DE1618857C3

DE1618857C3 - Verfahren zur Herstellung von Chondroitinpolysulfat

Info

Publication number: DE1618857C3
Application number: DE1618857A
Authority: DE
Inventors: Kinzo Tokio Nagasawa
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1966-03-01
Filing date: 1967-03-01
Publication date: 1975-01-09
Also published as: US3454560A; DE1618857B2; DE1618857A1; CH486495A; US3498972A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Chondroitinpolysulfat.

Es ist bekannt, daß Chondroitinpolysulfat mit einem geeigneten Molekulargewicht und einem geeigneten Schwefelgehalt, das durch chemische Behandlung von Chondroitinmonosulfat erhalten wurde, welches wiederum aus einer natürlichen Substanz (hauptsächlich Knorpeln von Tieren) extrahiert worden ist, verschiedene physiologische Aktivitäten besitzen kann.

Untersuchungen über die Sulfatierung von Chondroitinmonosulfat wurden von K. H. M e y e r und Mitarbeitern in HeIv. chim. Acta, 35, S. 574 bis 588 (1952), in der deutschen Patentschrift 968 752 und in der britischen Patentschrift 704 516 beschrieben. In der erstgenannten Veröffentlichung findet sich ein Bericht über die heparinoiden Aktivitäten von verschiedenen Chondroitinpolysulfaten mit verschiedenen Schwefelgehalten, wobei als Sulfatierungsmittel von Chondroitinmonosulfat (1) flüssiges SO₂ und SO₃, (2) flüssiges SO₂ und ClSO₃H, (3) Pyridin und SO₃, (4) ClSO₃H allein oder (5) Dioxan und SO₃ verwendet wurden. Die deutschen Patentschrift 968 752 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Chondroitinpolysulfat, bei welchem Chondroitinmonosulfat, z. B. mit Salzsäure, teilweise hydrolysiert wird, um dasselbe abzubauen, das abgebaute Produkt isoliert und anschließend dieses Produkt nach einem an sich bekannten Verfahren, beispielsweise mit Pyridin und ClSO₃H, sulfatiert wird.

Aus der deutschen Patentschrift 870 094 ist ein Verfahren zur Herstellung von Polyschwefelsäureestern des Chondroitins bekannt, wobei man Chondroitinschwefelsäure bei niedriger Temperatur, beispielsweise 10 bis 15°C, in Formamid mit Chlorsulfonsäure behandelt. Die Reaktion bei diesem bekannten Verfahren neigt dazu, heterogen zu werden, was leicht aus der Tatsache abzuleiten ist, daß das Lösungsmittel .Formamid kaum das Chondroitinmonosulfat und das Chondroitinpolysulfat in gleicher Weise löst, so daß es nicht möglich ist, ein Produkt von gleichförmiger und guter Qualität zu erhalten. Außerdem wird bei der Reaktion gemäß dem bekannten Verfahren Chlorwasserstoffgas gebildet, was für die Herstellung in großtechnischem Maßstab von großem Nachteil ist. Das bekannte Verfahren ist ferner auf Grund der Anwesenheit von Chlorwasserstoff und Chlorsulfonsäure nachteilig, da das gewünschte Endprodukt verschlechtert wird, so daß es praktisch unmöglich ist, in großer Ausbeute ein Produkt mit dem gewünschten hohen Molekulargewicht zu erhalten, was bezüglich der Bestimmung der heparinoiden Aktivität eine große Rolle spielt. Schließlich sind gemäß dem bekannten Verfahren komplizierte Reaktionsvorgänge und Nachbehandlungen erforderlich, die bei der Herstellung in großtechnischem Maßstab nachteilig sind.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Chondroitinpolysulfat durch Sulfatierung von Chondroitinmonosulfat zu entwickeln, bei welchem die vorstehend geschilderten Nachteile nicht auftreten und durch welches ein Produkt mit ausgezeichneten physiologischen Aktivitäten und mit einer äußerst niedrigen Toxizität in einfacher Weise hergestellt werden kann.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Chondroitinpolysulfat durch Sulfatierung von Chondroitinmonosulfat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Chondroitinmonosulfat oder eines seiner Salze bei einer Temperatur innerhalb des Bereichs von —30 bis +50⁰C in einem flüssigen Reaktionsmedium aus konzentrierter, wenigstens 85gewichtsprozentiger Schwefelsäure und gegebenenfalls bis zu 50 Gewichtsprozent eines acyclischen oder cyclischen aliphatischen Äthers mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen löst, die erhaltene Lösung bei einer Temperatur innerhalb des angegebenen Bereichs umsetzt und aus der Reaktionsmischung das gewünschte Produkt in Form des freien Esters oder eines seiner Salze gewinnt.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Chondroitinmonosulfat kann z. B. nach der Arbeitsweise von K. H. M e y e r u. a. in HeIv. chim. Acta 31, 1402 (1949), hergestellt werden. Ein typisches Monosulfat ist Chondroitin-4-sulfat (bezeichnet als Chondroitinsulfat A), das durch eine sich wiederholende Einheit der nachstehenden Formel

