JP2548494B2 - 核酸抽出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は血液、尿、髄液、痰、精
液、細胞、組織、生検標本や細菌、酵母等の微生物、ウ
イルス、培養細胞等の生物材料の核酸を簡単にかつ効率
よく抽出・精製を行う方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近核酸プローブを用いた研究や診断が
急速に進歩し、検体処理の簡略化及び核酸以外の不純物
を取り除き高純度に核酸を精製することがますます重要
になってきた。

【０００３】たとえば、核酸ハイブリダイゼーションを
行う場合、ＤＮＡ試料の精製が不十分だとＤＮＡに蛋白
が結合したり、また炭水化物を含んでいると制限酵素に
よるＤＮＡの消化を阻害するため、制限酵素の塩基配列
を認識することができず、満足の行く成績を得ることが
できない。また、ＲＮＡ試料を用いた核酸ハイブリダイ
ゼーションを行う場合も、ＲＮＡ試料の精製が不十分で
あると核酸ハイブリダイゼーションで満足の行く成績を
得ることできない。核酸ハイブリダイゼーションを行う
場合または制限酵素によるＤＮＡの消化を行う場合に
は、あらかじめＤＮＡを充分に精製することが大切であ
る。

【０００４】非放射性標識法によるプローブの検出の場
合、不純物が混入した試料を用いると試薬に用いた抗体
やアビジンが非特異的に不純物に結合してしまい判断を
誤ってしまうことがある。

【０００５】精製ＤＮＡまたはＲＮＡを調製するには通
常基本的に３つの操作を行う必要がある。すなわち、
細胞の溶解、除蛋白と脱炭水化物、濃縮の３つの操
作である。細胞の溶解にはリゾチーム、アクロモペプ
チダーゼなどの細胞壁溶解酵素やプロテインナーゼＫ等
の蛋白分解酵素を用いたり、アルカリやＳＤＳ等の界面
活性剤を用いて細胞を破壊する。

【０００６】また結核菌やぶどう球菌等強固な細胞壁を
持つ微生物の場合、ビーズや超音波を用いて物理的に破
壊させたりする。場合によってはこれに併用して細胞壁
溶解酵素や蛋白分解酵素を作用させたり、アルカリや界
面活性剤添加を組合わせて行う。

【０００７】の除蛋白と脱炭水化物については従来よ
りフェノール・クロロホルム法による抽出が最も多く使
用されている。しかしこのフェノール・クロロホルム法
は毒性が強いうえ時間と手間がかかるため大変扱いにく
いという問題があった。

【０００８】即ち、このフェノール・クロロホルム法に
はおいては、ＤＮＡは水性液体層（上層）に、変性蛋白
質は水性液体層と有機液体層（下層）との中間層に綿状
の白い層をつくるので、その白い層を吸い込まないよう
にＤＮＡ層を注意深く口の広いピペットを用いて静かに
吸い取り、新しいマイクロチューブに移すというような
面倒な作業を必要とする。この操作には、時間がかかり
かつ熟練を必要とするからＤＮＡ回収の再現性が悪く、
しかも大量処理が困難であった。

【０００９】の後最後に濃縮で不純物を取り除いた
後、酢酸アンモニウムまたは酢酸ナトリウムを加えてエ
タノールで沈澱させてＤＮＡまたはＲＮＡを濃縮・精製
する。

【００１０】これまでに抽出法を簡便に効率よく行うた
めにフェノール・クロロホルム法の改良が試みられてい
るが、フェノールの危険性を避けるためにフェノール・
クロロホルムを用いない方法も開発されている。

【００１２】たとえば、リンパ球に感染するＨＩＶ−
１、ＥＢウイルスを検査するために、血液サンプルから
ＤＮＡを抽出する場合、ヘパリン採血した血液をトリト
ンＸー１００で処理、遠心後沈澱物にグアニジンイソチ
オシネートを加えた後イソプロパノールを加えＤＮＡを
析出、エタノール洗浄を行う方法があり、この方法では
２時間以内にＤＮＡを抽出することができる。

【００１３】この方法はたいへん簡単ではあるが、しか
し対象試料が血液に限られ必ずしも一般的ではない。

【００１４】さらに、迅速に核酸を抽出分離するための
核酸抽出カラムを用いた方法もあるが、高価であるため
処理コストがかかるという問題があり、一般には使いに
くいという問題がある。

【００１５】最近安価にかつ迅速に核酸を抽出する方法
としてＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）
等の陽イオン界活性剤のＤＮＡ結合性を利用した方法が
報告されている（特開平２−３１６９６号公報）。

