ES2198411T3 - Metodo para preparar acidos nucleicos a partir de una muestra biologica utilizando un ph bajo y proteasa acida. - Google Patents

Metodo para preparar acidos nucleicos a partir de una muestra biologica utilizando un ph bajo y proteasa acida.

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Abstract

UN METODO PARA PODER DISPONER DE UN ACIDO NUCLEICO DESEADO QUE SE ENCUENTRA EN UNA MUESTRA BIOLOGICA, QUE CONSISTE EN ACIDIFICAR DICHA MUESTRA BIOLOGICA A UN PH EN QUE LAS NUCLEASAS ENDOGENAS CAPACES DE DEGRADAR EL O LOS ACIDOS NUCLEICOS DESEADOS SEAN INACTIVAS, PONER EN CONTACTO DICHA MUESTRA BIOLOGICA CON UNA PROTEASA ACIDA EXOGENA A DICHO PH, INCUBAR DICHA MUESTRA HASTA QUE SE REDUZCAN LAS ACTIVIDADES DE LA NUCLEASA ENDOGENA A UNOS NIVELES INSIGNIFICANTES Y ELEVAR EL PH DE LA MUESTRA BIOLOGICA A UN PH SUFICIENTE PARA HACER QUE LA PROTEASA EXOGENA SEA MENOS ACTIVA.

Description

Método para preparar ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica utilizando un pH bajo y proteasa ácida.
Campo del invento
El presente invento se refiere a procedimientos para tratar muestras biológicas para poner sus ácidos nucleicos a disposición para diversos propósitos, tales como ensayos de hibridación de ácidos nucleicos para la diagnosis de enfermedades y otros propósitos, y para la amplificación de ácidos nucleicos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de la diana. Específicamente, el presente invento se refiere a los procedimientos convenientes para poner los ácidos nucleicos a disposición de modo que se evite la degradación de los ácidos nucleicos por nucleasas endógenas presentes en la muestra biológica.
Antecedentes del invento
Muchos procedimientos de diagnóstico están basados en la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) presentes en una muestra biológica. Por ejemplo, la muestra puede contener bacterias, virus, u otros microorganismos cuya presencia debe ser averiguada para determinar la causa de una enfermedad infecciosa. En otros casos, la secuencia de ácidos nucleicos puede buscarse dentro del ADN de los glóbulos blancos de sangre humana para establecer la presencia de una mutación asociada con el cáncer o una enfermedad genética.
Para tales análisis de diagnóstico, es necesario poner a disposición el ácido nucleico específico que puede estar presente en la muestra. Frecuentemente, el ácido nucleico estará contenido dentro de una bacteria, hongo, virus, u otro microorganismo o dentro de células humanas tales como glóbulos blancos. Puede además estar contenido dentro de otras estructuras tales como ribosomas, plásmidos, o ADN cromosómico. Para realizar reacciones de hibridación para detectar ácidos nucleicos específicos o para amplificarlos usando PCR u otros métodos de amplificación de la diana, el ácido nucleico debe ser liberado de estos organismos y/o estructuras.
Desgraciadamente, tal liberación expone los ácidos nucleicos a degradación por nucleasas endógenas presentes en la muestra, que pueden existir en tal abundancia que el ácido nucleico sea destruido casi instantáneamente.
El problema es particularmente agudo cuando el ácido nucleico específico es un ARN, puesto que las RNAsas son abundantes en la mayoría de las muestras biológicas y con frecuencia son extremadamente resistentes a los tratamientos que desactivan fácilmente muchas otras enzimas.
Para tratar este problema, es común en la técnica emplear una variedad de medios para purificar los ácidos nucleicos de la muestra biológica. Por ejemplo, detergentes aniónicos y agentes caotrópicos tales como sales de guanidinio han sido usados para, simultáneamente, desactivar o inhibir actividades nucleasas y liberar ácidos nucleicos del interior de las células y estructuras subcelulares. Desgraciadamente, estos agentes son también potentes inhibidores de las enzimas usadas en los procesos de amplificación de la diana o en muchos métodos de detección por hibridación o, en el caso de caotrópicos, pueden interferir con la hibridación misma. Por lo tanto, ha sido necesario usar etapas adicionales para eliminar estos agentes y recuperar los ácidos nucleicos.
El procedimiento más comúnmente usado es el de precipitar los ácidos nucleicos de la muestra usando diversas sales y etanol. La muestra debe ser mantenida a temperatura reducida (normalmente -20ºC o inferior) durante algunas horas y centrifugada a alta velocidad para lograr buenos rendimientos de ácidos nucleicos en la mayoría de los casos.
Debido a que otras macromoléculas también precipitan bajo estas condiciones produciendo una masa pegajosa, insoluble que atrapa a los ácidos nucleicos, frecuentemente ha sido necesario recurrir a la extracción de la muestra con mezclas de disolventes orgánicos peligrosos que contienen fenol, cresol, y/o cloroformo previo a la precipitación con etanol. En algunos casos cuando se usan los detergentes aniónicos, las proteasas que están activas en presencia de estos detergentes, tales como proteinasa K o pronasa, son usadas para degradar parcialmente los componentes proteicos de la muestra para minimizar el atrapamiento durante la extracción con el disolvente orgánico, y/o degradar componentes que no puedan ser extraídos por el tratamiento con disolvente.
Se apreciará fácilmente que estos métodos son complejos, tediosos, de labor intensa, y lentos. Si no se toma gran cuidado en la realización del procedimiento, puede tener lugar una contaminación residual con nucleasas, y los ácidos nucleicos de la muestra serán degradados o perdidos. Ensayos de diagnóstico realizados con tales muestras pueden dar resultados negativos falsos. Resultados negativos falsos pueden obtenerse también si permanecen en la muestra detergentes aniónicos, sales caotrópicas, o etanol residuales e inhibir la hibridación y/o los procedimientos de amplificación de la diana. Si se han usado detergentes aniónicos y proteasas, la actividad proteolítica residual puede también degradar las enzimas usadas en la amplificación de la diana y/o las reacciones de detección por hibridación y producir resultados negativos falsos. Por otro lado, elaboraciones inadecuadas con estos métodos pueden dar como resultado también el aislamiento de proteínas desnaturalizadas u otras macromoléculas que pueden atrapar sondas marcadas y producir resultados positivos falsos con ensayos de diagnóstico que impliquen hibridación de ácidos nucleicos. Así, estos procedimientos no están bien adaptados para el procesamiento rutinario de muestras biológicas recibidas en laboratorios clínicos en cualquier cantidad.
