JP2003159056A - 核酸増幅妨害物質の除去方法 - Google Patents
核酸増幅妨害物質の除去方法Info
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 核酸を含有する生物材料検体を酸処理す
ることを特徴とする核酸増幅妨害物質の除去方法、核酸
増幅妨害物質除去用の生物材料検体処理試薬。 【効果】生物材料検体から迅速かつ簡便に核酸増幅反応
を妨害する物質を除去することができ、効率的な核酸増
幅が行えるため臨床診断の分野で有用。
ることを特徴とする核酸増幅妨害物質の除去方法、核酸
増幅妨害物質除去用の生物材料検体処理試薬。 【効果】生物材料検体から迅速かつ簡便に核酸増幅反応
を妨害する物質を除去することができ、効率的な核酸増
幅が行えるため臨床診断の分野で有用。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有する生
物材料検体から核酸を抽出する際に、核酸増幅反応を妨
害する物質を簡易且つ確実に除去する方法に関する。
物材料検体から核酸を抽出する際に、核酸増幅反応を妨
害する物質を簡易且つ確実に除去する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】近年、核酸の検出に関する研究や診断技
術が急速に進歩し、特に目的のDNAを増幅するPCR
法(特公平4−67957号公報、特公平4−6796
0号公報)や、RNAを増幅するRT−PCR法は様々
な試料中の核酸の高感度分析法として使用され、伝染
病、遺伝病及びガン等に係わる遺伝子の検出、更にはヒ
ト白血球型抗原のDNAタイピング検査にも応用されて
いる。
術が急速に進歩し、特に目的のDNAを増幅するPCR
法(特公平4−67957号公報、特公平4−6796
0号公報)や、RNAを増幅するRT−PCR法は様々
な試料中の核酸の高感度分析法として使用され、伝染
病、遺伝病及びガン等に係わる遺伝子の検出、更にはヒ
ト白血球型抗原のDNAタイピング検査にも応用されて
いる。
【0003】斯かるDNAやRNAの増幅反応を利用し
た臨床診断の分野では、核酸を含有する細胞、血液、便
等の生物検体や細菌及びウイルスといった感染体からD
NAやRNAを抽出精製することが重要なステップとな
るが、生物材料中に含まれるヘモグロビン、ビリルビン
等の色素、蛋白質及び糖類等により増幅に関連する酵素
が失活し、増幅反応が妨害されることが大きな問題とな
っていた。
た臨床診断の分野では、核酸を含有する細胞、血液、便
等の生物検体や細菌及びウイルスといった感染体からD
NAやRNAを抽出精製することが重要なステップとな
るが、生物材料中に含まれるヘモグロビン、ビリルビン
等の色素、蛋白質及び糖類等により増幅に関連する酵素
が失活し、増幅反応が妨害されることが大きな問題とな
っていた。
【0004】一方、生物材料からの核酸の抽出は、一般
に遺伝子を含有する生物材料の溶解、蛋白及び炭水化物
の除去、濃縮の3工程からなり、生物材料の溶解として
は、例えばリゾチーム、アクロモペプチダーゼ等の細胞
壁溶解酵素、プロテインナーゼK等の蛋白分解酵素及び
アルカリ若しくはSDS等の界面活性剤等を用いた方法
が用いられ、蛋白及び炭水化物の除去としては、フェノ
ール・クロロホルム法を用いた方法が用いられている。
また、生物材料を洗浄剤及び酵素による前処理によって
細胞を破壊した後、CTAB(臭化セチルトリメチルア
ンモニウム)等の陽イオン界面活性剤を用いて核酸との
複合体を形成させた後、核酸を回収する方法も報告され
ている(特開平2−31696号公報)。
に遺伝子を含有する生物材料の溶解、蛋白及び炭水化物
の除去、濃縮の3工程からなり、生物材料の溶解として
は、例えばリゾチーム、アクロモペプチダーゼ等の細胞
壁溶解酵素、プロテインナーゼK等の蛋白分解酵素及び
アルカリ若しくはSDS等の界面活性剤等を用いた方法
が用いられ、蛋白及び炭水化物の除去としては、フェノ
ール・クロロホルム法を用いた方法が用いられている。
また、生物材料を洗浄剤及び酵素による前処理によって
細胞を破壊した後、CTAB(臭化セチルトリメチルア
ンモニウム)等の陽イオン界面活性剤を用いて核酸との
複合体を形成させた後、核酸を回収する方法も報告され
