ES2252813T3 - Uso de un lavado alcohol-sal para la recuperacion eficaz de microbacterias y adn microbacteriano de sedimento respiratorio. - Google Patents
Uso de un lavado alcohol-sal para la recuperacion eficaz de microbacterias y adn microbacteriano de sedimento respiratorio.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION ESTA RELACIONADA CON METODOS PARA CONCENTRAR BACTERIAS A PARTIR DE UNA MUESTRA BIOLOGICA VISCOSA. LOS METODOS CONSISTEN EN AÑADIR A LA MUESTRA UN AGENTE HIDROSOLUBLE REDUCTOR DE LA DENSIDAD CON UNA DENSIDAD DE 0,7 A 0,9 G/ML Y UN PUNTO DE EBULLICION SUPERIOR A 50 (GRADOS) C. LA INVENCION TAMBIEN ESTA RELACIONADA CON METODOS PARA CONCENTRAR BACTERIAS Y ACIDOS NUCLEICOS BACTERIANOS LIBRES A PARTIR DE UNA MUESTRA BIOLOGICA QUE REQUIERE EL MEZCLADO CON LA MUESTRA DE UN AGENTE REDUCTOR DE LA DENSIDAD Y UNA SAL MONOVALENTE.
Description
Uso de un lavado alcohol-sal para
la recuperación eficaz de microbacterias y ADN microbacteriano de
sedimento respiratorio.
La presente invención se refiere a procedimientos
para concentrar y recuperar ácidos nucleicos bacterianos libres y
bacterias de muestras biológicas. En particular, la presente
invención se refiere a procedimientos para concentrar
Mycobacterium tuberculosis de una manera compatible con el
análisis subsiguiente del ácido nucleico.
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el
agente causal de la tuberculosis en seres humanos, se identifica
convencionalmente mediante cultivo microbiológico que requiere mucho
tiempo. Los especimenes clínicos remitidos para cultivo de
micobacterias usualmente están contaminados con otros
microorganismos que crecen con más rapidez. Estos especimenes,
típicamente un esputo u otra muestra respiratoria, deben someterse a
un procedimiento de digestión y descontaminación para licuificar
material orgánico viscoso y eliminar organismos no deseados. Los
reactivos más comunes usados en los procedimientos digestión y
descontaminación son
N-acetil-L-cisteína-hidróxido
de sodio (NALC-NaOH), hidróxido de sodio- dodecil
sulfato de sodio (NaOH-SDS) o NaOH solo. Un
protocolo de digestión y descontaminación típico incluiría la
incubación de la muestra respiratoria con uno de los reactivos
anteriores, disminuyendo el pH de la mezcla mediante la dilución
con solución tampón o agua y centrifugando la mezcla para concentrar
la micobacteria en un pellet. Decantaría una parte del sobrenadante
y resuspendería el pellet en el fluido sobrenadante remanente o en
una solución tampón. Las suspensiones obtenidas de tal manera se
llaman "sedimentos respiratorios".
Mientras los sedimentos respiratorios son
adecuados para el cultivo, no son apropiados para los análisis de
ácido nucleico, tales como amplificación de ácido nucleico,
restricción, digestión y secuenciación de nucleótidos. Previo a la
realización de análisis de ácido nucleico es necesario eliminar los
reactivos de digestión y descontaminación de los sedimentos
respiratorios porque estos reactivos interfieren con los análisis de
ácido nucleico. También es útil además concentrar la micobacteria de
las muestras de sedimento que tienen título bajo de micobacterias
previo a los análisis de ácido nucleico para incrementar la
probabilidad de detección de ácido nucleico.
Antes de la presente invención, los expertos en
la técnica intentaron resolver los problemas de los reactivos de
digestión y descontaminación contaminantes y las bajas
concentraciones de bacterias diluyendo las muestras en soluciones
acuosas, centrifugando posteriormente para formar pellets con las
micobacterias y eliminando la solución sobrenadante conteniendo
reactivos de digestión y descontaminación. Por ejemplo, Beavis y
col. (J. Clin. Microbiol., 33, 2582-2586 (1995)) usa
un procedimiento en el que se mezclan 100 \mul de sedimento
respiratorio con 500 \mul de un reactivo de lavado que comprende
Tris-HCl y solubilizante 1%. Se forman pellets con
las micobacterias de la mezcla centrifugando a 12.500 x g durante 10
minutos. (Ver también, Roche Molecular Systems. 1994. Instrucciones
de la prueba Roche Amplicor Mycobacterium tuberculosis, Roche
Molecular Systems, Branchburg, NJ.). Tales procedimientos, sin
embargo, tienen limitaciones. Estos procedimientos no son
particularmente adecuados para concentrar bacterias de muestras de
gran volumen porque el agregado del tampón de lavado incrementa el
volumen cinco veces. Además, tales procedimientos están limitados
porque es muy difícil formar pellets con las micobacterias en medio
acuoso por sus características de flotabilidad. De esta manera, la
centrifugación en agua o en solución tampón acuosa, tal como la
utilizada por Beavis y col., pueden dar como resultado una pérdida
significativa de los organismos blanco. Además, los ácidos nucleicos
libres de micobacterias en el sedimento respiratorio no quedan en el
pellet durante la centrifugación en medio acuoso. Los ácidos
nucleicos libres están presentes en el sedimento respiratorio porque
pueden liberarse durante la lisis bacteriana provocada por la
digestión y descontaminación de muestras frescas y por congelamiento
y descongelamiento de los sedimentos respiratorios almacenados.
