JP2003159056A - 核酸増幅妨害物質の除去方法 - Google Patents
核酸増幅妨害物質の除去方法Info
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 核酸を含有する生物材料検体を酸処理す
ることを特徴とする核酸増幅妨害物質の除去方法、核酸
増幅妨害物質除去用の生物材料検体処理試薬。 【効果】生物材料検体から迅速かつ簡便に核酸増幅反応
を妨害する物質を除去することができ、効率的な核酸増
幅が行えるため臨床診断の分野で有用。
ることを特徴とする核酸増幅妨害物質の除去方法、核酸
増幅妨害物質除去用の生物材料検体処理試薬。 【効果】生物材料検体から迅速かつ簡便に核酸増幅反応
を妨害する物質を除去することができ、効率的な核酸増
幅が行えるため臨床診断の分野で有用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有する生
物材料検体から核酸を抽出する際に、核酸増幅反応を妨
害する物質を簡易且つ確実に除去する方法に関する。
物材料検体から核酸を抽出する際に、核酸増幅反応を妨
害する物質を簡易且つ確実に除去する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、核酸の検出に関する研究や診断技
術が急速に進歩し、特に目的のＤＮＡを増幅するＰＣＲ
法（特公平４−６７９５７号公報、特公平４−６７９６
０号公報）や、ＲＮＡを増幅するＲＴ−ＰＣＲ法は様々
な試料中の核酸の高感度分析法として使用され、伝染
病、遺伝病及びガン等に係わる遺伝子の検出、更にはヒ
ト白血球型抗原のＤＮＡタイピング検査にも応用されて
いる。
術が急速に進歩し、特に目的のＤＮＡを増幅するＰＣＲ
法（特公平４−６７９５７号公報、特公平４−６７９６
０号公報）や、ＲＮＡを増幅するＲＴ−ＰＣＲ法は様々
な試料中の核酸の高感度分析法として使用され、伝染
病、遺伝病及びガン等に係わる遺伝子の検出、更にはヒ
ト白血球型抗原のＤＮＡタイピング検査にも応用されて
いる。
【０００３】斯かるＤＮＡやＲＮＡの増幅反応を利用し
た臨床診断の分野では、核酸を含有する細胞、血液、便
等の生物検体や細菌及びウイルスといった感染体からＤ
ＮＡやＲＮＡを抽出精製することが重要なステップとな
るが、生物材料中に含まれるヘモグロビン、ビリルビン
等の色素、蛋白質及び糖類等により増幅に関連する酵素
が失活し、増幅反応が妨害されることが大きな問題とな
っていた。
た臨床診断の分野では、核酸を含有する細胞、血液、便
等の生物検体や細菌及びウイルスといった感染体からＤ
ＮＡやＲＮＡを抽出精製することが重要なステップとな
るが、生物材料中に含まれるヘモグロビン、ビリルビン
等の色素、蛋白質及び糖類等により増幅に関連する酵素
が失活し、増幅反応が妨害されることが大きな問題とな
っていた。
【０００４】一方、生物材料からの核酸の抽出は、一般
に遺伝子を含有する生物材料の溶解、蛋白及び炭水化物
の除去、濃縮の３工程からなり、生物材料の溶解として
は、例えばリゾチーム、アクロモペプチダーゼ等の細胞
壁溶解酵素、プロテインナーゼＫ等の蛋白分解酵素及び
アルカリ若しくはＳＤＳ等の界面活性剤等を用いた方法
が用いられ、蛋白及び炭水化物の除去としては、フェノ
ール・クロロホルム法を用いた方法が用いられている。
また、生物材料を洗浄剤及び酵素による前処理によって
細胞を破壊した後、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルア
ンモニウム）等の陽イオン界面活性剤を用いて核酸との
複合体を形成させた後、核酸を回収する方法も報告され
ている（特開平２−３１６９６号公報）。
に遺伝子を含有する生物材料の溶解、蛋白及び炭水化物
の除去、濃縮の３工程からなり、生物材料の溶解として
は、例えばリゾチーム、アクロモペプチダーゼ等の細胞
壁溶解酵素、プロテインナーゼＫ等の蛋白分解酵素及び
アルカリ若しくはＳＤＳ等の界面活性剤等を用いた方法
が用いられ、蛋白及び炭水化物の除去としては、フェノ
ール・クロロホルム法を用いた方法が用いられている。
また、生物材料を洗浄剤及び酵素による前処理によって
細胞を破壊した後、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルア
ンモニウム）等の陽イオン界面活性剤を用いて核酸との
複合体を形成させた後、核酸を回収する方法も報告され
ている（特開平２−３１６９６号公報）。
【０００５】しかし、フェノール・クロロホルム法にお
いては、核酸増幅反応の妨害物質となり得る蛋白質等は
何れの液層にも溶け難く、不溶物として水層と有機層と
の境界に綿状の白い膜状の層を形成するため、ＤＮＡの
回収に時間と手間がかかり、回収の再現性も悪く大量処