ている(特開平2−31696号公報)。
【0005】しかし、フェノール・クロロホルム法にお
いては、核酸増幅反応の妨害物質となり得る蛋白質等は
何れの液層にも溶け難く、不溶物として水層と有機層と
の境界に綿状の白い膜状の層を形成するため、DNAの
回収に時間と手間がかかり、回収の再現性も悪く大量処
理が困難であった。
いては、核酸増幅反応の妨害物質となり得る蛋白質等は
何れの液層にも溶け難く、不溶物として水層と有機層と
の境界に綿状の白い膜状の層を形成するため、DNAの
回収に時間と手間がかかり、回収の再現性も悪く大量処
理が困難であった。
【0006】また、便等のように核酸の増幅を強く妨害
する夾雑物が含まれる検体では、フェノール・クロロホ
ルム法及びCTAB法のみでは妨害物質を充分に取り除
くことはできないという問題があった。
する夾雑物が含まれる検体では、フェノール・クロロホ
ルム法及びCTAB法のみでは妨害物質を充分に取り除
くことはできないという問題があった。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、核酸
の増幅反応を用いた遺伝子解析や臨床診断を行う場合に
おいて、核酸を含有する生物材料検体から核酸を抽出す
る際に、核酸増幅反応を妨害する物質を簡易に且つ確実
に除去する方法、当該妨害物質を除去するための試薬を
提供することにある。
の増幅反応を用いた遺伝子解析や臨床診断を行う場合に
おいて、核酸を含有する生物材料検体から核酸を抽出す
る際に、核酸増幅反応を妨害する物質を簡易に且つ確実
に除去する方法、当該妨害物質を除去するための試薬を
提供することにある。
【0008】
【課題を解決するための手段】斯かる実情において、本
発明者らは鋭意検討した結果、核酸抽出のいずれかの段
階で核酸を含む生物材料検体を酸処理することにより効
果的に核酸増幅妨害物質が除去でき、得られた抽出核酸
を用いれば核酸増幅反応が効率よく行われることを見出
し、本発明を完成した。
発明者らは鋭意検討した結果、核酸抽出のいずれかの段
階で核酸を含む生物材料検体を酸処理することにより効
果的に核酸増幅妨害物質が除去でき、得られた抽出核酸
を用いれば核酸増幅反応が効率よく行われることを見出
し、本発明を完成した。
【0009】即ち本発明は、核酸を含有する生物材料検
体を酸処理することを特徴とする核酸増幅妨害物質の除
去方法を提供するものである。
体を酸処理することを特徴とする核酸増幅妨害物質の除
去方法を提供するものである。
【0010】また本発明は、核酸を含有する生物材料検
体から核酸を抽出する任意の段階において、当該検体を
酸で処理することを特徴とする生物材料検体からの核酸
の抽出方法を提供するものである。
体から核酸を抽出する任意の段階において、当該検体を
酸で処理することを特徴とする生物材料検体からの核酸
の抽出方法を提供するものである。
【0011】更に本発明は、酸を含有することを特徴と
する核酸増幅妨害物質除去用の生物材料検体処理試薬を
提供するものである。
する核酸増幅妨害物質除去用の生物材料検体処理試薬を
提供するものである。
【0012】
【発明の実施の形態】本発明は、生物材料検体から遺伝
子解析や臨床診断に汎用されている核酸増幅反応を妨害
する物質を簡易に且つ確実に除去する方法及び当該妨害
物質が除去された核酸を得るための方法であるが、ここ
でいう核酸増幅反応とは、例えばPCR法(特公平4−
67957号公報、特公平4−67960号公報)の
他、逆転写酵素反応によりmRNAを鋳型として相補的
なDNAを合成し、これをPCRにかけることによりm
RNAを検出するRT−PCR法、2本鎖DNAの片側
のリン酸結合を切断する反応と相補鎖置換活性を有する
DNAポリメラーゼによりDNA合成を繰り返してDN
Aを増幅するSDA(Strand Displacement Amplificat
ion)法、2本鎖DNAを結合する活性を有するDNA
リガーゼを用いて検体DNAと相補的なDNAの結合反
応を繰り返してDNAを増幅するLCR(Ligase Chain
Reaction)法、検体中のRNAを標的として逆転写酵
素によるcDNAの合成反応とRNAポリメラーゼによ
るRNA合成とRNaseによるRNA/cDNAハイ
