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Verfahren zur Herstellung von Verbindungen des blutzuckersenkenden
Hormons des Pankreas Die Herstellung von verzögernd wirkenden Verbindungen des blutzuckersenkenden
Hormons der Bauchspeicheldrüse (Insulin) ist bereits bekannt. Es werden z. B. durch
Umsetzung von Insulin mit einem Protein (Brit. Patent 456,ioi), Globin (U.S.A. z
i6i 198) oder mit einer Chinolinverbindung, Bis-2-Methyl-4-Aminochinolyl-6-Carbamid
(Kli.Wo. 1938 S. 443), stark verzögernd wirkende Verbindungen erhalten. Die Wirkung
dieser Stoffe kann noch durch Kombination mit Zink verstärkt werden, wie z. B. im
U.S.A.-Patent 2 179 384 beschrieben ist.
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Die Verbindungen von Insulin mit oder ohne Zink mit dem eiweißartigen
Protamin und Globin haben den Nachteil, daß das Insulin an ein dem menschlichen
Organismus artfremdes und nicht indifferentes Eiweiß gebunden ist. Auch bei Behandlung
der Verbindung mit nSurfena wurden mehr oder weniger starke Reizerscheinungen nach
der Injektion beobachtet.
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Es wurde nun gefunden, daß sich diese Nachteile leicht vermeiden lassen,
wenn man erfindungsgemäß Insulin mit den eiweißfreien, dem menschlichen Organismus
gegenüber sich indifferent verhaltenden basischen Derivaten der Gallensäuren umsetzt.
Besonders geeignet sind die durch Aminogruppen substituierten Gallensäuren, wie
die 3, 7 - Diaminogallensäure, 3, 7, i2-Triaminogallensäure, Monoacyltriaminoga113nsäuren
u. a. sowie die Ester und Amide und sonstigen Derivate dieser Säuren.
Zweckmäßig
wird diese Umsetzung in der Weise ausgeführt, daß man Insulin auf das in Betracht
kommende Derivat der basischen Gallensäure zur Einwirkung bringt, gegebenenfalls
in Gegenwart von mit Ammoniak komplexbildenden in- Anwesenheit von Chlorionen leicht
löslichen Metallverbindungen, wie z. B. Kupfer, Kobalt, Nickel, vorzugsweise aber
solchen._die. keine. Wertigkeitswechsel zeigen, wie Zink oder Magnesium, in wäßriger
Lösung oder wäßrigen organischen Lebensmitteln, z. B. in verdünntem Alkohol. Es
kann auch die Lösung eines Derivates einer basischen Gallensäure in einem wasserunlöslichen
Lösungsmittel auf die wäßrige oder wäßrig-alkoholische Lösung des Insulins zur Einwirkung-
gebracht werden und die entstandene Insulin-Gallensäure-Verbindung zweckmäßig durch
Einstellung der Reaktionsmischung auf px 6,6 bis 7,2. ausgefällt werden: Hierbei
kann man bei der Fällung aus-wäßrig-alkoholischer Lösung die Ausbeuten durch Zusatz
eines mit Wässer nicht mischbaren Lösungsmittels, z. B. Äther,. vergrößern, wobei
dann auch ein weiterer px-Bereich für die Fällung eingehalten werden kann, und zwar
Pzi 4 bis B. ..
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Daß es sich bei den ausgefällten Produkten nicht um Mischungen, sondern
um neue, und zwar salzartige Verbindungen handelt, wobei das Insulin als Säure funktioniert,
geht daraus hervor, da.ß sie z. B. bei pst 7 sowohl in Wasser als auch im wäßrigen
5o bis 7oa/oigen Alkohol schwer löslich sind,. während Insulin allein wie auch die
basischen Gallensäurederivate allein unter gleichen Umständen gelöst werden.