CH₂OH

A
HO₃SO / _H

O

\i

O j

\l Ό

H / H
NHCOCH₃

dargestellt wird und Chondroitin-6-sulfat (bezeichnet als Chondroitinsulfat C), das durch eine sich wiederholende Einheit der nachstehenden Formel

j\

COOH

OH

^Λ \

I H

OH

HO

CH₂OSO,H

A-

— Ο

H / H
NHCOCH₃

dargestellt wird. Die hier verwendete Bezeichnung »Chondroitinmonosulfat« betrifft ein Chondroitinsulfat, das in seinem Natriumsalz 6,6 Gewichtsprozent oder weniger Schwefelgehalt aufweist.

Die bei dem Verfahren der Erfindung verwendete konzentrierte Schwefelsäure reagiert unmittelbar mit Chondroitinmonosulfat als Sulfatierungsmittel und dient gleichzeitig als Lösungsmittel für den Reaktionsteilnehmer und das Reaktionsprodukt. Die zu verwendende konzentrierte Schwefelsäure muß wenigstens 85 Gewichtsprozent H₂SO₄ enthalten. Je höher der Wassergehalt ist, um so geringer wird die Sulfatierungswirksamkeit, und es findet lediglich eine Depolymerisation statt; daher ist die Verwendung einer konzentrierten Schwefelsäure mit einem Gehalt von wenigstens 95 Gewichtsprozent H₂SO₄ besonders vorteilhaft. Bei Verwendung einer Schwefelsäure mit einer Konzentration unterhalb etwa 75 Gewichtsprozent findet keine wesentliche Sulfatierung statt, sondern es ist lediglich ein Fortschreiten der Depolymerisation zu beobachten.

Der Einfluß der Reaktionstemperatur bei dem Verfahren der Erfindung ist wesentlich und betrifft lediglich die Depolymerisation. Je höher die Reaktionstemperatur ist, um so mehr schreitet die Depolymerisation fort. Im Gegensatz dazu scheint die Schwefelsäureveresterung durch die Reaktionstemperatur nicht wesentlich beeinflußt zu werden. Eine Reaktionstemperatur oberhalb 50⁰C muß vermieden werden, da eine unerwünschte Carbonisierung und Zersetzung des Chondroitinmonosulfats und des Produkts dadurch beschleunigt werden. Wenn die Sulfatierung insbesondere unter Hemmung der Erniedrigung des Molekulargewichts bis auf einen geringen Grad ausgeführt wird, wird vorzugsweise eine Reaktionstemperatur von —30 bis —20⁰C verwendet. Bei einer Reaktion, die bei einer so tiefen Temperatur ausgeführt wird, ist es, um das Reaktionsmedium im flüssigen Zustand zu halten, erforderlich, den Gefrierpunkt der konzentrierten Schwefelsäure zu erniedrigen. Zu diesem Zweck wird der konzentrierten Schwefelsäure ein aliphatischer Äther mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen in angemessener Menge von bis zu 50 Gewichtsprozent, bezogen auf das flüssige Reaktionsraedium, zugesetzt. Beispiele für geeignete Äther sind acyclische aliphatische Äther, wie Diäthyläther, Diisopropyläther, Di-n-propyläther und Äthylenglykoldimethyläther sowie cyclische aliphatische Äther, wie Tetrahydrofuran und Dioxan.