理が困難であった。
いては、核酸増幅反応の妨害物質となり得る蛋白質等は
何れの液層にも溶け難く、不溶物として水層と有機層と
の境界に綿状の白い膜状の層を形成するため、ＤＮＡの
回収に時間と手間がかかり、回収の再現性も悪く大量処
理が困難であった。
【０００６】また、便等のように核酸の増幅を強く妨害
する夾雑物が含まれる検体では、フェノール・クロロホ
ルム法及びＣＴＡＢ法のみでは妨害物質を充分に取り除
くことはできないという問題があった。
する夾雑物が含まれる検体では、フェノール・クロロホ
ルム法及びＣＴＡＢ法のみでは妨害物質を充分に取り除
くことはできないという問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、核酸
の増幅反応を用いた遺伝子解析や臨床診断を行う場合に
おいて、核酸を含有する生物材料検体から核酸を抽出す
る際に、核酸増幅反応を妨害する物質を簡易に且つ確実
に除去する方法、当該妨害物質を除去するための試薬を
提供することにある。
の増幅反応を用いた遺伝子解析や臨床診断を行う場合に
おいて、核酸を含有する生物材料検体から核酸を抽出す
る際に、核酸増幅反応を妨害する物質を簡易に且つ確実
に除去する方法、当該妨害物質を除去するための試薬を
提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】斯かる実情において、本
発明者らは鋭意検討した結果、核酸抽出のいずれかの段
階で核酸を含む生物材料検体を酸処理することにより効
果的に核酸増幅妨害物質が除去でき、得られた抽出核酸
を用いれば核酸増幅反応が効率よく行われることを見出
し、本発明を完成した。
発明者らは鋭意検討した結果、核酸抽出のいずれかの段
階で核酸を含む生物材料検体を酸処理することにより効
果的に核酸増幅妨害物質が除去でき、得られた抽出核酸
を用いれば核酸増幅反応が効率よく行われることを見出
し、本発明を完成した。
【０００９】即ち本発明は、核酸を含有する生物材料検
体を酸処理することを特徴とする核酸増幅妨害物質の除
去方法を提供するものである。
体を酸処理することを特徴とする核酸増幅妨害物質の除
去方法を提供するものである。
【００１０】また本発明は、核酸を含有する生物材料検
体から核酸を抽出する任意の段階において、当該検体を
酸で処理することを特徴とする生物材料検体からの核酸
の抽出方法を提供するものである。
体から核酸を抽出する任意の段階において、当該検体を
酸で処理することを特徴とする生物材料検体からの核酸
の抽出方法を提供するものである。
【００１１】更に本発明は、酸を含有することを特徴と
する核酸増幅妨害物質除去用の生物材料検体処理試薬を
提供するものである。
する核酸増幅妨害物質除去用の生物材料検体処理試薬を
提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、生物材料検体から遺伝
子解析や臨床診断に汎用されている核酸増幅反応を妨害
する物質を簡易に且つ確実に除去する方法及び当該妨害
物質が除去された核酸を得るための方法であるが、ここ
でいう核酸増幅反応とは、例えばＰＣＲ法（特公平４−
６７９５７号公報、特公平４−６７９６０号公報）の
他、逆転写酵素反応によりｍＲＮＡを鋳型として相補的
なＤＮＡを合成し、これをＰＣＲにかけることによりｍ
ＲＮＡを検出するＲＴ−ＰＣＲ法、２本鎖ＤＮＡの片側
のリン酸結合を切断する反応と相補鎖置換活性を有する
ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成を繰り返してＤＮ
Ａを増幅するＳＤＡ（Strand Displacement Amplificat
ion）法、２本鎖ＤＮＡを結合する活性を有するＤＮＡ
リガーゼを用いて検体ＤＮＡと相補的なＤＮＡの結合反
応を繰り返してＤＮＡを増幅するＬＣＲ（Ligase Chain
Reaction）法、検体中のＲＮＡを標的として逆転写酵
素によるｃＤＮＡの合成反応とＲＮＡポリメラーゼによ
るＲＮＡ合成とＲＮａｓｅによるＲＮＡ／ｃＤＮＡハイ
ブリット中のＲＮＡの分解を繰り返してＲＮＡを増幅す
るＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplific
ation）法等が挙げられるが、本発明方法はこれらの何
れにも適用できる。
子解析や臨床診断に汎用されている核酸増幅反応を妨害
する物質を簡易に且つ確実に除去する方法及び当該妨害
物質が除去された核酸を得るための方法であるが、ここ
でいう核酸増幅反応とは、例えばＰＣＲ法（特公平４−
６７９５７号公報、特公平４−６７９６０号公報）の
他、逆転写酵素反応によりｍＲＮＡを鋳型として相補的
なＤＮＡを合成し、これをＰＣＲにかけることによりｍ