ブリット中のRNAの分解を繰り返してRNAを増幅す
るNASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplific
ation)法等が挙げられるが、本発明方法はこれらの何
れにも適用できる。
子解析や臨床診断に汎用されている核酸増幅反応を妨害
する物質を簡易に且つ確実に除去する方法及び当該妨害
物質が除去された核酸を得るための方法であるが、ここ
でいう核酸増幅反応とは、例えばPCR法(特公平4−
67957号公報、特公平4−67960号公報)の
他、逆転写酵素反応によりmRNAを鋳型として相補的
なDNAを合成し、これをPCRにかけることによりm
RNAを検出するRT−PCR法、2本鎖DNAの片側
のリン酸結合を切断する反応と相補鎖置換活性を有する
DNAポリメラーゼによりDNA合成を繰り返してDN
Aを増幅するSDA(Strand Displacement Amplificat
ion)法、2本鎖DNAを結合する活性を有するDNA
リガーゼを用いて検体DNAと相補的なDNAの結合反
応を繰り返してDNAを増幅するLCR(Ligase Chain
Reaction)法、検体中のRNAを標的として逆転写酵
素によるcDNAの合成反応とRNAポリメラーゼによ
るRNA合成とRNaseによるRNA/cDNAハイ
ブリット中のRNAの分解を繰り返してRNAを増幅す
るNASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplific
ation)法等が挙げられるが、本発明方法はこれらの何
れにも適用できる。
【0013】また、本発明いう核酸増幅妨害物質とは、
これらの核酸増幅反応を妨害する物質をいい、主にDN
Aポリメラーゼ等の核酸増幅に関連する酵素を失活させ
る要因となるヘモグロビン、ビリルビン等の色素、蛋白
質及び糖類等が挙げられる。
これらの核酸増幅反応を妨害する物質をいい、主にDN
Aポリメラーゼ等の核酸増幅に関連する酵素を失活させ
る要因となるヘモグロビン、ビリルビン等の色素、蛋白
質及び糖類等が挙げられる。
【0014】本発明でいう生物材料検体とは、便、血
液、痰、尿、胸水、腹水、髄液、精液、細胞、組織、生
検標本等の生体材料の他、細菌、酵母等の微生物、ウイ
ルス、培養細胞等が挙げられるが、本発明方法は、核酸
増幅妨害物質が多く含まれる便から核酸を抽出する際に
特に有用である。
液、痰、尿、胸水、腹水、髄液、精液、細胞、組織、生
検標本等の生体材料の他、細菌、酵母等の微生物、ウイ
ルス、培養細胞等が挙げられるが、本発明方法は、核酸
増幅妨害物質が多く含まれる便から核酸を抽出する際に
特に有用である。
【0015】本発明において使用する酸としては、塩
酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸、酢酸、クエン酸、フ
タル酸、フマル酸、マレイン酸等のカルボン酸、メタン
スルホン酸、p−トルエンスルホン酸などの有機スルホ
ン酸が挙げられるが、好ましくは鉱酸であり、中でも塩
酸が特に好ましい。
酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸、酢酸、クエン酸、フ
タル酸、フマル酸、マレイン酸等のカルボン酸、メタン
スルホン酸、p−トルエンスルホン酸などの有機スルホ
ン酸が挙げられるが、好ましくは鉱酸であり、中でも塩
酸が特に好ましい。
【0016】酸処理は、検体調製液にあらかじめ適当な
濃度に調製した酸液を加えるか、或いは検体調製液に適
当な濃度になるよう直接酸を加え、通常室温で1秒〜1
0分間激しく振とうさせ、更に1000〜15000回
転で1分〜30分間遠心分離を行い、上清に移行した妨
害物質を除去して核酸含有成分を採取分離することによ
り行われる。尚、酸の濃度は、用いられる酸の種類、生
物材料の種類や状態によっても異なるが、通常0.01
N〜10N、特に0.05N〜5Nが好ましい。
濃度に調製した酸液を加えるか、或いは検体調製液に適
当な濃度になるよう直接酸を加え、通常室温で1秒〜1
0分間激しく振とうさせ、更に1000〜15000回
転で1分〜30分間遠心分離を行い、上清に移行した妨
害物質を除去して核酸含有成分を採取分離することによ