La presente invención supera estos problemas
proveyendo un procedimiento para concentrar bacterias, incluyendo
Mycobacterium tuberculosis, de muestras biológicas viscosas.
La presente invención también provee un procedimiento para
concentrar ácidos nucleicos bacterianos libres así como las
bacterias presentes en muestras biológicas. Las muestras procesadas
de acuerdo con el procedimiento de la presente invención pueden
usarse para el análisis subsiguiente de ácidos nucleicos.
Así, es un objetivo de la presente invención
proveer un procedimiento para concentrar y procesar bacterias que
elimina los reactivos de digestión y descontaminación de la
muestra.
Otro objetivo de la presente invención es
recuperar simultáneamente bacterias y cualquier ADN bacteriano libre
presente en la muestra biológica.
Se ha encontrado inesperadamente que un agente
para disminuir la densidad, miscible en agua y con una densidad de
0,7 a 0,9 g/ml y un punto de ebullición mayor que 50ºC puede usarse
para concentrar bacterias en muestras biológicas. También se
encontró que tales agentes para disminuir la densidad pueden usarse
en combinación con una sal monovalente, tal como acetato de sodio,
para recuperar bacterias intactas y ADN bacteriano de muestras
biológicas que tienen una densidad superior que la de la bacteria
blanco.
En una forma de realización, la presente
invención se refiere a un procedimiento para concentrar bacterias de
una muestra biológica viscosa. El procedimiento comprende agregar a
la muestra, en una cantidad suficiente para reducir la densidad de
la muestra hasta una densidad menor que la de la bacteria, un agente
para disminuir la densidad, miscible en agua y con una densidad de
0,7 a 0,9 g/ml y un punto de ebullición mayor que 50ºC y centrifugar
la muestra para formar un pellet con cualquier bacteria presente en
la muestra.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a un procedimiento para concentrar bacterias y
ácidos nucleicos bacterianos de una muestra biológica. El
procedimiento comprende agregar a la muestra, en una cantidad
suficiente para reducir la densidad de la muestra hasta una densidad
menor que la de la bacteria, un agente para disminuir la densidad,
miscible en agua y con una densidad de 0,7 a 0,9 g/ml y un punto de
ebullición mayor que 50ºC y, una sal monovalente en una cantidad
suficiente para precipitar los ácidos nucleicos bacterianos libres.
Posteriormente la muestra se centrifuga para formar un pellet con
cualquier bacteria y cualquier ácido nucleico presente en la
muestra.
En otra forma de realización adicional, la
presente invención se refiere a un procedimiento para concentrar
bacterias de una muestra biológica viscosa y, simultáneamente,
ajustar el pH de la muestra. El procedimiento incluye agregar a la
muestra, en una cantidad suficiente para reducir la densidad de la
muestra hasta una densidad menor que la de la bacteria, un agente
para disminuir la densidad, miscible en agua y con una densidad de
0,7 a 0,9 g/ml y un punto de ebullición mayor que 50ºC y un agente
tamponador del pH. Posteriormente la muestra se centrifuga para
formar un pellet con cualquier bacteria presente en la muestra.
Otros varios objetivos y ventajas de la presente
invención serán evidentes con la descripción detallada de la
invención.
La presente invención provee procedimientos para
procesar muestras para la detección e identificación de bacterias,
tal como Mycobacterium tuberculosis, que son compatibles con
análisis basados en ácidos nucleicos. Los procedimientos presentes
son compatibles con una variedad de procedimientos de análisis de
ácido nucleico, incluyendo amplificación de ácidos nucleicos (tales
como PCR y reacción en cadena de ligasa), restricción digestión y
secuenciación de nucleótidos, porque las sustancias inhibitorias
usadas para la digestión y descontaminación de la muestra son
eliminadas eficientemente.
En una forma de realización, la presente
invención se refiere a un procedimiento para concentrar bacterias de
una muestra biológica viscosa. Las bacterias contenidas en la
muestra biológica se concentran mezclando la muestra con un agente
para disminuir la densidad, miscible en agua y centrifugando
posteriormente la muestra para formar un pellet con cualquier
bacteria presente en la muestra. El agente para disminuir la
densidad reduce la densidad de la mezcla resultante hasta una
densidad menor que la de la bacteria y por ello, aumenta la
recuperación de bacterias en la centrifugación.
