JP3477205B2 - 酸プロテアーゼを用いた核酸の調製 - Google Patents

酸プロテアーゼを用いた核酸の調製

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は病気の診断及び他の目的のための核酸ハイブ
リダイゼーション分析、およびポリメラーゼ鎖反応（PC
R）または他の標的増幅手段による核酸の増幅のごとき
様々な目的に用いることができる核酸を作るための生物
学的な試料を処理する方法に関する。具体的には、本発
明は生物学的試料内に存在する内因性のヌクレアーゼに
よる核酸の分解を予防することを可能にする、核酸を作
るための簡便な方法に関する。
発明の背景 多くの診断方法が生物学的試料内に存在する特異的な
核酸（DNAまたはRNA）配列の検出に基づいている。例え
ば、該試料は細菌、その他その存在が感染症の原因を決
定するために確認されるべき微生物を含有するであろ
う。他の例では、癌または遺伝子病に関連した変異の存
在を確立するために、核酸配列がヒトの白血球中に求め
られる。
このような診断分析のためには、試料中に存在するで
あろう入手可能で特異的な核酸を作ることが必要であ
る。しばしば、核酸は細菌、カビ、ウイルス、または他
の微生物、あるいは白血球のごときヒトの細胞中に含ま
れているであろう。核酸は、さらに、リボゾーム、プラ
スミド、またはクロモゾーマルDNAのごとき他の構造内
に含まれるであろう。ハイブリダイゼーション反応を行
って特異的な核酸を検出するためあるいはそれらをPCR
または他の標的増幅方法を用いて増幅するためには、核
酸はこれらの生物および／または構造から放出されなけ
ればならない。
不運なことに、このような放出は核酸を試料中に存在
する内因性のヌクレアーゼによる分解にさらし、該ヌク
レアーゼはそのように多量に存在するであろうから、核
酸はほとんど瞬間に破壊される。
この問題は、具体的な核酸がRNAである場合には特に
深刻である。というのは、RNaseはほとんどの生物学的
試料内に豊富にあり、しばしば多くの他の酵素を容易に
不活性化する処置に対して非常に耐性だからである。
この問題を取り扱うために、生物学的試料から核酸を
精製する様々な手段を用いることは当業者にとって普通
である。例えば、グアニジニウム塩のごときアニオン界
面活性剤およびカオトロピック薬剤は、ヌクレアーゼ活
性を不活性化または阻害し、また核酸を細胞内から、お
よび細胞下構造から放出させるのに用いられてきた。不
運にも、これらの薬剤は標的増幅過程においてまたは多
くのハイブリダイゼーション検出法において用いられる
酵素の潜在的な阻害剤であり、あるいはカオトロープの
場合においては、ハイブリダイゼーション自体を妨げ
る。それゆえ、これらの薬剤を除去し核酸を回収するの
に付加的な工程が必要であった。
最も頻繁に用いられる方法は様々な塩およびエタノー
ルを用いて核酸を試料から沈澱させることである。多く
の場合において核酸の高い収率を達成するためには試料
を低い温度（通常−20℃またはそれ以下）でかなりの時
間保ち、高速で遠心しなければならない。
他の巨大分子もこれらの条件下で沈澱し、核酸を捕捉
する粘着性で御しにくい塊を生じるので、エタノール沈
澱前にフェノール、クレゾール、および／またはクロロ
ホルムを含有する有害な有機溶媒によって試料を抽出す
る手段に訴える必要がしばしばあった。アニオン界面活
性剤が使用されるいくつかの場合において、プロテイナ
ーゼＫ（proteinase K）またはプロナーゼ（pronase）
のごときこれらの界面活性剤の存在下で活性であるプロ
テアーゼが、試料の蛋白質成分を部分的に分解して有機
溶媒抽出中の捕捉を最低限にするか、および／または該
溶媒処理では抽出できないであろう成分を分解するため
に使用される。
これらの方法は複雑で、長くて退屈で、また遅いこと
は容易に認識されるであろう。この方法を行う際に非常
な注意を払わないならば、ヌクレアーゼによる残渣のコ
ンタミネーションが起こり兼ねず、試料の核酸は分解す
るか失われるであろう。このような試料で行われる診断
テストは誤った陰性の結果を与えるであろう。残存する
アニオン界面活性剤、カオトロピック塩、またはエタノ
ールが試料中に依然存在し、ハイブリダイゼーションお
よび／または標的増幅手段を阻害した場合にも、誤った
陰性の結果が得られるであろう。もしアニオン界面活性
剤およびプロテアーゼを用いるならば、残存する蛋白質
分解活性により、標的増幅および／またはハイブリダイ
ゼーション検出反応で用いられる酵素をやはり分解し、
誤った陰性の結果を与えるであろう。他方で、これらの
方法での不適当な処理も、変性した蛋白質または他の巨
大分子の単離に帰し、これらは標識されたプローブを捕
捉し、核酸ハイブリダイゼーションを含む診断テストに
おいて誤った陽性の結果を招くであろう。従って、これ
らの方法はいかなる量の臨床的実験室で受け取られる生
物学的試料の日常の処置にも十分には適さない。