り行われる。尚、酸の濃度は、用いられる酸の種類、生
物材料の種類や状態によっても異なるが、通常0.01
N〜10N、特に0.05N〜5Nが好ましい。
【0017】上記のように、生物材料検体を酸処理する
ことにより核酸増幅妨害物質を効率的に除去することが
できるが、当該酸と浸透圧調整剤を共存させることによ
り、核酸増幅妨害物質の除去効果を増大させることがで
きる。ここで、浸透圧調整剤としては、塩化リチウム、
硫酸リチウム、炭酸リチウム、硝酸リチウム、塩化ナト
リウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、硝酸ナトリ
ウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、硝
酸カリウム等のアルカリ金属塩、塩化マグネシウム、硫
酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硝酸マグネシウ
ム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウ
ム、硝酸カルシウム等のアルカリ土類金属塩類、D−グ
ルコース、D−エリトロース、D−ガラクトース、D−
マンノース、アルドヘプトース、2−デオキシヘキソー
ス、D−グルクロン酸等の単糖類、ラクトース、α,α
−トレハロース、スクロース等のオリゴ糖類等の糖類が
挙げられ、中でもアルカリ金属塩及び単糖類が好まし
く、特に塩化ナトリウム及びグルコースが好ましい。
尚、反応液中の浸透圧調整剤の濃度は、0.1〜10.
0%の範囲であり、好ましくは0.5〜2.0%、特に
好ましくは0.8%である。
ことにより核酸増幅妨害物質を効率的に除去することが
できるが、当該酸と浸透圧調整剤を共存させることによ
り、核酸増幅妨害物質の除去効果を増大させることがで
きる。ここで、浸透圧調整剤としては、塩化リチウム、
硫酸リチウム、炭酸リチウム、硝酸リチウム、塩化ナト
リウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、硝酸ナトリ
ウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、硝
酸カリウム等のアルカリ金属塩、塩化マグネシウム、硫
酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硝酸マグネシウ
ム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウ
ム、硝酸カルシウム等のアルカリ土類金属塩類、D−グ
ルコース、D−エリトロース、D−ガラクトース、D−
マンノース、アルドヘプトース、2−デオキシヘキソー
ス、D−グルクロン酸等の単糖類、ラクトース、α,α
−トレハロース、スクロース等のオリゴ糖類等の糖類が
挙げられ、中でもアルカリ金属塩及び単糖類が好まし
く、特に塩化ナトリウム及びグルコースが好ましい。
尚、反応液中の浸透圧調整剤の濃度は、0.1〜10.
0%の範囲であり、好ましくは0.5〜2.0%、特に
好ましくは0.8%である。
【0018】本発明の方法を行うに当たっては、予め適
当な濃度に調製した酸及び必要に応じて浸透圧調整剤を
含有する生物材料検体処理試薬として用いるのが好まし
い。また、当該処理試薬には、酸及び浸透圧調整剤の他
に必要に応じて緩衝液又は界面活性剤を適宜加えること
ができる。
当な濃度に調製した酸及び必要に応じて浸透圧調整剤を
含有する生物材料検体処理試薬として用いるのが好まし
い。また、当該処理試薬には、酸及び浸透圧調整剤の他
に必要に応じて緩衝液又は界面活性剤を適宜加えること
ができる。
【0019】生物材料検体からの核酸の抽出は、通常遺
伝子を含有する生物材料の溶解、蛋白及び炭水化物の除
去及び濃縮の3工程からなり、本発明の核酸抽出方法
は、当該核酸抽出操作と酸処理を組み合わせることによ
り行うことができる。従って、上記酸処理以外は公知の
核酸抽出操作を行えばよい。酸処理は、生物材料の溶
解、蛋白及び炭水化物の除去及び濃縮の何れの段階で行
ってもよいが、操作の効率性を考慮すると核酸抽出操作
の初期段階、即ち生物材料の溶解操作の前段階で行うの
が好ましい。
伝子を含有する生物材料の溶解、蛋白及び炭水化物の除