【００１６】この方法は細胞破壊の前処理後、ＣＴＡＢ
を加え有機溶剤中で核酸とＣＴＡＢの複合体を形成させ
た後、高塩濃度の水溶液に溶解してＤＮＡとＣＴＡＢを
解離し、エタノールまたはイソプロパノールでＤＮＡを
回収する方法である。この方法は危険性の高いフェノー
ルは使わないものの実際には遠心、洗浄も多く操作も面
倒である。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点に鑑みて発明されたもので、核酸を簡
便、迅速かつ高純度に抽出・精製する傾斜（デカンテー
ション）又は転倒分取可能な方法を提供することを目的
とするものである。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明は上記の課題を解
決するために、生物材料から核酸を溶出するための前処
理を行ったのち、この前処理した生物材料にチキソトロ
ピー性を有する増粘剤を含む非親水性の高比重有機液体
と水性液体を加えて混合し、遠心分離後、上層と下層の
境界面に非流動性の凝集層を形成し、上層の核酸を分離
抽出するようにしたものである。

【００１９】上記前処理は蛋白変性剤及び／又は膜溶解
剤を加えて行われる。また、分離抽出手段としては、遠
心分離後、傾斜（デカンテーション）又は転倒によって
分取することが好適である。

【００２０】本発明の構成をさらに具体的にいえば、生
物材料を破壊し、生物材料中の核酸分解酵素を失活させ
ると同時に蛋白質を変性させて生物材料を溶解し、この
溶解した生物材料に、蛋白質等の汚染物質と結合して上
層と下層の境界面に非流動性の凝集層を形成するチキソ
トロピー性を有する増粘剤を含む高比重有機液体と核酸
を抽出するための水性液体を加えて混合し、相分配抽出
を行い、核酸を上層へ溶出させ、傾斜（デカンテーショ
ン）又は転倒によりこの上層を分離し、簡便に核酸を抽
出するようにしたものである。

【００２１】本発明でいう生物材料とは、血液、尿、髄
液、痰、精液、細胞、組織、生検標本や細菌、酵母等の
微生物、ウイルス、培養細胞等を指称するものである。

【００２２】

【作用】本発明の方法においては、生物材料から核酸を
溶出するための前処理は、生物材料をキレート剤を含む
緩衝液（ｐＨ５〜９）中で前処理した後、細胞膜または
細胞壁等を破壊するために通常は約０．１〜１０．０％
（Ｗ／Ｖ）の範囲の濃度の陰イオン界面活性剤や非イオ
ン性界面活性剤等の膜溶解剤と約１Ｍ〜６Ｍのグアニジ
ンチオシネートまたは約１Ｍ〜６Ｍの塩酸グアニジン等
の蛋白変性剤で処理することをいう。場合によっては細
胞膜や細胞壁等を破壊するための酵素によって処理して
もよい。

【００２３】上記したキレート剤として好適に用いられ
るものは、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコー
ルビス四酢酸、８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン、
８−ヒドロキニリン−５−スルフォン酸、１，１０−フ
ェナントロリン、８−キノリノール，サリチル酸及びそ
れらの塩等があり、通常は処理液中に約０．００５から
０．３Ｍの範囲で用いられる。

【００２４】上記した膜溶解剤として好適な陰イオン界
面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム，Ｎ−ラウロイ
ルサルコシンナトリウム，リン酸ラウリル，カプリレー
ト塩，コレート塩，スルフォン酸デカン塩，デオキシコ
レート塩，グリココレート塩，グリコデオキシコレート
塩，タウロコレート塩，タウロデオキシコレート塩等が
ある。

【００２５】上記した膜溶解剤として適切な非イオン性
界面活性剤には、Ｓｐａｎ２０，Ｓｐａｎ４０，Ｓｐａ
ｎ６０，Ｓｐａｎ６５，Ｓｐａｎ８０，Ｓｐａｎ８５等
のｄ−ソルビトールの脂肪酸エステル類、Ｔｗｅｅｎ２
０，Ｔｗｅｅｎ２１，Ｔｗｅｅｎ４０，Ｔｗｅｅｎ６
０，Ｔｗｅｅｎ６５，Ｔｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ８
１，Ｔｗｅｅｎ８５等のポリオキシエチレングリコール
ソルビタンアルキルエステル類、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００等のポリオキシエチレングリコールｐ−ｔ−オクチ
ルフェニルエーテル類等がある。

【００２６】上記した細胞膜や細胞壁等を破壊するため
の酵素として好適に用いられるものは、約１ｍｇ／ｍｌ
から５０ｍｇ／ｍｌの濃度のリゾチーム、アクロモペプ
チターゼ、リゾスタフィン、リチカーセ、ムタノリシン
等の膜溶解酵素によって、もしくは約１０μｇ／ｍｌか
ら２０ｍｇ／ｍｌの濃度の蛋白分解酵素、例えばプロテ
アーゼｋ、プロナーゼ、ペプシン、パパイン等がある。

