DD136572B1 - Verfahren zur herstellung eines therapeutisch wirksamen mukopolysaccaridpolyschwefelsaeureesters aus rinder-trachea - Google Patents
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Description
Titel der Erfindung
Verfahren zur Heratellung einea therapeutiach wirksamen Mukopolysaccharidpolyschwefelsäureestera aua Rinder-Trachea
Anwendungagebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herateilung einea therapeutiach wirksamen Mukopolyaaccharidpolyachwefelsäureeatera aus Rinder-Trachea, der ala pharmazeutiachea Präparat zur Behandlung von Gelenkerkrankungen geeignet ist und inabeaondere intraartikulär injizierbar ist.
Charakteristik der bekannten techniechen Lösungen
Es ist bekannt, daß Mukopolyaaccharidpolyschwefölsäureester mit blutgerinnungshemmender und/oder lipolytischer (antilipämiacher) Wirkung durch Sulfatierung tierischer oder pflanzlicher Polysaccharide gewonnen werden können (Pharm· Praxis 12. 281 (1969)).
Obwohl die entsprechenden Verfahren häufig technisch aufwendige Reinigungsstufen, wie enzymatische Abbauschritte mit Papain, Trypsin, Hyaluronidase oder Bakterienproteasen enthalten, sind die bisher bekannten Präparate in der Regel auf Grund ihrer zu hohen Heparinoidwirkung oder ihrer sonstigen Zusammensetzung zur Therapie von Gelenkerkrankungen in Bezug auf Wirkung und Verträglichkeit ungeeignet, was sich besonders bei intraartikulärer Injektion zeigt,
Bs sind bereits Verfahren zur Isolierung saurer Mukopolysaccharide bekannt (DT-OS 1.492.017, DT-OS 1.467.810, BE 843.095, JA 031353, JA 076160, JA 123444), die jedoch zur intraartikulären Injektion bei Gelenkerkrankungen nicht verwendbar sind.
Uach der DT-OS 1.492.017 werden saure Polysaccharide aus Knochen- oder Knorpelgewebe gewonnen durch eine Extraktion mit einer wäßrigen schwach alkalischen Lösung von Äthylendiamintetraessigsäure, Behandlung der Extrakte bei. pH 5 mit einem Kationenaustauacherharz IR 50 und einem enzymatischen Abbau der unlöslichen Rückstände mittels Papain und Trypsin sowie anschließender Ausfällung der sauren Polysaccharide mit quarternären Ammoniumverbindungen.
Weiterhin wurde Duodenal-Heparinoid mit antilipämischer Wirkung durch fraktionierte Fällung mit quarternären Ammoniumsalzen bzw· Zinkchlorid nach der DT-OS 1.467.810 gereinigt. Chondroitinsulfate wurden durch die Behandlung von Knorpel mit Pepsin und Papain (BE 843.095), einer Kulturlösung von Serratia oder Вас. subt. (JA 031.353), durch eine Behandlung von Tierhaut mit Lipase, Pronase und einer Dowex-1-Chromatografie (JA 076.160) bzw. durch eine Reinigung mittels Chromatografie an einem grobporigen, stark basischen Anionenaustauscher (JA 123.444) gewonnen.