去及び濃縮の3工程からなり、本発明の核酸抽出方法
は、当該核酸抽出操作と酸処理を組み合わせることによ
り行うことができる。従って、上記酸処理以外は公知の
核酸抽出操作を行えばよい。酸処理は、生物材料の溶
解、蛋白及び炭水化物の除去及び濃縮の何れの段階で行
ってもよいが、操作の効率性を考慮すると核酸抽出操作
の初期段階、即ち生物材料の溶解操作の前段階で行うの
が好ましい。
【0020】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明
する。核酸増幅が強固に妨害される便のモデル検体を以
下のように作製し、検討を行った。なお、便は20%濃
度の便液となる様にして処理を行った。
する。核酸増幅が強固に妨害される便のモデル検体を以
下のように作製し、検討を行った。なお、便は20%濃
度の便液となる様にして処理を行った。
【0021】参考例1
一夜培養したベロ毒素1型遺伝子(VT1)を有する腸管出
血性大腸菌(E.coli)を滅菌生理食塩水で1×108 C
FU/mlに調製した。その菌液10mlと便2.5g
を混合し、モデル検体とした。このようにして調製した
モデル検体0.5mlをマイクロチューブに移し、一般
的に核酸の抽出法として用いられるフェノール・クロロ
ホルム法による処理を以下のように行なった。まず、菌
を溶菌させるために、95℃で10分間加熱した後、2
000回転、5分間の遠心分離を行い、その上清200
μlを新しいマイクロチューブに移した。このマイクロ
チューブにフェノール溶液を等量加え、30秒激しく振
とうした。10000回転、5分間の遠心分離を行い、
上清を新しいマイクロチューブに移した。このマイクロ
チューブにフェノール・クロロホルム・イソアミルアル
コール溶液(25:24:1)を等量加え、30秒激し
く振とうした。10000回転、5分間の遠心分離を行
い、上清を新しいマイクロチューブに移した。このマイ
クロチューブにクロロホルム・イソアミルアルコール溶
液(24:1)を等量加え、30秒激しく振とうした。
10000回転、5分間の遠心分離を行い、上清を新し
いマイクロチューブに移した。この溶液の1/10量の
3M酢酸ナトリウムと2.5倍量のエタノールを加え、
振とうした。−20℃で2時間冷却後、4℃、1500
0回転、10分間の遠心を行ない、DNAを沈殿させ
た。沈殿を吸わないように、上清をピペットマンなど用
いて注意深く除き、70%エタノールを1ml加え沈殿
をすすぎ、再度4℃、15000回転、5分間の遠心を
行ない、DNAを沈殿させた。上清を除去し、遠心濃縮
機(エバポレーター)などを用いて沈殿を乾燥させた。
沈殿を10mMトリス緩衝液(pH7.5)10μlに
懸濁した。これを15000回転、1分間の遠心分離を
行い、その上清1μlを核酸増幅に供した。核酸の増幅
ならびに検出はベロ毒素遺伝子検出試薬(湧永製薬株式
会社製造、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社販
売)を使用した。結果を表1に示す。なお、吸光度によ
る測定(O.D.415nm)で0.2以上の値を示したものが
陽性、それ未満は陰性である。
血性大腸菌(E.coli)を滅菌生理食塩水で1×108 C
FU/mlに調製した。その菌液10mlと便2.5g
を混合し、モデル検体とした。このようにして調製した
モデル検体0.5mlをマイクロチューブに移し、一般
的に核酸の抽出法として用いられるフェノール・クロロ
ホルム法による処理を以下のように行なった。まず、菌
を溶菌させるために、95℃で10分間加熱した後、2
000回転、5分間の遠心分離を行い、その上清200
μlを新しいマイクロチューブに移した。このマイクロ
チューブにフェノール溶液を等量加え、30秒激しく振
とうした。10000回転、5分間の遠心分離を行い、
上清を新しいマイクロチューブに移した。このマイクロ
チューブにフェノール・クロロホルム・イソアミルアル
コール溶液(25:24:1)を等量加え、30秒激し
く振とうした。10000回転、5分間の遠心分離を行
い、上清を新しいマイクロチューブに移した。このマイ
クロチューブにクロロホルム・イソアミルアルコール溶
液(24:1)を等量加え、30秒激しく振とうした。