ＲＮＡを検出するＲＴ−ＰＣＲ法、２本鎖ＤＮＡの片側
のリン酸結合を切断する反応と相補鎖置換活性を有する
ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成を繰り返してＤＮ
Ａを増幅するＳＤＡ（Strand Displacement Amplificat
ion）法、２本鎖ＤＮＡを結合する活性を有するＤＮＡ
リガーゼを用いて検体ＤＮＡと相補的なＤＮＡの結合反
応を繰り返してＤＮＡを増幅するＬＣＲ（Ligase Chain
Reaction）法、検体中のＲＮＡを標的として逆転写酵
素によるｃＤＮＡの合成反応とＲＮＡポリメラーゼによ
るＲＮＡ合成とＲＮａｓｅによるＲＮＡ／ｃＤＮＡハイ
ブリット中のＲＮＡの分解を繰り返してＲＮＡを増幅す
るＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplific
ation）法等が挙げられるが、本発明方法はこれらの何
れにも適用できる。
【００１３】また、本発明いう核酸増幅妨害物質とは、
これらの核酸増幅反応を妨害する物質をいい、主にＤＮ
Ａポリメラーゼ等の核酸増幅に関連する酵素を失活させ
る要因となるヘモグロビン、ビリルビン等の色素、蛋白
質及び糖類等が挙げられる。
これらの核酸増幅反応を妨害する物質をいい、主にＤＮ
Ａポリメラーゼ等の核酸増幅に関連する酵素を失活させ
る要因となるヘモグロビン、ビリルビン等の色素、蛋白
質及び糖類等が挙げられる。
【００１４】本発明でいう生物材料検体とは、便、血
液、痰、尿、胸水、腹水、髄液、精液、細胞、組織、生
検標本等の生体材料の他、細菌、酵母等の微生物、ウイ
ルス、培養細胞等が挙げられるが、本発明方法は、核酸
増幅妨害物質が多く含まれる便から核酸を抽出する際に
特に有用である。
液、痰、尿、胸水、腹水、髄液、精液、細胞、組織、生
検標本等の生体材料の他、細菌、酵母等の微生物、ウイ
ルス、培養細胞等が挙げられるが、本発明方法は、核酸
増幅妨害物質が多く含まれる便から核酸を抽出する際に
特に有用である。
【００１５】本発明において使用する酸としては、塩
酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸、酢酸、クエン酸、フ
タル酸、フマル酸、マレイン酸等のカルボン酸、メタン
スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機スルホ
ン酸が挙げられるが、好ましくは鉱酸であり、中でも塩
酸が特に好ましい。
酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸、酢酸、クエン酸、フ
タル酸、フマル酸、マレイン酸等のカルボン酸、メタン
スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機スルホ
ン酸が挙げられるが、好ましくは鉱酸であり、中でも塩
酸が特に好ましい。
【００１６】酸処理は、検体調製液にあらかじめ適当な
濃度に調製した酸液を加えるか、或いは検体調製液に適
当な濃度になるよう直接酸を加え、通常室温で１秒〜１
０分間激しく振とうさせ、更に１０００〜１５０００回
転で１分〜３０分間遠心分離を行い、上清に移行した妨
害物質を除去して核酸含有成分を採取分離することによ
り行われる。尚、酸の濃度は、用いられる酸の種類、生
物材料の種類や状態によっても異なるが、通常０．０１
Ｎ〜１０Ｎ、特に０．０５Ｎ〜５Ｎが好ましい。
濃度に調製した酸液を加えるか、或いは検体調製液に適
当な濃度になるよう直接酸を加え、通常室温で１秒〜１
０分間激しく振とうさせ、更に１０００〜１５０００回
転で１分〜３０分間遠心分離を行い、上清に移行した妨
害物質を除去して核酸含有成分を採取分離することによ
り行われる。尚、酸の濃度は、用いられる酸の種類、生
物材料の種類や状態によっても異なるが、通常０．０１
Ｎ〜１０Ｎ、特に０．０５Ｎ〜５Ｎが好ましい。
【００１７】上記のように、生物材料検体を酸処理する
ことにより核酸増幅妨害物質を効率的に除去することが
できるが、当該酸と浸透圧調整剤を共存させることによ
り、核酸増幅妨害物質の除去効果を増大させることがで
きる。ここで、浸透圧調整剤としては、塩化リチウム、
硫酸リチウム、炭酸リチウム、硝酸リチウム、塩化ナト
リウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、硝酸ナトリ
ウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、硝
酸カリウム等のアルカリ金属塩、塩化マグネシウム、硫
酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硝酸マグネシウ