Auch die nach den japanischen Patenten Hr. 7000 156-R (Derwent 04390 R), Hr. 7001 445 (Derwent 06504 R), Hr. 7004 734 (Derwent 14519 R), Hr. 7314 078 (Derwent 25548 U) erhaltenen niedermolekularen Chondroitinpolyaulfate (MG 400-5000), die durch eine ca. 10-atündige Behandlung von Chondroitinsulfat (MG 400-4000) mit Chloraulfonsäure in Pyridin oder Formamid mit anschließender Alkalisierung, Wasserdampfdestillation oder Behandlung mit einem Kationenaustauscherharz bzw. durch Depolymerisation von Chondroitinpolyaulfat mittels Chondroitinase und fraktionierte Ausfällung mit organischen Lösungsmitteln gewonnen werden, besitzen zwar eine hohe antilipämische und damit eine anti-arteriosklerotische Wirkung, eine Eignung zur Eehandlung von Gelenkerkrankungen ist jedoch nicht bekannt.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat zum Ziel, einen Mukopolyaaccharidpolyschwefelaäureester zu gewinnen, der als Therapeutikuin bei degenerativen Gelenkerkrankungen direkt in die Gelenkkapsel injiziert werden kann·
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines hochgereinigten Mukopolyeaccharidpolyschwefelsäureesters, der frei von unverträglichen Polyaaccharid- und Prcteinanteilen ist, zu entwickeln.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß man zur Herstellung eines therapeutisch wirksamen und gelenksverträglichen Präparates zur Abtrennung störender höhermolekularer PoIysaccharid- und Proteinanteile eine Mukopolysaccharid-Fraktion durch Alkoholfraktionierung eines in bekannter Weise aus Rindertrachea mittels alkalischer Extraktion gewonnenen rohen Mukopolysaceharidgemisches isoliert, vorzugsweise durch Ausfällung einer i'orfraktion bei pH 1-2 und 20 0C mit einer Äthanolkonzentration von 30-34 VoI.%, die verworfen wird und nachfolgender Ausfällung der gewünschten Mukopolysaccharid-Fraktion mit einer Äthanolkonzentration von 70-74 VoI,%, und diese zur Abtrennung niedermolekularer Anteile nach partieller Hydrolyse und Sulfatierung in Form einer 5%igan wäßrigen Lösung von pH 9-1O bei 20 0C Über Hohlfaaern oder Membranen mit einer Ausschlußgrenze von MG 5000 dialysiert, wobei die partielle Hydrolyse mit Salzsäure und die Sulfatierung mittels Chlorsulfonsäure in Formamid in bekannter Weise durchgeführt wird, und mit einem stark sauren Kationonaustauscher reinigt und mit Wasserstoffperoxid entfärbt.
Der erhaltene Mukopolysaccharidpolyschwefeleäureester (MPS) besitzt einen Schwefelgehalt von 11-13,5 %, einen Stickstoffgehalt von 1,7-2,2 %f einen Uronsäuregehalt von 20-26 % sowie eine gerinnungshemraende Aktivität von weniger als 15 ΙΕ/mg, verglichen mit Standard-Heparin.
Nach 12-maliger Injektion von je 0,2 ml einer Lösung von 50 mg MPS/ml in das rechte Kniegelenk der Hinterextremitäten von Kaninchen (3 Injektionen pro Woche) trat keine entzündliche Reaktion der Gelenkkapsel auf·
Bei 10-maliger intraartikulärer Injektion von je 50 mg/1 ml am Menschen erwies sich das Präparat als gut verträglich und wirksam bei degenerativen Kniegelenkerkrankmigcn·
Ausführungsbeispiele
10 kg frische Rinder-Luftröhren wurden im Fleischwolf zerkleinert und 3-mal mit 35 1 Azeton bei Raumtemperatur (20 0C) 3 Stunden lang geriihrt, wobei im Anschluß daran jeweils Über ein grobes Sieb filtriert wurde. Das grobfasrige Tracheapulver wurde an der Luft getrocknet. Ausbeute: 2,150 kg
2 kg trockenes Tracheapulver wurden mit 600 g Ätznatron und 15 1 Wasser 20 Stunden bei 15 0C unter gelegentlichem Umrühren aufgeschlossen. Anschließend wurde mit 3,9 1 18%iger Salzsäure auf pH 1 eingestellt und zentrifugiert. Das klare Zentrifugat (16 1) wurde mit 48 1 Äthanol versetzt. Wach einer 15-stündigen Standzeit bei -4 0C wurde der Niederschlag abzentrifugiert, mit Alkohol und Aceton ausgewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet. Ausbeute: 203,4 g rohes Mukopolysaccharidgemisch