Wenn z. B. Chondroitin-6-sulfat (mittleres Molekulargewicht: 67 200) mit konzentrierter Schwefelsäure bei einer Temperatur von —6 bis -7⁰C während 2 Stunden umgesetzt wird, werden zwei Fraktionen, die jeweils einen dem Chondroitindisulfat entsprechenden Sulfatgehalt und ein mittleres Molekulargewicht von etwa 10 000 bzw. 4000 aufweisen, erhalten. Im Gegensatz dazu wird bei Umsetzung von Chondroitin-6-sulfat in konzentrierter Schwefelsäure mit einem Gehalt von 14% Tetrahydrofuran bei -3O⁰C während der gleichen Zeitdauer eine Fraktion mit einem Schwefelgehalt entsprechend dem Chondroitindisulfat und einem mittleren Molekulargewicht von etwa 50 000 erhalten.

Die Reaktionsdauer bei dem Verfahren der Erfindung übt anscheinend einen Einfluß auf den Abbau und den Grad der Schwefelsäureveresterung aus. Bei dem Verfahren, bei welchem Chondroitinmonosulfat konzentrierter Schwefelsäure zugesetzt und unter gleichförmiger Dispergierung gelöst wird, scheint die primäre Schwefelsäureveresterung und eine Erniedrigung des Molekulargewichts fortzuschreiten, worauf im Verlauf der Zeit die sekundäre Schwefelsäureveresterung und Erniedrigung des Molekulargewichts stattfinden. Wenn z. B. Chondroitinmonosulfat (mittleres Molekulargewicht 67 200) mit konzentrierter Schwefelsäure umgesetzt wird, werden nach Verlauf von 1 Stunde bei einer Reaktionstemperatur von 4 bis 5°C die Reaktionsprodukte von zwei Fraktionen mit jeweils einem Schwefelgehalt, entsprechend dem Chondroitindisulfat, und einem mittleren Molekulargewicht von 7000 bzw. 3400 erhalten, während nach Verlauf von 5 Stunden ein Reaktionsprodukt mit einem Schwefelgehalt, entsprechend dem Chondroitintetrasulfat, und einem mittleren Molekulargewicht von 2200 erhalten wird. Das heißt die Reaktionsdauer beeinflußt sowohl die Schwefelsäureveresterung als auch die Erniedrigung des Molekulargewichts, und zwar in besonderem Maße das Fortschreiten der Schwefelsäureveresterung.

Nach Vervollständigung der Umsetzung ist es besonders wichtig, das gewünschte Produkt von der Reaktionsmischung in wirksamer Weise abzutrennen.

Es wurde gefunden, daß bei Zusatz einer ausreichenden Menge eines aliphatischen Äthers mit einem Gehalt bis zu 8 Kohlenstoffatomen zu der Reaktionsmischung, während diese gekühlt wird, das gewünschte Produkt als freier Ester nahezu quantitativ ausfällt.

Beispiele für geeignete aliphatische Äther sind die gleichen, wie vorstehend als Gefrierpunktserniedrigungsmittel für die konzentrierte Schwefelsäure angegeben. Beispielsweise wird diese Ausfällung durch Filtrieren durch ein Glasfilter oder durch Zentrifugalkraft abgetrennt. Wenn die abgetrennte Ausfällung mit dem gleichen Äther gewaschen wird, erhält man ein nahezu reines Chondroitinpolysulfat in Form eines freien Esters. Da dieser eine hygroskopische

5 6

und stark saure Substanz ist, die zur Zersetzung neigt, droitintrisulfat in der 2- oder 3-Stellung der D-GIu-

wird diese zweckmäßig durch Neutralisation des curonsäureeinheit vorliegt. In ähnlicher Weise werden

freien Esters augenblicklich mit einer geeigneten die dritte und vierte Sulfatgruppe des Tetrasulfats

Base (Alkali- und Erdalkalihydroxyden, Alkali- und in der 2-Stellung und der 3-Stellung der D-Glucuron-

Erdalkalicarbonaten und organischen Basen) in ein 5 säureeinheit angenommen.