得に、望む核酸の種類がRNAである場合において多く
の生物学的試料でトラブルに出くわし、試料はかなりの
量の「膵臓の（pancreatic）」型のRNase（しばしば
「リボヌクレアーゼＡ（ribonuclease A）」とも呼ばれ
る）を含む。膵臓ヌクレアーゼは血清、血漿、および体
の多くの組織に存在する。これらは熱および酸による変
性に耐性であり、1N塩酸中で10分間沸騰した場合さえも
活性の損失がなく耐える。これらはアニオン界面活性
剤、カオトロープ、およびフェノールのごとき有機溶媒
により阻害されるが、これらの薬剤によって不可逆的に
不活化されることはなく；従って、界面活性剤、カオト
ロープ、または溶媒が除去されれば、（もし注意深い抽
出により除去されていなければ）RNaseは望むRNAの分解
を進行するであろう。
強いアルカリへの暴露は不可逆的にこれらのRNaseを
不活化する；しかしながら、このような条件はRNA自体
の分解という結果を招く。
本発明は、ハイブリダイゼーション分析、標的増幅手
段、または他の使用のために使用できる試料核酸を作り
つつ、生物学的試料中のヌクレアーゼを簡便に阻害し不
活化するための方法を供給することによりこの問題を扱
う。阻害的な界面活性剤またはカオトロープは試料内に
要求されず、残存するタンパク質分解活性はない。該方
法は単純で、同時に多数の試料を処理するのに適用でき
る。エタノール沈澱法と異なり、危害な有機溶媒を使用
せず、また試料を冷却するあるいは遠心によって沈澱を
回収するための装置も必要としない。
発明の要約 本発明は、試料中に存在する内因性ヌクレアーゼが活
性であるpHより下にpHを下げ、そのpHで活性であって低
いpHへの暴露によって不可逆的に不活化されなかったい
ずれのヌクレアーゼをも分解するプロテアーゼを添加
し、次いでpHを上げることによってプロテアーゼを（そ
の働きを終えた後に）不活化することにより生物試料中
の内因性ヌクレアーゼを不可逆的に不活化する方法をそ
の要旨とする。高いpHにおいて、選択されたプロテアー
ゼは不活性であるか不可逆的に不活化される。もし可能
ならば、該プロテアーゼは、試料の意図された使用を妨
げる試料中の他の巨大分子の消化の助けとなるように選
択され、望む核酸を含む微生物の細胞壁、ウイルス粒
子、リボゾーム、および／または他の構造を分解するこ
とによって望む核酸を使用可能にする助けになるように
選択される。他の方法として、一度試料ヌクレアーゼ活
性が効率的に制御され、減少され、または除去されれ
ば、これらの構造の可溶化および核酸の放出は界面活性
剤、熱、または他の方法によって行うことができる。
一般的に、生物学的試料は、内因性ヌクレアーゼが不
可逆的に不活化されるか効率的に阻害される低いpHに調
整される。ペプシンのごとき外部の酸ペロテアーゼを次
いで添加するか、あるいはpHを低下させる溶液と同時に
添加してもよい。酸プロテアーゼの作用は、試料中に存
在する内因性ヌクレアーゼを消化し、pHが引き続いて上
昇した場合に試料である核酸を分解しないようにそれら
を不可逆的に不活化する。加えて、プロテアーゼは核酸
を微生物、ヒト細胞、またはリボゾームまたは核のごと
き細胞下成分から放出するように通常は作用するであろ
う。それはまた、ハイブリダイゼーション分析および／
または標的増幅法のための試料の引き続いての使用を妨
げるものを含めた、生物学的試料中の多くの蛋白質成分
を分解するであろう。
選択された酸プロテアーゼは酸性pH、pH1.0ないしpH
4.0において活性を有し、他の望ましい成分と同様試料
中に見い出されるヌクレアーゼを含めた広い範囲の蛋白
質を消化できなければならない。加えて、理想的には、
所望の核酸を含む成分を消化することができるべきであ
る。いくつかの場合において、（試料中のその存在が遊
離型である核酸は望ましくない）核酸がその成分構造か
ら遊離されないように、より限定された特異性のプロテ
アーゼを選択することが望ましいであろう。
また、酸プロテアーゼそれ自体も、選択された酸性pH
において活性であるかまたは選択された酸性プロテアー
ゼによる分解または不活化に耐性であるヌクレアーゼ活
性を有さないかどうかを確実にするためチェックしなけ
ればならない。
酸プロテアーゼの商業的調製物はこのような酵素が混
入しており、もし必要ならば、それらを除去するために
精製しなければならない。以下の実施例において、ペプ
シン消化では除去できない残存RNase活性を除去するた
めの商業的に入手可能なペプシン調製物を精製するため
の方法を挙げる。同等の方法を他のプロテアーゼに対し
て使用することができる。
プロテアーゼはpHを上昇させる単純な行動によって不
活化される。幾つかの酸プロテアーゼについては、これ
は、完全にさらなる蛋白質分解消化を停止させるのに十
分であり、酵素を不可逆的に変性または不活化する。他
のプロテアーゼについては、試料を加熱してプロテアー
ゼの完全不活化を達成する手段に訴える必要があるかも