Los agentes para disminuir la densidad adecuados
para el uso en la presente invención son solubles en agua, tienen
una densidad de 0,7 a 0,9 g/ml, y tienen un punto de ebullición
mayor que 50ºC. Tales agentes incluyen, pero no están limitados a,
alcoholes metílicos sustituidos o no sustituidos, alcoholes etílicos
sustituidos o no sustituidos, alcoholes propílicos sustituidos o no
sustituidos y cetonas. Por ejemplo pueden usarse como agente para
disminuir la densidad en la presente invención etanol, metanol,
metiletilcetona, 2-pentanol,
3-pentanona, propanol, alcohol isobutílico,
2-propanol, alcohol tert-butílico, o
2-propanona.
De preferencia, el agente para disminuir la
densidad es un alcohol metílico sustituido o no sustituido, un
alcohol etílico sustituido o no sustituido o un alcohol propílico
sustituido o no sustituido. De más preferencia, el agente para
disminuir la densidad usado en los procedimientos de la presente
invención es etanol.
El agente para disminuir la densidad se agrega a
la muestra en una cantidad suficiente para reducir la densidad de la
muestra a una densidad inferior a la de la bacteria blanco. Tales
cantidades son fácilmente determinables por aquellos expertos en la
técnica. De preferencia, se agregan 2 a 6 volúmenes de agente para
disminuir la densidad por unidad de volumen de muestra; de más
preferencia, se agregan de 2 a 2,5 volúmenes de agente para
disminuir la densidad por unidad de volumen de muestra.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a un procedimiento para concentrar bacterias de
una muestra biológica viscosa y, simultáneamente, ajustar el pH de
la muestra a un nivel compatible con los análisis subsiguientes. Por
ejemplo, puede combinarse un tampón tal como acetato, citrato o Tris
con el agente para disminuir la densidad para lavar las muestras de
sedimento de esputo que tienen un pH de 12-14 para
bajar el pH a un nivel compatible con la captura de polímeros (pH
6,8) o PCR (pH 8,5). (Para una discusión a cerca de captura de
polímeros ver las Patentes de EEUU Nº 5.582.988, 5.434.270 y
5.523.368). Las bacterias contenidas en la muestra biológica se
concentran mezclando la muestra con un agente para disminuir la
densidad, miscible en agua y un agente tamponador del pH.
Posteriormente la muestra se centrifuga para formar un pellet con
cualquier bacteria presente en la muestra.
En otra forma de realización adicional, la
presente invención se refiere a un procedimiento para concentrar
bacterias y ácidos nucleicos bacterianos libres de muestras
biológicas. Los ácidos nucleicos bacterianos pueden liberarse de las
bacterias, por ejemplo, durante el almacenamiento y los tratamientos
de congelamiento-descongelamiento. Este ADN
bacteriano libre en la muestra puede concentrarse y recuperarse
usando la presente invención. Tanto las bacterias como los ácidos
nucleicos bacterianos libres contenidos en una muestra biológica se
concentran tratando la muestra con agente para disminuir la
densidad, miscible en agua y una sal monovalente. El agente para
disminuir la densidad y la sal monovalente pueden agregarse al
pellet previamente mezclados o de manera individual. Posteriormente
la muestra se centrifuga para formar un pellet con las bacterias y
ácidos nucleicos bacterianos que puedan estar presentes en la
muestra. La sal monovalente ayuda a precipitar ADN libre en solución
acuosa ya que provee cationes necesarios para neutralizar las cargas
negativas en el ADN. El uso de un agente para disminuir la densidad,
tal como etanol o isopropanol, junto con una sal monovalente tal
como acetato o cloruro de sodio, potasio, amonio o litio, da como
resultado la concentración y recuperación de bacterias y ADN
bacteriano libre presente en la muestra.
Las sales monovalentes adecuadas para el uso en
la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, sales
metálicas de acetato o cloruro y sales no metálicas de acetato o
cloruro. De preferencia, la sal monovalente es una sal de acetato o
cloruro de litio, sodio, potasio o amonio. De más preferencia, la
sal monovalente es acetato de sodio, cloruro de sodio, acetato de
amonio o cloruro de litio. La sal monovalente se agrega en una
cantidad suficiente para precipitar cualquier ácido nucleico
bacteriano libre presente en la muestra. Tales cantidades son
fácilmente determinables por aquellos expertos en la técnica.
Las bacterias que pueden concentrarse usando los
procedimientos de la presente invención incluyen, pero no están
limitadas a, micobacterias (tal como Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium avium), Prevotella sp.,
Porphyromonas sp., Chlamydia trachomatis sp., Neisseria gonorrhoeae
sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Enterococcus sp.,
Clostridium sp. y Bacteroides sp.. Otras especies
detectables resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la
técnica.
