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Verfahren zur Herstellung von hochmolekularen Verbindungen hydroxylgruppenhaltiger
Steroide Es ist bekannt, daß Cyclopentylpropionate des Östradiols nur in Öllösung
oder als wäßrige Suspension injiziert werden können (vgl. die USA.-Patentschrift
2 611773).
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von hochmolekularen
Verbindungen hydroxylgruppenhaltiger Steroide, unter denen sowohl Steroide mit Hydroxylgruppen
in den Molekülen als auch solche Steroide zu verstehen sind, bei denen die Hydroxylgruppen
durch Enolisierung von Ketogruppen entstehen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß man die Steroide der östron-, Androstan- oder Testosteronreihe, einschließlich
der Enolformen entsprechender Steroidketone, gegebenenfalls unter Mitverwendung
von Kupplungsstoffen, die mindestens zwei nicht benachbarte, phosphorylierbare Gruppen
enthalten, so lange phosphoryliert, bis Produkte mit estergebundenen Steroidgruppen
gebildet werden, die einerseits 'hochmolekular, jedoch in jedem Fall nach der anschließenden
Hydrolyse in Wasser bei neutraler oder alkalischer Reaktion 15s-1 ich sind.
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Die Erzeugnisse des Verfahrens gemäß der Erfindung zeichnen sich dadurch
aus, daß sie im Organismus die biologische Wirkung des in die Verbindungen eingehenden
Steroids während längerer Zeit, als es bisher möglich gewesen ist, hervorrufen und
aufrechterhalten können. Die Erfindung hat besonders Interesse in Verbindung mit
Steroiden mit Hormonwirkung.
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Es ist bekannt, daß der Hormoninhalt eines hormonproduzierenden Organs
niedrig ist im Verhältnis zu denjenigen Hormonmengen, die dem Organismus zugeführt
werden müssen, um eine unzweideutige Hormonwirkung zu erzielen. Dieses wurde sowohl
durch Tierversuche als auch durch klinische Anwendung der betreffenden Hormone nachgewiesen.
Daraus läßt sich folgern, daß Hormone von den Herstellungsstellen kontinuierlich
abgesondert werden und daß sie dort nicht akkumuliert werden. Demgemäß findet man,
die beste Substitutionstherapie müsse darin bestehen, dieses natürliche, biologische
Verhältnis nach Möglichkeit nachzuahmen. Zu diesem Zweck hat man versucht, Hormonpräparate
mit kontinuierlicher und prolongierter Wirkung herzustellen.
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Die Versuche, die bisher im Hinblick auf die Erzielung einer verlängerten
Wirkung von Steroidhormonpräparaten gemacht wurden, lassen sich in folgende drei
Gruppen zusammenfassen: a) Verabreichung von Derivaten, vorwiegend Estern, wie Testosteronpropionat
und Östradiolbenzoat, wobei die prolongierte Wirkung dadurch hergestellt wird, daß
die Substanz im Organismus hydrolysiert werden muß, bevor eine biologische Wirkung
eintritt; b) Verabreichung des Hormons in Öldepots, von denen es nur langsam resorbiert
wird.
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Durch Kombinieren von a) und b) lassen sich Präparate herstellen,
die die beiden Prinzipien verwerten.
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c) Eingabe des Hormons in festem, amorphem Zustand in Form einer Suspension
oder als Adsorbat z. B. an Kohle oder Aluminiumphosphat, indem man eine Suspension
von Mikrokristallen oder Tabletten von Mikrokristallen eingibt, die sogenannten
»Pellets« implantiert.
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Keine der genannten Methoden ist besonders zufriedenstellend. So muß
die Injektion des Hormons in Öl relativ oft wiederholt werden, was zur Folge hat,
daß unangenehme Öldepots hinterlassen werden, die der Organismus nicht oder nur
mit Schwierigkeiten beseitigen kann. Präparate, welche Steroidhormone enthalten,
die z. B. an Aluminiumphosphat adsorbiert sind, erzeugen entzündliche Reaktionen
und andere Nebenwirkungen. Beim Implantieren der sogenannten Pellets beobachtet
man oft einen unebenen und diskontinuierlichen Verlauf des Resorptionsprozesses,
und es ist überhaupt zweifelhaft, ob man auf diese Weise eine genügend gleichmäßige
und kontinuierliche Resorption erzielen kann. Dabei ist
das Implantat
oft lästig, und es wird in gewissen Fällen von der Implantationsstelle ausgestoßen.