しれない。中性pHにおける熱への短時間の暴露によりヌ
クレアーゼは破壊され、かつ核酸は損傷を受けないの
で、核酸はこの方法を無傷で生き残るであろう。
従って、本発明はin vitroで核酸を抽出するための
単純な方法を提供する。この方法は、Ｃ型肝炎ウイルス
のごときウイルスを含有するものを含めた多くの生物学
的な試料を処理するために用いることができるが、それ
は開きにくいRNA含有ウイルスであるので特有の困難を
生じ、試料はかなりの量の膵臓型RNase活性を有する血
清または血漿であり、ウイルスはしばしば非常に少量し
か存在しないので、エタノール沈澱技術による核酸の回
収を困難としている。
従って、第一の態様において、本発明は、（所望の核
酸を分解可能な）内因性ヌクレアーゼの活性が低いpH、
例えば、1.0から4.0の間のpHに生物学的試料を酸性化
し；該生物学的試料をそのpHで活性な外因性の酸プロテ
アーゼに接触させ；試料を、内因性のヌクレアーゼが有
意でないレベル（試料中の核酸のレベルに対する影響が
有意でないレベル、例えば、標準の塩溶液中で37℃にお
いて60分にわたり５％より少ない核酸が分解されるレベ
ル）にまで分解されるまでインキュベートし；生物学的
試料のpHを、塩基で、外因性のプロテアーゼがもはや活
性でないようにするのに十分なpH、例えば、プロテアー
ゼがもはや活性でないpHまで上昇させることによって、
生物学的試料から核酸を精製するかまたは使用可能にす
るための方法をその要旨とする。
「使用可能にする」とは、核酸がハイブリダイゼーシ
ョンまたは増幅のごとき後の分析に利用できることを意
味する。
「活性が低い」とは、内因性ヌクレアーゼに関して、
（同じ条件下で）治療前よりもヌクレアーゼ活性が低い
ことを意味する。「活性が低い」とは、外因性プロテア
ーゼに関して、治療前よりもプロテアーゼ活性が低いこ
とを意味する。好ましくは、低い外因性プロテアーゼ活
性は、単離した核酸を含む後の過程で用いられる酵素の
活性を引き下げるのには不十分である。
「分解された」とは、ヌクレアーゼの活性が、単離し
た核酸の後の実験または操作を可能にするレベルにまで
減少することを意味する。
「所望の核酸」とは、本発明により恐らくは他の核酸
と共に得られる核酸を意味し、その後具体的に同定する
ことができる。
好ましい具体例において、生物学的試料は組織細胞、
血液成分、および感染病薬剤を含有していてもよい他の
ヒトの生物学的物質から選択され；生物学的試料はヒト
白血球、ガン細胞、または他の細胞であって遺伝的分析
のためのヒトの細胞核酸の簡便な源を提供するもの、体
液、分泌物、もしくは組織からなり；「酸プロテアー
ゼ」はペプシンであり；インキュベーションの後の試料
のpHは、外因性プロテアーゼの存在下では好ましくはpH
4またはそれ以下であるが、次の使用に適したレベルま
で引き上げられるが、外因性プロテアーゼが完全に阻害
されるか不活化されるレベルよりは下であり；酸性化工
程においてpHは1.0ないし4.0に調整され；該上昇させる
工程においてpHは6.0より大きくなるよう調整され；上
昇させる工程に続いて試料を加熱して試料中に存在する
酸性プロテアーゼおよび／または他の酵素活性の不活化
を助け；界面活性剤を試料に添加して他の試料成分から
の所望の核酸の放出を助け；インキュベーションの時間
は、試料成分の溶解および／または他の試料成分の分解
を成し遂げるように、有意でないレベルにまで外因性ヌ
クレアーゼレベルを減少させるのに必要な時間よりは長
い。
関連する態様において、本発明は、本発明の方法を実
施するのに必要な成分を含有するキット、およびこの方
法で使用するRNaseからペプシンを精製する方法をその
要旨とする。このような精製はマカロイド（Macaloid）
またはベントナイトのごとき、プロテアーゼは吸着しな
いRNase吸着剤を使用する。マカロイドはその表面にRNa
seを吸着する特性を有する天然の粘土鉱物産物である。
ベントナイトは、主にモンモリロナイトからなるコロイ
ド状の天然の水和したケイ酸アルミニウムの粘土である
類似の物質である。両方とも様々な生物学的物質からRN
aseを除去するためにしばしば交換可能に用いられる。
他のより多いまたはより少ない特異的な吸着剤が使用さ
れる。但し、RNaseは吸着するが所望のプロテアーゼは
吸着しないものとする。
好ましい具体例の記述 本発明は、核酸の分解が最小化される酸性条件下で様
々な型の生物学的試料から核酸を単離する方法を提供す
る。この過程は内因性ヌクレアーゼによる核酸の有意な
分解の危険がある場合に試料から核酸を獲得するために
特に有用である。この方法により単離し得る核酸は天然
に生じた核酸および合成核酸またはオリゴヌクレオチド
を含む。
単離すべき核酸を含有する生物学的試料は組織細胞、
血液成分、ウイルス、微生物、病原生物、およびこれら
の様々な生物を含む体液を含む。
本発明の方法の最初の工程は、所望の核酸を含む生物
学的試料の酸性度のpH4またはそれより下への調整であ