10000回転、5分間の遠心分離を行い、上清を新し
いマイクロチューブに移した。この溶液の1/10量の
3M酢酸ナトリウムと2.5倍量のエタノールを加え、
振とうした。−20℃で2時間冷却後、4℃、1500
0回転、10分間の遠心を行ない、DNAを沈殿させ
た。沈殿を吸わないように、上清をピペットマンなど用
いて注意深く除き、70%エタノールを1ml加え沈殿
をすすぎ、再度4℃、15000回転、5分間の遠心を
行ない、DNAを沈殿させた。上清を除去し、遠心濃縮
機(エバポレーター)などを用いて沈殿を乾燥させた。
沈殿を10mMトリス緩衝液(pH7.5)10μlに
懸濁した。これを15000回転、1分間の遠心分離を
行い、その上清1μlを核酸増幅に供した。核酸の増幅
ならびに検出はベロ毒素遺伝子検出試薬(湧永製薬株式
会社製造、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社販
売)を使用した。結果を表1に示す。なお、吸光度によ
る測定(O.D.415nm)で0.2以上の値を示したものが
陽性、それ未満は陰性である。
【0022】
【表1】
【0023】表1の結果より、一般的なフェノール・ク
ロロホルム法による処理を行なった場合には、腸管出血
性大腸菌を1×108CFU/mlを含むモデル便液か
らは、ベロ毒素1型遺伝子が検出されなかった。このこ
とから、フェノール・クロロホルム法による処理では、
核酸増幅が行われず、便中の核酸増幅妨害物が十分に除
去されていないことを示している。
ロロホルム法による処理を行なった場合には、腸管出血
性大腸菌を1×108CFU/mlを含むモデル便液か
らは、ベロ毒素1型遺伝子が検出されなかった。このこ
とから、フェノール・クロロホルム法による処理では、
核酸増幅が行われず、便中の核酸増幅妨害物が十分に除
去されていないことを示している。
【0024】実施例1〜2
一夜培養したベロ毒素1型遺伝子(VT1)を有する腸管
出血性大腸菌(E.coli)を滅菌生理食塩水で1×108
CFU/mlに調製した。その菌液10mlと便2.5
gを混合し、モデル検体とした。このようにして調製し
たモデル検体0.5mlをマイクロチューブに移し、こ
れに0.8%塩化ナトリウムを含む酸液(2N塩酸又は
2N酢酸)又は生理食塩水30μl(コントロール)を
加えた。この後、マイクロチューブを激しく振とうし、
さらに、2000回転、5分間の遠心分離を行い、これ
らの上清200μlを新しいマイクロチューブに移し
た。これらの上清200μlに0.8%NaClを含む
95%のメタノールを1ml加え、激しく振とうし、さ
らに8000回転、1分間の遠心分離を行い上清を除去
して、沈渣を生理食塩水1mlに懸濁した。さらに15
000回転、1分間の遠心分離を行い上清を除去して、
沈渣を10mMトリス緩衝液(pH7.5)10μlに
懸濁した。これらを95℃で10分間加熱した後、15
000回転、1分間の遠心分離を行い、その上清1μl
を核酸増幅に供した。結果を表2に示す。
出血性大腸菌(E.coli)を滅菌生理食塩水で1×108
CFU/mlに調製した。その菌液10mlと便2.5
gを混合し、モデル検体とした。このようにして調製し
たモデル検体0.5mlをマイクロチューブに移し、こ
れに0.8%塩化ナトリウムを含む酸液(2N塩酸又は
2N酢酸)又は生理食塩水30μl(コントロール)を
加えた。この後、マイクロチューブを激しく振とうし、
さらに、2000回転、5分間の遠心分離を行い、これ
らの上清200μlを新しいマイクロチューブに移し
た。これらの上清200μlに0.8%NaClを含む
95%のメタノールを1ml加え、激しく振とうし、さ
らに8000回転、1分間の遠心分離を行い上清を除去
して、沈渣を生理食塩水1mlに懸濁した。さらに15
000回転、1分間の遠心分離を行い上清を除去して、
沈渣を10mMトリス緩衝液(pH7.5)10μlに
懸濁した。これらを95℃で10分間加熱した後、15
000回転、1分間の遠心分離を行い、その上清1μl
を核酸増幅に供した。結果を表2に示す。
【0025】
【表2】
【0026】表2の結果より、塩酸あるいは酢酸による
洗浄を行なった場合には、腸管出血性大腸菌を1×10
8CFU/ml含むモデル便液から、ベロ毒素1型遺伝