Bei den unter b) und c) genannten Erzeugnissen kann es außerdem schwerfallen, volle
Sterilität zu sichern.
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Der Zweck der vorliegenden Erfindung ist, hochmolekulare Verbindungen
hydroxylgruppenhaltiger Steroide zu schaffen, aus denen für therapeutische Zwecke
Präparate hergestellt werden können, denen die vorgenannten Mängel nicht anhaften
und in denen das Hormon eine verlängerte Wirkung, vielfach sogar eine sehr verlängerte
Wirkung aufweist.
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Die gemäß der Erfindung hergestellten hochmolekularen Verbindungen
sind Ester aus Phosphorsäuren, darunter phosphoriger Säure und Thiophosphorsäure,
mit hydroxylgruppenhaltigen Steroiden, darunter Steroiden, bei denen, die Hydroxylgruppen
durch Enolisierung - von Ketogruppen entstanden sind. Sie bestehen aus kettenförmigen
Molekülen, deren Einzelglieder mittels Phosphorsäuregruppen verknüpft sind, und
worin das Steroid in Form von Steroidphosphorsäuregruppen eingeht.
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Die Bezeichnung »Phosphorsäuregruppen« soll hier und im folgenden
sowie in den Ansprüchen sowohl für Phosphat- als auch Phosphit- und Thiophosphatgruppen,
der Ausdruck »kettenförmige Moleküle« für gerade als auch für verzweigte Moleküle
gelten.
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Die Natur der neuen hochmolekularen Verbindungen und die Art der darin
enthaltenen Gruppen wird nachstehend in Verbindung mit der Beschreibung ihrer Herstellung
näher erläutert. Ferner wird durch Beispiele die durch die neuen Verbindungen erzielbare
Wirkung erläutert werden. Die hochmolekularen Verbindungen lassen sich erfindungsgemäß
dadurch herstellen, daß das Steroid mit oder ohne Anwendung eines Kupplungsstoffes
mit mindestens zwei nicht benachbarten phosphorylierbaren Gruppen mit einem Phosphorylierungsmittel
unter Bildung eines hochmolekularen Produktes mit estergebundenen Steroidgruppen
umgesetzt wird, wonach das Reaktionsprodukt einer Hydrolyse unterworfen wird.
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Wenn man die Bedingungen variiert, unter denen die Phosphorylierung
erfolgt, kann man Erzeugnisse mit verschiedener Molekülgröße und hierdurch mit einer
mehr oder weniger protrahierten Wirkung der Verbindungen erzielen. In der Regel
wird die Reaktion vorteilhaft bei Temperaturen unter 0° durchgeführt, während es
im Falle eines trägen Reaktionsverlaufes zweckmäßig sein kann, - die Reaktionstemperatur
unter Umständen bis auf 100° zu erhöhen.
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Erfindungsgemäß ist es zweckmäßig, die Behandlung mit dem Phosphorylierungsmittel
so lange fortzusetzen, bis das Molekulargewicht des gewonnenen Produktes höher als
2000 ist, da man hierdurch eine völlig befriedigende protrahierte Wirkung der Verbindungen
erzielen wird.
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Wenn die Reaktion eine angemessene Stufe erreicht hat, was z. B. durch
Prüfung der Dialysierbarkeit des Produktes kontrolliert werden kann, unterbricht-man
sie, z. B. durch Hydrolyse. So kann man z. B. die Reaktion dadurch zum Abschluß
bringen, daß man der Reaktionsmischung zerquetschtes Eis zusetzt oder die Mischung
in Eiswasser gießt. .