る。このpHにおいて、生物学的試料中に存在し得るヌク
レアーゼは活性でない。酸性条件で緩衝能を有するKCl
−HC1緩衝液、グリシン−HCl緩衝液、酢酸緩衝液および
様々な他の酸性緩衝液組成物を、試料のpHを引き下げる
ために使用できる。臨床的試料に存する内因性ヌクレア
ーゼは十分な酸性のpHでは作用しない（即ち、無視でき
る酵素活性しか有しない）。というのは、このpHはその
最適な範囲よりずっと下だからである。例えば、血清RN
aseはその最適pHが約6.5である。それはpH3.0またはそ
れより下ではほとんど活性がない。白血球RNaseは6.0な
いし6.5の範囲の最適pH範囲を有し、pH4.0またはそれよ
り下では実質的には酵素活性を有しない。従って、該混
合物のpH4またはそれ以下への酸性度の調整はほとんど
公知の内因性RNaseの作用を妨げるであろう。
同様に、血清デオキシリボヌクレアーゼ活性は約5.8
ないし7.0においてその最適pHを持つが、これは存在す
る二価の金属の型に依存する。それは、存在する金属イ
オンにかかわらず、pH5.0より下でほとんど活性を有さ
ない。白血球DNAseは約4.0ないし5.0の間で最適pHを有
し、pH3.0以下では実質的には不活性である。臨床試料
で見い出されるヌクレアーゼの正確なpH範囲は、pHを調
製するのに用いる緩衝液の種類、金属イオン要求性、お
よび、もしあるならば温度のような変数に依存するであ
ろう。
本発明の使用のために、当業者は興味のある１または
それ以上の核酸を分解する活性をどうやって分析するか
を知り、具体的な試料の型に必要な適当なpH、緩衝液、
および温度を容易に決定できる。特に、DNAを回収する
ことが望まれる場合は、温度を低くし暴露の時間を最小
化することが重要であろう。というのは、DNAの脱プリ
ンはより高い温度およびより長い温度を用いれば、低い
pHで起こり得るからである。しかしながら、いくらかの
DNAの脱プリンおよび鎖の破損が起こり得ることは本発
明の重要な特徴であって、いくつかの生物学的試料（例
えば、白血球細胞ペレット）が溶解した場合に産生され
るDNAのゼラチン状の固まりを破壊するのに役立つ点で
有用である。従って、本発明は該方法の添加された利益
としてこの付加的な試料処理問題を扱うことが可能であ
る。
次の工程（もし望めば、最初の工程と同時に、または
その前においてさえも行える）は、酸性化された生物学
的試料への酸プロテアーゼの添加である。反応混合物中
の内因性ヌクレアーゼを消化しこのプロテアーゼによっ
て不可逆的に不活化する。この工程において、所望の核
酸は、生物学的成分、例えば、細胞膜が酸性プロテアー
ゼによってまた消化される場合に、生物学的試料から水
溶液中に放出させることができる。ペプシンは、この工
程で使用可能な酸性プロテアーゼの一例である。他のプ
ロテアーゼも、生物学的試料に存在する望まないヌクレ
アーゼ活性を不活化する酸性条件下で酵素活性を保持す
る限り使用可能である。このようなプロテアーゼは標準
的な方法を用いて当業者によって容易に確認される。
上記に記載される工程によって放出される核酸は安定
である。なぜならば、（アルカリの添加によって酸プロ
テアーゼを不活化した溶液の中和の後さえも）水溶液が
もはや活性なヌクレアーゼを含まないからである。この
ような中和は次の酵素反応、例えば、PCR、cDNA重合法
のごとき核酸増幅方法に適する生理的条件を供給する。
それゆえ、中和した溶液はさらなる処理、例えば、強い
アニオン界面活性剤または他の苛酷な薬剤であって、引
き続いての次の過程において用いられる酵素の活性に影
響し得るものを除去することなく直接この方法に使用し
てもよい。
本発明は他の核酸単離法よりも非常な利点を供給す
る。というのは、グアニジンイソチオシアナートまたは
（他の方法で用いられる）他の変性剤を除去する過程が
必要でないからである。外因性酸プロテアーゼは内因性
ヌクレアーゼを不可逆的に不活化し、一工程で生物学的
試料から核酸を放出させる。この方法は、遺伝的診断の
ために生物学的試料から核酸を単離するのに容易かつ簡
便に用いることができ、従って臨床の実験室において有
用である。
以下の実施例は本発明の様々な態様を例示するために
記載するが、より具体的に請求項で表される態様を決し
て限定しない。
実施例1:低pHにおけるヒト血清RNaseの阻害 ヒトの血液試料を健康な志願者から採取した。血液を
室温（約20℃）で放置し凝固させた。血餅を低速遠心で
除去した。得られた血清をヒト血清RNaseの源として用
いた。
血清RNase活性を以下の方法で研究した。終濃度が50m
MとなるようにKClを５マイクロリットルの血清に添加し
た。HClを終濃度が20mMから97mMの範囲になるように添
加した。RNAをRNase基質として添加した。容量を10マイ
クロリットルに調整した。溶液の酸性度は、溶液に含ま
れるHClの量に応じてpH1.5からpH5.0の間で変化した。