Particularmente, el problema se encuentra con muchas muestras biológicas en las que la especie de ácido nucleico deseada es el ARN, y la muestra contiene cantidades significativas de RNAsa del tipo ``pancreático'' (también frecuentemente referida como ``ribonucleasa A''). Las RNAsas pancreáticas están presentes en el suero y plasma y en muchos tejidos del cuerpo. Son resistentes a la desnaturalización por calor y ácidos y resistirán incluso a la ebullición en HCl 1N durante 10 minutos sin pérdida de actividad. Se inhiben por detergentes aniónicos, caotrópicos, y disolventes orgánicos tales como fenol, pero no son desactivados irreversiblemente por estos agentes; por lo tanto, cuando los detergentes, caotrópicos, o disolventes se eliminan, la RNAsa (si no se ha eliminado por extracción cuidadosa) puede proceder a degradar el ARN deseado.
La exposición a un alquilo fuerte desactivará irreversiblemente estas RNAsas; sin embargo, tales condiciones también darán como resultado la degradación del ARN mismo.
El presente invento aborda estos problemas proporcionando un método para inhibir y desactivar convenientemente nucleasas en muestras biológicas mientras que pone ácidos nucleicos de muestras a disposición de ensayos de hibridación, procedimientos de amplificación de la diana, u otros usos. No se requieren en la muestra detergentes o caotrópicos inhibitorios, y no hay actividad proteolítica residual. El método es simple y aplicable para procesar un gran número de muestras simultáneamente. A diferencia de los métodos de precipitación con etanol, no se usan disolventes orgánicos peligrosos, ni se requieren kits para enfriar la muestra o recuperar los precipitados por centrifugación.
Sumario del invento
El presente invento presenta un procedimiento para la desactivación irreversible de nucleasas endógenas en muestras biológicas mediante la reducción del pH por debajo del que las nucleasas endógenas presentes en la muestra están activas, añadiendo una proteasa que es activa a ese pH y que degrada cualquier nucleasa que no ha sido irreversiblemente desactivada por exposición a bajo pH, y luego desactivando la proteasa (después de haber hecho su función) por aumento del pH. Al pH más alto, la proteasa elegida es o bien inactiva o bien desactivada irreversiblemente. Si es posible, la proteasa se elige así para ayudar en la digestión de otras macromoléculas en la muestra que puedan interferir con el uso que se pretende asignar a la muestra, y se elige para ayudar a poner a disposición los ácidos nucleicos deseados por degradación de las paredes celulares de los microorganismos, partículas víricas, ribosomas, y/u otras estructuras que contengan los ácidos nucleicos deseados. Alternativamente, la solubilización de estas estructuras y la liberación de los ácidos nucleicos puede ser efectuadas mediante el uso de detergentes, calor, u otros medios una vez que la actividad de la nucleasa de la muestra ha sido eficazmente controlada, reducida, o eliminada.
En general, la muestra biológica se ajusta a un pH bajo donde las nucleasas endógenas son o bien desactivadas irreversiblemente o bien inhibidas eficazmente. La proteasa ácida exógena (tal como pepsina) se añade luego o puede ser añadida simultáneamente con la disolución que reduce el pH. La acción de la proteasa ácida digiere las nucleasas endógenas presentes en la muestra y las desactiva irreversiblemente de modo que no puedan degradar los ácidos nucleicos de la muestra cuando el pH es subsiguientemente elevado. Además, la proteasa actuará normalmente para liberar los ácidos nucleicos de los microorganismos, células humanas, o componentes subcelulares tales como ribosomas y núcleos. También degradará muchos componentes proteicos de la muestra biológica, incluyendo unos que puedan interferir con el uso subsiguiente de la muestra para ensayos de hibridación y/o procedimientos de amplificación de la diana.
La proteasa ácida seleccionada debería tener actividad a un pH ácido, pH 1,0 a pH 4,0, y ser capaz de digerir una amplia variedad de proteínas, incluyendo las nucleasas encontradas en la muestra así como otros componentes no deseados. Además, idealmente debería ser capaz de digerir componentes que contengan el ácido nucleico deseado. En algunos casos, puede ser deseable seleccionar una proteasa de una especificidad más limitada para que un ácido nucleico (cuya presencia en forma libre en la muestra fuera indeseable) no sea liberado de sus estructuras componentes.
La proteasa ácida debería ser también comprobada para asegurar que está libre ella misma de actividades de nucleasa que son activas al pH ácido elegido o que son resistentes a la degradación y desactivación por la proteasa ácida elegida.
Las preparaciones comerciales de proteasas ácidas pueden ser contaminadas con tales enzimas y deberían ser purificadas, si fuera necesario, para eliminarlas. En los ejemplos que siguen, se da un procedimiento para purificar preparaciones de pepsina disponibles comercialmente para eliminar actividades RNAsa residuales que no son eliminadas por la digestión con pepsina. Procedimientos equivalentes pueden ser usados para otras proteasas.
La proteasa se vuelve inactiva por el simple hecho de aumentar el pH. Con algunas proteasas ácidas, esto es suficiente para parar completamente digestiones proteolíticas adicionales y pueden desnaturalizar y desactivar irreversiblemente la enzima. Con otras proteasas, puede ser necesario recurrir a calentar la muestra para lograr una desactivación completa de la proteasa. Puesto que las nucleasas han sido destruidas y los ácidos nucleicos no han sido dañados por exposición breve al calor a un pH neutro, sobrevivirán intactos a este procedimiento.
Consecuentemente, este invento proporciona un procedimiento simple para extraer ácidos nucleicos in vitro. Este procedimiento puede ser usado para procesar muchas muestras biológicas, incluyendo las que contienen virus, tales como el virus de la hepatitis C, que presenta dificultades concretas porque es un virus que contiene ARN que es difícil de abrir, la muestra es suero o plasma que contiene cantidades significativas de actividad RNAsa de tipo pancreático, y el virus está presente con frecuencia en muy pequeñas cantidades, lo que hace difícil la recuperación de los ácidos nucleicos por técnicas de precipitación con etanol.