子が検出されたが、生理食塩水による洗浄ではベロ毒素
1型遺伝子が検出されなかった。このことは、酸液処理
により、便中の核酸増幅妨害物質が十分に除去されたこ
とを示す。
洗浄を行なった場合には、腸管出血性大腸菌を1×10
8CFU/ml含むモデル便液から、ベロ毒素1型遺伝
子が検出されたが、生理食塩水による洗浄ではベロ毒素
1型遺伝子が検出されなかった。このことは、酸液処理
により、便中の核酸増幅妨害物質が十分に除去されたこ
とを示す。
【0027】実施例3〜4
浸透圧調整剤の有無による検出効率の比較を行った。浸
透圧調整剤(0.8%塩化ナトリウム又は50mMグル
コース)を含む2N塩酸と浸透圧調整剤を含まない2N
塩酸(比較例)を用い、実施例1〜2と同様の処理を行
った。検体はVT1産生型の腸管出血性大腸菌を104
又は103CFU/ml含む菌液を使用した。DNA抽
出後のPCR以下の検出はベロ毒素遺伝子検出試薬を使
用した。結果を表3に示す。
透圧調整剤(0.8%塩化ナトリウム又は50mMグル
コース)を含む2N塩酸と浸透圧調整剤を含まない2N
塩酸(比較例)を用い、実施例1〜2と同様の処理を行
った。検体はVT1産生型の腸管出血性大腸菌を104
又は103CFU/ml含む菌液を使用した。DNA抽
出後のPCR以下の検出はベロ毒素遺伝子検出試薬を使
用した。結果を表3に示す。
【0028】
【表3】
【0029】表3の結果から、浸透圧調整剤として0.
8%NaCl又は50mMグルコースが含まれた場合、
103CFU/ml以上の菌量で検出が可能であった
が、浸透圧調整剤を含まないものでは104CFU/m
l以上の菌量でなければ検出がされなかった。このこと
から、浸透圧調整剤を含む試薬を用いることにより、検
出効率が良くなる。
8%NaCl又は50mMグルコースが含まれた場合、
103CFU/ml以上の菌量で検出が可能であった
が、浸透圧調整剤を含まないものでは104CFU/m
l以上の菌量でなければ検出がされなかった。このこと
から、浸透圧調整剤を含む試薬を用いることにより、検
出効率が良くなる。
【0030】実施例5
一夜培養した黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureu
s)を滅菌生理食塩水で1×104CFU/mlに調製し
た。その菌液10mlと便2.5gを混合し、モデル検
体とした。このようにして調製したモデル検体0.5m
lをマイクロチューブに移し、これに酸液または生理食
塩水30μlを加えた。酸液として0.8%NaClを
含む2N塩酸を用いた。この後、マイクロチューブを激
しく振とうし、さらに、2000回転、5分間の遠心分
離を行い、これらの上清200μlを新しいマイクロチ
ューブに移した。これらの上清200μlに0.8%N
aClを含む95%のメタノールを1ml加え、激しく
振とうし、さらに8000回転、1分間の遠心分離を行
い上清を除去して、沈渣を生理食塩水1mlに懸濁し
た。さらに15000回転、1分間の遠心分離を行い上
清を除去して、沈渣を10mMトリス緩衝液(pH7.
5)10μlに懸濁した。上記の懸濁液5μlを検体と
して、ジーンカラーmecA・spa(湧永製薬製造、ロシュ
・ダイアグノスティックス販売)を使用して黄色ブドウ
球菌に特異的な遺伝子(spa)の検出を行った。結果を
表4に示す。なお、吸光度による測定(O.D.415nm)で
0.2以上の値を示したものが陽性である。
s)を滅菌生理食塩水で1×104CFU/mlに調製し
た。その菌液10mlと便2.5gを混合し、モデル検
体とした。このようにして調製したモデル検体0.5m
lをマイクロチューブに移し、これに酸液または生理食
塩水30μlを加えた。酸液として0.8%NaClを
含む2N塩酸を用いた。この後、マイクロチューブを激
しく振とうし、さらに、2000回転、5分間の遠心分
離を行い、これらの上清200μlを新しいマイクロチ
ューブに移した。これらの上清200μlに0.8%N
aClを含む95%のメタノールを1ml加え、激しく
振とうし、さらに8000回転、1分間の遠心分離を行
い上清を除去して、沈渣を生理食塩水1mlに懸濁し
た。さらに15000回転、1分間の遠心分離を行い上
清を除去して、沈渣を10mMトリス緩衝液(pH7.