Salz übergeführt. Ein weiteres Merkmal des nach dem Verfahren

Gemäß einer anderen Arbeitsweise zur Abtrennung der Erfindung erhaltenen Produkts ist die gleichdes gewünschten Produkts aus dem Reaktionsgemisch förmige Verteilung von Schwefel unter den Molewird dieses in einer großen überschüssigen Menge külen und die Homogenität der Molekulargewichtsvon kaltem Wasser oder einer wäßrigen Lösung einer io verteilung. Wenn Natriumchondroitinpolysulfat, das alkalischen Verbindung, z. B. eines Alkalihydroxyds nach dem Verfahren der Erfindung erhalten wurde, oder -carbonate, gelöst, anschließend aus der wäßrigen dialysiert wird, wird in einem bestimmten Fall eine Lösung die darin vorhandenen anorganischen Schwe- aus dem Dialysierfilm austretende Fraktion von gefelsäureionen durch Dialyse oder durch Ausfällen, ringem Molekulargewicht und in einem gewissen beispielsweise als Bariumsulfat, abgetrennt. Bei Kon- 15 anderen Fall eine den Dialysierfilm durchschreitende zentrierung der auf diese Weise von anorganischen Fraktion von geringem Molekulargewicht neben einer Schwefelsäureionen befreiten Lösung und anschlie- Fraktion von hohem Molekulargewicht, die nicht Bender Zugabe eines Nichtlösungsmittels für das durch den Dialysierfilm hindurchgeht, erhalten. Jede Produkt, beispielsweise von Äthanol, kann das ge- dieser Fraktionen wirkt bei der Papierelektrophorese wünschte Produkt gewonnen werden. Dieses Ge- 20 als unterscheidbare Einzelkomponente, woraus erwinnungsverfahren für das Produkt ist vorteilhaft zur sichtlich ist, daß jede Fraktion eine Verhältnis-Abtrennung des Produkts aus dem Reaktionsgemisch, mäßig gleichförmige Molekulargewichtsverteilung und das unter Anwendung einer möglichst geringen Menge Schwefelverteilung unter den Molekülen aufweist, an konzentrierter Schwefelsäure erhalten wurde. So Diese Homogenitäten können durch Ionenaustauschkann gemäß einer besonders bevorzugten Ausfüh- 25 Chromatographie und Gelfiltration bestätigt werden, rungsform der Erfindung Chondroitinpolysulfat da- In unerwarteter Weise wurde gefunden, daß das durch erhalten werden, daß man Chondroitinmono- nach dem Verfahren der Erfindung erhaltene Produkt sulfat oder dessen Salz mit 200 bis 400 Volumteilen, eine überlegene Blut-Antikoagulanz-Aktivität in vitro bezogen auf 100 Gewichtsteile des Chondroitinmono- und in vivo und eine geringere Toxizität, verglichen sulfats, eines flüssigen Reaktionsmediums mischt, in 30 mit dem Produkt mit einem im wesentlichen gleichen welchem wenigstens 50 Gewichtsprozent konzentrierte Schwefelgehalt und mittlerem Molekulargewicht, das Schwefelsäure mit einer Konzentration von wenig- nach dem üblichen Verfahren (einem Sulfatierungsstens 85 Gewichtsprozent bei einer Temperatur inner- verfahren mittels Pyridin-C1SO₃H) erhalten wurde, halb des Bereichs von —30 bis +50⁰C vorliegt. Die aufweist.

erhaltene viskose Paste wird bei einer Temperatur 35 Die Erfindung wird nachstehend an Hand von Beiinnerhalb des angegebenen Bereichs umgesetzt, das spielen näher erläutert,
erhaltene Reaktionsgemisch in einer überschüssigen . -I₁
Menge Wasser gelöst, die darin vorhandenen anorga- Beispiel
nischen Schwefelsäureionen aus der wäßrigen Lösung 50 ml technische konzentrierte Schwefelsäure erster entfernt und das gewünschte Produkt abgetrennt. 40 Qualität mit einer Konzentration von mindestens Das Reaktionsmedium kann aus konzentrierter Schwe- 95% wurden auf eine Temperatur von 4 bis 5° C gefeisäure mit einer Konzentration von wenigstens kühlt, worauf 5 g Natriumchondroitin-6-sulfat (mitt-85 Gewichtsprozent, sofern diese bei der Reaktions- leres Molekulargewicht 67 200) zugegeben und gelöst temperatur flüssig ist, oder aus einem Gemisch der wurden. Die Mischung wurde bei der gleichen Temkonzentrierten Schwefelsäure und bis zu 50 Gewichts- 45 peratur während einer Stunde unter Rühren umgesetzt, prozent des vorstehend angegebenen aliphatischen Anschließend wurden dem bei einer Temperatur von Äthers bestehen. —5 bis 0⁰C gehaltenen Reaktionsgemisch 250 ml

