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Verfahren zur Herstellung von Verbindungen des blutzuckersenkenden
Hormons der Bauchspeicheldrüse Die Herstellung verzögernd wirkender Verhin dungen
des blutzuckersenken.den Hormons (Insulin) ist bereits bekannt. So werden nach dem
Verfahren: des britischen Patents 4561o1 durch Umsetzung von Insulin mit einem Protamin
und, wie weiter in der Literatur beschrieben (Kli. Wo.. 1938, S. 4q.3), durch Umsetzung
von Insulin mit Bis-2-meth,yl-4-aminochinolyl-6-@carbamid solche Verbindungen erhalten.
Ebenso ist im amerikanischen Patent 2 179 384 ein Zink-Protamin-Insulin und im amerikanischen
Patent 2 161 198 ein Zink-Glob,in-Insulin für diesen Zweck genannt.
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Die Verbindungen von Insulin mit oder ohne Zink mit Protamin und mit
Globin haben den -Nachteil, daß das Insulin an ein dem menschlichen 0rganismus artfremdes
und nicht indifferentes Eiweiß gebunden. ist (s. Umber. u. Me., Kli. Wo. 1938, Nr.
13, S. 443 Abs. 2 und S. 445) In der Verbindung mit Bis-2-methyl-4-aminochinolyl-6-carbamid
ist Insulin gebunden an ein als Oberflächen- und Tiefenantiseptikum eingeführtes
Produkt, .das durchaus nicht indifferent ist. A m m o n (Deutsche Med. Wo. 1938,
Heft 39, S. 1392 ff.), B an s e (Med. Welt 1938, Heft 38), Beckmann und Weitzsäcker
(Kli. Wo. 1938, Nr. 38, S. 1321 ff., besonders S. 132.1), W. B e c k e r t (Mü.
Med. Wo. 1938, Nr. 41, S. 159.1 ff., besonders S. 1596) berichten alle von. mehr
oder minder starken Reizerscheinungen nach der Injektion mit dem Depot-Insulin,
in welchem das Hormon
arr das genannte Antiseptikum gebunden ist.
Auch das Nativ-Insulin (Kli. Wo. 1939, Nr. 24, S. 837, Abschn. 6 und 7) enthält
einen, wenn auch angeblich nativen, so doch höheren Eiweißgehalt,- der immerhin
urtikarielle Hauterscheinungen und Irrfiltrate veranlassen kann.
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Es wurde neun .gefunden, daß sich diese Nachteile leicht vermeiden>
lassen, wenn man erfindungsgemäß Insulin mit basischenDerivaten des Insulins, insbesondere
mit Insulinestern, wie sie nach C a r r. und M e., Biochtem. H., Bd.23, S. ioio
ff. (I929) oder nach F r e u d1 e n b: e r g, Hoppe Seyler's Zeitschrift f. physiolog.
Chemie, Bd. 202, S. 133 bis 136 und S. 149 bis 151 (193i) hergestellt werden
können, umsetzt.
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Zweckmäßig wird diese Umsetzung in der Weise ausgeführt, daß, Insulin
mit dem Ester gegebenenfalls in Gegenwart von mit Ammanlade komplexbildenden, in
Anwesenheit von Chlorionen leicht löslichen Metallverbindungen,, wie von Kupfer,
Nickel, Kobalt, vorzugsweise aber solchen, die keinen Wertigkeitswechsel zeigen,
wie Zink oder Magnesium, in wäßriger Lösung oder wäßrigen organischen Lösungsmitteln,
z. B. verdünntem Alkohol, zur Umsetzung gebracht wird. Man kann aber auch die Lösung
des Insulinesters in einem wasserunlöslichen Lösungsmittel auf die wäßrige oder
wäßrig-alkoholi,sche Lösung des Insulins einwirken. lassen und die entstandene Verbindung
durch Einstellen der Reaktionsmischung auf pH 6,6 bis 7,2 ausfällen. Hierbei kann
man bei der Fällung aus wäßrig-.a:lkohcli.scher Lösung die Ausbeuten durch Zusatz
eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels, z. B. Äther, verbessern, wobei
dann auch ein weiteres p11-Bereich für die Fällung eingehalten werden kann (pH 4
bis &).