Así, en un primer aspecto, el invento presenta un método para purificar o poner a disposición un ácido nucleico de una muestra biológica mediante la acidificación de la muestra biológica a un pH al que las nucleasas endógenas (capaces de degradar los ácidos nucleicos deseados) son menos activas, por ejemplo, a un pH entre 1,0 y 4,0; poniendo en contacto la muestra biológica con una proteasa ácida exógena activa a ese pH; incubando la muestra hasta que las nucleasas endógenas hayan sido degradadas a niveles insignificantes (es decir, a un nivel donde sus efectos sobre los niveles de ácidos nucleicos en la muestra sean insignificantes, por ejemplo, a un nivel donde menos del 5% de los ácidos nucleicos sean degradados a lo largo de un período de 60 minutos a 37ºC en una disolución salina estándar); y aumentando el pH de la muestra biológica con una base a un pH suficiente para volver la proteasa exógena menos activa, por ejemplo, a un pH al que la proteasa ya no sea activa.
Por ``poner a disposición'' se quiere decir que el ácido nucleico es accesible para análisis posteriores, tales como hibridación o amplificación.
Por ``menos activo'' se quiere decir, con respecto a las nucleasas endógenas, que la actividad de la nucleasa es menor que antes del tratamiento (bajo las mismas condiciones). Por ``menos activo'' se quiere decir, con respecto a proteasas exógenas, que la actividad de la proteasa es menor que antes del tratamiento. Preferiblemente, la actividad de la proteasa exógena inferior es insuficiente para reducir la actividad de las enzimas usadas en procesos posteriores implicando a los ácidos nucleicos aislados.
Por ``degradado'' se quiere decir que la actividad de las nucleasas se reduce a un nivel que permitirá experimentos o manipulaciones de los ácidos nucleicos aislados posteriores.
Por ``ácido nucleico deseado'' se quiere decir un ácido nucleico que es obtenido, posiblemente junto con otros ácidos nucleicos mediante este invento, y puede consiguientemente ser identificado específicamente.
En realizaciones preferidas, se elige una muestra biológica de tejidos celulares, componentes de la sangre, y otros materiales biológicos humanos que pueden contener agentes de enfermedades infecciosas; la muestra biológica consiste en glóbulos blancos de sangre humana, células cancerígenas, u otras células que ofrezcan una fuente adecuada de ácidos nucleicos celulares humanos para análisis genéticos, fluidos corporales, secreciones, o tejidos; la ``proteasa ácida'' es pepsina; el pH de la muestra después de incubar, preferiblemente a un pH 4 o inferior en presencia de una proteasa exógena, es elevado a un nivel adecuado para su subsiguiente uso, pero debajo del nivel al que la proteasa exógena se inhibe o desactiva completamente; en la etapa de acidificación el pH se ajusta entre 1,0 y 4,0; en la etapa de elevación el pH se ajusta para ser superior a 6,0; siguiendo la etapa de elevación la muestra se calienta para ayudar a la desactivación de la proteasa ácida y/u otras actividades enzimáticas presentes en la muestra; se añaden detergentes a la muestra para ayudar a liberar los ácidos nucleicos deseados de otros componentes de la muestra; y el tiempo de incubación es mayor del necesario para reducir los niveles de nucleasa endógena a niveles insignificantes, para efectuar la lisis de componentes de la muestra y/o la degradación de otros componentes de la muestra.
En aspectos relacionados, el invento presenta un kit que incluye componentes necesarios para llevar a cabo el método de este invento, y un método para purificar la pepsina de RNAsas para el uso en este método. Tal purificación hace uso de una adsorbente de RNAsas que no adsorbe proteasas, por ejemplo, Macaloide o bentonita. El Macaloide es un producto mineral de arcilla natural que tiene la propiedad de adsorber RNAsas en su superficie. La bentonita es un material similar que es una arcilla de silicato de aluminio hidratado nativo coloidal que consiste principalmente de montmorillonita. Ambas pueden ser usadas con frecuencia intercambiablemente para eliminar RNAsas de una variedad de materiales biológicos. Otros adsorbentes más o menos específicos podrían ser usados con tal de que adsorbieran las RNAsas y no la proteasa deseada.
Descripción de las realizaciones preferidas
El presente invento proporciona un procedimiento para aislar los ácidos nucleicos de diferentes tipos de muestras biológicas bajo condiciones ácidas en el que la degradación de estos ácidos nucleicos está minimizada. Este proceso es particularmente útil para obtener ácidos nucleicos de especímenes en los que hay un riesgo de una degradación significativa de ácidos nucleicos por nucleasas endógenas. Los ácidos nucleicos que pueden ser aislados por este procedimiento incluyen ácidos nucleicos presentes de forma natural y ácidos nucleicos sintéticos u oligonucleótidos.
Las muestras biológicas que contienen los ácidos nucleicos para ser aislados incluyen tejidos celulares, componentes sanguíneos, virus, microorganismos, organismos patógenos, y fluidos corporales que contengan estos diversos organismos.
Una etapa inicial del procedimiento del presente invento es el ajuste de la acidez de la muestra biológica que contiene los ácidos nucleicos deseados a un pH alrededor de 4 o inferior. A este pH, las nucleasas que puedan estar presentes en la muestra biológica no están activas. El tampón KCl-HCl, el tampón glicina-HCl, el tampón ácido acético y otras diversas composiciones tampón ácidas que tienen actividad tamponadora en condiciones ácidas, pueden ser usados para reducir el pH de la muestra. Las nucleasas endógenas presentes en muestras clínicas no funcionan (es decir, tienen una actividad enzimática despreciable) a un pH suficientemente ácido, puesto que este pH está muy por debajo de su intervalo óptimo. Por ejemplo, la RNAsa sérica tiene su pH óptimo a alrededor de 6,5. Casi no tiene actividad a pH 3,0 o inferior. La RNAsa leucocitaria tiene un intervalo de pH óptimo desde 6,0 a 6,5 y no tiene virtualmente actividad enzimática a pH 4,0 o inferior. Por lo tanto, el ajuste de la acidez de la mezcla a alrededor de pH 4 o inferior evitaría la acción de la mayoría de las RNAsas endógenas conocidas.