溶液を37℃において20分間インキュベートし、血清RNas
eによってRNAを分解させた。
残存するRNAの量をアーノルド（Arnold）によってEP3
09230に記載されたごとく化学発光的に標識したプロー
ブによるハイブリダイゼーション分析により決定した。
手短かに言えば、反応混合物を、反応を完結させる際に
95℃における加熱によって変性させた。（上記の混合物
中のRNAに相補的な）化学発光標識プローブを含む溶液
を添加し、得られた混合物を60℃にて20分間インキュベ
ートした。試薬を添加してハイブリダイズしなかったプ
ローブの化学発光標識を選択的に不活化し、60℃で４分
間インキュベートした。室温まで冷却した後、ハイブリ
ダイズしたプローブの化学発光をルミノメーター（lumi
nometer）を用いて相対的光単位（RLU）で測定した。
反応溶液に添加したRNAの約50％をpH4.0での処理後回
収した。添加したRNAの100％がpH3.5またはそれ以下で
回収された。血清のRNase活性は約pH4.0またはそれより
下でかなり低下し、その酵素活性はpH3.5またはそれよ
り下で完全に失われた。これらの結果を表１に示す。
実施例2:ヒト白血球RNase 健康な志願者の血液をサポニンで処理して赤血球を溶
解した。白血球を低速遠心で収集した。白血球を次いで
生理的食塩水で洗浄し、トリトンＸ−100 Triton X−1
00）を含む緩衝液中に溶解した。得られた溶液をヒト白
血球RNase溶液として用いた。
ヒト白血球RNaseのpH依存度を、次いで、実施例１と
類似の方法で実験した。手短かに言えば、RNase溶液を1
2.25mM NaClと10mM MgCl2とを含むpH4.0の酢酸カリウ
ム緩衝液に添加した。RNAを溶液に添加し、全体の体積
を10マイクロリットルに合わせた。反応溶液を37℃で20
分間インキュベートしてヒト白血球RNaseでRNAを消化し
た。反応を完結する際に、残存するRNAの量を、実施例
１に記載した標識プローブハイブリダイゼーションによ
って測定した。
対照として、反応混合物を調製するために酢酸カリウ
ム緩衝液の代わりに30mlのトリス−HCl緩衝液（pH7.7）
を用いた。５マイクロリットルの血液から調製したヒト
白血球RNase溶液を添加し、上記記載の方法と類似の反
応方法を行った。pH7.7に緩衝化した反応混合物中で、
添加されたRNAは、これらの条件下で５マイクロリット
ルのヒト血液から得られた白血球RNaseによって消化さ
れて検出不能なレベルになった。対照的に、pH4.0にお
いて反応混合物に100マイクロリットルの血液由来のヒ
ト白血球RNase溶液を添加した場合に、もとのRNaseの約
85％が回収された。従って、ヒト白血球RNase活性はpH
4.0において実質的に減少した。二組の試験の結果を表
２に示す。
実施例3:添加したRNAの回収 健康な志願者からの血清を常法によって単離した。５
マイクロリットルの血清に対し、KCl、NaClおよびMgCl2
をそれぞれ終濃度が50mM、86mM、10mMおよび25mMとなる
ように添加した。溶液の酸性度をpH2.5から1.0に調整し
て混合物中のRNaseを不活化した。RNAを基質として添加
し、水で10マイクロリットルとした。ペプシンを次いで
最終的に量が2.5ないし200単位となるように添加した。
この混合物を37℃にて５分間インキュベートした。反応
の完結の際に、トリス塩基を反応混合物に終濃度50mMと
なるように添加し、混合物の体積を20マイクロリットル
とした。この塩基は混合物の酸性度を中和しpHを約7.0
に調整した。この混合物を37℃でさらに20分間インキュ
ベートした。反応の完結の際に、混合物中に残存するRN
Aを95℃で加熱することにより変性し、標識したプロー
ブ（上記混合物中のRNAに相補的）を添加した。混合物
を60℃で20分間インキュベーションし上記で示されるよ
うにいかなる残存するRNAをも分析した。
100％の外因性RNAが2.5ユニットまたはそれ以上のペ
プシン存在下これらの条件で回収された。この実施例は
血清RNaseがペプシンによって不可逆的に不活化され、
反応混合物の中の外因性RNAを血清ヌクレアーゼによっ
て影響を受けずに回収できることを示す。これらの結果
を表３に示す。
実施例4:HCV試験試料 本発明の方法を、Ｃ型肝炎ウイルスを含む試料血清を
用いて評価した。用いた試料血清はＣ型肝炎ウイルスに
感染した患者から得られ、商業的なＣ型肝炎抗体検出キ
ットにより陽性であることを確認した。
内因性血清RNaseによる分解のないＣ型肝炎ウイルスR
NAの回収を確認するためには、かかる試料に存在する痕
跡量のRNAを試料からの抽出後に増幅しなければならな
い。この実施例では、RNA標的を、逆転写酵素を用いて
核酸を増幅する方法によってDNA標的を作るために使用
する。得られたDNA産物を、次いで、PCR法により二度増
幅した。ランダムプライマーを逆転写反応に用い、２つ
のプライマーを各PCR法に用いた。この方法を以下に詳
