatz der in Betracht kommenden physiologischen Salze und nach Anwendung geeigneter Sterilisierungs:maßnahmen Blutersatzflüssigkeiten, die sich in vieler Hinsicht (Verträglichkeit, Verweildauer im Organismus, Resorptionsverhältnisse usw.) gegenüber den bisher angewandten Ersatzstoffen als überlegen erweisen. Beispiele i. Eine Aufschlämmung von iog feingepulverter, durch- mehrtägige Einwirkung von Formaldehyddämpfen gehärteter Gelatine in 200 ccm 0,4 n-Salzsäure wird auf dem Wasserbad unter Rühren auf 9o° erwärmt. Sobald sich die Formolgelatine gelöst hat (Dauer etwa 30 Minuten) wird das pff der Mischung durch Zugabe von 2 n-Natronlauge auf 5,o eingestellt, worauf auf o° abgekühlt wird. Man versetzt nun die Lösung mit so viel Aceton, daß die Konzentration daran 70 Volumprozent beträgt und läßt das Gemisch 2 Stunden lang bei o° stehen. Der durch das Aceton gefällte Anteil (etwa 5o Gewichtsprozent der eingesetzten Gelatine) wird abgetrennt, vom anhaftenden Aceton befreit und in der 2ofachen Menge physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die filtrierte und sterilisierte Lösung stellt eine gut verträgliche Blutpla:sma-Ersatzflüssigkeit dar.
• 2. 2-,4g Knochengelatine (i i °/o H20 und etwa o,9 % Asche, meist Calciumsalze) werden in 21 destilliertem Wasser gelöst; die Lösung wird durch Zugabe von i i ccm 2 n-I@Tatronlauge auf ein pH von 7,2 eingestellt. Es wird eine Lösung von 40 mg eines gereinigten Pilzproteinasepräparates von insgesamt 2d. ooo Baumann-Einheiten (erhalten durch Züchtung von Aspergillus oryzae auf einem Weizenkleie- und fischmehlhaltigen Nährboden und Aufarbeitung des Myceliums) in 2 ccm physiologischer Kochsalzlösung zugegeben, worauf man langsam 5,15 ccm einer 38o/oigen Formalinlösung (2 g C H.; O) einrührt. Nun läßt man bei einer Temperatur von 35 bis 4.o° unter weiterem kräftigen Rühren i n-Natronlauge hinzulaufen: sobald das PH der Lösung hierbei den Viert von 7,5 übersteigt, macht sich eine deutliche Zunahme der Viskosität bemerkbar, bis sich schließlich die Masse zu versteifen beginnt, worauf man die Zugabe von Lauge unterbricht. Nach einigen Minuten hat sich der Ansatz infolge des enzymatischen Abbaus wieder verflüssigt, wobei auch das PH etwas abgenommen hat. Durch weiteren vorsichtigen Zusatz von i n-Natronlauge wird die Kondensation wieder gefördert, bis sich der Ansatz aufs neue gallertartig versteift, worauf nach Unterbrechung der Laugenzugabe erneut Verflüssigung eintritt. Nachdem man diesen Vorgang der Versteifung und Wiederverflüssigung 5- bis 8mal sich hat wiederholen lassen (wobei darauf zu achten ist, daß die oben angegebene Temperatur erhalten bleibt), wird der Ansatz auch bei weiterer Zugabe von Lauge nicht mehr fest, da die ursprünglich zugegebene Menge Formaldehyd inzwischen verbraucht worden ist.
• Jetzt wird durch schnelles Erwärmen im Wasserbad auf 65 bis 7o° eine Abtötung der Fernente bewirkt und das Gemisch durch Zugabe von verdünnter Salzsäure neutralisiert. Vorhandene Calciumionen werden sodann mittels eines Kationenaustauschers oder auf chemischem Wege entfernt. Die Testreaktion auf Formaldehyd mittels fuchsinschwefliger Säure soll nach schwachem Ansäuern einer Probe negativ oder höchstens ganz sehwach positiv sein; gegebenenfalls wird etwa vorhandener überschüssiger Formaldehyd durch Dialysieren oder alkalische Behandlung mit Wasserstoffperoxyd aus dem Ansatz beseitigt. Nachdem man in einem aliquoten Teil der Lösung- den Gelatinegehalt (Stickstoffbestimmung nach K j e 1 d ah 1) und den Gehalt an Cl-Ionen festgestellt hat, wird das Gut durch Zugabe von destilliertem Wasser bzw. Kochsalzlösung auf einen Gehalt an organischen Bestandteilen von 5'10 und einen solchen an Na Cl von o,9% eingestellt. Man filtriert durch ein Seitzfilter und sterilisiert durch 2ominutiges Erhitzen auf 115° im Autoklav. Die so hergestellte Blutplasma-Ersatzflüssigkeit erstarrt erst unter 30° und besitzt eine relative Viskosität von 2 bis 5 bei 37°.