Las bacterias que pueden concentrarse y
recuperarse usando los procedimientos de la presente invención de
muestras biológicas viscosas varias incluyen, pero no están
limitadas a, muestras respiratorias (tal como muestras de esputo),
sedimentos respiratorios, fluidos orales, fluidos vaginales, fluidos
seminales, fluidos de infecciones de heridas y fluidos de abscesos.
De preferencia, la muestra biológica es una muestra respiratoria. De
más preferencia, la muestra respiratoria se trata previamente para
obtener un sedimento respiratorio para uso en la presente
invención.
A manera de ejemplo, puede concentrarse M.
tuberculosis de un sedimento respiratorio de acuerdo con los
procedimientos de la presente invención. Para preparar el sedimento
respiratorio, una muestra respiratoria tal como esputo, se procesa
primero por los procedimientos convencionales para licuificar y
descontaminar. Cualquiera de los procedimientos de digestión y
descontaminación son adecuados para esta etapa incluyendo, pero no
limitando a, modificaciones varias del tratamiento
NALC-NaOH (Kent & Kubica, Public Health
Mycobacteriology A Guide for the Level III Laboratory, U.S.
Department of Health and Human Services 31-47
(1985); Noordhock y col., J. Clin. Microbiol., 32,
277-284 (1994)). Estos procedimientos generalmente
incluyen licuificar la muestra y matar las bacterias competidoras
con un reactivo de digestión y descontaminación y posteriormente
centrifugar la muestra licuificada para formar un pellet con las
bacterias. El pellet resuspendido, el sedimento respiratorio, puede
procesarse posteriormente de a cuerdo con la presente invención para
concentrar las micobacterias presentes en el mismo. Por ejemplo, se
puede concentrar M. tuberculosis de un sedimento respiratorio
preparado usando el agente para disminuir la densidad etanol.
Para concentrar y recuperar M. tuberculosis y
cualquier ácido nucleico micobacteriano presente en el sedimento
respiratorio, puede tratarse el espécimen con un agente para
disminuir la densidad tal como etanol, con una sal monovalente tal
como acetato de sodio, de acuerdo con el procedimiento de la
presente invención para eliminar los reactivos de digestión y
descontaminación, para concentrar los títulos bacterianos bajos y
para recuperar ácidos nucleicos micobacterianos libres.
Se puede utilizar un agente para disminuir la
densidad junto con acetato de sodio o de amonio para concentrar,
lavar y cambiar el pH hasta un valor deseado a preparaciones
micobacterianas de muestras de sedimento respiratorio y convertirlas
en adecuadas para la subsiguiente detección de ácido nucleico o
análisis tal como el análisis de reacción en cadena de polimerasa
(PCR). Para la detección y/o análisis de ácido nucleico las
micobacterias recuperadas presentes en el pellet se lisan usando
procedimientos estándar de lisado bien conocidos por aquellos
expertos en la técnica. Los procedimientos de lisado adecuados
incluyen, pero no están limitados a, calentamiento, sonicación,
ruptura mecánica (bead beating),
congelamiento-descongelamiento y digestión con
proteasas. Ver, por ejemplo, Noordhock y col., J. Clin. Microbiol.,
32, 277-284 (1994); Nolte y col., J. Clin.
Microbiol., 31, 1777-1782 (1993); Forbes y col., J.
Clin. Microbiol., 31, 1688-1694 (1993); Hurley y
col., J. Clin. Microbiol., 25, 2227-2229 (1987); y
Folgueira y col., J. Clin. Microbiol., 31, 1019-1021
(1993).
Los ácidos nucleicos liberados de las
micobacterias lisadas así como los ácidos nucleicos micobacterianos
libres recuperados pueden usarse para análisis de ácido nucleico una
vez que se eliminaron los reactivos de digestión y descontaminación.
Los ácidos nucleicos recuperados pueden usarse, por ejemplo, en
procedimientos de hibridización de ácido nucleico y procedimientos
de amplificación de ácido nucleico, tales como, PCR, reacción en
cadena de ligasa, secuenciación de ácido nucleico basado en
amplificación (NASBA), amplificación mediada de transcripción (TMA),
amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y replicasa
Q-beta. Tales protocolos son bien conocidos en la
técnica y disponibles fácilmente para aquellos expertos en la
técnica. Por ejemplo, los principios y condiciones generales para
amplificación y detección de ácidos nucleicos usando PCR son muy
bien conocidos, los detalles de los mismos se proveen en numerosas
referencias incluyendo las Patentes de EEUU Nº 4.683.195, 4.683.202
y 4.965.188 y por Guatelli y col., Clin. Microbiol. Rev., 2 (2) pág.
217-226 (1989). En vista de lo enseñado en la
técnica y las enseñanzas específicas provistas en este documento, un
experto en la técnica no debería tener dificultades para poner en
práctica la presente invención combinando el procedimiento de
concentración y recuperación de bacterias de esta invención con
procedimientos de lisis celular y reacción en cadena de
polimerasa.
Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar
ciertas formas de realización de la presente invención, y no deben
considerarse limitantes de la invención.
Se obtienen sedimentos de esputo congelados
libres o conteniendo M. tuberculosis (Mtb) de varios laboratorios de
microbiología clínica.
Se prepararon y usaron los siguientes reactivos
en los experimentos. (Se usó agua desionizada en la preparación de
todos los reactivos).
Se disolvió acetato de sodio anhidro (12,3 g) en
aproximadamente 40 ml de H2O. Se ajustó el pH de la solución hasta
5,2 con ácido acético glacial y se llevó a un volumen de 50 ml con
agua.
Se combinaron una parte en volumen de la solución
de acetato de sodio anterior con 20 a 25 partes en volumen de
etanol. Se usaron con similar éxito etanol absoluto y etanol
desnaturalizado (conteniendo 5% de isopropanol y 5% de metanol).
Procedimiento
1
Se pipeteó una parte en volumen de la solución
NaAc descrita anteriormente en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
Se agregaron 10 partes en volumen de sedimento de esputo y se mezcló
brevemente usando un vórtex. Se agregaron de veinte a veinticinco
partes en volumen de etanol y se mezcló brevemente otra vez con un
vórtex. Posteriormente se colocó el tubo conteniendo la muestra en
una microcentrífuga y se centrifugó a 16.000 x g durante 15 minutos
para formar un pellet con las bacterias y ácidos nucleicos
precipitados y se eliminó el sobrenadante.
Para el procesamiento posterior, se
resuspendieron los pellets de bacterias/ADN en reactivo de lisis
(Tris 10 mM, pH 8,0, Tween 20 1%, Tritón X-100 1%,
Dodecil sulfato de sodio 0,1%) y se calentó a 100ºC durante 30
minutos para lisar las bacterias y liberar el ADN. Se recuperó el
ADN de estos lisados por la técnica de captura de polímero, como se
describe en la Patente de EEUU 5.582.988. Se usó brevemente un
polímero catiónico básico soluble. El ADN se une electrostáticamente
al polímero por medio de sus grupos fosfato cargados negativamente
y forma un complejo insoluble. Se decanta el complejo por
centrifugación, se elimina el sobrenadante y se libera el ADN
purificado aplicando calor en solución alcalina.
El ADN micobacteriano recuperado se amplificó y
detectó un sistema para amplificación y detección de ácido nucleico
por PCR de Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. como se
describe en las Patentes de EEUU Nº 5.089.233, 5.229.297 y
5.380.489. Brevemente, la muestra y los reactivos para PCR se
mezclaron y colocaron en una ampolla de la bolsa plástica del
sistema, la que fue posteriormente sellada. Se usan oligonucleótidos
marcados con biotina, que representan secuencias de ADN únicas para
Mtb, para la amplificación del ADN específico de Mtb con polimerasa
de ADN térmicamente estable. Las mezclas de reacción que contienen
la muestra, la polimerasa de ADN, dNTP's, tampón y sal primeramente
se calientan para desnaturalizar el ADN, luego se someten a un ciclo
de temperaturas, altas temperaturas (95ºC) para desnaturalizar y
bajas temperaturas (65-75ºC) para hibridar
iniciadores y extender o sintetizar copias de la secuencia de ADN.
El blanco amplificado se detecta luego de que los productos de
reacción se pasan a través de una cámara de detección, donde se
hibridizan con los oligos complementarios unidos a bolitas. El
producto hibridizado se detecta tras hacer pasar el conjugado
HRP-estreptavidina y un subsiguiente sustrato
HRP-colorante a través de la cámara de
detección.
Procedimiento
2
Se pipetearon veinte a veinticinco partes en
volumen del reactivo combinado NaAc/EtOH en un tubo de
microcentrífuga. Se agregaron diez partes en volumen de muestra de
sedimento de esputo y se mezcló brevemente en un vórtex.
Posteriormente se colocó el tubo de microcentrífuga en una
microcentrífuga y se lo centrifugó a 16.000 x g durante 15 minutos
para formar un pellet con las bacterias y ácidos nucleicos
precipitados y se eliminó el sobrenadante.
Para el procesamiento posterior, se
resuspendieron los pellets de bacterias/ADN en reactivo de lisis
(Tris 10 mM, pH 8,0, Tween 20 1%, Tritón X-100 1%,
Dodecil sulfato de sodio 0,1%) y se calentó a 100ºC durante 30
minutos para lisar las bacterias y liberar el ADN. Se recuperó el
ADN de estos lisados por la técnica de captura de polímero, como se
describe en la Patente de EEUU 5.582.988.
El ADN micobacteriano recuperado se amplificó y
detectó un sistema para amplificación y detección de ácido nucleico
por PCR de Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. como se
describe en las Patentes de EEUU Nº 5.089.233, 5.229.297 y
5.380.489.