細に説明する。
５マイクロリットルのHCV陽性血清を採取し、５マイ
クロリットルのHCl緩衝液（86mM HCl、50mM KCl、10m
M MgCl2、および25mM NaCl）を添加した。25ユニット
のペプシン（マカロイドで処理した）を次いで添加し
た。混合物を37℃で15分間インキュベートした。HCV試
料を、５μｌの172mM KOHの添加によりpH7.0まで中和
した。混合物を95℃で２分間加熱し、室温（約20℃）ま
で冷却し、0.5マイクログラム（250pmol）のランダムプ
ライマー（Takara（タカラ）、日本）、13.3mMトリス−
塩酸（pH8.3）、0.7mM MgCl2、および各0.27mMのdAT
P、dTTP、dGTP、およびdCTP（ファルマシア（Pharmaci
a））を含む反応プレミックス（premix）75μｌを次い
で添加し、全体の容量を90マイクロリットルにした。混
合物を65℃で５分加熱し、室温まで冷却した。200ユニ
ット／μｌのMMLV逆転写酵素（BRL）を含有する１μｌ
を反応混合物に添加し、混合物を37℃で30分間インキュ
ベートした。PCR反応をマリス（Mullis）の、米国特許
出願第4,683,195号で明示する条件に従い行った。手短
に言えば、逆転写反応を完結する際に、HCVのNS5領域に
対応する100pmolの２つのプライマーを添加した。2.5ユ
ニットのタック（Taq）DNAポリメラーゼを添加し、全体
の容量を100μｌとした。反応産物を92℃で２分加熱す
ることにより変性した。加熱と冷却の循環を40回繰り返
した。（各循環は92℃で1.5分の加熱、53℃で1.5分の加
熱、および70℃で２分の加熱を含む）。得られた混合物
を次いで70℃で９分インキュベートした。
混合物のうち10μｌを、次いで、第一のPCR反応で用
いられた第一の一組のプライマーの内部の位置にハイブ
リダイズするよう設計された第二の一組のプライマーと
混合した。（これらの実施例で用いた現実のプライマー
は本発明には必須でない。）混合物の容量を100マイク
ロリットルとし、第二のPCR反応を、第一のPCR反応で用
いたのと同じ条件で行った。（具体的には、10mMトリス
−HCl、pH8.3、100pmolプライマー、1.5mM MgCl2、50m
M KCl、0.2mM各dNTP、および2.5ユニットのタック（Ta
q）ポリメラーゼを使用した。） これらの増幅から得られた核酸を95℃で５分加熱する
ことにより変性した。90μｌの標識したプローブを、実
施例１で記載した方法を用いて核酸の分析のために添加
した。結果を表４に示す。
これらのデータは、HCV陽性血清のシグナルの強度
が、健康な血清のそれよりも８から15倍大きいことを示
す。従って、HCV RNAは内因性RNaseにより影響を受け
ずにこの方法により遊離された。本実施例はまた、本発
明の方法により単離されたRNAは、さらに他の精製また
は単離過程を経ずに酵素反応の基質として用いることが
できることも示す。従って、本発明の方法は、これら自
体で、または他の増幅方法と組み合わせて、診断テスト
で特異的な核酸を検出するのに広く用いることができる
ことが期待される。
実施例5:HCV試験試料。PCR増幅無し 以下はHCV試料中の核酸の検出のためのもう一つのプ
ロトコールである。緩衝液（KCl/HClまたはグリシン/HC
l）中の５μｌのペプシン溶液を適当な試験管に入れた
（ペプシンはシグマ（Sigma）から得た）。KCl/HCl緩衝
液のためのペプシン溶液は100mM KCl−172mM HCl中に
25Uのペプシンを含み；グリシン/HCl緩衝液のためには4
00mMグリシン−400mM HCl中に25Uのペプシンを含む。
５μｌの血清試料（健康またはHCVに感染した患者の
もの）をこれらの試験管に添加し、37℃で15分間インキ
ュベートした。
10μｌの中和溶液を添加した（KCl/HCl緩衝液のため
には中和溶液は172mM KOH−128mM KCl;そしてグリシ
ン/HCl緩衝液のためには200mM KOH）。試料を次いで実
質的にはカシアンおよびフルツ（Kacian and Fultz）
の、転写複合体を使用した核酸配列増幅方法（NUCLEIC
ACID SEQUENCE AMPLIFICATION METHODS UTILIZING A TR
ANSCRIPTION COMPLEX）、PCT/US90/03907に記載された
ように増幅した。この混合物を37℃で４時間インキュベ
ートし、10μｌの増幅した試料を、AE−CP−6278プロー
ブ（NS5領域）を使用してHPAに付した。結果を表５に示
す。
これらの結果は、HCVが、本発明と組み合わせたPCR増
幅無しの系を用いて検出可能なことを示す。
実施例6:マカロイド（Macaloid）によるペプシン精製方
法 以下は潜在的に有害な酵素活性を有しないペプシンの
調製方法である。
A. マカロイド懸濁液の原液の調製（16mg/ml）：（こ