Similarmente, la actividad desoxiribonucleasa sérica tiene su pH óptimo a alrededor de 5,8 hasta 7,0, dependiendo del(los) tipo(s) de metal(es) bivalente(s) presentes. Muestra una pequeña actividad debajo del pH 5,0, sin reparar en el ión metálico presente. La DNAsa leucocitaria tiene un intervalo de pH óptimo desde alrededor de 4,0 hasta alrededor de 5,0, y es virtualmente inactiva por debajo de pH 3,0. Los intervalos exactos de pH en los que las nucleasas encontradas en muestras clínicas son activas dependerán de tales variables como el tipo de tampón usado para controlar el pH, los requerimientos de ión metálico, si hay alguno, y la temperatura.
Para el uso del presente invento, aquellos expertos en la técnica saben como ensayar las actividades que degradan uno o más ácidos nucleicos de interés, y pueden fácilmente determinar el pH, el tampón, y la temperatura apropiados que son necesarios para un tipo de muestra particular. En particular, puede ser importante reducir la temperatura y minimizar el tiempo de exposición a un pH muy bajo cuando se desea recuperar ADN, puesto que la despurinización del ADN puede tener lugar a un pH bajo cuando se emplean temperaturas más altas y tiempos más largos. Sin embargo, es una característica importante del presente invento que pueda ocurrir algo de despurinización de ADN y una rotura de cadenas y es útil en cuanto a que ayuda a romper agregaciones gelatinosas de ADN que se producen cuando algunas muestras biológicas (por ejemplo, precipitados de glóbulos blancos) son lisadas. Así pues, el presente invento puede abordar este problema adicional de procesamiento de la muestra como un beneficio añadido del método.
La etapa siguiente (que puede ser realizada simultáneamente, o incluso antes de, la primera etapa si se desea) es la adición de una proteasa ácida en muestras biológicas acidificadas. Las nucleasas endógenas en la mezcla de reacción son digeridas y desactivadas irreversiblemente por esta proteasa. En esta etapa, los ácidos nucleicos deseados pueden ser también liberados desde la muestra biológica a la disolución acuosa cuando los componentes biológicos, 
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membranas celulares, son también digeridos por la proteasa ácida. La pepsina es un ejemplo de una proteasa ácida que puede ser usada en esta etapa. Otras proteasas pueden ser usadas mientras que conserven actividades enzimáticas bajo condiciones ácidas que desactiven las actividades de nucleasa no deseadas presentes en la muestra biológica. Tales proteasas son fácilmente identificadas por aquellos expertos en la técnica que usan procedimientos estándar.
Los ácidos nucleicos liberados por las etapas descritas anteriormente son estables porque la disolución acuosa ya no contiene nucleasas activas (incluso después de la neutralización de la disolución para desactivar la proteasa ácida mediante la adición de alcalí). Tal neutralización proporciona condiciones fisiológicas adecuadas para las subsiguientes reacciones enzimáticas, por ejemplo, para procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como PCR, y métodos de polimerización de cADN. Así pues, la disolución neutralizada puede ser usada directamente en tales procedimientos sin procesamientos adicionales, por ejemplo, sin eliminación de detergentes aniónicos fuertes u otros agentes fuertes que puedan afectar la actividad de las enzimas usadas en los procesos subsiguientes.
Este procedimiento proporciona ventajas significativas sobre otros métodos de aislamiento de ácidos nucleicos, puesto que no se requiere ningún proceso para eliminar isotiocianato de guanidinio u otros agentes desnaturalizantes (usados en otros procedimientos). La proteasa ácida exógena desactiva irreversiblemente las nucleasas endógenas y libera ácidos nucleicos de la muestra biológica en una etapa. Este procedimiento puede ser usado fácil y simplemente para aislar ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica para diagnóstico genético y es así útil en un laboratorio clínico.
Los ejemplos siguientes se exponen para ilustrar diversos aspectos del presente invento, pero no limitan de ningún modo su alcance como más particularmente se expone en las reivindicaciones.
Ejemplo 1 Inhibición de RNAsas séricas humanas a un pH bajo
Se tomó una muestra de sangre humana de un voluntario sano. La sangre se dejó reposar a temperatura ambiente (alrededor de 20ºC) para coagular. La sangre coagulada fue eliminada mediante centrifugación a baja velocidad. El suero obtenido se usó como fuente de RNAsa sérica humana.
La actividad de RNAsa sérica se estudió por el procedimiento siguiente. Se añadió KCl a 5 microlitros de suero a una concentración final de 50 mM. Se añadió HCl a una concentración final en un intervalo desde 20 mM a 97 mM. Se añadió ARN como sustrato de RNAsa. El volumen se ajustó a 10 microlitros. La acidez de la disolución varió desde un pH 1,5 a un pH 5,0 dependiendo de la cantidad de HCl incluida en la disolución. La disolución se incubó a 37ºC durante 20 minutos para permitir la degradación del ARN por la RNAsa sérica.
La cantidad de ARN sobrante se determinó por un ensayo de hibridación de sonda marcada quimioluminiscente como se describe en Arnold y otros, en el documento de patente europea EP 309230. Brevemente, la mezcla de reacción se desnaturalizó por calentamiento a 95ºC tras completar la reacción. Se añadió una disolución que contenía una sonda marcada quimioluminiscente (complementaria al ARN de la mezcla anterior) y la mezcla resultante se incubó a 60ºC durante 20 minutos. Se añadió un reactivo para desactivar selectivamente la sonda quimioluminiscente de la sonda no hibridada y se incubó a 60ºC durante 4 minutos. Después de enfriarla a temperatura ambiente, la quimioluminiscencia de la sonda hibridada se midió en unidades de luz relativa (ULR) usando un luminómetro.
Alrededor del 50% del ARN añadido a la disolución de la reacción se recuperó tras el tratamiento a pH 4,0. El cien por cien del ARN añadido se recuperó a un pH 3,5 o inferior. La actividad RNAsa sérica se redujo significantemente a alrededor de un pH 4,0 o inferior, y su actividad enzimática se perdió completamente a un pH 3,5 o inferior. Estos resultados se ilustran en la Tabla 1.