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Eine besonders zweckmäßige Ausführungsform der Erfindung stellt die
Behandlung des Steroids mit einer Menge des Phosphorylierungsmittels dar, die die
mit dem Steroid oder mit dem Steroid plus dem Kupplungsstoff äquimolare -!Menge
nicht wesentlich übersteigt.
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Durch die -erwähnte Begrenzung der Menge des Phosphorylierungsmittels
fördert man -den Aufbau kettenförmiger Moleküle dadurch, daß die einzelnen Moleküle
des Phosphorylierungsmittels eine größere Möglichkeit erhalten, gleichzeitig mit
mehreren Molekülen des Steroids, des Kupplungsstoffes oder der beiden zu reagieren.
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Wie aus der Beschreibung des Verfahrens zu ersehen, ist die Bedingung
für seine Durchführung, daß man Steroide mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen
oder enolisierbaren Ketogruppen verwendet, da Steroide, die solche Gruppen nicht
enthalten, sich nicht phosphorylieren lassen.
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Ein Diphosphorsäureester des Ostradiols ist bekannt; er behält aber
wie die oben in Gruppe a) erwähnten Ester seine Hormonwirkung nur eine relativ kurze
Zeit nach der Injektion in den Organismus bei.
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Auch ein Monophosphorsäureester des Östradiols ist bekannt, welcher
aber eine noch niedrigere östrogeiie Wirkung hat. In Anbetracht dieser Tatsachen
war es nicht vorauszusehen, daß hochmolekulare Verbindungen von Steroiden, in denen
Steroidhormongruppen durch Veresterung mit Phosphorsäuregruppen kondensiert sind,
eine hohe Hormonwirkung aufweisen würden. Es ist im Gegenteil zu erwarten, daß sie
- wie das Monophosphat des Östradiols -nur eine geringe Hormonwirkung aufweisen
würden. Infolgedessen ließ sich die Möglichkeit, durch derartige Verbindungen eine
erhebliche - unter Umständen eine sogar sehr große - protrahierte Wirkung zu erzielen,
noch weniger in Anbetracht der schon bekannten Tatsachen voraussehen.
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Man verwendet als Phosphorylierungsmittel vorzugsweise Phosphoroxylhalogenid,
Phosphortrihalogenid oder Thiophosphorylhalogenid, besonders -chlorid, während sich
andere Phosphorylierungsmittel jedoch auch anwenden lassen, eventuell in Kombination
mit den vorgenannten, z. B. Phenylphosphoryldichlorid.
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Es ist anzunehmen, daß die prolongierte Wirkung der neuen Verbindungen
dadurch entsteht, daß der Organismus die Verbindungen stückweise, vermeintlich durch
eine Enzymwirkung, abbaut. Es kann in einigen Fällen zweckmäßig sein, diesen Abbau
regulieren zu können. Zweck der Erfindung ist, eine Variation derjenigen Geschwindigkeit
zu ermöglichen, mit der das Steroid dem Organismus zur Verfügung gestellt wird.
Zur Erzielung dieses Zweckes kann man das Steroid phosphorylieren oder thiophosphorylieren
und dasselbe durch die P'hosp'horsäuregruppe oder -gruppen mit einem besonderen
Kupplungsstoff kuppeln. Es wird hierdurch möglich, hochmolekulare Verbindungen aufzubauen,
in denen nur einige der von den Phosphorsäuregruppen verknüpften Gruppen, z. B.
jede zweite, Steroidcharakter haben, so daß die Hormonabspaltung in entsprechendem
Grad verzögert wird.
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Als Kupplungsstoff läßt sich erfindungsgemäß ein aromatisches Di-
oder Polyamin, ein Di- oder Polyphenol oder ein Aminophenol verwenden. Als Beispiele
derartiger Stoffe sind zii nennen: Phlorogluci.n, Phloretin, Phloridzin und Phloramin.
Es gibt übrigens eine Menge anderer natürlicher oder synthetisch hergestellter Stoffe
ähnlichen Charakters, die in der hier genannten Verbindung als Kupplungsstoffe geeignet
sind.