【００２７】上記したような前処理を行うと、生物材料
は上記したキレート剤、膜溶解剤、蛋白変性剤や、膜溶
解酵素、蛋白分解酵素等を含む水溶液に溶解し、この水
溶液中には核酸と各種の生物物質が可溶化する。

【００２８】次に、この可溶化した生物材料中から核酸
が水性溶媒層に抽出されかつ傾斜（デカンテーション）
又は転倒により簡便に分離できるような相分配抽出（ph
ase-partition-extraction）を行う。

【００２９】まず、蛋白質等の汚染物質と結合しかつ相
分配抽出において、上層と下層の境界面で非流動性の凝
集層を形成して傾斜（デカンテーション）又は転倒分取
による核酸の分離を可能ならしめるために、チキソトロ
ピー性を有する増粘剤を含む高比重有機液体、または高
比重有機液体の混合物、もしくはこれらの高比重有機液
体とアルコールの混合物と核酸を上層に抽出するための
水性液体を可溶化した生物材料中に加えて混合したのち
遠心分離する。遠心分離後、上層と下層の境界面に非流
動性の凝集層が形成される。

【００３０】この非流動性の凝集層が形成される理由
は、蛋白質等の汚染物質と結合したチキソトロピー性を
有する増粘剤が遠心分離による遠心力と高比重有機液体
の浮力により、中間層（境界面）に集められる結果、チ
キソトロピー性を有する増粘剤の濃度が高くなることに
より増粘効果に伴った粘性の変化に起因するものと考え
られる。

【００３１】本発明でいう相分配抽出において、上層と
下層の境界面で非流動性の凝集層を形成させるチキソト
ロピー性を有する増粘剤としては、高比重有機液体に分
散性のある増粘剤が用いられ、さらに蛋白質等の汚染物
質と結合性のある増粘剤が好ましい。

【００３２】本発明で用いられるチキソトロピー性を有
する増粘剤としては、ベンナイト有機誘導体を用いるこ
とが好ましい。ベンナイト有機誘導体には、スメクタイ
ト粘土の有機誘導体、ヘクトライト粘土の有機誘導体、
モンモリナイト粘土の有機変性体、精製したスメクタイ
ト粘土、特殊処理スメクタイト粘土、精製有機鉱物粘土
等を用いることができる。

【００３３】使用するチキソトロピー性を有する増粘剤
の濃度としては、０．１から１０％（Ｗ／Ｖ）の範囲が
好適である。

【００３４】本発明のチキソトロピー性を有する増粘剤
として用いられるスメクタイト粘土の有機誘導体として
は、ＢＥＮＴＯＮＥ ２７（エヌ・エル・インダストリ
ィズ・インコーポレーテッド製、チクソトロープ及びゲ
ル化剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮＥ ３４（エヌ・エル
・インダストリィズ・インコーポレーテッド製、チクソ
トロープ及びゲル化剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮＥ ３
８（エヌ・エル・インダストリィズ・インコーポレーテ
ッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、ＢＥ
ＮＴＯＮＥ ＳＤ−１（エヌ・エル・インダストリィズ
・インコーポレーテッド製、チクソトロープ及びゲル化
剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮＥ ＳＤ−２（エヌ・エル
・インダストリィズ・インコーポレーテッド製、チクソ
トロープ及びゲル化剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮＥ Ｓ
Ｄ−３（エヌ・エル・インダストリィズ・インコーポレ
ーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）等
を好適に挙げることができる。また、本発明のチキソト
ロピー性を有する増粘剤として用いられるモンモリナイ
ト粘土の有機変性体としてはＢＥＮＴＯＮＥ １２８
（エヌ・エル・インダストリィズ・インコーポレーテッ
ド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、ＢＥＮ
ＴＯＮＥ ５００（エヌ・エル・インダストリィズ・イ
ンコーポレーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の
商品名）、精製したスメクタイト粘土としはＭＡＣＡＬ
ＯＩＤ、特殊処理スメクタイト粘土としはＢＥＮＴＯＮ
Ｅ ＥＷ（エヌ・エル・インダストリィズ・インコーポ
レーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品
名）、精製有機鉱物粘土としてはＢＥＮＴＯＮＥ ＬＴ
（エヌ・エル・インダストリィズ・インコーポレーテッ
ド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）等を好適
に挙げることができる。