ム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウ
ム、硝酸カルシウム等のアルカリ土類金属塩類、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−エリトロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−
マンノース、アルドヘプトース、２−デオキシヘキソー
ス、Ｄ−グルクロン酸等の単糖類、ラクトース、α，α
−トレハロース、スクロース等のオリゴ糖類等の糖類が
挙げられ、中でもアルカリ金属塩及び単糖類が好まし
く、特に塩化ナトリウム及びグルコースが好ましい。
尚、反応液中の浸透圧調整剤の濃度は、０．１〜１０．
０％の範囲であり、好ましくは０．５〜２．０％、特に
好ましくは０．８％である。
ことにより核酸増幅妨害物質を効率的に除去することが
できるが、当該酸と浸透圧調整剤を共存させることによ
り、核酸増幅妨害物質の除去効果を増大させることがで
きる。ここで、浸透圧調整剤としては、塩化リチウム、
硫酸リチウム、炭酸リチウム、硝酸リチウム、塩化ナト
リウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、硝酸ナトリ
ウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、硝
酸カリウム等のアルカリ金属塩、塩化マグネシウム、硫
酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硝酸マグネシウ
ム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウ
ム、硝酸カルシウム等のアルカリ土類金属塩類、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−エリトロース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−
マンノース、アルドヘプトース、２−デオキシヘキソー
ス、Ｄ−グルクロン酸等の単糖類、ラクトース、α，α
−トレハロース、スクロース等のオリゴ糖類等の糖類が
挙げられ、中でもアルカリ金属塩及び単糖類が好まし
く、特に塩化ナトリウム及びグルコースが好ましい。
尚、反応液中の浸透圧調整剤の濃度は、０．１〜１０．
０％の範囲であり、好ましくは０．５〜２．０％、特に
好ましくは０．８％である。
【００１８】本発明の方法を行うに当たっては、予め適
当な濃度に調製した酸及び必要に応じて浸透圧調整剤を
含有する生物材料検体処理試薬として用いるのが好まし
い。また、当該処理試薬には、酸及び浸透圧調整剤の他
に必要に応じて緩衝液又は界面活性剤を適宜加えること
ができる。
当な濃度に調製した酸及び必要に応じて浸透圧調整剤を
含有する生物材料検体処理試薬として用いるのが好まし
い。また、当該処理試薬には、酸及び浸透圧調整剤の他
に必要に応じて緩衝液又は界面活性剤を適宜加えること
ができる。
【００１９】生物材料検体からの核酸の抽出は、通常遺
伝子を含有する生物材料の溶解、蛋白及び炭水化物の除
去及び濃縮の３工程からなり、本発明の核酸抽出方法
は、当該核酸抽出操作と酸処理を組み合わせることによ
り行うことができる。従って、上記酸処理以外は公知の
核酸抽出操作を行えばよい。酸処理は、生物材料の溶
解、蛋白及び炭水化物の除去及び濃縮の何れの段階で行
ってもよいが、操作の効率性を考慮すると核酸抽出操作
の初期段階、即ち生物材料の溶解操作の前段階で行うの
が好ましい。
伝子を含有する生物材料の溶解、蛋白及び炭水化物の除
去及び濃縮の３工程からなり、本発明の核酸抽出方法
は、当該核酸抽出操作と酸処理を組み合わせることによ
り行うことができる。従って、上記酸処理以外は公知の
核酸抽出操作を行えばよい。酸処理は、生物材料の溶
解、蛋白及び炭水化物の除去及び濃縮の何れの段階で行
ってもよいが、操作の効率性を考慮すると核酸抽出操作
の初期段階、即ち生物材料の溶解操作の前段階で行うの
が好ましい。
【００２０】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明
する。核酸増幅が強固に妨害される便のモデル検体を以
下のように作製し、検討を行った。なお、便は２０％濃
度の便液となる様にして処理を行った。
する。核酸増幅が強固に妨害される便のモデル検体を以
下のように作製し、検討を行った。なお、便は２０％濃
度の便液となる様にして処理を行った。
【００２１】参考例１
一夜培養したベロ毒素1型遺伝子（VT1）を有する腸管出
血性大腸菌（E.coli）を滅菌生理食塩水で１×１０8 Ｃ