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Die- neuen Verbindungen werden zweckmäßig in Form von Suspensionen
bei einem pn von ungefähr 7 verwendet, wobei als Suspensionsmittel außer Wasser
auch wäßrige Lösungen wie physiologische Kochsalzlösung, Serumsalzlösungen u. a.,
ferner organische Flüssigkeiten wie Diäthylin (Glykoldiäthyläther) und Öle wie Lebertran,
Olivenöl, Arachisöl, Sesamöl; Rizinusöl benutzt werden können: Das pn kann aber
auch in wäßriger Lösung auf 3,5 bis 4 eingestellt und die Lösung so. gespritzt.
werden. Es tritt in dem Gewebe durch das Seiüm eine Pufferung auf ein pl# von ungefähr
7 ein, und die Ausfällung des Depotkörpers erfolgt dann erst im Gewebe. Beispiel
z Man löst 50 g kristallisiertes Insulin (mit 2o int.E.-pro mg) in 19,88
1 verdünnter Salzsäure (io ccm normale Salzsäure auf 11). Zu der Lösung gibt
man 6o ccm Trikresol und i6o ccm einer Lösung von 17,5 g 3, 7-Diaminogallensäuredichlorhydrat
in..i 1 Wasser. Nach guter Mischung tropft man soviel n/io-Kalilauge, unter starkem
Umrühren ein, bis ein pn von 6,9 bis 7,2 erreicht ist. Wenn diese- ganzen Vorgänge
steril ausgeführt sind, kann man die hierbei entstehende wäßrige Suspension direkt
in sterilisierte -Ampullen mit Gummikappen abfüllen. Sie sind dann sofort verwendungsfähig-
Man kann aber auch den entstehenden Niederschlag, das Diaminogallensäureinsulat,
auf übliche Weise abtrennen, trocknen und mit Hilfe bekannter Apparaturen, z. B.
in, organischen Lösungsmitteln wie Diäthylin, Lebertran usw, suspendieren. Wenn
diese Arbeiten steril .vorgenommen werden, können diese Suspensionen in organischen
Lösungsmitteln, die sich durch besondere Haltbarkeit z. B. in den Tropen auszeichnen,
direkt in Ampullen gefüllt werden.
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Das 3, 7-Diaminogaliensäuredichlorhydrat bzw. das entsprechende Säureamid
werden, was hier nicht beansprucht wird, wie folgt erhalten: 16 g Dehydrodesoxycholsäuremethylester
(Zeitschr. physiol. Chemie Bd. z23, S. i59ff.) wurden in 35o ccm Methanol gelöst
und mit 6,7 g Hydroxylaminochlorhydrat in io ccm Wasser und 15 g Natriumacetat in
25 ccm Wasser 6 Stunden am Wasserbad gekocht. Aus der Lösung wurde mit kaltem Wasser
als Kristallpulver das Dioxim der Diaminogallensäure (Fp. 1i8°) ausgefällt. 4 g-
Oximester werden in Zoo ccm Isoamylalkohol gelöst und mit i3 -g Natrium in Stücken
allmählich innerhalb von 2 Stunden versetzt. Temperatur i3o bis i40°. Dauer der
Reduktion: 4 bis 5 Stunden. Nach dem Erkalten wird in Wasser gelöst und mit Salzsäure
angesäuert. . Die amylalkoholische Schicht wird im Scheidetrichter mit verdünnter
Salzsäure gewaschen, bis die Reaktion mit Pikrinsäure sehr schwach wird. Die wäßrigen
Auszüge werden im Vakuum eingedampft bis zur Trockne, mit Butanol aufgenommen, die
butylalkoholische Lösung im Vakuum stark konzentriert und mit Äther das Dichlorhydrat
der Diaminogallensäure ausgefällt. Ausbeute: i;3 g. Fp. unter Zersetzung: 256°.
Monochlorhydrat (Fp. 246°) aus dem Diehlorhydrat durch Erhitzen seiner konzentrierten
wäßrigen Lösung bei einem pn von 8,9. Das Mono- oder Dichlorhydrat wird in Methanol
gelöst und Salzsäure -eingeleitet, zuerst in der Kälte und dann 2 Stunden unter
Erhitzen auf dem Wasserbad. Dann wird im Vakuum eingeengt und die zurückbleibende
Masse mit konzentriertem- wäßrigen Ammoniak verrieben: Die zuerst schrnierigeSubstanz
wirdlangsam fest. Schmelzpunkt des entsprechenden Säureamids i68°. Beispiel 2 .