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Die Anwendung eines Kupplungsstoffes ermöglicht ferner den Aufbau
hochmolekularer Verbindungen von Steroiden mit nur einer Hy droxylgruppe oder enolisierbarer
Ketogruppe im Molekül, während es, wenn kein Kupplungsstoff angewandt wird, notwendig
ist, daß das angewandte Steroid mindestens
zwei solcher Gruppen
im Molekül hat, um die für die Herstellung hochmolekularer Verbindungen erforderliche
Kettenbildung erzielen zu können.
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Nach einer zweckmäßigen Ausführungsform der Erfindung wird ein Steroid
mit nur einer Hydroxylgruppe oder durch Enolisierung einer Ketogruppe hergestellten
Hydroxylgruppe im Molekül mit einem Phosphorylierungsmittel unter Anwendung eines
Kupplungsstoffes mit mindestens drei Amino- oder Hydroxylgruppen oder beiderlei
Gruppen umgesetzt, indem die Moleküle dieses Kupplungsstoffes vor, während oder
nach der Kupplung mit der steroidhaltigen Gruppe durch Phosp'horylierung verkuppelt
werden. Zwei der Amino- oder Hydroxylgruppen dienen somit dem Aufbau einer Kette,
in welcher die Glieder mittels Phbsphorsäuregruppen verbunden sind. Eine dritte
Amino- oder Hydroxylgruppe hat die Aufgabe, mit Hilfe der Phosphorsäuregruppe das
Steroid zu binden, das hierdurch an die Kette gekuppelt wird.
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In der Praxis kann man bei dieser Ausführungsform der Erfindung so
verfahren, daß man zuerst das Steroid mit der äquimolaren Menge oder vorzugsweise
mit einem kleinen Überschuß des Phosphorylierungsmittels phosphoryliert. Mit Phosphoroxychlorid
als Phosphorylierungsmittel bilden sich hierdurch Verbindungen des Typs R O P (O)
C12, wobei R die Steroidgruppe bezeichnet. Dann wird der Kupplungsstoff zugesetzt,
wodurch sich Diester des Typs R O P (O) (Cl) ORl bilden, worin R1 die Kupplungsstoffgruppe
ist, oder entsprechende Esteramide. Danach wird eine neue Menge Phosphorylierungsmittel
zugesetzt, und da R1 mindestens zwei Hydroxyl- oder Aminogruppen enthält, die in
der Diester- oder Esteramidbildung nicht engagiert sind, kann bei passenden Reaktionsbedingungen
eine Kupplung mit Phosphorsäuregruppen zu hochmolekularen Verbindungen erfolgen.
Man kann auch so verfahren, daß man unmittelbar Steroid und Kupplungsstoff mischt
und dann diese Mischung phosphoryliert, oder man kann zunächst den Kupplungsstoff
phosphorylieren und dann das phosphorylierte Steroid oder das nicht phosphorylierte
Steroid und Phosphorylierungsmittel zusetzen.
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Zur Förderung des Aufbaues hochmolekularer Verbindungen kann man erfindungsgemäß
ein kondensationsförderndes Mittel, wie ein tertiäres Amin, verwenden. Beispiele
dafür sind Pyridin und Chinolin. Bisweilen wird das Kondensationsmittel auch als
Reaktionsmedium dienen können, aber es wird oft zweckmäßig sein, noch ein indifferentes
Lösungsmittel, wie Äther, Dioxan oder Aceton, zu verwenden.
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Als Beispiele von Steroiden, welche unmittelbar unter Bildung von
hochmolekularen Verbindungen phosphoryliert werden können und also mindestens zwei
Hydroxylgruppen oder durch Enolisierung von Ketogruppen gebildete Hydroxylgruppen
enthalten, sind zu nennen: Östradi-ol, Methylandrostendiol, Östriol und Testosteron.