【００３５】また、本発明のチキソトロピー性を有する
増粘剤として用いられるスメクタイトの有機誘導体とし
ては、ＢＥＮＴＯＮＥ ３４（エヌ・エル・インダスト
リィズ・インコ−ポレーテッド製、チクソトロープ及び
ゲル化剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮＥ ＳＤ−３（エヌ
・エル・インダストリィズ・インコ−ポレーテッド製、
チクソトロープ及びゲル化剤の商品名）、ＢＥＮＴＯＮ
Ｅ ＬＴ（エヌ・エル・インダストリィズ・インコ−ポ
レーテッド製、チクソトロープ及びゲル化剤の商品
名）、ＢＥＮＴＯＮＥ ＥＷ（エヌ・エル・インダスト
リィズ・インコ−ポレーテッド製、チクソトロープ及び
ゲル化剤の商品名）、ＭＡＣＡＬＯＩＤ等を好適に挙げ
ることができる。しかし、本発明で用いられるチキソト
ロピー性を有する増粘剤は、本発明における非流動性の
凝集層を形成するものであれば使用可能であり、上記し
た増粘剤に限定されるものではない。

【００３６】本発明でいう非親水性の高比重有機液体と
は、水に難溶性又は不溶性の密度（ｇ／ｃｍ³ ）として
１．０５以上の有機液体が適当である。

【００３７】本発明における非親水性の高比重有機液体
として好適に用いられるものには、四塩化炭素、クロロ
ホルム、１，２−ジクロロエタン、１，２−ジブロモエ
タン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ク
ロロベンゼン、ブロモベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン
等のハロゲン化合物、２，２，２−トリフルオロエタノ
ール、フェノール、フルフラール等のアルデヒド、ニト
ロメタン、ニトロベンゼン等のニトロ化合物、スルホラ
ン等の硫黄化合物がある。これらの高比重有機液体は、
単独で用いてもよいし混合して用いることもできる。

【００３８】上記高比重有機液体の安定剤として添加す
る適当なアルコールとしては、メタノール、エタノー
ル、１−プロパノール、２−プロパノール、イソアミル
アルコール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブ
チルアルコール、シクロヘキサノール、エチレングリコ
ール、２−メトキシエタノール、２−エトキシエタノー
ル等を挙げることができる。これらのアルコールも、単
独で用いてもよいし混合して用いることもできる。

【００３９】核酸を上層に抽出するための水性溶媒とし
ては、水または塩化ナトリウム，塩化カリウム，塩化カ
ルシウム，塩化マグネシウム，酢酸ナトリウム，塩化ア
ンモニウム，酢酸アンモニウム，硫酸アンモニウム等の
無機塩および塩酸ジメチルアミン，塩酸トリメチルアミ
ン等の有機塩を水溶液として用い、通常、１０ｍＭ〜１
Ｍの範囲の濃度で使用するのが好ましい。このとき、核
酸の回収率を高くするために、この水溶液に０．０１〜
１０％の適当な陰イオン界面活性剤または非イオン性界
面活性剤を加えてもよい。

【００４０】高比重有機液体層と水性液体層との比（Ｖ
／Ｖ）は約１：５から５：１が好適であり、これらの層
は混和されたのち遠心分離によって形成された境界面の
非流動性の凝集層によって、下層の高比重有機液体層と
上層の水性液体層とに分配させられ、傾斜（デカンテー
ション）又は転倒によって水性溶媒層（上層）が取り出
される。

【００４１】取り出された水性溶媒層（上層）から核酸
を分離・濃縮するために、水性液体層の１／１０量に相
当する１〜５Ｍの酢酸ナトリウム等を加えたのち等量の
イソプロパノール、または２倍量のエタノールを加えて
核酸を沈澱させる。沈澱した核酸は適当な溶剤に溶かさ
れる。

【００４２】沈澱した核酸を溶解する適当な水溶液に
は、Ｔ．Ｅ緩衝液（一般的に５０ｍＭのトリスヒドロキ
シメチルアミノエタン−塩酸緩衝液ｐＨ８．０・２０ｍ
ＭのＥＤＴＡ）等の緩衝液や塩化ナトリウム，塩化カリ
ウム，塩化カルシウム，塩化マグネシウム，酢酸ナトリ
ウム，塩化アンモニウム，酢酸アンモニウム，硫酸アン
モニウム等の無機塩およびその混合物があり、通常、約
０．１から１０．０Ｍの範囲の濃度で使用する。

【００４３】

【実施例】以下に、本発明の実施例を挙げて説明する
が、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないこ
とは勿論である。

【００４４】実施例１ 一夜培養した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を滅菌生理食塩水
等で１．２×１０¹⁰ｃｅｌｌｓ／ミリリットルに調製
し、被験菌液とした。この被験菌液１ミリリットルをマ
イクロチューブ（１．５ミリリットル〜２．０ミリリッ
トル）に移し１２０００回転、３０秒〜１分間の遠心で
上清を除去して、菌体を５０ｍＭのグルコース、１０ｍ
ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭのトリスー塩酸
（ｐＨ８．０）の溶液１００μリットルに懸濁し、５分
間室温に放置した。