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Wie Beispiel x, jedoch unter Zusatz von i g wasserfreiem Chlorzink
zu . der Mischung von Insulin und Dichlorhydrat der Diarninogallensäure vor dem
Einstellen auf pn 7.
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. :- .. Beispiel 3 ' 50 g nicht kristallisiertes Insulin (entsprechend
i Mill. int. E) werden aufgelöst in 2o 1 n/ioo-Salzsäure, die auf 11 3 ccm
Trikresol enthält. Unter starkem Rühren werden in diese Lösung 5 g fein gepulvertes
Dichlorhydrat der Diaminogallensäure eingetragen und die Reaktionsmischung bis zur
vollständigen Auflösung des Pulvers kräftig gerührt. Man kann dann die Reaktionsmischung,
wie im Beispiel i oder 2 beschrieben, weiter aufarbeiten. Das pu kann aber auch
auf 3,5 bis 4 eingestellt und die Lösung, wenn sie steril hergestellt wurde, in
Ampullen gefüllt werden. Wird diese Lösung gespritzt, -so tritt in das Gewebe durch
das Serum eine Pufferung auf pn 7 ein, und die Ausfällung des Depotkörpers erfolgt
dann im Gewebe. .
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Beispiel 4 50 g Insulin werden in 2o 1 n/ioo-Salzsäure, die
0,3a/0. Trikresol oder . 0,3 %- Trichlorisobütylalkohol
oder o,i
°/o eines p-Oxybenzoesäuremethyl- und äthylester-Gemisches enthält, aufgelöst und
dann unter starkem Rühren soviel n/io-Kalilauge eingetropft, bis ein pu von 7 erreicht
ist, wobei bei pli q. bis 6 eine Ausfällung eintritt, die sich bei p#, 7 wieder
klar auflöst. Getrennt davon wird eine Lösung von Diaminogallensäuredichlorhydrat
(i7,5 g auf i 1) hergestellt und soviel n/io-Kalilauge eingetropft, bis ein pH von
7,1 erreicht wird. Die Lösung bleibt klar. Von dieser Aminogallensäurelösung werden
i6o ccm in die Insulinlösung unter starkem Rühren eingetragen. Die dabei entstehende
Suspension der neuen Verbindung wird nach Beispiel i weiter behandelt: Beispiel
s Zoo g Insulin (mit 6o y pro E) werden in 2o 1 7oo/oigem Alkohol, der io ccm normale
Salzsäure auf 1 1 enthält, aufgelöst. Es werden dann ii-g Diaminogallensäurechlorhydrat
unter starkem Rühren in dieser Mischung aufgelöst und hierauf unter weiterem Rühren
soviel n/io-Kalilauge eingetropft, bis ein pu von 6,9
bis 7,1 erreicht wird.
Der dabei ausfallende Niederschlag der neuen Verbindung wird abzentrifugiert, auf
der Zentrifuge in bekannter Weise mit einem Gemisch von Alkohol und Äther i : i
und dann mit trocknem Äther gewaschen. Nach dem Trocknen im Exsikkator wiegt der
Niederschlag 148 g. Aus dem Filtrat können durch Zufügung von soviel 96o/oigem Alkohol,
bis die Spindel einen Gehalt von go % Weingeist zeigt, und durch weiteres Zumischen
von 1,5 Volumenteilen Äther, bezogen auf ein Volumenteil der Mischung, die go o/0
Alkohol enthält, noch 62 g der neuen Verbindung isoliert werden.