TABLA 1
PH HCl conc. (mM) ULR brutas *ULR netas **%ULR recuperación
sin suero con 5\mul sin suero con 5\mul
de suero de suero
1,5 97 12762 15341 12042 13665 113,5
1,5-2 86 16721 15346 16001 13670 85,4
Ensayo 2 75 13440 14701 12720 13025 102,4
2-2,5 64 11907 13911 11187 12235 109,3
3 53 14198 14638 13478 12962 96,2
3,5 42 15124 14814 14404 13138 91,2
4-4,5 33 16011 6698 15291 5022 32,8
5 20 16317 2211 15597 535 3,4
Controles 1,5 97 720 1676 0 0 0
sin ARN
*ULR netas: las URL de reacciones sin ARN diana (fondo) fueron 720 URL y 1676 URL en reacciones sin suero
y con suero respectivamente
``ULR netas'' indica los valores de ULR brutos menos los valores de ULR de fondo
(Fondo es el valor ULR de reacciones en las que no hay ARN presente)
**%ULR recuperación:
valores de ULR de reacción con suero/ valores de ULR de reacción sin suero x 100
Ejemplo 2 RNAsa leucocitaria humana
La sangre de un voluntario sano se trató con saponina para disolver los eritrocitos. Los leucocitos se recogieron por centrifugación a baja velocidad. Los leucocitos se lavaron luego con salino fisiológico y se disolvieron en un tampón que contenía Tritón X-100. La disolución resultante se usó como disolución RNAsa de leucocitos humanos.
La dependencia al pH de la RNAsa leucocitaria humana se estudió luego por un procedimiento similar al del ejemplo 1. Brevemente, la disolución RNAsa se añadió a tampón acetato potásico 40 mM de pH 4,0 que contenía NaCl 12,25 mM y MgCl_{2} 10 mM. Se añadió ARN a la disolución y el volumen total se llevó a 10 microlitros. La disolución de reacción se incubó a 37ºC durante 20 minutos para digerir el ARN con la RNAsa leucocitaria humana. Tras completar la reacción, la cantidad sobrante de ARN se determinó por el ensayo de hibridación de sonda marcada descrita en el Ejemplo 1.
Como un testigo, se utilizaron 30 ml de tampón Tris-HCl (pH 7,7) en lugar de un tampón acetato potásico para preparar la mezcla de reacción. La disolución de RNAsa leucocitaria humana, preparada a partir de 5 microlitros de sangre, se añadió y se llevó a cabo un procedimiento de reacción similar al descrito anteriormente. En la mezcla de la reacción tamponada a pH 7,7, el ARN añadido se digirió hasta un nivel no detectable por la RNAsa leucocitaria obtenida a partir de los 5 microlitros de sangre humana bajo estas condiciones. En contraste, alrededor del 85% del ARN original se recuperó cuando la disolución de RNAsa leucocitaria humana procedente de 100 microlitros de sangre se añadió a la mezcla de la reacción a un pH 4,0. Así, la RNAsa linfocitaria humana se reduce sustancialmente a pH 4,0. Los resultados de dos grupos de ensayos se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2 Ensayo 1
pH Agente de *Volumen de ULR brutas *ULR netas *** % de
tamponamiento RNAsa de recuperación
glóbulos blancos de ULR
de la sangre
7,7 TrisCl 20 mM 0 14655 14108 100
7,7 TrisCl 20 mM 0,06 10885 10338 73,3
7,7 TrisCl 20 mM 0,2 5403 4856 34,4
Ensayo 7,7 TrisCl 20 mM 0,6 1466 919 6,5
7,7 TrisCl 20 mM 1,7 981 434 3,1
7,7 TrisCl 20 mM 5 1461 914 6,5
4 Acetato de K 40 mM 0 11574 11000 100
4 Acetato de K 40 mM 0,06 11396 10822 98,4
Ensayo 4 Acetato de K 40 mM 0,2 10797 10223 92,9
4 Acetato de K 40 mM 0,6 11481 10907 99,2
4 Acetato de K 40 mM 1,7 10407 9833 89,4
4 Acetato de K 40 mM 5 11470 10896 99,1
Testigos
Sin ARN 7,7 TrisCl 20 mM 0 547 0 0
Sin ARN 4 Acetato de Na 40 mM 0 574 0 0
*Volumen de lisado de glóbulos blancos de sangre:
Volumen de sangre de la que se obtuvo la preparación RNAsa de glóbulos blancos.
**ULR neto:
``ULR neto'' indica los valores de ULR restados con los valores de ULR de fondo de los valores brutos
(Fondo es el valor de ULR de reacciones en las que no hay ARN presente)
***%ULR Recuperación:
% de ULR frente al valor de ULR de reacción de lisado sin glóbulos blancos
TABLA 2 (continuación) Ensayo 2
pH Agente de *Volumen de ULR brutas *ULR netas *** % de
tamponamiento RNAsa de recuperación
glóbulos blancos de ULR
de la sangre
7,7 TrisCl 20 mM 0 19694 19057 100
7,7 TrisCl 20 mM 0,06 15407 14770 77,5
7,7 TrisCl 20 mM 0,2 5986 5349 28,1
Ensayo 7,7 TrisCl 20 mM 0,6 1040 403 2,1
7,7 TrisCl 20 mM 1,7 948 311 1,6
7,7 TrisCl 20 mM 5 694 57 0,3
TABLA 2 (continuación)
pH Agente de *Volumen de ULR brutas *ULR netas *** % de
tamponamiento RNAsa de recuperación
glóbulos blancos de URL
de la sangre
4 Acetato de K 40 mM 0 15195 14566 100
4 Acetato de K 40 mM 1,3 13429 12800 87,9
Ensayo 4 Acetato de K 40 mM 4 14195 13566 93,1
4 Acetato de K 40 mM 11,9 14712 14083 96,7
4 Acetato de K 40 mM 35,7 13932 13303 91,3
4 Acetato de K 40 mM 107 13115 12486 85,7
Testigos
Sin ARN 7,7 TrisCl 20 mM 0 637 0 0
Sin ARN 4 Acetato de Na 40 mM 0 629 0 0
*Volumen de lisado de glóbulos blancos de sangre:
Volumen de sangre de la que se obtuvo la preparación RNAsa de glóbulos blancos.