Der Schwefelgehalt in einem nach dem Verfahren Äthyläther zugesetzt, um das Reaktionsprodukt aus-

der Erfindung erhaltenen Natriumsalz von Chon- zufallen. Nach dem Abfiltrieren der Ausfällung durch

droitinpolysulfat kommt einem Wert entsprechend 50 ein Glasfilter und Waschen mit Äthyläther wurde

dem Disulfat (10,6%), Trisulfat (13,5%) oder Tetra- Chondroitinpolyschwefelsäure in Form eines weißen

sulfat (15,8 %) sehr nahe. Es wird aus dieser Tatsache hygroskopischen Pulvers erhalten, das in kaltem Was-

geschlossen, daß der Schwefelgehalt des Produkts ser gelöst wurde. Der pH-Wert der Lösung wurde mit

von dem Reaktionsbedingungen abhängt und je Natriumhydroxydlösung auf 6,5 eingestellt, worauf

nach den angewandten Bedingungen hauptsächlich 55 unter Verwendung einer Dialysefolie oder eines Di-

das Disulfat, hauptsächlich das Trisulfat oder haupt- alysefilms (technisch erhältlicher Dialyse-Zellglas-

sächlich das Tetrasulfat gebildet wird. Das nach dem schlauch 36/32) die Lösung in destilliertem Wasser di-

Verfahren der Erfindung erhaltene Disulfat wird als alysiert wurde (wobei alle 24 Stunden 3mal je 300 ml

Chondroitin-4,6-disuIfat angenommen, da durch In- destilliertes Wasser ersetzt wurden). Die Flüssigkeit

frarotanalyse bekannt ist, daß ein aus Chondroitin- 60 innerhalb des Dialysefilms oder der Dialysefolie wurde

6-sulfat erhaltenes Disulfat und ein aus Chondroitin- unter vermindertem Druck konzentriert und filtriert,

4-sulfat erhaltenes Disulfat im wesentlichen die gleiche die sich ergebende Flüssigkeit (etwa 30 ml) mit 150 ml

Struktur aufweisen. Diese Tatsache bedeutet ferner, Äthanol zur Abtrennung einer Ausscheidung versetzt,

daß die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen die erhaltene Ausfällung durch ein Filter filtriert und

Produkte die Sulfatgruppen in einer innermolekularen 65 nacheinander mit Äthanol und Äthyläther gewa-

Homogenität verteilt enthalten. Es wird angenommen, sehen, wobei Natrium-chondroitinpolysulfat in Fonr

daß die Stellung einer dritten Sulfatgruppe in dem eines weißen Pulvers erhalten wurde. Das Pulver wurde

nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Chon- bei 85° C unter vermindertem Druck während 2 Stun-

7 8

den getrocknet. Die Ausbeute betrug 2,4 g, der Schwe- Beispiel 3

felgehalt war 11,35%. Das Produkt besaß ein mittleres

Molekulargewicht (gemäß der Endgruppenanalyse) 100 ml handelsübliche konzentrierte Schwefelsäure

von .7010. erster Qualität, deren Konzentration wenigstens 95%

Die Flüssigkeit außerhalb des Dialysefilms (etwa 5 betrug, wurden auf eine Temperatur von—7 bis—8° C

900 ml) wurde mit Bariumacetatlösung zur Ausfällung gekühlt. Sodann wurden 10 g Natriumchondroitin-

von anorganischen Schwefelsäureionen als Barium- 6-sulfat (mittleres Molekulargewicht 67 200) zuge-

sulfat versetzt, und der Niederschlag wurde abzentri- geben und gelöst. Die Mischung wurde bei dieser Tem-

fugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit unter peratur während 45 Minuten unter Rühren umgesetzt,

vermindertem Druck bis auf eine Menge von etwa io Anschließend wurden dem auf einer Temperatur un-

30 ml konzentriert wurde. Nach dem Abtrennen einer terhalb —5°C gehaltenen Reaktionsgemisch 500 ml

geringen Menge an Verunreinigungen durch Filtration Äthyläther zugegeben, um das Reaktionsprodukt aus-

oder Zentrifugieren der konzentrierten Flüssigkeit zufallen. Nach der Filtration der Ausfällung durch ein

wurde die Flüssigkeit mit 240 ml Äthanol versetzt, Glasfilter und Waschen mit Äthyläther wurde Chon-

um eine Ausfällung abzutrennen. Nach der Filtration 15 droitinpolyschwefelsäure in Form eines weißen hy-

der Ausfällung durch ein Filter und aufeinander- groskopischen Pulvers erhalten. Das Pulver wurde

folgendes Wischen mit Äthanol und Äthyläther wurde in kaltem Wasser gelöst, der pH-Wert wurde mit Na-