【００４５】放置後、菌体を溶解するために５Ｍのグア
ニジンチオシネート、５％のラウロイル・サルコシン・
ナトリウム、２５ｍＭのクエン酸ナトリウムの溶液を１
００μリットル加えた。次に、２．７％（Ｗ／Ｖ）のＢ
ＥＮＴＯＮＥ ＳＤ−３を含む四塩化炭素：イソアミル
アルコール（２４：１）７００μリットルと０．５Ｍの
酢酸ナトリウム４００μリットルを加え激しく振とうし
た後、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）１０〜１５
分間遠心分離する。遠心分離後、上層（水性液体層）と
下層（高比重有機液体層）の境界面に非流動性凝集層が
形成されるので、マイクロチューブを傾斜（デカンテー
ション）させて上層のＤＮＡを含む水性液体層を新しい
マイクロチューブに移した。

【００４６】この水性液体層の１／１０量に相当する３
Ｍの酢酸ナトリウムを加え、さらに同量のイソプロピル
アルコールを加え軽く撹拌した後、１２０００ＲＰＭ
（１１０００×ｇ）で１０〜１５分間遠心して核酸を沈
澱させ、デカンテーションで静かに上清を除去した後、
ペレットに７０％のエタノール１ミリリットルを静かに
加え１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で５分間遠心
してデカンテーションで静かに上澄みを除去し、乾燥さ
せた後、０．１×ＳＳＣを加えて核酸を溶解した。この
ときに抽出・精製した核酸の回収率と純度は分光光度計
を使って、波長２６０ｎｍの吸光度を測定してＤＮＡ量
を計算（ＯＤ₂₆₀ ＝１．０のとき、５０μｇ／ミリリッ
トルのＤＮＡ量に相当する）して求め、表１に示した。
また、純度試験として波長２８０ｎｍと波長２３４ｎｍ
の吸光度を測定し、表１に示した。ＯＤ₂₆₀ ／ＯＤ₂₈₀
の比率が１．６５以上であれば、蛋白質等の混在はほと
んどないものと判定し、ＯＤ₂₃₄ ／ＯＤ₂₆₀ の比率が
０．９以下であれば多糖類等の混在は少ないものと判定
した。

【００４７】このとき抽出・精製した核酸の回収率と純
度は、比較例１のＳＤＳ−フェノール法と同等であっ
た。

【００４８】比較例１ 上記実施例１と比較するために、以下に記した従来公知
のＳＤＳ−フェノール法を用いて実験を行った。

【００４９】一夜培養した大腸菌を５０ｍＭのＥＤＴＡ
緩衝液（ｐＨ８．０）で１×１０¹⁰ｃｅｌｌｓ／ミリリ
ットルに調製し、被験菌液とした。

【００５０】この被験菌液１ミリリットルをマイクロチ
ューブ（１．５ミリリリットル〜２．０ミリリットル）
に移し、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で３０秒
〜１分間の遠心で上清を除去して、菌体を５ｍＭのＥＤ
ＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）２００μリットルに懸濁し
た。

【００５１】リゾチーム粉末を０．１５Ｍ ＮａＣ１，
０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶解液でとかし５
０μリットル加え室温で５分間放置後、２０％のＳＤＳ
（ラウリル硫酸ナトリウム）３０μリットル加え６０℃
で５分間加温して菌体を溶解した。次に、フェノール・
クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：
１，Ｖ／Ｖ）２００μリットル加え激しく振とうした
後、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で１０〜１５
分間遠心分離する。

【００５２】ＤＮＡは水性液体層（上層）に、変性蛋白
質は水性液体層と有機液体層（下層）との中間層に綿状
の白い層をつくるので、その白い層を吸い込まないよう
にＤＮＡ層を注意深く口の広いピペットを用いて静かに
吸い取り、新しいマイクロチューブに移した。この操作
には、時間がかかりかつ熟練を必要とするから大量処理
は困難である。

【００５３】冷エタノール４００μリットルを加えよく
混合した後、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で１
０〜１５分間遠心して核酸を沈澱させ、デカンテーショ
ンで静かに上清を除去した後、ペレットに７０％のエタ
ノール１ミリリットルを静かに加え１２０００ＲＰＭ
（１１０００×ｇ）で５分間遠心してデカンテーション
で静かに上清を除去し、乾燥させた後、０．１×ＳＳＣ
（１５０ｍＭ ＮａＣｌと１５ｍＭクエン酸三ナトリウ
ム）を加えて核酸を溶解した。このときに抽出・精製し
た核酸の回収率と純度を実施例１と同様に測定し、表１
に示した。