**ULR neto:
``ULR neto'' indica los valores de ULR restados con los valores de ULR de fondo de los valores brutos
(Fondo es el valor de ULR de reacciones en las que no hay ARN presente)
***%ULR Recuperación:
% de ULR frente al valor de ULR de reacción de lisado sin glóbulos blancos
Ejemplo 3 Recuperación del ARN añadido
Se aisló suero de voluntarios sanos mediante un procedimiento convencional. Se añadieron KCl, HCl, MgCl_{2} y NaCl a una concentración final de 50 mM, 86 mM, 10 mM y 25 mM, respectivamente, a 5 microlitros de suero. La acidez de la solución se ajustó a pH 2,5-1,0 para desactivar las RNAsas en la mezcla. Se añadió ARN como un sustrato, y el volumen se llevó a 10 microlitros con agua. Luego se añadió pepsina a una cantidad final de entre 2,5 y 200 unidades. La mezcla se incubó a 37ºC durante 5 minutos. Tras completar la reacción, se añadió base Tris a la mezcla de reacción hasta una concentración final de 50 mM, y el volumen de la mezcla se llevó a 20 microlitros. Esta base neutraliza la acidez de la mezcla y ajusta el pH a alrededor de 7,0. La mezcla se incubó a 37ºC durante más de 20 minutos. Tras completar la reacción, el ARN restante en la mezcla se desnaturalizó calentándolo a 95ºC, y se añadió una sonda marcada (complementaria al ARN en la mezcla anterior). La mezcla se incubó a 60ºC durante 20 minutos y el ensayo para ver cualquier ARN restante se realizó como se explica anteriormente.
El cien por cien del ARN exógeno se recuperó bajo estas condiciones en presencia de pepsina a 2,5 unidades o más. Este ejemplo demuestra que la RNAsa sérica se desactiva irreversiblemente por pepsina, y que el ARN exógeno en la mezcla de reacción puede ser recuperada sin ser afectada por nucleasas séricas. Estos resultados se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3
Pepsina Suero ULR brutas *ULR netas **%ULR
(U/10 \mul Reacción) (\mul/10 \mul Reacción) Recuperación
0 5 1816 69 0,1
2,5 5 85595 83848 147
5 5 84773 83026 145
Ensayos 10 5 72493 70746 124
25 5 92796 91049 160
50 5 92204 90457 158
100 5 86124 84377 148
200 5 80382 78635 138
TABLA 3 (continuación)
Pepsina Suero ULR brutas *ULR netas **%ULR
(U/10 \mul Reacción) (\mul/10 \mul Reacción) Recuperación
Testigos
Sin RNA 0 0 1747 0 0
Sin Suero 0 0 58822 57075 100
*ULR netas:
El fondo de ULR fue de 1747
ULR netas = ULR brutas - 1747
**%ULR Recuperación:
Las ULR netas totales fueron de 57075
%ULR Recuperación = ULR netas / 57075 x 100
Ejemplo 4 Muestra de ensayo de VHC
El procedimiento del presente invento se evaluó mediante el uso de una muestra de suero que incluía el virus de la hepatitis C. La muestra de suero usada se obtuvo de un paciente infectado de hepatitis C, que se había confirmado que era positivo para el virus de la hepatitis C mediante un kit comercial de detección de anticuerpos para la hepatitis C.
Para confirmar la recuperación del ARN viral de la hepatitis C sin degradación por RNAsa sérica endógena, la cantidad traza de ARN presente en tal muestra debe ser amplificada después de la extracción de la muestra. En este ejemplo, el ARN diana se usa para formar un ADN diana mediante un procedimiento que amplifica los ácidos nucleicos usando una transcriptasa inversa. El ADN producto obtenido se amplifica luego dos veces por un procedimiento de PCR. Se usaron cebadores aleatorios en la reacción de transcripción inversa, y se usaron dos cebadores en cada procedimiento de PCR. Este procedimiento se proporciona en detalle a continuación.
Se tomaron cinco microlitros de suero positivo para VHC y se añadieron 5 microlitros de un tampón HCl (HCl 86 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2}10 mM, y NaCl 25 mM). Luego se añadieron 25 unidades de pepsina (tratada con Macaloide). La mezcla se incubó a 37ºC durante 15 minutos. La muestra de VHC se neutralizó a pH 7,0 por adición de una disolución de 5 \mul de KOH 172 mM. La mezcla se calentó a 95ºC durante 2 minutos, y se enfrió a temperatura ambiente (alrededor de 20ºC), luego se añadieron 75 \mul de una premezcla de reacción que contenía 0,5 microgramos (250 pmoles) de cebadores aleatorios (TaKaRa, Japón), Tris-HCl 13,3 mM (pH 8,3), MgCl_{2 }0,7 mM, y dATP, dTTP, dGTP, y dCTP 0,27 mM cada uno (Pharmacia) y el volumen total se llevó a 90 microlitros. La mezcla se calentó a 65ºC durante 5 minutos y se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió a la mezcla de reacción 1 \mul que contenía 200 unidades/\mul de MMLV de transcriptasa inversa (BRL), y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Las reacciones de PCR se realizaron de acuerdo con las condiciones especificadas en Mullis, documento de patente norteamericana Nº 4.683.195. Brevemente, tras completar la reacción de transcripción inversa, se añadieron 100 pmoles de dos cebadores que corresponden a la región NS5 del VHC. Se añadieron 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa y el volumen total se llevó hasta 100 \mul. Los productos de la reacción se desnaturalizaron por calor durante 2 minutos a 92ºC. Un ciclo de calentamiento y enfriamiento se repitió 40 veces. (Cada ciclo incluye calentar a 92ºC durante 1,5 minutos, calentar a 53ºC durante 1,5 minutos, y calentar a 70ºC durante 2 minutos). La mezcla resultante se incubó después a 70ºC durante 9 minutos.
Una alícuota de 10 microlitros de la mezcla se mezcló luego con un grupo de cebadores secundarios diseñado para hibridar en una localización dentro del grupo de cebadores primarios usados en la reacción de PCR primaria. (Los cebadores actuales usados en estos ejemplos no son esenciales en este invento). El volumen de la mezcla se llevó hasta 100 microlitros, y la reacción de PCR secundaria se realizó bajo las mismas condiciones usadas en la reacción de PCR primaria. (Específicamente, se usaron Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, 100 pmoles de cebadores, MgCl_{2}1,5 mM, KCl 50 mM, dNTP 0,2 mM cada uno, y 2,5 unidades de Taq polimerasa).