Para identificar las condiciones óptimas para la
recuperación de ADN libre de una solución con un intervalo de pH con
el que se encuentra en el sedimento de esputo y otras muestras de
sedimento respiratorio, se ajustó agua a pH 7, 10 o 14 con hidróxido
de sodio para simular el intervalo de pH de los sedimentos
respiratorios, y se usó para diluir ADN de timo de ternero
(Ct-DNA), obtenido de Sigma Chemical Co., hasta una
concentración final de 50 ng ADN/\mul. Se agregó bien cloruro de
sodio (NaCl) o acetato de sodio (NaAc) a cada muestra de ADN con el
pH ajustado para dar una concentración final de NaCl 0,2 M o NaAc
0,3 M. Se transfirieron alícuotas de medio mililitro a tubos desde
microcentrífuga, se mezclaron bien con 1 ml de etanol (EtOH) o 0,5
ml de isopropanol (IPP) y se centrifugaron inmediatamente a
temperatura ambiente (RT) o se incubaron a -20ºC durante 1 hora
antes de centrifugar. La centrifugación fue a 16.000 x g durante 15
minutos. Se resuspendió el material decantado en 0,5 ml de agua y se
midió con un espectrofotómetro su absorción a 260 nm, la
\lambdamáx para ADN y se comparó con la absorción del material no
precipitado. El porcentaje de recuperación de ADN para las
diferentes condiciones experimentales se presenta a continuación en
la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Sal = NaCl | |||||
| pH de la | Sal = NaCl | Desviación | |||
| solución | % de | % de | estándar | ||
| de ADN | alcohol | incubación | recuperación | recuperación | (n = 3) |
| 7 | EtOH | NO | 13 | 120 | 0 |
| EtOH | 1 h, -20 | 15 | 120 | 2 | |
| IPP | NO | 12 | 117 | 1 | |
| IPP | 1 h, -20 | 66 | 118 | 0 | |
| 10 | EtOH | NO | 16 | 120 | 1 |
| EtOH | 1 h, -20 | 20 | 119 | 1 | |
| IPP | NO | 22 | 118 | 0 | |
| IPP | 1 h, -20 | 54 | 113 | 4 | |
| 14 | EtOH | NO | 6 | 93 | 1 |
| EtOH | 1 h, -20 | 5 | 92 | 0 | |
| IPP | NO | 2 | 6 | 3 | |
| IPP | 1 h, -20 | 2 | 75 | 3 |
\newpage
Los resultados muestran que NaAc combinado con
EtOH o IPP es eficaz para permitir recuperación cuantitativa de ADN
de muestras a pH 7 o 10, ya sea centrifugadas inmediatamente o tras
incubación a -20ºC. Aún a pH 14, la recuperación de ADN con NaAc
combinado con EtOH fue casi cuantitativa, pero IPP combinado con
NaAc fue menos eficaz a este pH. La combinación de NaCl con alcohol
no permitió una recuperación eficaz de Ct-DNA bajo
cualquiera de las condiciones probadas. Por lo tanto, la combinación
de NaAc con EtOH con centrifugación inmediata tras la mezcla con la
muestra a temperatura ambiente resulta de preferencia con sedimento
de esputo y otras muestras de sedimento respiratorio.
En este experimento, la recuperación de Mtb de
muestras de sedimento de esputo mostró ser más eficaz si las
muestras se diluyen primero con EtOH solo o con NaAc y EtOH juntos.
Se agregaron Mtb cultivados a alícuotas de un pool de sedimentos
respiratorios para obtener varios títulos diferentes, expresados en
unidades formadoras de colonias (CFU) por ensayo PCR, y se llevó a
cabo un tratamiento con NaAc/EtOH de acuerdo con el Procedimiento 1
descrito anteriormente. Se trataron alícuotas de doscientos \mul
como se indica en la Tabla 2. Para EtOH solo, se omitió NaAc del
lavado. Para centrifugado solo, el lavado se omitió por completo,
esto es, el sedimento solo, sin EtOH o NaAc se centrifugó como en
los dos primeros tratamientos. Las muestras decantadas fueron
posteriormente procesadas y ensayadas para Mtb por PCR como se
describió anteriormente. Se incluyó un control sin centrifugado para
mostrar la máxima recuperación en el que el reactivo de lisis se
agregó directamente en el sedimento respiratorio sin centrifugar. A
pesar de que muchos especimenes de sedimento respiratorio
interfieren con la captura de polímero o PCR cuando se usan sin un
lavado con etanol, esta muestra particular se eligió para el control
sin centrifugado porque no interfirió. Los valores dados en la Tabla
2 son porcentaje de réplicas que fueron positivas para Mtb con PCR;
n = 4 (*n = 3; **n = 1).