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Daß es sich bei dem ausgefällten Produkt nicht um eine Mischung, sondern,
um eine neue, und zwar salzartige Verbindung handelt, wobei das Insulin= als. Säure
funktioniert, geht daraus hervor, d-aß sie z. B. bei. ).H 7 sowohl in, Wasser als
auch in wäßrigem 50 bis 7oo/oigem Alkohol schwer löslich ist, während Insulin
allein wie auch dar Insulinester allein unter gleichere Umständen gelöst bleiben.
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Die neue Verbindung wird zweckmäßig in Form von Suspensionen bei einem
pH von ungefähr 7 verwendet, wobei als Suspensionsmittel außer Wässer auch wäßrige
Lösungen, wie physiologische Kochsalzlösungen, Serumsalzlösungen u: ä., ferner organische
Flüssigkeiten, wie Diäthylin, und Öle, wie Lebertran, Olivenöl, Arachisöl; Sesamöl,
Rizinusöl, benutzt werden können. Das pi kaürv aber auch, in wäßriger Lösung auf
3,5 bis 4 eingestellt und die Lösung so gespritzt werden. Es tritt in dem Gewebe
durch das Serum eine Pufferung auf ein pH von ungefähr 7 ein., und,die Ausfällung
des Depotkörpers erfolgt dann erst im Gewebe. Beispiel I Man löst 50 g krist.
Insulin (mit 20 irrt. E. pro mg) in 19,881 verdünnter Salzsäure (io ccm normale
Salzsäure auf 11). Zu der Lösung gibt man 6o ccm Trikresol und. 16Q ccm einer Lösung
von 17,5 g Insulinester in 1 1 n/roo Salzsäure. Nach, guter Mischung tropft
man so viel n/io Kalilauge unter starkem Umrühren ein, bis ein pH von 6,9 bis 7,2
erreicht ist. (Wenn diese ganzen Vorgänge steril ausgeführt werden, kann man. die
hierbei entstehende wäßri.ge Suspension direkt in sterilisierte Ampullen mit Gummikappen
abfüllen. Sie sind dann sofort verwendungsfähig.) Man: kann aber auch den, entstehenden
Niederschlag, das Insu.lireester-Insulat, auf übliche Weise abtrennen, trocknen
und mit Hilfe bekannter Apparaturen z. B. in organischen Lösungsmitteln, wie Diäthylin,
Lebertran usw., suspendieren. Wenn diese Arbeiten, steril vorgenommen werden,, können
diese Suspensionen in organischen Lösungsmitteln, die sich durch besondere Haltbarkeit
z. B. in den Tropen auszeichnen, direkt in Ampullen gefüllt werden. Beispiel e Wie
Beispiel i, jedoch unter Zusatz von. i g wasserfreiem Chlorzink zu der Mischung
von Insulin und Insulinester vor dem Einstellen auf PH 7. Beispiel 3 5o g nicht
kristallisiertes Insulin (entsprechend i Mill. irrt. E.) werden aufgelöst in 2o
1 n/ioo Salzsäure, die auf 1 1 -3 ccm Trikresol enthält. Unter starkem Rühren werden
in diese Lösung 5 g feingepulverter Insulinester eingetragen. und die Rea@ktionsmischung
bis zur vollständigen Auflösung des Pulvers kräftig gerührt. Man. kann dann die
Reaktionsmischung, wie im Beispiel i, oder 2 beschrieben, weiter aufarbeiten. Das
pH kann aber auch auf 3,5 bis 4 eingestellt und die Lösung, wenn sie steril hergestellt
wurde, in Ampullen gefüllt werden. Wird diese Lösung gespritzt, so tritt in dem.