ＦＵ／ｍｌに調製した。その菌液１０ｍｌと便２．５ｇ
を混合し、モデル検体とした。このようにして調製した
モデル検体０．５ｍｌをマイクロチューブに移し、一般
的に核酸の抽出法として用いられるフェノール・クロロ
ホルム法による処理を以下のように行なった。まず、菌
を溶菌させるために、９５℃で１０分間加熱した後、２
０００回転、５分間の遠心分離を行い、その上清２００
μｌを新しいマイクロチューブに移した。このマイクロ
チューブにフェノール溶液を等量加え、３０秒激しく振
とうした。１００００回転、５分間の遠心分離を行い、
上清を新しいマイクロチューブに移した。このマイクロ
チューブにフェノール・クロロホルム・イソアミルアル
コール溶液（２５：２４：１）を等量加え、３０秒激し
く振とうした。１００００回転、５分間の遠心分離を行
い、上清を新しいマイクロチューブに移した。このマイ
クロチューブにクロロホルム・イソアミルアルコール溶
液（２４：１）を等量加え、３０秒激しく振とうした。
１００００回転、５分間の遠心分離を行い、上清を新し
いマイクロチューブに移した。この溶液の１／１０量の
３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールを加え、
振とうした。−２０℃で２時間冷却後、４℃、１５００
０回転、１０分間の遠心を行ない、ＤＮＡを沈殿させ
た。沈殿を吸わないように、上清をピペットマンなど用
いて注意深く除き、７０％エタノールを１ｍｌ加え沈殿
をすすぎ、再度４℃、１５０００回転、５分間の遠心を
行ない、ＤＮＡを沈殿させた。上清を除去し、遠心濃縮
機（エバポレーター）などを用いて沈殿を乾燥させた。
沈殿を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌに
懸濁した。これを１５０００回転、１分間の遠心分離を
行い、その上清１μｌを核酸増幅に供した。核酸の増幅
ならびに検出はベロ毒素遺伝子検出試薬（湧永製薬株式
会社製造、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社販
売）を使用した。結果を表１に示す。なお、吸光度によ
る測定（O.D.415nm）で０．２以上の値を示したものが
陽性、それ未満は陰性である。
血性大腸菌（E.coli）を滅菌生理食塩水で１×１０8 Ｃ
ＦＵ／ｍｌに調製した。その菌液１０ｍｌと便２．５ｇ
を混合し、モデル検体とした。このようにして調製した
モデル検体０．５ｍｌをマイクロチューブに移し、一般
的に核酸の抽出法として用いられるフェノール・クロロ
ホルム法による処理を以下のように行なった。まず、菌
を溶菌させるために、９５℃で１０分間加熱した後、２
０００回転、５分間の遠心分離を行い、その上清２００
μｌを新しいマイクロチューブに移した。このマイクロ
チューブにフェノール溶液を等量加え、３０秒激しく振
とうした。１００００回転、５分間の遠心分離を行い、
上清を新しいマイクロチューブに移した。このマイクロ
チューブにフェノール・クロロホルム・イソアミルアル
コール溶液（２５：２４：１）を等量加え、３０秒激し
く振とうした。１００００回転、５分間の遠心分離を行
い、上清を新しいマイクロチューブに移した。このマイ
クロチューブにクロロホルム・イソアミルアルコール溶
液（２４：１）を等量加え、３０秒激しく振とうした。
１００００回転、５分間の遠心分離を行い、上清を新し
いマイクロチューブに移した。この溶液の１／１０量の
３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールを加え、
振とうした。−２０℃で２時間冷却後、４℃、１５００
０回転、１０分間の遠心を行ない、ＤＮＡを沈殿させ
た。沈殿を吸わないように、上清をピペットマンなど用
いて注意深く除き、７０％エタノールを１ｍｌ加え沈殿
をすすぎ、再度４℃、１５０００回転、５分間の遠心を
行ない、ＤＮＡを沈殿させた。上清を除去し、遠心濃縮
機（エバポレーター）などを用いて沈殿を乾燥させた。
沈殿を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌに
懸濁した。これを１５０００回転、１分間の遠心分離を
行い、その上清１μｌを核酸増幅に供した。核酸の増幅
ならびに検出はベロ毒素遺伝子検出試薬（湧永製薬株式
会社製造、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社販
売）を使用した。結果を表１に示す。なお、吸光度によ
る測定（O.D.415nm）で０．２以上の値を示したものが
陽性、それ未満は陰性である。
【００２２】
【表１】
【００２３】表１の結果より、一般的なフェノール・ク
ロロホルム法による処理を行なった場合には、腸管出血