Als Beispiele von Steroiden, die nur eine Hydroxylgruppe oder enolisierbare Ketogruppe
haben und daher mittels eines Kupplungsstoffes zu hochmolekularen Verbindungen aufgebaut
werden können, sind zu nennen: Östron, Testosteron und 19-Nortestosteron. Erfindungsgemäß
können hochmolekulare Verbindungen dieser Steroide mit Phosphorsäuren und etwaigem
Kupplungsstoff und auch entsprechende Verbindungen anderer ähnlicher Steroide hergestellt
werden.
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Wie schon erwähnt, ist es für die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen
kennzeichnend, daß sie aus im Prinzip kettenförmigen Molekülen bestehen, worin die
einzelnen Gruppen mittels Phosphorsäuregruppen verknüpft sind und worin das StProid
in Form von Steroidphosphorsäuregruppen eingeht. Die Verbindungen sind in Wasser
mit neutraler oder alkalischer Reaktion löslich und gegen Hydrolyse stabil. , Eine
prolongierte Wirkung von Steroidhormonen läßt sich am leichtesten durch Tierversuche
nachweisen. So verwendet man bei Untersuchungen der Stärke der Östrogene die sogenannte
Vaginalschabetechnik, d. h., man mißt die Dauer der vaginalen Brunst an Versuchstieren
(kastrierten Mäusen).
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Bei Untersuchungen der Stärke der Androgene kann man die Gewichtserhöhung
von Prostata verwenden, und bei der Prüfung der anabolischen Wirkung kann man die
Gewichtszunahme von levator ani als Maßstab anwenden.
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Das Resultat solcher Tierversuche ist in der Zeichnung dargestellt.
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Fig. 1 zeigt Kurven A, B, C, D über die Wirkung von Injektionen
von Östradiolbenzoat bzw. Ethinylöstradiol, Östradioldiphosphat und einem nach der
Erfindung hergestellten Polyöstradiolphosphat; Fig. 2 zeigt Kurven I, 1I und III
über die Wirkung von Injektionen des Testosteronpropionats in Öl und eines erfindungsgemäß
hergestellten Polytestosteronphloretinphosphats verglichen mit Kontrollversuchen;
Fig. 3 zeigt Kurven I und 1I über die Wirkung eines erfindungsgemäß hergestellten
Polymethylandrostendiolphosphats bzw. eines Testosteronpropionats in Öl sowie eines
Kontrollversuches, der durch den Punkt III vertreten ist.
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In Fig. 1 zeigt die Ordinate der Kurven die prozentuale Menge von
Versuchstieren, die auf die Hormoninjektion Reaktion gezeigt haben, während die
Abszisse die Anzahl der Tage nadh der Injektion angibt. Als Maßstab der Hormonwirkung
wird diejenige Anzahl Tage angewandt, bei welcher mindestens 5011/o der Versuchstiere
vaginale Brunst zeigen. Die 5011/o-Grenze ist in den Kurven punktiert dargestellt.
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Für die Injektionen wurden beim Östradioldip#hoisphat 200 Mikrogramm
und bei den übrigen Produkten 20 Mikrogramm angewandt, die in gleich großen Mengen
Propylenglykol gelöst sind. Aus den Kurven geht hervor, daß die Wirkung der Östradiolbenzoat-,
Ethinylöstradiol- und Östradioldiphosphatinjektionen etwa 4 bzw. 4 und 3 Tage anhielt,
während die Wirkung des Polyöstradiolphosphats etwa 26 Tage dauerte. Dies zeigt
klar, daß das östradiol kontinuierlich und sehr langsam aus dem Polyöstradiolphosphat
frei zemacht wird, was der Wirkung der natürlichen Hormonproduktion möglichst nahe
kommt.
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Entsprechende Versuche sind mit ganz analogen Resultaten mit dem Polyöstronphloretinphosphat
ausgeführt worden. Klinische Untersuchungen haben auch die Ergebnisse bestätigt,
-die bei den Tierversuchen erzielt wurden.