• 3. Eine Lösung von Zoo g Gelatine in 1 1 destilliertem Wasser wird unter kräftigem Rühren mit 2,5 ccm einer 40%igen Formalinlösung und 10 ccm 2 n-Natronlauge versetzt. Das hierbei schnell erstarrende Gemisch wird noch 2 Stunden auf dem Wasserbad auf 8o° gehalten, worauf man noch 24 Stunden ,stehenläßt. Die gewonnene Gallerte wird in geeigneter Weise zerkleinert und mit 6oo ccm 0,4 n-Salzsäure versetzt. Man erhitzt das Gemisch unter kräftigem Rühren im Wasserbad auf 85°, wobei nach etwa 15 Minuten Lösung eintritt. jetzt wird mittels verdünnter Natronlauge auf ein pH von 5,o eingestellt. Man versetzt in der Kälte mit so viel Aceton, daß die Konzentration daran 45 Volumprozent beträgt. Der hierbei ausgefällte Anteil (etw .a 700/0) wird abgetrennt, von Aceton befreit und in 1 1 destillierten Wassers gelöst. Aus dieser Lösung entfernt man die Calciumionen, beispielsweise mittels eines Kationenaustauschers. Schließlich wird die Lösung auf einen NaCI-Gehalt von o,85% eingestellt, in Ampullen abgefüllt und sterilisiert.
• 4. 11 1o%ige neutrale Gelatinelösung wird bei 40% mit 2 ccm eines gereinigten Pankreatinpräparates versetzt, worauf 2,5 ccm einer 4o%igen Formalinlösung hinzugefügt werden. Die Kondensation wird durch Zugabe von 20 ccm 2 n-Natriumcarbonatlösung in Gang gebracht, wobei sich der Ansatz vorübergehend verfestigt. Nach 2 Minuten wird der Ansatz infolge der Ferrnentwirkung wieder flüssig, worauf man weitere ioccmNatriumcarbonatlösung hinzufügt. Nachdem man in Abständen von jeweils 5 Minuten 4mal je 5 ccm 2 n-Natriumcarbonatlösung hinzugegeben hat, wird das Gemisch rasch auf 6o° erhitzt. Hierauf versetzt man mit 7 ccm 2 n-Natronlauge unci 2,5 g Tierkohle, worauf filtriert wird. Das Filtrat wird auf ein PH von 7,2 eingestellt, mit Kochsalz bis zu einer Konzentration von o,85 % daran versetzt und sterilisiert. Man erhält wie nach den vorigen Beispielen eine als Blutplasma-Ersatz gut geeignete Flüssigkeit.

Claims (3)

1. PATENTANSPRÜCHE: -i. Verfahren zur Herstellung von als Blutplasma-Ersatz geeigneten Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Formaldehyd behandelte Gelatine mittels eiweißspaltender Agenzien einem partiellen Abbau unterwirft, bis einerseits die Löslichkeit wiederhergestellt ist und andererseits das mittlere Molekulargewicht der Abbauprodukte nicht den Wert von etwa 2o ooo unterschreitet, worauf das Spaltungsgut, gegebenenfalls nach Fraktiionierung, den physiologischen Bedingungen angepaßt wird.
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß der Eiweißabbau auf fermentativem Wege in einen dem Wirkungsoptimum des jeweils verwendetenEnzyms entsprechenden pH-Bereich vorgenommen wird.
3. 3. Verfahren gemäß Ansprüchen i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß, gegebenenfalls wiederholt, während der Proteolyse eine Nachkondensation mit Formaldehyd vorgenommen wird. 4.. Verfahren in Abänderung der Ansprüche i bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Formaldehydbehandlung der Gelatine und die Einwirkung der eiweißspaltenden Agenzien gleichzeitig vorgenommen wird.