Los resultados mostrados en la Tabla 2 indican
que las bacterias cultivadas forman un pellet más eficientemente de
sedimentos respiratorios en un medio que contiene EtOH o NaAc/EtOH
que con la centrifugación directa del sedimento de esputo sin EtOH
(sólo centrifugación). El pool de sedimento respiratorio usado
estaba contaminado con un muy pequeño número de organismos Mtb, no
detectados por cultivo, lo que explica el resultado positivo
ocasional por PCR en la serie CFU cero.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tratamiento | ||||
| Mtb | NaAc | EtOH | Centrifugado | Sin |
| (CFU) | +EtOH | solo | solo | centrifugado |
| 0 | 0% | 25% | 0% | 25% |
| 2 | 75% | 100% | 0% | 100% |
| 5 | 100% | 100% | 50% | 100% |
| 10 | 100% | 100% | 50% | 100% |
| 50 | 100% | 100% | 75% | 100% |
| 100 | 100% | 100% | 100% | 100% |
\vskip1.000000\baselineskip
Este experimento fue idéntico al del Ejemplo 2
excepto en que la fuente de Mtb fueron muestras de pacientes reales
en lugar de cultivos. Se realizaron diluciones con un pool de
muestras de sedimento respiratorio que resultaron positivas para Mtb
por cultivo con un pool de muestras de sedimento respiratorio que
resultaron negativas para muestras de Mtb por cultivo. Se trataron
alícuotas de doscientos microlitros como en el Ejemplo 2. Los
valores dados son porcentajes de réplicas positivas por PCR para
Mtb; n = 4. Como en el Ejemplo 2, el pool negativo por cultivo
contenía niveles de Mtb que fueron detectados por PCR. Sin embargo,
no se observaron diferencias entre lavados con y sin NaAc. No
obstante, se detectó una pérdida de blanco en los pellets de
muestras sin etanol o acetato de sodio (sólo centrifugado).
| Tratamiento | ||||
| Dilución de | NaAc | EtOH | Centrifugado | sin |
| Pool Mtb+ | +EtOH | solo | solo | centrifugado |
| Pool "neg." | 100% | 100% | 50% | 100% |
| 10^{-7} | 100% | 100% | 25% | 100% |
| 10^{-6} | 100% | 100% | 75% | 100% |
| 10^{-5} | 100% | 100% | 25% | 100% |
| 10^{-4} | 100% | 100% | 100% | 100% |
| 10^{-3} | 100% | 100% | 100% | 100% |
Puede resultar ventajoso usar etanol
desnaturalizado en lugar de etanol puro debido a temas de regulación
y de costo. Por lo tanto, se compararon la eficacia de recuperación
de micobacterias cultivadas de un pool de sedimento respiratorio con
etanol puro (absoluto) y etanol desnaturalizado (90% etanol, 5%
metanol, 5% isopropanol). Se prepararon las muestras de prueba y se
trataron con NaAc y EtOH como en el Ejemplo 2, pero se sustituyó el
etanol desnaturalizado por etanol puro en una serie de muestras. Los
valores dados son en porcentaje de réplicas positivas por PCR para
Mtb; n = 6. Como en los Ejemplos 2 y 3, el pool negativo por
cultivo está ligeramente contaminado con Mtb, sin embargo, los
resultados son idénticos para etanol puro y desnaturalizado.
\vskip1.000000\baselineskip
| Mtb | Etanol | Etanol |
| (CFU) | Puro | Desnaturalizado |
| 0 | 17% | 17% |
| 0,5 | 83% | 83% |
| 1 | 100% | 100% |
| 2 | 100% | 100% |
| 5 | 100% | 100% |
| 10 | 100% | 100% |
Este experimento demuestra que NaAc junto con
EtOH proveen recuperación y detección más eficaces de micobacterias
de un subgrupo de muestras de sedimentos de esputo. Se prepararon y
trataron las muestras de prueba con NaAc/EtOH o EtOH solo, como en
el Ejemplo 2, excepto que se usó un pool negativo de PCR de
sedimentos respiratorios, se aumentó el volumen de sedimento
respiratorio a 300 \mul y se usaron 700 \mul del reactivo
combinado EtOH/NaAc (descrito anteriormente en el procedimiento 2).
Los valores dados en la Tabla 5 son porcentajes de las réplicas que
fueron positivas en PCR para Mtb; n = 4. Como se muestra, el etanol
y el acetato de sodio, juntos fueron más eficaces que el etanol
solo. Los experimentos subsiguientes demostraron que el ADN se
recuperó eficazmente por medio de captura de polímero cuando se
incluyó NaAc al tratamiento de etanol. La captura de polímero eficaz
necesitó un pH muy cercano a 6,8. El pH de algunas muestras
respiratorias fue 7,4 durante la captura de polímero si se omitió
NaAc del lavado con etanol, y el ADN no se capturó eficazmente. Sin
embargo, el pH con una segunda alícuota de estas muestras fue 6,8 a
7,1 si se incluía NaAc con el EtOH y el ADN se capturó eficazmente.