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In Fig. 2 zeigt Kurve I das Gewicht der ventralen Prostata zu verschiedenen
Zeiten nach der Verabreichung von 3,75 mg Testosteronpropionat in ' Öl an kastrierten
Ratten, Kurve II zeigt entsprechende Versuche mit 3,75 mg Polytestosterönphloretinphösphat,
und Kurve III veranschaulicht das Verhalten unhehandelter Kontrolltiere, wobei die
Ordinate das Gewicht der ventralen Prostata in Milligramm und die Abszisse die Anzahl
Tage angibt, die nach deir Injektion verlaufen sind. Jeder Punkt der Kurven gibt
das Verhalten von fünf Tieren an.
Die Kurven zeigen, daß man mit
Po.lytestosteronphloretinphosphat eine sehr einheitliche und stark prolongierte
Wirkung erzielt. Obgleich die zugeführte Testosteronmenge in Form von Polytestosteronphloretinphosphat
nur die Hälfte der in Form von Testosteronpropionat zugeführten Menge darstellt
und das erfindungsgemäße Präparat in Form einer wäßrigen Lösung, das Propionat jedoch
im Oldepot zugeführt wurde, übersteigt die Hormonwirkung des erfindungsgemäßen Präparats
nach 16 Tagen die Wirkung des Testosteronpropionats.
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In Fig. 3 zeigt Kurve I die Wirkung eines in wäßriger Lösung administrierten
Polymethylandrostendiolphosphats auf den Zuwachs von levator ani bei kastrierten
Ratten, und Kurve II zeigt die Wirkung derselben Dosis Testosteronpropionats in
Öl, während Punkt III einen Kontrollversuch darstellt. Die Ordinate zeigt die Gewichtserhöhung
in Milligramm pro 100 g Versuchstiere von lev ator ani, und die Abszisse zeigt die
Menge des administrierten Hormonpräparats in Milligramm; jeder Punkt der Kurven
bezieht sich auf fünf Tiere; die Bestimmungen sind am dreizehnten Tage nach den
Injektionen vorgenommen. Aus dem Versuch geht hervor, daß das Polymethylandrostendiolphosphat
eine starke und außerdem sehr verlängerte anabolische Wirkung aufweist.
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Daß nicht, wie bei den schon bekannten Hormonpräparaten, mit prolongierter
Wirkung die Rede von einer Depotwirkung an der Injektionsstelle ist, ließ sich durch
einen Versuch nachweisen, bei welchem zur Herstellung der erfindungsgemäßen Produkte
ein Phosphorylierungsmittel angewandt wurde, welches radioaktives Phosphor (P32)
enthält. Diese Versuche zeigten, daß die hochmolekularen Phosphorsäureverbindungen
unter anderem im Blut und in der Leber retiniert werden. In Übereinstimmung mit
dem hohen Molekulargewicht und dem Charakter der Stoffe als Polyanionen ist es wahrscheinlich,
daß sie im Organismus in Kuppelung mit Eiweißstoffen vorliegen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend durch einige Beispiele
näher erläutert. Beispiel 1 3 g Östradiol werden in 75 ml wasserfreiem Pyridin gelöst.
Die Lösung wird auf -10° abgekühlt, wonach unter Umschütteln eine Lösung von 1,1
ml Phosp'hGroxychlorid in 10 ml wasserfreiem Pyri.din zugesetzt wird. Nach der Zugabe,
die 7 ;Minuten dauert, hält man die Reaktionsmischung noch 3 Stunden auf -10° und
danach während 15 Stunden auf Zimmertemperatur. Hierdurch entsteht eine klare Lösung,
zu der feinzerquetschtes Eis zugesetzt wird. Die hierdurch gewonnene Lösung wird
im Vakuum zur Trockne eingedampft. Nach Trocknung in einem Vaku.umexsi,klcato;r
erhält man 3,8 g eines weißen Pulvers. Dasselbe wird in 2 tnl Pyridin aufgeschlämmt.