性大腸菌を１×１０8ＣＦＵ／ｍｌを含むモデル便液か
らは、ベロ毒素１型遺伝子が検出されなかった。このこ
とから、フェノール・クロロホルム法による処理では、
核酸増幅が行われず、便中の核酸増幅妨害物が十分に除
去されていないことを示している。
ロロホルム法による処理を行なった場合には、腸管出血
性大腸菌を１×１０8ＣＦＵ／ｍｌを含むモデル便液か
らは、ベロ毒素１型遺伝子が検出されなかった。このこ
とから、フェノール・クロロホルム法による処理では、
核酸増幅が行われず、便中の核酸増幅妨害物が十分に除
去されていないことを示している。
【００２４】実施例１〜２
一夜培養したベロ毒素１型遺伝子（VT１）を有する腸管
出血性大腸菌（E.coli）を滅菌生理食塩水で１×１０8
ＣＦＵ／ｍｌに調製した。その菌液１０ｍｌと便２．５
ｇを混合し、モデル検体とした。このようにして調製し
たモデル検体０．５ｍｌをマイクロチューブに移し、こ
れに０．８％塩化ナトリウムを含む酸液（２Ｎ塩酸又は
２Ｎ酢酸）又は生理食塩水３０μｌ（コントロール）を
加えた。この後、マイクロチューブを激しく振とうし、
さらに、２０００回転、５分間の遠心分離を行い、これ
らの上清２００μｌを新しいマイクロチューブに移し
た。これらの上清２００μｌに０．８％ＮａＣｌを含む
９５％のメタノールを１ｍｌ加え、激しく振とうし、さ
らに８０００回転、１分間の遠心分離を行い上清を除去
して、沈渣を生理食塩水１ｍｌに懸濁した。さらに１５
０００回転、１分間の遠心分離を行い上清を除去して、
沈渣を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌに
懸濁した。これらを９５℃で１０分間加熱した後、１５
０００回転、１分間の遠心分離を行い、その上清１μｌ
を核酸増幅に供した。結果を表２に示す。
出血性大腸菌（E.coli）を滅菌生理食塩水で１×１０8
ＣＦＵ／ｍｌに調製した。その菌液１０ｍｌと便２．５
ｇを混合し、モデル検体とした。このようにして調製し
たモデル検体０．５ｍｌをマイクロチューブに移し、こ
れに０．８％塩化ナトリウムを含む酸液（２Ｎ塩酸又は
２Ｎ酢酸）又は生理食塩水３０μｌ（コントロール）を
加えた。この後、マイクロチューブを激しく振とうし、
さらに、２０００回転、５分間の遠心分離を行い、これ
らの上清２００μｌを新しいマイクロチューブに移し
た。これらの上清２００μｌに０．８％ＮａＣｌを含む
９５％のメタノールを１ｍｌ加え、激しく振とうし、さ
らに８０００回転、１分間の遠心分離を行い上清を除去
して、沈渣を生理食塩水１ｍｌに懸濁した。さらに１５
０００回転、１分間の遠心分離を行い上清を除去して、
沈渣を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌに
懸濁した。これらを９５℃で１０分間加熱した後、１５
０００回転、１分間の遠心分離を行い、その上清１μｌ
を核酸増幅に供した。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】表２の結果より、塩酸あるいは酢酸による
洗浄を行なった場合には、腸管出血性大腸菌を１×１０
8ＣＦＵ／ｍｌ含むモデル便液から、ベロ毒素１型遺伝
子が検出されたが、生理食塩水による洗浄ではベロ毒素
１型遺伝子が検出されなかった。このことは、酸液処理
により、便中の核酸増幅妨害物質が十分に除去されたこ
とを示す。
洗浄を行なった場合には、腸管出血性大腸菌を１×１０
8ＣＦＵ／ｍｌ含むモデル便液から、ベロ毒素１型遺伝
子が検出されたが、生理食塩水による洗浄ではベロ毒素
１型遺伝子が検出されなかった。このことは、酸液処理
により、便中の核酸増幅妨害物質が十分に除去されたこ
とを示す。
【００２７】実施例３〜４
浸透圧調整剤の有無による検出効率の比較を行った。浸
透圧調整剤（０．８％塩化ナトリウム又は５０ｍＭグル
コース）を含む２Ｎ塩酸と浸透圧調整剤を含まない２Ｎ
塩酸（比較例）を用い、実施例１〜２と同様の処理を行
った。検体はＶＴ１産生型の腸管出血性大腸菌を１０4
又は１０3ＣＦＵ／ｍｌ含む菌液を使用した。ＤＮＡ抽
出後のＰＣＲ以下の検出はベロ毒素遺伝子検出試薬を使
用した。結果を表３に示す。
透圧調整剤（０．８％塩化ナトリウム又は５０ｍＭグル
コース）を含む２Ｎ塩酸と浸透圧調整剤を含まない２Ｎ
塩酸（比較例）を用い、実施例１〜２と同様の処理を行
った。検体はＶＴ１産生型の腸管出血性大腸菌を１０4
又は１０3ＣＦＵ／ｍｌ含む菌液を使用した。ＤＮＡ抽
出後のＰＣＲ以下の検出はベロ毒素遺伝子検出試薬を使
用した。結果を表３に示す。
【００２８】
【表３】
【００２９】表３の結果から、浸透圧調整剤として０．
８％ＮａＣｌ又は５０ｍＭグルコースが含まれた場合、