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Beispiel 6@ Zoo g Insulin (mit 18 g E/mg) werden in 50 1 n/ioo-Salzsäuregelöst
und die Lösung mit i/i n-Natronlauge auf PH 7 eingestellt, wobei die zwischendurch
bei pii 5 eintretende Fällung von isoelektrischem Insulin sich wieder vollständig
löst. Daneben wurde eine Lösung von 2o g Diaminogallensäurechlorhydrat in 15 1 Butanol
hergestellt. Das pH dieser Lösung war gleichfalls 7,o. Beide Lösungen, die klar
sind, werden übereinander geschichtet, wobei man an der Berührungsstelle das Entstehen
eines Niederschlages beobachten kann. Bei gutem Umrühren oder Schütteln auf einer
Schüttelmaschine erhält man eine starke, feinflockige Fällung, wobei das pH der
Mischung auf 7,o bestehen bleibt. Nach Einstellen des Schüttelns oder Rührens trennen
sich die beiden Flüssigkeitsschichten wieder, und es kann der Niederschlag der neuen
Verbindung in bekannter Weise isoliert werden. Beispiel 7 Zoo g Insulin (mit 18
E/mg) werden in 5 1 salzsaurem Wasser bei pH 2,5 bis 3 gelöst und die Lösung mit
Natronlauge auf PH 7 eingestellt, wobei zwischendurch das bei pH 5 bis 6 ausfallende
isoelektrische Insulin wieder in Lösung geht. Durch Zugabe von 151 Alkohol wurde
eine etwa 75o/oige wäßrig-alkoholische Lösung erhalten. Hierzu wird die Lösung von
2o g Diaminogallensäurechlorhydrat in 2 bis 31 Äthylalkohol oder in 15 1 Butylalkohol
oder Propylalkohol gegeben. Das px der Gallensäurelösungwar ebenfalls 7,0. Beim
Vermischen der beiden klaren Lösungen tritt eine Fällung ein, die sich in groben
Flocken absetzt. Die Fällung wurde vervollständigt durch Zugabe von 3o 1 Äther.
Die neue Verbindung wird in üblicher Weise abgetrennt und getrocknet. Ausbeute
190 9.
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Ganz analog den Beispielen mit Diaminogallensäuredichlorhydrat können
Beispiele mit Diaminogallensäuremonochlorhydrat und mit Diaminogallensäureamid durchgeführt
werden.
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Auch Triaminogallensäurechlorhydrat, sowie Monoacyltriaminogallensäure
können an Stelle der Diaminogallensäurederivate Verwendung finden. Diese Verbindungen
werden nach folgendem, hier nicht beanspruchten Verfahren erhalten: 15 g Trioxim
des Dehydrocholsäuremethylesters (Berichte `der deutsch. chem. Ges., Bd. 52 S. 1353-i359)
wurden in goo ccm Amylalkohol frei von Pyridin gelöst und unter dauerndem Kochen
der Lösung (Ölbad) mit 6o g Natrium innerhalb von 2 Stunden versetzt. Das Erhitzen
wird bis zur vollständigen Lösung des Natriums fortgesetzt. Nach dem Erkalten wird
das Natriumamylat mit Wasser aus dem Kolben gelöst und mit Salzsäure angesäuert.
Die amylalkoholische Schicht wird nochmals mit verdünnter Salzsäure gewaschen, bis
kein Niederschlag mit Pikrinsäure mehr auftritt. Die wäßrige Lösung wird zum Trocknen
eingeengt, mit Methanol aufgenommen und unter Erhitzen im Wasserbad durch Einleiten
von Salzsäure verestert. Ausgeschiedenes Kochsalz wird abfiltriert, die Lösung im
Vakuum eingetrocknet, der Rückstand mit Methanol aufgenommen und das Trichlorhydrat
des Triaminogallensäuremethylesters (Fp. über 32o°) mit Äther gefällt. Ausbeute
ii,2o g.
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Monobenzoyltriaminogallensäuremethylester wird aus Triaminogallensäureester
nach Schotten -B a u m a n n in der üblichen Weise mit der berechneten Menge Benzoylchlorid
hergestellt.
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Während sich die Umsetzung von Monobenzyltriaminogallensäuretrichlorid
mit Insulin ganz analog wie in den vorstehenden Beispielen mit Diaminogallensäuredichlorid
beschrieben durchführen läßt, gibt die Triaminogallensäure als Chlorhydrat oder
Ester bei pH 7, gelöst mit der ebenfalls klaren Lösung von Insulin bei pH 7, keinen
Niederschlag. Wenn man jedoch die beiden Lösungen bei p,H 2,5 bis 3 herstellt oder
darauf einstellt und dann Kalilauge zutropft, so erhält man zunächst bei Pu 5 bis
6 den Niederschlag, der sich bei Insulin ohne Aminogallensäure bildet (isoelektrisches
Insulin). Während sich in letzterem Falle der Niederschlag bei weiterem Zutropfen
von Kalilauge bis zu PH 7 wieder auflöst zu einer klaren Lösung, bleibt im Falle
des Zusatzes von Triaminogallensäure (-Trichlorhydrat) in demselben Prozentsatz,
wie man die Diaminogallensäure verwendet, der Niederschlag auch bei p)i 7 bestehen
und enthält nun die neue Verbindung von Triaminogallensäure und Insulin.