Natriumchondroitinpolysulfat in Form eines Weißen triumhydroxydlösung auf 6,5 eingestellt, worauf unter

Pulvers erhalten, das bei 85° C unter vermindertem Verwendung eines Dialysefilms (im Handel erhält-

Druck während 2 Stunden getrocknet wurde. Die 20 licher Dialyse-Zellglasschlauch 36/32) die wäßrige

Ausbeute betrug 1,85 g. Der Schwefelgehalt war Lösung in destilliertem Wasser dialysiert wurde

11,69 %. Das Produkt besaß ein mittleres Molekular- (3mal jeweils 500 ml destilliertes Wasser wurden alle

gewicht (auf Grund der Endgruppenanalyse) von 24 Stunden ersetzt).

3420. Die Flüssigkeit innerhalb des Dialysefilms oder der

25 Dialysefolie wurde "unter vermindertem Druck kon-

Beispiel 2 zentriert und filtriert und die sich ergebende Flüssigkeit (etwa 50 ml) mit 300 ml Äthanol zur Abtrennung

50 ml handelsüblicher konzentrierter Schwefelsäure einer Ausscheidung versetzt, anschließend die Auserster Qualität, deren Konzentration wenigstens 95 % fällung mit einem Filter filtriert und mit Äthanol und betrug, wurden auf eine Temperatur von 4 bis 5°C 30 Äthyläther nacheinander gewaschen. Man erhielt Nagekühlt. Sodann wurden 5 g Natriumchondroitm- triumchondroitinpolysulfat in Form eines weißen 6-sulfat (mittleres Molekulargewicht 67 200) züge- Pulvers. Das Pulver wurde bei 85⁰C während 2 Stungeben und gelöst. Die Mischung wurde bei dieser den unter vermindertem Druck getrocknet. Die AusTemperatur während 4 Stunden unter Rühren umge- beute betrug 7,6 g, der Schwefelgehalt war 11,10 %. setzt. Anschließend wurden dem bei einer Temperatur 35 Das Produkt besaß ein mittleres Molekulargewicht von —5 bis 0⁰C gehaltenen Reaktionsgemisch 250 ml (gemäß der Endgruppenanalyse) von 10 540.
Äthyläther zugegeben, um das Reaktionsprodukt Die Flüssigkeit außerhalb des Dialysefilms (1500ml) auszufällen. Nach der Filtration der^Ausfällung durch wurde mit Bariumacetatlösung zur Ausfällung von ein Glasfilter und Waschen mit Äthyläther wurde anorganischen Schwefelsäureionen als Bariumsulfat Chondroitinpolyschwefelsäure in Form eines grau- 40 versetzt, und das Sulfat wurde abzentrifugiert, worauf weißen hygroskopischen Pulvers erhalten. Das Pulver die überstehende Flüssigkeit unter vermindertem wurde in kaltem Wasser gelöst, der pH-Wert der Druck bis auf eine Menge von etwa 30 ml konzen-Lösung wurde mittels Natriumhydroxydlösung auf triert wurde. Nach der Entfernung einer geringen 6,5 eingestellt, worauf unter Verwendung eines Di- Menge an Verunreinigungen durch Filtration oder alysefilms (im Handel erhältlicher Dialyse-Zellglas- 45 Zentrifugieren der konzentrierten Flüssigkeit wurde schlauch 36/32) die Lösung in destilliertem Wasser die Flüssigkeit mit 250 ml Äthanol versetzt, um eine dialysiert wurde (alle 24 Stunden wurden 3mal je Ausfällung abzutrennen. Nach Filtration der Aus-300 ml destilliertes Wasser ersetzt). In der Flüssigkeit fällung durch ein Filter und aufeinanderfolgendes innerhalb des Dialysefilms lag keine Chondroitinpoly- Waschen mit Äthanol und Äthyläther wurde Naschwefelsäure vor. Die Flüssigkeit außerhalb des Di- 50 triumchondroitinpolysulfat in Form eines weißen alysefilms (etwa 900 ml) wurde mit Bariumacetat- Pulvers erhalten, das bei 85° C während 2 Stunden lösung versetzt, um anorganische Schwefelsäureionen unter vermindertem Druck getrocknet wurde. Die als Bariumsulfat auszufällen. Nach dem Abzentri- Ausbeute betrug 2,05 g, der Schwefelgehalt war fugieren der Ausfällung wurde die überstehende 10,28% und das Produkt besaß ein mittleres Mole-Flüssigkeit unter vermindertem Druck bis auf Menge 55 kulargewicht (auf Grund der Endgruppenanalyse) von etwa 40 ml konzentriert. Nach Entfernung einer von 3360.