5)10μlに懸濁した。上記の懸濁液5μlを検体と
して、ジーンカラーmecA・spa(湧永製薬製造、ロシュ
・ダイアグノスティックス販売)を使用して黄色ブドウ
球菌に特異的な遺伝子(spa)の検出を行った。結果を
表4に示す。なお、吸光度による測定(O.D.415nm)で
0.2以上の値を示したものが陽性である。
【0031】
【表4】
【0032】
【発明の効果】本発明方法を用いることにより、生物材
料検体から迅速かつ簡便に核酸増幅反応を妨害する物質
を除去することができ、得られた抽出核酸を用いれば効
率的な核酸増幅を行えるため臨床診断の分野で有用であ
る。
料検体から迅速かつ簡便に核酸増幅反応を妨害する物質
を除去することができ、得られた抽出核酸を用いれば効
率的な核酸増幅を行えるため臨床診断の分野で有用であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
Fターム(参考) 4B024 AA11 AA20 CA01 HA11
4B063 QA11 QA19 QQ02 QQ04 QQ05
QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR62
QS25
Claims (8)
- 【請求項1】 核酸を含有する生物材料検体を酸処理す
ることを特徴とする核酸増幅妨害物質の除去方法。 - 【請求項2】 核酸を含有する生物材料検体から核酸を
抽出する任意の段階において、当該検体を酸処理するこ
とを特徴とする生物材料検体からの核酸抽出方法。 - 【請求項3】 酸が鉱酸である請求項1又は2記載の核
酸増幅妨害物質の除去方法又は核酸抽出方法。 - 【請求項4】 検体を更に浸透圧調整剤で処理するもの
である請求項1〜3のいずれか1項記載の核酸増幅妨害
物質の除去方法又は核酸抽出方法。 - 【請求項5】 浸透圧調整剤がアルカリ金属塩又は単糖
類である請求項4記載の核酸増幅妨害物質の除去方法又
は核酸抽出方法。 - 【請求項6】 生物材料検体が便である請求項1〜5の
いずれか1項記載の核酸増幅妨害物質の除去方法又は核
酸抽出方法。 - 【請求項7】 酸を含有することを特徴とする核酸増幅
妨害物質除去用の生物材料検体処理試薬。 - 【請求項8】 更に浸透圧調整剤を含有するものである
請求項7記載の生物材料検体処理試薬。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17725999A JP2003159056A (ja) | 1999-06-23 | 1999-06-23 | 核酸増幅妨害物質の除去方法 |
AU52470/00A AU5247000A (en) | 1999-06-23 | 2000-06-14 | Method for eliminating nucleic acid amplification inhibitors |
PCT/JP2000/003851 WO2001000813A1 (fr) | 1999-06-23 | 2000-06-14 | Procede d'elimination des inhibiteurs de l'amplification d'acide nucleique |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17725999A JP2003159056A (ja) | 1999-06-23 | 1999-06-23 | 核酸増幅妨害物質の除去方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003159056A true JP2003159056A (ja) | 2003-06-03 |
Family
ID=16027953
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP17725999A Pending JP2003159056A (ja) | 1999-06-23 | 1999-06-23 | 核酸増幅妨害物質の除去方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2003159056A (ja) |
AU (1) | AU5247000A (ja) |
WO (1) | WO2001000813A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8097414B2 (en) | 2005-11-25 | 2012-01-17 | K. K. Dnaform | Method for detecting and amplifying nucleic acid |
KR101835006B1 (ko) | 2010-09-14 | 2018-03-06 | 삼성전자주식회사 | 중합효소 연쇄 반응의 효율 및 감도를 증가시키는 방법 및 이를 위한 조성물 |
-
1999
- 1999-06-23 JP JP17725999A patent/JP2003159056A/ja active Pending
-
2000
- 2000-06-14 AU AU52470/00A patent/AU5247000A/en not_active Abandoned
- 2000-06-14 WO PCT/JP2000/003851 patent/WO2001000813A1/ja active Application Filing
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8097414B2 (en) | 2005-11-25 | 2012-01-17 | K. K. Dnaform | Method for detecting and amplifying nucleic acid |
KR101835006B1 (ko) | 2010-09-14 | 2018-03-06 | 삼성전자주식회사 | 중합효소 연쇄 반응의 효율 및 감도를 증가시키는 방법 및 이를 위한 조성물 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU5247000A (en) | 2001-01-31 |
WO2001000813A1 (fr) | 2001-01-04 |
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