Gewebe durch das Serum eine Pufferung auf pH von ungefähr 7 ein, und die Ausfällung
des Depotkörpers erfolgt dann im Gewebe. Beispiel 4 5o g Insulin werden in 2o 1
n/ioo Salzsäure, die 0,3'/o Trikresol oder 0,31/o Acetonchloroform oder 0,1% p-Oxybenzoesäureester
enthält, aufgelöst und dann unter starkem Rühren so viel n/io Kalilauge eingetropft,
bis ein pH von 7 erreicht wird, wobei bei PH 4 bis 6 eine Ausfällung eintritt, die
sich bei PH 7 wieder klar auflöst. Getr..ennt .davon Wird eine Lösung von Insulinester
(17,5 g auf 11) hergestellt und so viel nn//io Kalilauge eingetropft, bis ein PI,
von 7,1 erreicht wird. Von dieser klaren Insulin@-esterlösung werden 16o ccm in
die Insulinlösung unter starkem Rühren eingebracht. Die dabei entstehende Suspension
der neuen Verbindung kann nach Beispiel i weiterbehandelt werden. Beispiel 5 Zoo
g Insulin (mit 6o y pro E.) werden in, 201 7o°/oigem Alkohol, der io ccm normale
Salzsäure auf 1 1 enthält, aufgelöst. Es werden. dann i i g Insulinester unter starkem
Rühren in dieser Mischung aufgelöst und hierauf unter weiterem Rühren so
viel
n/io Kalilauge eingetropft, bis ein pH von 6,9 bis 7,1 erreicht wirrt. Der dabei
anfallende Niederschlag der neuen Verbindung wird abzentrifugiert auf der Zentrifuge
in bekannter Weise mit einem Gemisch von Alkohol und Äther i : i und dann mit trockenem
Äther gewaschen. Nach dem Trocknen im Exsikkator wiegt der Niederschlag 148 g. Aus
dem Filtrat können durch Zufügung von: so viel 96o/aigem Alkohol, bis die Spindel
einen Gehalt von go% Weingeist zeigt, und durch weiteres Zumischen von 1,5 Volumteilen
Äther, bezogen auf i Volumteil der Mischung, die 9o °/o Alkohol enthält, nochmals
62 g der neuen Verbindung isoliert werden. Beispiel 6 ioo g Insulin (mit i8 E./mg)
werden in 5o l n/ioo Salzsäure gelöst und die Lösung mit i/i n Natronlauge auf pH
7 eingestellt, wobei die zwischendurch bei pH 5 eintretende Fällung von isoelektrischem
Insulin, sich wieder vollständig löst.
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Daneben wurde eine Lösung von 2o g Insulinester in 151 n/Methylsalicylat
hergestellt. Das pH dieser Lösung war gleichfalls 7,o. Beide Lösungen, die klar
sind, werden übereinander geschichtet, wobei man an der Berührungsstelle das Entstehen
eines Niederschlages beobachten kann. Bei gutem Umrühren oder Schütteln auf einer
Schüttelmaschine erhält man eine starke, feinflockige Fällung, wobei das pH der
Mischung auf 7,o bestehen bleibt. Nach Einstellen des Schüttelns oder Rührens trennen
sich die beiden Flüssigkeitsschichten wieder, und es kann der Niederschlag der neuen
Verbindung in bekannter Weise isoliert werden. Beispiel ? Zoo g Insulin (der Qualität
wie im Beispiel 6) «erden in 5 1 salzsaurem Wasser bei pH 2,5 bis 3 gelöst und die
Lösung mit Natronlauge auf pH 7 eingestellt, wobei das zwischendurch bei pH 5 bis
6 ausfallende isoelektrische Insulin wieder in Lösung geht. Durch Zugabe von 151
Alkohol wurde eine .etwa 75o/oige wälirigalkoholische Lösung erhalten. Hierzu wird
die Lösung von 2o g Insulinester in -2 bis 3 1 Äthylalkohol oder in 15 1 Methylsalicylat
gegeben. Das pH der Insulinesterlö.sung war ebenfalls 7,o. Vor dem Mischen waren
die beiden Lösungen klar. Beim Vermischen der beiden klaren Lösungen tritt eine
Fällung ein, die sich in groben Flocken schön absetzt. Die Fällung wurde vervollständigt
durch Zugabe von 301 Äther. Die neue Verbindung wird in üblicher Weise abgetrennt
und getrocknet. Ausbeute igo g. Zur Herstellung des In.sulinesters kann auch ein
in der Haltbarkeit minderwertiges Insulin aus schlechtem Pankreas verwendet werden,
das hergestellt werden kann aus diesem schlechten Pankreas nach einem Verfahren,
das es ermöglicht, Fermente und Insulin aus dem el eiche en Pankreas herzustellen.