【００５４】

【表１】

【００５５】実施例２ 一夜培養した緑膿菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を
５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）、２５ｍＭのトリスー塩酸（ｐＨ８．０）の溶解で
９．４×１０⁹ ｃｅｌｌｓ／ミリリットルに調製し、被
験菌液とした。

【００５６】この被験菌液１ミリリットルをマイクロチ
ューブ（１．５ミリリットル〜２．０ミリリットル）に
移し、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で３０秒〜
１分間の遠心で上清を除去して、５分間室温に放置し
た。

【００５７】放置後、実施例１と同様に操作をして核酸
をデカンテーションで分離したのち、１２０００ＲＰＭ
（１１０００×ｇ）で３０秒〜１分間の遠心で上清を除
去して、５分間室温に放置した。

【００５８】放置後、実施例１と同様に菌体を処理して
核酸をデカンテーションで分離したのち、この分離した
水層の１／１０量に相当する量の３Ｍの酢酸ナトリウム
を加え、さらに同量のイソプロピルアルコールを加え軽
く攪拌した後、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で
１０〜１５分間遠心して核酸を沈澱させ、デカンテーシ
ョンで静かに上清を除去した後、ペレットに７０％のエ
タノール１ミリリットルを静かに加え１２０００ＲＰＭ
（１１０００×ｇ）で５分間遠心してデカンテーション
で静かに上清を除去し、０．１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ
ＮａＣｌと１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）に溶解させ
た。

【００５９】この時、抽出・精製した核酸の回収率と純
度を測定し、表２に示した。なお、分離・精製したＤＮ
Ａの純度はＡ_234/260 とＡ_260/280 の比率で測定した。

【００６０】このとき抽出・精製した核酸の回収率と純
度は、比較例２のＳＤＳ−フェノール法と同等であっ
た。

【００６１】比較例２ 実施例２と比較するために、比較例１と同様に従来公知
のＳＤＳ−フェノール法を用いて実験した。このときに
抽出・精製した核酸の回収率と純度を実施例２と同様に
測定し、表２に示した。

【００６２】

【表２】

【００６３】実施例３ 一夜培養した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を滅菌生理食塩水
等で１×１０¹⁰ｃｅｌｌｓ／ミリリットルに調製し、被
験菌液とした。この被験菌液１ミリリットルをマイクロ
チューブ（１．５ミリリットル〜２．０ミリリットル）
に移し１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）、３０秒〜
１分間の遠心で上清を除去して、菌体を５０ｍＭのグル
コース、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ
のトリスー塩酸（ｐＨ８．０）の溶液１５０μリットル
に懸濁し、５分間室温に放置した。

【００６４】放置後、菌体を溶解するために５Ｍのグア
ニジンチオシネート、５％のラウロイル・サルコシン・
ナトリウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウムの溶液を１５
０μリットル加えた。

【００６５】次に、２．５％（Ｗ／Ｖ）のＢＥＮＴＯＮ
Ｅ ＬＴを含むフェノール・クロロホルム・イソアミル
アルコール（２５：２４：１，Ｖ／Ｖ）７００μリット
ルと０．１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳを含む１．０Ｍのジメ
チルアミン４００μリットルを加え激しく振とうした
後、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で１０〜１５
分間遠心分離した。

【００６６】遠心分離後、上層（水性液体層）と下層
（高比重有機液体層）の境界面に非流動性凝集層が形成
されるので、マイクロチューブで傾斜（デカンテーショ
ン）させて上層のＤＮＡを含む水性液体層を新しいマイ
クロチューブに移した。

【００６７】水性液体層の１／１０量に相当する量の３
Ｍの酢酸ナトリウムを加え、さらに同量のイソプロピル
アルコールを加え軽く撹拌した後、１２０００ＲＰＭ
（１１０００×ｇ）で１０〜１５分間遠心して核酸を沈
澱させ、デカンテーションで静かに上清を除去した後、
ペレットに７０％のエタノール１ミリリットルを静かに
加え１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で５分間遠心
してデカンテーションで静かに上清を除去し、乾燥させ
た後、０．１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌと１５ｍ
Ｍクエン酸三ナトリウム）を加えて核酸を溶解した。

【００６８】なお、抽出・精製した核酸の回収率と純度
を測定し、表３に示した。分離・精製したＤＮＡの純度
はＡ_234/260 とＡ_260/280 の比率で測定した。このとき
抽出・精製した核酸の純度は、比較例３のＳＤＳ−フェ
ノール法と同等であった。