geringen Menge an Verunreinigungen durch Filtration B e i s t) i e 1 4
oder Zentrifugieren der konzentrierten Flüssigkeit

wurde die Flüssigkeit mit 300 ml Äthanol versetzt, 50 ml handelsübliche konzentrierte Schwefelsäure um die Ausfällung abzutrennen. Nach Filtration der 60 erster Qualität mit einer Konzentration von minde-

Ausfällung mit einem Filter und aufeinanderfolgendes stens 95% wurden auf eine Temperatur von —6 bis

Waschen mit Äthanol und Äthyläther wurde Natrium- —7° C gekühlt, worauf 5 g Natriumchondroitin-

chondroitinpolysulfat in Form eines weißen Pulvers 4-sulfat (mittleres Molekulargewicht 36 970). zuge-

erhalten, das bei 85°C unter vermindertem Druck geben und gelöst wurden. Die Mischung wurde bei während 2 Stunden getrocknet wurde. Die Ausbeute 65 der gleichen Temperatur während 2 Stunden unter

betrug 4,1g. Der Schwefelgehalt war 15,35%. Das Rühren umgesetzt. Anschließend wurden dem auf

Produkt besaß ein mittleres Molekulargewicht (auf einer Temperatur von unterhalb —5°C gehaltenen

Grund der Endgruppenanalyse) von 2200. Reaktionsgemisch 250 ml Äthyläther zugesetzt, um

9 ίο

das Reaktionsprodukt auszufällen. Nach dem Ab- gehalten. Dieser Mischung wurden 5 g Natriumchon-

filtrieren der Ausfällung durch ein Glasfilter und droitin-6-sulfat (mittleres Molekulargewicht 67 200)

Waschen mit Äthyläther wurde Chondroitinpoly- zugegeben und die Mischung bei der vorstehend an-

schwefelsäure in Form eines weißen hygroskopischen gegebenen Temperatur während 2 Stunden unter

Pulvers erhalten, das in kaltem Wasser gelöst wurde. 5 Rühren umgesetzt. Anschließend wurde das Reak-

Der pH-Wert der Lösung wurde mit einer Natrium- tionsgemisch bei —30° C mit 400 ml Äthyläther zur

hydroxydlösung auf 6,5 eingestellt, worauf unter Ver- Ausfällung des Reaktionsprodukts versetzt. Nach

Wendung einer Dialysefolie oder eines Dialysefilms dem Abfiltrieren der Ausfällung durch ein Glasfilter

(im Handel erhältlicher Dialyse-Zellglasschlauch 36/32) und Waschen mit Äthyläther ,wurde- Ghbnär'oitihpoly-

die wäßrige Lösung in destilliertem Wasser dialysiert io schwefelsäure in Form eines weißen hygroskopischen

wurde (wobei 3mal jeweils 300 ml destilliertes Wasser Pulvers erhalten. Dieses Pulver wurde in kaltem

alle 24 Stunden ersetzt wurden). Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit

Die Flüssigkeit innerhalb des Dialysefilms wurde einer Natriumhydroxydlösung auf 6,5 eingestellt, wo-

unter vermindertem Druck konzentriert und filtriert rauf unter Verwendung einer Dialysefolie oder eines

und die sich ergebende Flüssigkeit (etwa 30 ml) mit 15 Dialysefilms (im Handel erhältlicher Dialyse-Zellglas-

150 ml Äthanol zur Abtrennung einer Ausfällung ver- schlauch 36/22) die wäßrige Lösung in destilliertem

setzt und anschließend die _ erhaltene Ausfällung Wasser (500 ml) dialysiert wurde. In der Flüssigkeit

filtriert und nacheinander mit Äthanol und Äthyläther außerhalb des Dialysefilms befand sich keine Chon-

gewaschen. Dabei erhielt man Natriumchondroitin- droitinschwefelsäure.

polysulfat in Form eines weißen Pulvers, das bei 85° C ao Die Flüssigkeit innerhalb des Dialysefilms wurde

während 2 Stunden unter vermindertem Druck ge- bei vermindertem Druck konzentriert und filtriert, der

trocknet wurde. Die Ausbeute betrug 3,2 g. Der filtrierten Flüssigkeit (etwa 40 ml) wurden zur Ab-