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In der gleichen Weise lassen sich mit gleichem Erfolge andere basische
Verbindungen der Steroidreihe z. B. o-Nicotinoylgallensäuren und Aminoalkyläther
und -ester der Gallensäuren sowie auch Aminosterine,
C-Nikotinoylsterine,
basische Äther der Sterine u. a. verwenden.
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So erhält man z. B. nach den Verfahren obiger Beispiele ein Insulin-Cholestenonpyridiniumsulfat.
Beispiel 8 Man löst 5o g kristallisiertes Insulin (mit 2o int. E/mg) in z9,881 verdünnter
Salzsäure (io ccm normale Salzsäure' auf 11); zu der Lösung gibt man 6o ccm
Trikresol und 16o ccm einer Lösung von 30 g Diaminocholestanolchlorhydrat
in 11 Wasser. Nach, guter Mischung tropft man soviel n/io-Kahlauge unter
starkem Umrühren ein, bis ein px von 6,9 bis 7,2 erreicht ist. Wenn diese
ganzen Vorgänge steril ausgeführt sind, kann man die hierbei entstehende wäB-rige
Suspension direkt in sterilisierte Ampullen mit Gummikappen abfüllen. Sie sind dann
sofort verwendungsfähig. Man kann aber auch den entstehenden Niederschlag, das Diaminocholestanolinsulinat,
auf übliche Weise abtrennen, trocknen und mit Hilfe bekannter Apparaturen, z. B.
in organischen Lösungsmitteln, wie Diäthylin, Lebertran usw. suspendieren. Wenn
diese Arbeiten steril vorgenommen werden, können diese Suspensionen in organischen
Lösungsmitteln, die sich durch besondere Haltbarkeit z. B. in den Tropen auszeichnen,
direkt in Ampullen gefüllt werden.
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_ 1Beispiel 9 Wie Beispiel 8, jedoch unter Zusatz von i g' wasserireiem
Chlorzink zu der Mischung von Insulin und, -dem Chlorhydrat des Diaminocholestanols
vor dem Einstellen auf PH 7.
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Beispiel io 50 g nicht kristallisiertes Insulin '(entsprechend
i Mill. int. E) werden aufgelöst in 2o 1 n/ioo-Salzsäure, die auf 113 g Phenol
enthält. Unter starkem Rühren werden in diese Lösung 5 g fein gepulvertes Chlorhydrat
des Diaminocholestanols eingetragen und die Reaktionsmischung bis zur vollständigen
Auflösung des Pulvers kräftig gerührt. Man kann dann die Reaktionsmischung wie im.
Beispiel 8 oder 9 beschrieben, weiter aufarbeiten. Das pu kann aber auch auf 3,5
bis ¢ eingestellt und die Lösung, wenn sie steril hergestellt wurde, in Ampullen
abgefüllt werden. Wird diese Lösung gespritzt, so tritt in dem Gewebe durch das
Serum eine Pufferung auf p$ von ungefähr 7 ein und die Ausfällung des Depotkörpers
erfolgt dann im Gewebe.