【００６９】比較例３ 実施例３と比較するために、比較例１と同様に従来公知
のＳＤＳ−フェノール法を用いて実験を行った。このと
きに抽出・精製した核酸の回収率と純度を実施例３と同
様に測定し、表３に示した。

【００７０】

【表３】

【００７１】実施例４ 一夜培養した緑膿菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を
５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）、２５ｍＭのトリース塩酸（ｐＨ８．０）の溶液で
９．２×１０⁹ ｃｅｌｌｓ／ミリリットルに調製し、被
験菌液とした。

【００７２】この被験菌液１ミリリットルをマイクロチ
ューブ（１．５ミリリットル〜２．０ミリリットル）に
移し、１２０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で３０秒〜
１分間の遠心で上清を除去して、５分間室温に放置し
た。

【００７３】放置後、実施例３と同様に操作をして核酸
を抽出・精製した後、０．１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌと１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）に溶解させ
た。

【００７４】このときに抽出・精製した核酸の回収率と
純度を測定し、表４に示した。なお、分離・精製したＤ
ＮＡの純度はＡ_234/260 とＡ_260/280 の比率で測定し
た。

【００７５】このとき抽出・精製した核酸の純度は、蛋
白質や多糖類の混在がほとんど認められず、比較例４の
ＳＤＳ−フェノール法と同等であった。

【００７６】比較例４ 実施例４と比較するために、比較例１と同様に従来公知
のＳＤＳ−フェノール法を用いて実験を行った。このと
きに抽出・精製した核酸の回収率と純度を実施例４と同
様に測定し、表４に示した。

【００７７】

【表４】

【００７８】実施例５ 培養したＣＨＯ ｃｅｌｌ（Carcinoma Hamster Ovary
）をＰＢＳ等で３．７×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ミリリッ
トルに調製し、被験菌液とした。

【００７９】この被験菌液１ミリリットルをマイクロチ
ューブ（１．５ミリリットル〜２．０ミリリットル）に
移し、３０００ＲＰＭ、１分間〜５分間の遠心で上清を
除去して、細胞を５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥ
ＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）の溶液１００μリットルに懸濁し、５分間室温
に放置した。

【００８０】放置後、細胞を溶解するために５Ｍのグア
ニジンチオシネート、５％（Ｗ／Ｖ）のラウロイル・サ
ルコシン・ナトリウム、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム
の溶液１５０μリットル加えた。

【００８１】次に、３．６％（Ｗ／Ｖ）のＢＥＮＴＯＮ
Ｅ ＳＤ−３を含むクロロホルム：ｎ−ブチルアルコー
ル（２４：１，Ｖ／Ｖ）７００μリットルと滅菌蒸留水
４００μリットルを加え、激しく振とうした後、１２０
００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で１０〜１５分間遠心分
離した。遠心分離後、上層（水性液体層）と下層（高比
重有機液体層）の境界面に非流動清凝集層が形成される
ので、マイクロチューブを傾斜（デカンテーション）さ
せて上層のＤＮＡを含む水性液体層を新しいマイクロチ
ューブに移した。

【００８２】水層の１／１０量に相当する量の３Ｍの酢
酸ナトリウムを加え、さらに同量のイソプロピルアルコ
ールを加え軽く撹拌した後、１２０００ＲＰＭ（１１０
００×ｇ）で１０〜１５分間遠心して核酸を沈澱させ、
デカンテーションで静かに上清を除去した後、ペレット
に７０％のエタノール１ミリリットルを静かに加え１２
０００ＲＰＭ（１１０００×ｇ）で５分間遠心してデカ
ンテーションで静かに上清を除去し、乾燥させた後、
０．１×ＳＳＣを加えて核酸を溶解した。

【００８３】なお、分離・精製したＤＮＡの純度はＡ
_234/260 とＡ_260/280 の比率で測定し、その結果を表５
に示した。このとき抽出・精製した核酸の回収率と純度
は、比較例５のSDS-フェノール法と同等であった。

【００８４】比較例５ 実施例５と比較するために、比較例１と同様に従来公知
のＳＤＳ−フェノール法を用いて比較実験を行った。こ
のときに抽出・精製した核酸の回収率と純度を実施例５
と同様に測定し、表５に示した。

【００８５】

【表５】

【００８６】続いて、添付図面に基づいて本発明方法の
操作を説明する。図１は、生物材料の破壊と同時に蛋白
質の汚染物質が変性して、核酸および核酸以外の不純物
が分散している水溶液体１１と、生物材料中の汚染物質
等と結合性がありかつ相分配抽出において上層と下層の
境界面で非流動性凝集層を形成して傾斜（デカンテーシ
ョン）又は転倒による核酸の分離を可能ならしめるため
のチキソトロピー性を有する増粘剤を含む高比重有機液
体、または高比重有機液体の混合物、もしくはこれらの
高比重有機液体とアルコールの混合物１２とをマイクロ
チューブＴ１に分離した状態を示す図面である。