Schwefelgehalt war 10,70%. Das Produkt besaß ein trennung der Ausfällung 200 ml Äthanol zugegeben,

mittleres Molekulargewicht (gemäß der Endgruppen- Nach_aufeinanderfolgendem Waschen der Ausfällung

analyse) von 10 960. 35 mit Äthanol und Äthyläther wurde Natriumchon-

Die Flüssigkeit außerhalb des Dialysefilms (etwa droitinpolysulfat in Form eines weißen Pulvers er-

900 ml) wurde mit Bariumacetatlösung zur Ausfällung halten, das bei 85° C unter vermindertem Druck

von anorganischen Schwefelsäureionen als Barium- während 2 Stunden getrocknet wurde. Ausbeute: 4,1g;

sulfat versetzt Die Fällung wurde abzentrifugiert, Schwefelgehalt: 9,57%, Mittleres Molekulargewicht

worauf die überstehende Flüssigkeit unter verminder- 30 (auf Grund der Endgruppenanalyse): 48 690.

tem Druck bis auf eine Menge von etwa 30 ml kon- ' . . . ,

zentriert wurde. Nach der Entfernung einer geringen Beispiel

Menge an Verunreinigungen durch Filtrieren oder 10 ml (18,5 g) handelsübliche konzentrierte Schwe-

Zentrifugieren der konzentrierten Flüssigkeit wurde feisäure erster Qualität wurden auf eine Temperatur

die Flüssigkeit mit 250 ml Äthanol versetzt, um eine 35 unterhalb 0°C gekühlt und bei Zugabe von 5 g Na-

Ausfällung abzutrennen. Nach Filtration der Aus- triumchondroitin-6-sulfat und gleichförmigem Mi-

fällung durch ein Filter und aufeinanderfolgendes sehen wurde eine trübe viskose Paste erhalten, die

Waschen mit Äthanol und Äthyläther wurde Natrium- durchsichtig wurde, nachdem sie 30 Minuten auf

chondroitinpolysulfat in Form eines weißen Pulvers einer Temperatur zwischen 0 und —2° C gehalten

erhalten, das bei 85° C unter vermindertem Druck 4° wurde. Diese durchsichtige Paste wurde 30 Minuten

während 2 Stunden getrocknet wurde. Die Ausbeute auf der gleichen Temperatur gehalten, anschließend

betrug 1,05 g. Der Schwefelgehalt war 11,05%. Das in einer kalten 5 %igen wäßrigen NaOH-Lösung gelöst,

Produkt besaß ein mittleres Molekulargewicht (auf um aus der Paste eine wäßrige Lösung mit einem

Grund der Endgruppenanalyse) von 4150. pH-Wert von ungefähr 6,5 zu bilden.

. . 45 Anschließend wurden gemäß der im Beispiel 1 be-

ispiel schriebenen Dialysierungsvorgänge Natriumchondroi-

75 ml handelsübliche konzentrierte Schwefelsäure tinpolysulfat mit einem mittleren Molekulargewicht

erster Qualität mit einer Konzentration von minde- von 10 280 (Ausbeute: 2,9 g, Schwefelgehalt: 10,81 %)

stens 95% wurden mit 25 ml Tetrahydrofuran ver- und Natriumchondroitinpolysulfat mit einem mittleren

setzt. Danach wurde die Mischung mit Trockeneis- 50 Molekulargewicht von 3110 (Ausbeute: 1,6 g, Schwe-

Aceton gekühlt und die Innentemperatur bei —30° C felgehalt: 10,89%) erhalten.

Claims

Patentanspruch:

. Verfahren zur Herstellung von Chondroitinpolysulfat durch Sulfatierung von Chondroitinmonosulfat, dadurch gekennzeichnet, daß man Chondroitinmonosulfat oder eines seiner Salze bei einer Temperatur innerhalb des Bereichs von —30 bis +50⁰C in einem flüssigen Reaktionsmedium aus konzentrierter, wenigstens xo 85gewichtsprozentiger Schwefelsäure und gegebenenfalls bis zu 50 Gewichtsprozent eines acyclischen oder cyclischen aliphatischen Äthers mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen löst, die erhaltene Lösung bei einer Temperatur innerhalb des angegebenen Bereichs umsetzt und aus der Reaktionsmischung das gewünschte Produkt in Form des freien Esters oder eines seiner Salze gewinnt.