200 g rohes Mukopolysaccharidgemisch wurden in 1800 ml Wasser gelöst. Nach Einstellung der Lösung mit Salzsäure auf pH 1 wurde auf 2000 ml mit Wasser aufgefüllt. Durch Zugabe von 1000 ml 96%igem Äthanol bei 20 0C wurde eine Vorfraktion ausgefällt, die nach einer Standzeit über Nacht bei +4 0C abzentrifugiert und verworfen wurde. Aus dem Zentrifugat ist bei 4 0C eine Mukopolysaccharid-Praktion durch Zugabe von weiteren 5000 ml Äthanol ausgefällt worden, die durch Zentrifugieren und Auswaschen mit Äthanol und Azeton gewonnen worden ist. Ausbeute: 118,2 g Mukopolysaccharid-Fraktion
Eine 10%ige Lösung von 10Og des fraktionierten Mukopolysaccharide in 0,1 IT Salzsäure wurde 3 Stunden bei 80 0C belassen. Die Ausfällung der partiell abgebauten Mukopolysaccharid-Fraktion erfolgte mit 5000 ml Äthanol. Der niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und mit Alkohol und Azeton ausgewaschen
Ausbeute: 76,1 g
75 g der partiell abgebauten Mukopolysaccharid-Fraktion wurden in 750 ml Formamid gelbst und unter Rühren und Kühlung im Sulfierkolben innerhalb 1 Stunde mit 112,5 ml Chlorsulfonsäure tropfenweise versetzt, wobei die Temperatur auf 10-15 0C gehalten wurde. Anschließend ist noch 4 Stunden bei Raumtemperatur (20 0C) gerührt worden. Durch Eingießen der Lösung in 6 1 Methanol wurde das sulfatierte Mukopolysaccharid ausgefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt und in 1500 ml Wasser gelöst. Mit Natronlauge wurde der pH- Wert auf 10 gestellt und zwecks Dialyse die Lösung Stunden durch eine Hohlfaserpatrone (Ausschlußgrenze MG 5000) gepumt, die im Außenmantel von fließendem Leitungswasser und abschließend destilliertem V/asser durchspült wurde. Nach Konzentrierung der dialysierten Mukopolysaccharidlösung durch Ultrafiltration über die gleiche Hohlfaserpatrone auf 695 ml wurde das sulfatierte MPS mit 3500 ml Äthanol unter Zugabe von Natriumacetat ausgefällt. Ausbeute: 75,8 g
Eine Lösung ѵов 75 g der sulfatierten MPS-Fraktion in 750 ml destillierten Wassers wurde über 750 ml eines stark sauren Kationenaustauschers auf der Basis eines Styrol-Divinylbenzolcopolymerieates mit kernständigen Sulfonsäuregruppen (H+-Form) filtriert. Nach Einstellen des Filtrates mit 4 N Natronlauge auf pH 7,0 wurden 75 ml 30%iges
Waaaeratoffperoxid zugegeben und der Anaatz 60 min bei 70 0C belaaaen, wobei mit 0,1 N NaOH alle 10 min wieder auf 7,0 nachgeatellt wurde. Nach dem Abkühlen wurde daa Muko poly sac charid durch Eingießen der Lb'aung in 5000 ml Äthanol ausgefällt (Zugabe von Natriumazetat zur Verbeaeerung der Auaflockung)« Der Niederschlag wurde zentrifugiert, mit Azeton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 71,5 g Mukopolyaaccharidpolyachwefelaäureeater-Na-SaIz
Schwefel-Gehalt: 11,32 % Uronsäure: 23,0 % Natrium: 11,3 % Stickstoff: 1,9 %
Claims (1)
- ErfindungsanspruchVerfahren zur Herstellung eines therapeutisch wirksamen Mukcpolysaccharidpolyschwefelsäureestors aus Rindertrachea* dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mukopolysacbharid-Fraktion durch Fraktionierung mit einem niederen aliphatischen Alkohol eines in bekannter Weise aus Rindertrachea mittels alkalischer Extraktion gewonnenen rohen Mukopolysaccharidgemisches isoliert, vorzugsweise durch Ausfällung einer Vorfraktion bei pH 1-2 und 20 0C mit einer Äthanolkonzentration von 30-34 Vol.%, die verworfen wird, und nachfolgender Ausfällung der gewünschten Mukopolysaccharid-Fraktion mit einer Äthanolkonzentration von 70-74 Vol.%, diese nach in bekannter Weise durchgeführten partiellen Hydrolyse und Sulfatierung in Form einer 5%igen wäßrigen Lösung von ρΉ 9-10 bei 4-25 °Czur Dialyse über HohlJfasern oder Membranen mit einer Ausschlußgrenze von MG 5000 filtriert sowie mit einem stark sauren Kationenaustauscher-Harz reinigt und mit Wasserstoffperoxid entfärbt·
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