Los ácidos nucleicos obtenidos de estas amplificaciones se desnaturalizaron calentándolos a 95ºC durante 5 minutos. Se añadieron 90 \mul de sonda marcada para ensayar para determinar los ácidos nucleicos usando el método descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se resumen en la Tabla 4.
\newpage
TABLA 4
Muestra Sérica ULR Observadas
Sano 686
Paciente PI 10027
Paciente POM 6553
Paciente POT 5422
Estos datos indican que la intensidad de las señales de un suero positivo para VHC es de 8 a 15 veces mayor que el de un suero sano. Así, el ARN de VHC se liberó mediante el procedimiento sin estar afectado por RNAsas endógenas. Este ejemplo también demuestra que el ARN aislado por los métodos de este invento puede ser usado como un sustrato para reacciones enzimáticas sin ningún otro proceso de purificación o aislamiento. Consecuentemente, se espera que los métodos del presente invento puedan ser ampliamente usados por sí mismos, o en combinación con otros procedimientos de amplificación para detectar ácidos nucleicos específicos en ensayos de diagnóstico.
Ejemplo 5 Muestra de Ensayo de VHC. Amplificación por técnica distinta de PCR
El siguiente es otro protocolo para la detección del ácido nucleico en una muestra de VHC. Se colocan 5 \mul de disolución de pepsina en tampón (KCl/HCl o Glicina/HCl) en tubos apropiados (la pepsina se obtiene de Sigma). La disolución de pepsina para el tampón KCl/HCl contiene 25 U de pepsina en KCl 100 mM - HCl 172 mM; y para tampón Glicina/HCl contiene 25 U de pepsina en Glicina 400 mM - HCl 400 mM.
Se añadieron 5 \mul de muestra de suero (de un paciente sano o infectado con VHC) a estos tubos, y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos.
Se añadieron 10 \mul de disolución de neutralización (disolución de neutralización para tampón KCl/HCl es de KOH 172 mM - KCl 128 mM; y para tampón Glicina/HCl era de KOH 200 mM). La muestra fue luego ampliada esencialmente como está descrito por Kacian y Fultz, NUCLEIC ACID SEQUENCE AMPLIFICATION METHODS UTILIZING A TRANCRIPTION COMPLEX, documento de patente PCT/US90/03907. La mezcla se incubó a 37ºC durante 4 horas, y 10 \mul de muestras amplificadas se sometieron a HPA usando la sonda AE-CP-6278 (región NS5). Los resultados se muestran en la Tabla 5.
TABLA 5
Muestra de suero ULR Observada
Tampón KCl/HCl Tampón Glicina/HCl
Sano 3541 1127
Paciente PKB 15165 1421
Paciente PN-1 101146 82361
Paciente PT-1 166160 1051277
Paciente PH-1 802740 907997
Paciente PY-2 1143597 1126462
Paciente P-7 1143699 1147653
Paciente P-37 407889 471565
Paciente P-27 1089869 1113446
Paciente P-32 512470 516870
Paciente P-37 314846 579284
Paciente P-38 948738 756643
Estos resultados muestran que el VHC puede ser detectado usando un sistema de amplificación distinto de PCR en conjunción con el presente invento.
Ejemplo 6 Procedimiento para purificar pepsina con Macaloide
El siguiente es un procedimiento para preparar pepsina libre de actividades enzimáticas potencialmente dañinas.
A. Preparación de una disolución patrón de suspensión de Macaloide (16 mg/ml): (este procedimiento es el mismo que el descrito en Molecular Cloning 1ª Edición (Maniatis et al., 1982, p452)).
1.
Peso 0,25 g de Macaloide
2.
Se suspenden 0,25 g de Macaloide en 25 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,5.
3.
Se hierve la suspensión a 100ºC durante 5 minutos con agitación constante.
4.
Se centrifuga la suspensión de Macaloide a 2500xg a 4ºC.
5.
Se descarta el sobrenadante
6.
Se resuspende el precipitado en 20 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,5.
7.
Se centrifuga la suspensión de Macaloide a 2500xg a 4ºC.
8.
Se repite el procedimiento 5 hasta 7 (procedimiento de lavado) 4 veces más.
9.
Se resuspende el precipitado pegajoso en 15 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,5.
10.
Se almacena la suspensión de Macaloide a 4ºC ó - 20ºC.
B. Preparación de la suspensión activa de Macaloide para la adsorción de RNAsa contaminada en pepsina:
La pepsina se desactiva fácilmente a pH neutro. Por lo tanto el Macaloide suspendido en tampón debería ser sustituido por un tampón de pH ácido para usar en una preparación de pepsina.
1.
Se coloca la suspensión de Macaloide en Tris-HCl 50 mM en un tubo EPPENDORF.
2.
Se centrifuga la suspensión de Macaloide a 5000 rpm en microfuga (5 minutos).
3.
Se descarta el sobrenadante.
4.
Se añade un tampón de NaCl 150 mM - acetato sódico 10 mM a pH 5,2.
5.
Se mantiene la suspensión de Macaloide a 4ºC durante varias horas.
6.
Se centrifuga el tubo a 5000 rpm en microfuga (5 minutos).
7.
Se descarta el sobrenadante.
8.
Se repite el procedimiento 4 hasta 7 hasta que el pH de la suspensión de Macaloide esté por debajo de 5,5. (Típicamente esto requiere cuatro o cinco repeticiones de sustitución de tampón).
9.
Se resuspende el Macaloide en un tampón de NaCl 150 mM - acetato sódico 10 mM de pH 5,2 (el mismo volumen que el volumen inicial).
C. Adsorción de RNAsa contaminada en pepsina sobre Macaloide:
1.
Se disuelve pepsina (Sigma Cat#6887) en de HCl 10 mM-Glicerol 50% a 345 U/\mul.
2.
Se colocan 150 \mul de pepsina en un tubo EPPENDORF.
3.
Se añaden 50 \mul de suspensión de Macaloide en tampón de NaCl 150 mM - acetato sódico 10 mM de pH 5,2 y se mezcla.
4.
Se mantiene el tubo en agua con hielo durante 2 horas.
5.