１０3ＣＦＵ／ｍｌ以上の菌量で検出が可能であった
が、浸透圧調整剤を含まないものでは１０4ＣＦＵ／ｍ
ｌ以上の菌量でなければ検出がされなかった。このこと
から、浸透圧調整剤を含む試薬を用いることにより、検
出効率が良くなる。
８％ＮａＣｌ又は５０ｍＭグルコースが含まれた場合、
１０3ＣＦＵ／ｍｌ以上の菌量で検出が可能であった
が、浸透圧調整剤を含まないものでは１０4ＣＦＵ／ｍ
ｌ以上の菌量でなければ検出がされなかった。このこと
から、浸透圧調整剤を含む試薬を用いることにより、検
出効率が良くなる。
【００３０】実施例５
一夜培養した黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureu
s）を滅菌生理食塩水で１×１０4ＣＦＵ／ｍｌに調製し
た。その菌液１０ｍｌと便２．５ｇを混合し、モデル検
体とした。このようにして調製したモデル検体０．５ｍ
ｌをマイクロチューブに移し、これに酸液または生理食
塩水３０μｌを加えた。酸液として０．８％ＮａＣｌを
含む２Ｎ塩酸を用いた。この後、マイクロチューブを激
しく振とうし、さらに、２０００回転、５分間の遠心分
離を行い、これらの上清２００μｌを新しいマイクロチ
ューブに移した。これらの上清２００μｌに０．８％Ｎ
ａＣｌを含む９５％のメタノールを１ｍｌ加え、激しく
振とうし、さらに８０００回転、１分間の遠心分離を行
い上清を除去して、沈渣を生理食塩水１ｍｌに懸濁し
た。さらに１５０００回転、１分間の遠心分離を行い上
清を除去して、沈渣を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
５）１０μｌに懸濁した。上記の懸濁液５μｌを検体と
して、ジーンカラーmecA・spa（湧永製薬製造、ロシュ
・ダイアグノスティックス販売）を使用して黄色ブドウ
球菌に特異的な遺伝子（spa）の検出を行った。結果を
表４に示す。なお、吸光度による測定（O.D.415nm）で
０．２以上の値を示したものが陽性である。
s）を滅菌生理食塩水で１×１０4ＣＦＵ／ｍｌに調製し
た。その菌液１０ｍｌと便２．５ｇを混合し、モデル検
体とした。このようにして調製したモデル検体０．５ｍ
ｌをマイクロチューブに移し、これに酸液または生理食
塩水３０μｌを加えた。酸液として０．８％ＮａＣｌを
含む２Ｎ塩酸を用いた。この後、マイクロチューブを激
しく振とうし、さらに、２０００回転、５分間の遠心分
離を行い、これらの上清２００μｌを新しいマイクロチ
ューブに移した。これらの上清２００μｌに０．８％Ｎ
ａＣｌを含む９５％のメタノールを１ｍｌ加え、激しく
振とうし、さらに８０００回転、１分間の遠心分離を行
い上清を除去して、沈渣を生理食塩水１ｍｌに懸濁し
た。さらに１５０００回転、１分間の遠心分離を行い上
清を除去して、沈渣を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
５）１０μｌに懸濁した。上記の懸濁液５μｌを検体と
して、ジーンカラーmecA・spa（湧永製薬製造、ロシュ
・ダイアグノスティックス販売）を使用して黄色ブドウ
球菌に特異的な遺伝子（spa）の検出を行った。結果を
表４に示す。なお、吸光度による測定（O.D.415nm）で
０．２以上の値を示したものが陽性である。
【００３１】
【表４】
【００３２】
【発明の効果】本発明方法を用いることにより、生物材
料検体から迅速かつ簡便に核酸増幅反応を妨害する物質
を除去することができ、得られた抽出核酸を用いれば効
率的な核酸増幅を行えるため臨床診断の分野で有用であ
る。
料検体から迅速かつ簡便に核酸増幅反応を妨害する物質
を除去することができ、得られた抽出核酸を用いれば効
率的な核酸増幅を行えるため臨床診断の分野で有用であ
る。
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フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 HA11
4B063 QA11 QA19 QQ02 QQ04 QQ05
QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR62
QS25
Claims (8)
- 【請求項１】 核酸を含有する生物材料検体を酸処理す
ることを特徴とする核酸増幅妨害物質の除去方法。 - 【請求項２】 核酸を含有する生物材料検体から核酸を
抽出する任意の段階において、当該検体を酸処理するこ
とを特徴とする生物材料検体からの核酸抽出方法。 - 【請求項３】 酸が鉱酸である請求項１又は２記載の核
酸増幅妨害物質の除去方法又は核酸抽出方法。 - 【請求項４】 検体を更に浸透圧調整剤で処理するもの