【００８７】図２は、ＤＮＡを含む水性液体の上層１３
と、遠心分離による遠心力と高比重有機液体の浮力によ
り、蛋白質等と結合したチキソトロピー性を有する増粘
剤が中間層（境界面）に集められ、チキソトロピー性を
有する増粘剤の濃度が高くなり、その増粘効果に伴う粘
性の変化により形成された非流動性凝集層１４と、蛋白
質等の汚染物質を含む高比重有機液体、または高比重有
機液体の混合物、もしくはこれらの高比重有機液体とア
ルコールの混合物の下層１５とに分離した状態を示す図
面である。

【００８８】図３はデカンテーションで新しいマイクロ
チューブＴ２にＤＮＡを含む水性液体の上層１３を移し
た状態を示す図面である。

【００８９】

【発明の効果】精製されたＤＮＡを調製するためには、
通常基本的に細胞の溶解、核酸以外の汚染物質の除
去、核酸の濃縮の３つの操作がある。

【００９０】一般的に用いられるＳＤＳ−フェノール法
などの抽出剤では、細胞の溶解にはリゾチームなどの
細胞壁溶解酵素やプロテインナーゼＫ等の蛋白分解酵素
を用いて細胞を破壊するが、本発明においてはこれらの
酵素を用いずに蛋白質等を変性させ細胞を破壊すること
ができるという利点がある。

【００９１】核酸以外の汚染物質の除去では、一般的
に用いられているＳＤＳ−フェノール法などの抽出剤
は、相分配抽出において上層と下層の境界面が不明瞭な
ため上層のＤＮＡを含む水溶液層の分解が困難であった
が、本発明においては上層と下層の境界面で非流動性凝
集層が形成されるため境界面が明瞭になり、なおかつ傾
斜（デカンテーション）によって上層の水溶液層を分離
できるという利点がある。この非流動性凝集層は常温で
形成されるため、特別な装置を必要とせず極めて簡便に
核酸抽出が行なえるものである。

【００９２】また、本発明方法は、血液、尿、髄液、
痰、精液、細胞、組織、生検標本や細菌、酵母等の微生
物、ウイルス、培養細胞等の広範囲の生物材料に応用可
能で、その利用価値は極めて高いものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による転倒分取においての核酸を含む水
性液体層の分離の手順を示すもので、マイクロチューブ
における上層と下層の分離状態を示す図面である。

【図２】本発明による転倒分取によっての核酸を含む水
性液体層の分離の手順を示すもので、マイクロチューブ
における上層と下層との界面に非流動性の凝集層が形成
された状態を示す図面である。

【図３】本発明による転倒分取によっての核酸を含む水
性液体層の分離の手順を示すもので、転倒分取操作によ
って上層を新しいマイクロチューブに移す状態を示す図
面である。

【符号の説明】

１１ 生物材料の破壊と同時に蛋白質の汚染物質が変性
して、核酸および核酸以外の不純物が分散している水性
液体 １２ 生物材料中の汚染物質等と結合性がありかつ相分
配抽出において上層と下層の境界面で非流動性凝集層を
形成して転倒分取による核酸の分離を可能ならしめるた
めのチキソトロピー性を有する増粘剤を含む高比重有機
液体、または高比重有機液体の混合物、もしくはこれら
の高比重有機液体とアルコールの混合物 １３ 核酸を含む水性液体の上層 １４ 遠心分離による遠心力と高比重有機液体の浮力に
より、蛋白質等と結合したチキソトロピー性を有する増
粘剤が中間層（境界面）に集められ、チキソトロピー性
を有する増粘剤の濃度が高くなり、その増粘効果に伴う
粘性の変化により形成された非流動性凝集層 １５ 蛋白質等の汚染物質を含む高比重有機液体、また
は高比重有機液体の混合物、もしくはこれらの高比重有
機液体とアルコールの混合物の下層 Ｔ１，Ｔ２ マイクロチューブ

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物材料から核酸を溶出するための前処
   理を行ったのち、この前処理した生物材料にチキソトロ
   ピー性を有する増粘剤を含む非親水性の高比重有機液体
   と水性液体を加えて混合し、遠心分離後、上層と下層の
   境界面に非流動性の凝集層を形成させることにより核酸
   を含有する上層を容易に分離し、核酸を抽出することを
   特徴とする核酸抽出方法。
2. 【請求項２】 チキソトロピー性を有する増粘剤として
   ベントナイト有機誘導体を用いる請求項１記載の方法。