の方法はモレキュラー・クローニング第一版（Molecula
r Cloning 1st Edition）（マニアティス（Maniatis）
ら、1982、p452）に記載された方法と同じである）。
1. 0.25gのマカロイドを量る。
2. 0.25gのマカロイドを25mlの50mMトリス−HCl、pH
7.5に懸濁する。
3. 常に攪拌しながら懸濁液を100℃で５分沸騰させ
る。
4. マカロイド懸濁液を４℃にて2500×ｇで遠心す
る。
5. 上清を捨てる。
6. 沈澱を20mlの50mMトリス−HCl、pH7.5に再懸濁す
る。
7. マカロイド懸濁液を４℃にて2500×ｇで遠心す
る。
8. ５から７までの方法（洗浄方法）をさらに４回繰
り返す。
9. 粘着性のペレットを15mlの50mMトリス−HCl、pH
7.5に再懸濁する。
10. マカロイド溶液を４℃ないし−20℃に保存す
る。
B. ペプシン中に混入したRNaseの吸着のための実際に
役立つマカロイド懸濁液の調製： ペプシンは中性pHで容易に不活化される。従って、マ
カロイドを懸濁させる緩衝液は、ペプシン調製での使用
の際に酸性pHの緩衝液で置換する必要がある。
1. 50mMトリス−HCl中のマカロイド懸濁液をエッペ
ンドルフ（EPPENDORF）試験管に入れる。
2. マカロイド懸濁液を微量高速遠心機で5000rpm遠
心する（５分）。
3. 上清を捨てる。
4. 150mM NaCl−10mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.2
を添加する。
5. マカロイド懸濁液を数時間４℃で放置する。
6. 試験管を微量高速遠心機で5000rpmで遠心する
（５分）。
7. 上清を捨てる。
8. マカロイド懸濁液のpHが5.5より下になるまで４
から７までの方法を繰り返す（一般的には、これには緩
衝液の４回または５回の置換を有する）。
9. マカロイドを150mM NaCl−10mM酢酸ナトリウム
緩衝液、pH5.2に再懸濁する（最初の体積と同じ体
積）。
C. マカロイドによるペプシン中に混入したRNaseの吸
着： 1. ペプシン（シグマ（Sigma）カタログ番号6887）
を10mM HCl−50％グリセロール中に345U/μｌになるよ
う溶解する。
2. 150μｌのペプシンをエッペンドルフ（EPPENDOR
F）試験管に入れる。
3. 150mM NaCl−10mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.2
中の50μｌのマカロイド懸濁液を添加し混合する。
4. 試験管を氷水中に２分放置する。
5. 試験管を４℃にて10分微量高速遠心機で7500rpm
で遠心する。
6. 150μｌの上清をもう一本の試験管に移す（上清
のpHは約4.5である）。
7. 工程３のマカロイド懸濁液50μｌを再び添加し混
合する。
8. 試験管を４℃で15分保つ。
9. 試験管を４℃、10分、微量高速遠心機で7500rpm
で遠心する。
10. 150μｌの上清をもう一本の試験管に移す（上清
のpHは約4.5である）。
11. 工程３のマカロイド懸濁液50μｌを添加し混合
する。
12. 試験管を４℃で15分放置する。
13. 試験管を微量高速遠心機で7500rpmで遠心する
（10分）。
14. 上清をもう一本の試験管に移し−20℃に保つ
（上清のpHは4.5−5.0（4.5に近い））。
D. ペプシン活性の分析： マカロイドへの吸収方法の後のペプシン活性を、各吸
収段階の後の標準的な方法により試験した。結果を表６
に示す。
吸着後のペプシン活性をペプシン原液から描いた標準
的な曲線を用いて計算した。
このデータはペプシン活性がマカロイド吸着方法によ
り影響されなかったことを示す。
E. ペプシン中における混入したRNase活性の分析： ペプシン中に混入したRNaseの活性は、アクリジニウ
ムエステルで標識したDNAプローブがRNA基質にハイブリ
ダイズする能力の損失をモニターすることにより測定し
た。用いられたRNAは、クラミジア・トラコーマティス
（Chlamydia trachomatis）のリボゾームRNAの部分に見
い出される配列のin vitroで合成された転写物であっ
た。ペプシン溶液の原液（吸収無し）および３度の吸着
後のペプシン調製物の両方における混在するRNaseの活
性を試験した。
反応は、各反応試験管が、DNAプローブとアニールし
た場合に、RNase、50mMトリス−HCl（pH7.5）、10mM M
gCl2、25mM NaCl、および２％グリセロールの不存在下
で40,000の相対的光単位（RLU）シグナルを産生するRNA
転写物の量を含むように整えられた。0U、345Uまたは69
0ユニット当量のペプシン調製物を添加した。全体の容
量は20μｌであった。ペプシンのマカロイド処理後、無
視出来るまたは検出不可能な量のRNase活性が検出でき
た。
本明細書中に引用される本開示および特許出願は当業