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Beispiel ii 50 g Insulin werden in 2o 1 n/ioo-Salzsäure, die
0,30/ o Trikresol oder Phenol oder Trichlorisobutylalkoholoder o,i °/a eines p-Oxybenzoesäuremethyl-und
äthylester-Gemisches .enthält, aufgelöst und dann unter starkem Rühren soviel n/io-Natronlauge
eingetropft, bis ein pu von 7 erreicht ist, wobei zwischendurch bei PR q. bis 6
eine Ausfällung eintritt, die sich bei pu 7 wieder klar auflöst. Getrennt davon
wird eine Lösung von Diaminocholestanolchlorhydrat (30g auf 11) hergestellt
und soviel n/io-Natroniauge eingetropft, bis ein px von 7, i erreicht wird. Die
Lösung bleibt klar. Von dieser Digminocholestanolchlorhydratlösung werden 16o ccrri
in die Insulinlösung unter starkem Rühren eingetragen. Die dabei entstehende Suspension
der neuen Verbindung wird nach Beispiel 8_ weiterbehandelt.
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Beispiel 12 2oo g Insulin mit 6o y/E werden in 2o 1 7o°/oigem Alkohol,
der io ccm normale Salzsäure auf 11 r. enthält, aufgelöst. Es werden dann
ii g Diaminocholestanolchlorhydrat unter starkem Rühren in dieser Mischung aufgelöst
und hierauf unter weiterem Rühren soviel n/io-Kalilauge eingetropft, bis ein pn
von 6,9 bis 7,1 erreicht wird. Der dabei ausfallende Niederschlag der neuen Verbindung
wird abzentrifugiert, auf der Zentrifuge in bekannter Weise mit einem Gemisch von
Alkohol und Äther i : i und dann mit trocknem Äther gewaschen. Nach dem Trocknen
im Exsikkator wiegt der Niederschlag 148 g. Aus dem Filtrat können durch Zufügen
von soviel 96°/oigem Alkohol, bis die Spindel einen Gehalt von 9o 0/a wenigstens
zeigt, und durch weiteres Zumischen von 1,5 Volumenteilen Äther, bezogen
auf i Volumteil der Mischung, die 9o °/a Alkohol enthält, noch 62 g der neuen Verbindung
isoliert werden.
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Beispiel 13 ioo g Insulin mit 18 E/mg werden in 50 1 11/100-Salzsäure
gelöst und die Lösung mit n/i-Natronlauge auf px 7 eingestellt, wobei die zwischendurch
bei px 5 eintretende Fällung von isoelektrischem Insulin sich wieder vollständig
löst. Daneben wurde eine Lösung von 2o g Diaminocholestanolchlorhydrat in 15 1 Butanol
hergestellt. Das pu dieser Lösung war gleichfalls 7,o. Beide Lösungen, die klar
sind, werden übereinander geschichtet, wobei man an der Berührungsstelle das Entstehen
eines Niederschlags beobachten kann. Bei gutem Umrühren oder Schütteln auf einer
Schüttelmaschine erhält man eine starke feinflockige Fällung, wobei das px der Mischung
auf 7,o bestehen bleibt. Nach Einstellen des Schüttelns oder Rührens trennen sich
die beiden Flüssigkeitsschichten wieder, und es kann der Niederschlag der neuen
Verbindung in bekannter Weise isoliert werden. Beispiel 1q.
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Zoo g Insulin mit 18 E/mg werden in 5 1 salzsaurem Wasser bei pn 2,5
bis 3 gelöst und die Lösung mit Natronlauge auf PR 7 eingestellt, wobei zwischendurch
das bei pu 5 bis 6 ausfallende isoelektrische Insulin wieder in Lösung geht. Durch
Zugabe von x5 1 Alkohol wurde eine etwa 75°/oige alkoholisch-wäßrige Lösung erhalten.
Hierzu wird die Lösung von 2o g Diaminocholestanolchlorhydrat in 2 bis 31 Äthylalkohol
öder in 15 1 Butylalkohol oder Propylalkohol gegeben. Das pu der Aminosterinlösung
war ebenfalls 7,o. Beim Vermischen der beiden klaren Lösungen tritt eine Fällung
ein, die sich in groben Flocken absetzt. Die Fällung wurde vervollständigt durch
Zugabe von 30 1 Äther. Die neue Verbindung wird in üblicher Weise abgetrennt und
getrocknet. Ausbeute: igo g.
In den Beispielen 8 bis 1q. läBt sich
das Diaminocholestanolchlorhydrat ersetzen z. B. durch Aminocholestanchlorhydrat
oder Diaminocholestan oder andere basische Sterine.