である請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸増幅妨害
物質の除去方法又は核酸抽出方法。 - 【請求項５】 浸透圧調整剤がアルカリ金属塩又は単糖
類である請求項４記載の核酸増幅妨害物質の除去方法又
は核酸抽出方法。 - 【請求項６】 生物材料検体が便である請求項１〜５の
いずれか１項記載の核酸増幅妨害物質の除去方法又は核
酸抽出方法。 - 【請求項７】 酸を含有することを特徴とする核酸増幅
妨害物質除去用の生物材料検体処理試薬。 - 【請求項８】 更に浸透圧調整剤を含有するものである
請求項７記載の生物材料検体処理試薬。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17725999A JP2003159056A (ja) | 1999-06-23 | 1999-06-23 | 核酸増幅妨害物質の除去方法 |
| AU52470/00A AU5247000A (en) | 1999-06-23 | 2000-06-14 | Method for eliminating nucleic acid amplification inhibitors |
| PCT/JP2000/003851 WO2001000813A1 (fr) | 1999-06-23 | 2000-06-14 | Procede d'elimination des inhibiteurs de l'amplification d'acide nucleique |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17725999A JP2003159056A (ja) | 1999-06-23 | 1999-06-23 | 核酸増幅妨害物質の除去方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003159056A true JP2003159056A (ja) | 2003-06-03 |
Family
ID=16027953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17725999A Pending JP2003159056A (ja) | 1999-06-23 | 1999-06-23 | 核酸増幅妨害物質の除去方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003159056A (ja) |
| AU (1) | AU5247000A (ja) |
| WO (1) | WO2001000813A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8097414B2 (en) | 2005-11-25 | 2012-01-17 | K. K. Dnaform | Method for detecting and amplifying nucleic acid |
| KR101835006B1 (ko) | 2010-09-14 | 2018-03-06 | 삼성전자주식회사 | 중합효소 연쇄 반응의 효율 및 감도를 증가시키는 방법 및 이를 위한 조성물 |
-
1999
- 1999-06-23 JP JP17725999A patent/JP2003159056A/ja active Pending
-
2000
- 2000-06-14 AU AU52470/00A patent/AU5247000A/en not_active Abandoned
- 2000-06-14 WO PCT/JP2000/003851 patent/WO2001000813A1/ja active Application Filing
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8097414B2 (en) | 2005-11-25 | 2012-01-17 | K. K. Dnaform | Method for detecting and amplifying nucleic acid |
| KR101835006B1 (ko) | 2010-09-14 | 2018-03-06 | 삼성전자주식회사 | 중합효소 연쇄 반응의 효율 및 감도를 증가시키는 방법 및 이를 위한 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU5247000A (en) | 2001-01-31 |
| WO2001000813A1 (fr) | 2001-01-04 |
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