Se centrifuga el tubo a 7500 rpm en microfuga durante 10 minutos a 4ºC.
6.
Se transfieren 150 \mul de sobrenadante a otro tubo. (El pH del sobrenadante es alrededor de 4,5).
7.
Se añaden otros 50 \mul de suspensión de Macaloide en la etapa 3 y se mezcla.
8.
Se mantiene el tubo a 4ºC durante 15 minutos.
9.
Se centrifuga el tubo a 7500 rpm en microfuga durante 10 minutos a 4ºC.
10.
Se transfieren 150 \mul de sobrenadante a otro tubo. (El pH del sobrenadante es alrededor de 4,5).
11.
Se añaden 50 \mul de suspensión de Macaloide en la etapa 3 y se mezcla.
12.
Se mantiene el tubo a 4ºC durante 15 minutos.
13.
Se centrifuga el tubo a 7500 rpm en microfuga (10 minutos).
14.
Se pasa el sobrenadante a otro tubo y se mantiene a -20ºC. (El pH del sobrenadante es de 4,5-5,0 (cercano a 4,5)).
D. Ensayo para determinar la actividad de la pepsina:
Se ensayó la actividad de la pepsina después del procedimiento de adsorción sobre Macaloide por procedimiento estándar después de cada etapa de adsorción. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
TABLA 6
Pepsina A 520 nm
(Unidad equivalente/Rxn) Disoluc. Original 1ª Adsorción 2ª Adsorción 3ª Adsorción
0 0,12 0,12 0,12 0,12
10 0,32 0,36 0,46 0,44
40 1,37 1,03 1,02 1,20
70 1,91 1,78 1,69 1,77
100 2,23 1,74 2,26 2,16
La actividad de la pepsina después de la adsorción se calibra usando la curva estándar dibujada a partir de la disolución original de pepsina.
Estos datos muestran que la actividad de la pepsina no se afectó por el procedimiento de adsorción sobre Macaloide.
Ensayo para determinar la actividad de RNAsa contaminante en pepsina:
las actividades de RNAsa contaminantes en pepsina se midieron por monitorización de la pérdida de capacidad de una sonda de ADN marcada con éster de acridina para hibridar con un sustrato de ARN. El ARN usado fue un transcrito sintetizado in vitro de secuencias encontradas en una porción del ARN ribosomal de Chlamydia trachomatis. Se ensayaron las actividades de RNAsa contaminantes tanto en la disolución original de pepsina (sin adsorción) como en la preparación de pepsina después de la tercera adsorción.
Las reacciones se colocaron de modo que cada tubo de reacción contuviera la cantidad de ARN transcrito que, cuando se aparee con la sonda de ADN, produzca una señal de 40.000 unidades de luz relativa (ULR) en ausencia de RNAsa, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 10 mM, NaCl 25 mM, y Glicerol 2%. Se añadieron 0 U, 345 U ó 690 Unidades equivalentes de una preparación de pepsina. El volumen total fue de 20 \mul. Cantidades despreciables o no detectables de actividad RNAsa se detectaron después del tratamiento con Macaloide de la pepsina.

Claims (14)

1. Un método para poner a disposición un ácido nucleico deseado presente en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:
(a)
ajustar el pH de dicha muestra a un nivel por debajo del cual las nucleasas endógenas pueden degradar activamente el ácido nucleico deseado;
(b)
proporcionar a dicha muestra una proteasa ácida activa al pH alcanzado en la etapa (a) y capaz de degradar nucleasas endógenas no desactivadas irreversiblemente en la etapa (a);
(c)
incubar dicha muestra en una disolución salina estándar durante un período de tiempo que permita a las nucleasas endógenas presentes en dicha muestra ser degradadas, por lo que menos del 5% de los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra son degradados por actividades de nucleasas endógenas a lo largo de un período de 60 minutos a 37ºC; y
(d)
elevar el pH de dicha muestra a un nivel al que dicha proteasa ácida sea inactiva.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el pH se ajusta para estar entre 1,0 y 4,0 en la etapa (a).
3. El método de la reivindicación 1, en el que el pH se ajusta para ser mayor que 6,0 en la etapa (d).
4. Un método para poner a disposición un ácido nucleico deseado presente en una muestra biológica, comprendiendo dicho método:
(a)
ajustar el pH a dicha muestra para que esté entre 1,0 y 4,0, tal que las nucleasas endógenas no pueden degradar activamente el ácido nucleico deseado;
(b)
proporcionar a dicha muestra una proteasa ácida activa al pH alcanzado en la etapa (a) y capaz de degradar nucleasas no desactivadas irreversiblemente en la etapa (a);
(c)
incubar dicha muestra en una disolución salina estándar durante un período de tiempo que permita a las nucleasas endógenas presentes en dicha muestra ser degradadas, por lo que menos del 5% de los ácidos nucleicos presentes en dicha muestra son degradados por actividades de nucleasas endógenas a lo largo de un período de 60 minutos a 37ºC; y
(d)
elevar el pH de dicha muestra por encima de 6,0 pero debajo del nivel al que la proteasa ácida se desactiva o inhibe completamente.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra biológica es un material biológico humano que puede contener un agente de enfermedad infecciosa.
6. El método de la reivindicación 5, en el que dicho material biológico humano es bien un tejido celular o bien un componente sanguíneo.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra biológica es una célula que contiene ácido nucleico celular humano.
8. El método de la reivindicación 7, en el que dicha célula es o bien un glóbulo blanco humano o bien una célula cancerígena.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra biológica es suero humano.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha proteasa ácida es pepsina.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además calentar dicha muestra para ayudar a la desactivación de dicha proteasa ácida.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se añade un detergente a la muestra para ayudar en la liberación del ácido nucleico deseado de otros componentes de la muestra.
13. Un kit que comprende, en compartimentos separados un ácido adaptado para reducir el pH de una muestra biológica a, o debajo de, pH 4,0 y una proteasa ácida capaz de digerir materiales celulares en una muestra biológica para liberar ácido nucleico en dicha muestra biológica y degradar nucleasas endógenas que puedan estar presentes en dicha muestra biológica.
\newpage
14. El kit de la reivindicación 13, que comprende además, en un compartimento separado, una base capaz de elevar el pH de la muestra tras la finalización de una digestión proteolítica.
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