者の技術の範囲を示す。当業者にとっては、様々な変
化、修飾、および変種を、発明の請求項によって定義さ
れる発明の精神および態様から離れずに行ってもよいこ
とが明らかであろう。
他の具体例は以下の請求項の中にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開92／08807（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/70 C07H 21/04 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生物学的試料を、所望の核酸を分解可能な
    内因性ヌクレアーゼが不活性となるような1.0ないし4.0
    の間のpHまで酸性化し、 該生物学的試料を該酸性化工程のpHで活性な外因性酸プ
    ロテアーゼに接触させ、 該生物学的試料を、該生物学的試料中に存在する５％よ
    り少ない核酸が標準の塩溶液中で37℃において60分間に
    分解されるレベルまで内因性ヌクレアーゼの活性を減少
    させるのに十分な時間インキュベートし、次いで、 該外因性プロテアーゼが低活性となるような6.0より大
    きなpHまで該生物学的試料のpHを上昇させる工程を含む
    ことを特徴とする、生物学的試料に含有された所望の核
    酸を利用できるようにする方法。
  2. 【請求項２】該生物学的試料がヒトの生物学的試料であ
    って、感染病の薬剤を含んでいてもよい請求項１記載の
    方法。
  3. 【請求項３】該生物学的試料が組織細胞または血液成分
    を含む請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】該酸プロテアーゼがペプシンである請求項
    １ないし４のいずれか１記載の方法。
  5. 【請求項５】さらに、生物学的試料のpHを6.0より大き
    なpHまで上昇させた後、該試料を加熱して、該生物学的
    試料中に存在する該酸プロテアーゼおよび／または他の
    酵素の活性の不活性化を援助することを含む請求項１な
    いし４のいずれか１記載の方法。
  6. 【請求項６】界面活性剤を該生物学的試料に添加して、
    所望の核酸の他の試料成分からの遊離を援助する請求項
    １ないし５のいずれか１記載の方法。
  7. 【請求項７】該インキュベーション工程の時間を、内因
    性ヌクレアーゼの活性を該生物学的試料中に存在する５
    ％より少ない核酸が標準の塩溶液中で37℃にて60分間に
    わたり分解されるレベルまで減少させるのに必要な時間
    より長くすることによって、試料成分からの核酸の遊離
    を援助する請求項１ないし６のいずれか１記載の方法。
  8. 【請求項８】内因性ヌクレアーゼの活性を、該酸性化工
    程中に、該生物学的試料中に存在する５％より少ない核
    酸が標準の塩溶液中で37℃にて60分間にわたり分解され
    るレベルまで減少させて、 内因性ヌクレアーゼの活性を、該インキュベーション工
    程中に、該生物学的試料中に存在する５％より少ない核
    酸が標準の塩溶液中で37℃にて60分間にわたり分解され
    るレベルまで不可逆的に減少させる請求項１ないし７の
    いずれか１記載の方法。
  9. 【請求項９】生物学的試料に含有された所望の核酸を利
    用できるようにするキットであって、以下の成分： 該生物学的試料のpHを1.0ないし4.0の間のpHまで低下さ
    せることができる酸、 該生物学的試料中の細胞物質を消化して、核酸を遊離さ
    せ、かつ該生物学的試料に存在し得る内因性ヌクレアー
    ゼを不活化するのに適した酸プロテアーゼ、および 該酸を含む該生物学的試料のpHを6.0より大きなpHまで
    上昇させることによって、該酸プロテアーゼを不活性に
    させる塩基 を別々の区画に入れてなる該キット。
  10. 【請求項１０】標識したプローブをさらに含む請求項９
    記載のキット。
  11. 【請求項１１】該酸プロテアーゼがペプシンである請求
    項９または10記載のキット。
  12. 【請求項１２】さらに、別々の区画に界面活性剤成分を
    含む請求項９ないし11のいずれか１記載のキット。
  13. 【請求項１３】実質的に該成分よりなる請求項９ないし
    12のいずれか１記載のキット。
  14. 【請求項１４】該成分よりなる請求項９ないし12のいず
    れか１記載のキット。
  15. 【請求項１５】さらに、最終工程として、標識したプロ
    ーブによるハイブリダイゼーション分析により、該核酸
    の量を測定すること含むことを特徴とする請求項１〜８
    のいずれか１記載の方法。
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