Resulta evidente que el agregado de NaAc ajusta el pH y por ello,
mejora la recuperación de ADN de Mtb en este subgrupo de muestras
clínicas.
| Mtb | EtOH | EtOH/ |
| (CFU) | Solo | NaAc |
| 0 | 0% | 0% |
| 0,25 | 0% | 25% |
| 0,5 | 25% | 75% |
| 1 | 50% | 100% |
| 2 | 0% | 100% |
| 5 | 25% | 100% |
Este experimento demostró la presencia de ADN
libre de Mtb en sedimentos de esputo previamente congelados. Se
centrifugaron 3 alícuotas de 200 \mul de muestra de sedimento de
esputo positivas en cultivo, preparadas como en el Ejemplo 3, sin
agregado de EtOH/NaAc. Los sobrenadantes resultantes se filtraron a
través de filtros de 0,2 \mum con el fin de eliminar las bacterias
residuales. Tanto los sobrenadantes filtrados, que podrían contener
ADN libre de Mtb, como los pellets, que podrían contener Mtb
intacto, se procesaron y ensayaron posteriormente por PCR buscando
ADN de Mtb como se describió anteriormente. La Tabla 6 muestra el
porcentaje de réplicas (n = 4) que fueron positivas por PCR para ADN
de Mtb. Los datos indican que hay ADN libre de Mtb significativo en
esta muestra de sedimento de esputo, tanto como 10 veces más que la
cantidad recuperada de organismos Mtb intactos. Como se muestra aquí
y en el Ejemplo 1, el ADN libre puede recuperarse con el
procedimiento de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
| Dilución | Pellet | Filtrado |
| 10^{-7} | 0% | 0% |
| 10^{-6} | 0% | 0% |
| 10^{-5} | 0% | 100% |
| 10^{-4} | 100% | 100% |
| 10^{-3} | 100% | 100% |
| 10^{-2} | 100% | 100% |
| 10^{-1} | 100% | 100% |
Claims (12)
1. Un procedimiento para concentrar bacterias de
una muestra biológica viscosa que comprende:
a) agregar a la muestra, en una cantidad
suficiente para reducir la densidad de la muestra hasta una densidad
menor que la de la bacteria, un agente para disminuir la densidad,
miscible en agua y con una densidad de 0,7 a 0,9 g/ml y un punto de
ebullición mayor que 50ºC; y
b) centrifugar la muestra para formar un pellet
con cualquier bacteria presente en la muestra.
2. Un procedimiento para concentrar bacterias y
ácidos nucleicos bacterianos libres de una muestra biológica que
comprende:
a) agregar a la muestra, en una cantidad
suficiente para reducir la densidad de la muestra hasta una densidad
menor que la de la bacteria, un agente para disminuir la densidad,
miscible en agua y con una densidad de 0,7 a 0,9 g/ml y un punto de
ebullición mayor que 50ºC y, una sal monovalente en una cantidad
suficiente para precipitar los ácidos nucleicos bacterianos libres;
y
b) centrifugar la muestra para formar un pellet
con cualquier bacteria y cualquier ácido nucleico presente en la
muestra.
3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que la sal monovalente es acetato de sodio, cloruro de sodio,
acetato de amonio o cloruro de litio y de preferencia acetato de
sodio.
4. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que la muestra se trata previamente con
reactivos que interfieren con análisis de ácidos nucleicos.
5. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en el que la muestra biológica viscosa es
muestra respiratoria, sedimento respiratorio, fluido oral, fluido
vaginal, fluido seminal, fluido de infección de herida o fluido de
absceso.
6. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en el que la muestra biológica viscosa es
sedimento respiratorio.
7. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en el que el agente para disminuir la
densidad es alcohol metílico sustituido o no sustituido, alcohol
etílico sustituido o no sustituido, alcohol propílico sustituido o
no sustituido o una cetona.
8. El procedimiento de las reivindicaciones 1 a
7, en el que el agente para disminuir la densidad es etanol.
9. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 en el que se agregan 2 á 6 volúmenes, de
preferencia 2 á 2,5 volúmenes de agente para disminuir la densidad
por unidad de volumen de muestra.
10. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 en el que la bacteria es Mycobacterium
sp., Prevotella sp., Porphyromonas sp., Chlamydia trachomatis sp.,
Neisseria gonorrhoeae sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp.,
Enterococcus sp., Clostridiium sp. o Bacteroides sp., en
particular el complejo Mycobacterium tuberculosis o el
complejo Mycobacterium avium.
11. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 en el que, se agrega un agente tamponador de
pH a la muestra junto con el agente para disminuir la densidad.
12. El procedimiento de la reivindicación 11 en
el que el agente tamponador lleva el pH de la muestra a un valor
entre 6 y 9.
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| US39239P | 1997-02-28 | ||
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