Dann werden 25m1 0,5 n-Natriumhydroxyd zugesetzt, wobei man eine Lösung erhält,
die mit Wasser auf 100 ml verdünnt wird. Danach wird durch eine Zellophantnembran
gegen 41 Wasser während 10 Stunden unter Umrühren dialysiert. Die Dialysierung wird
noch zweimal mit neuem Wasser wiederholt. Der dialysierten Lösung werden 2 ml 1
n-Salzsäure zugesetzt, wodurch Polyöstradiolphosphat in Form eines weißen, voluminösen
Niederschlags ausgefällt wird. Dieser wird abzentrifugiert und wiederholt mit 0,1
n-Salzsäure gewaschen. Dann wird im Vakuumexsilzkator getrocknet. Die Ausbeute beträgt
3 g Polyöstradiiolphosphat. Die Analyse ergibt 0,65% Feuchtigkeit, 1,35 14, Pyridin
und 9,3%. Phosphor (aus trockener Substanz berechnet).
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Beispiel 2 0,55 g Methylandrostendiol werden in 15m1 wasserfreiem
Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf -10° abgekühlt, wonach unter Umschütteln eine
Lösung von 0,18 ml Phosphoroxychlorid in 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird.
Zusatzdauer: 3 Minuten. Die Reaktionsmischung wird wie im Beispiel 1 behandelt und
hydrolysiert. Die gewonnene Lösung wird eingedampft und gibt nach Trocknung im `'akuumexsikkator
0,65 g eines gelben Pulvers. Dieses enthält 60% nicht dialysierbaren Polymethylandrostendiolphosphats.
Beispiel 3 0,016 g Östriol werden in 0,8 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung
wird auf -15° abgekühlt, wonach 0,55m1 einer Lösung von 0.5m1 Phosphoroxychlorid
in 59 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt werden. Die Reaktionsmischung bleibt 5 Stunden
bei - 5° stehen und wird danach wie im Beispiel 2 aufgearbeitet. Die Ausbeute beträgt
0,0125g Polyöstriolphosphat. Beispiel 4 0,5 g Testosteron werden in 10 ml wasserfreiem
Pyridin gelöst, Bei -10° gibt man diese Lösung tropfenweise unter Umschütteln zu
einer Lösung von 0,19 ml Phosphoroxychlorid in 6 ml wasserfreiem Pyridin. Zusatzdauer:
4 Minuten. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei -10° stehen, wonach sie unter Umschütteln
und Abkühlung tropfenweise zu einer Lösung von 0,47 g Phloretin in 5 ml wasserfreiem
Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer: 2 Minuten. Die Mischung bleibt bei -10° während
1/2 Stunde stehen, wonach unter Umschütteln eine Lösung von 0,15 ml Phosphoroxychlorid
in 5 ml wasserfreiem Pvridin zugesetzt wird. Zusatzdauer: 3 Minuten. Die Mischung
bleibt dann 3 Stunden bei -10° und danach bei Zimmertemperatur noch 15 Stunden stehen.
Dann wird zu der Mischung feinzerquetschtes Eis zugesetzt, und nach Abfiltrieren
einer kleineren Menge von ungelöstem Stoff wird die Lösung im Vakuum zur Trockne
eingedampft. Der eingedampfte Rest wird in 10 ml 2 n-Natriumhydroxyd gelöst und
mit 15 ml 2 n-Salzsäure gefällt, die mit 1\atriumchlorid gesättigt ist. Das Produkt
wird abfiltriert, mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und danach im @ralcuumexsilclcator
getrocknet. Die Ausbeute beträgt 1,8 g; das Produkt enthält 75°/m von nicht dialysierbarem
Polytestosteronphloretinphospllat. Beispiel s 0,251 g Testosteron werden in 5 ml
wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird unter Umschütteln bei -10° zu einer
Lösung von 0,095 ml Phosphoroxychlorid in 3 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Zusatzdauer:
2 Minuten. Die ?Mischung bleibt 1/2 Stunde bei -10° stehen, wonach sie unter Urrschütteln
und Abkühlung tropfenweise zu einer Lösung von 0,11 g Phloroglucin in 2,5 ml wasserfreiem
Pyridin zugegeben wird. Zusatzdauer: 2 Minuten. Die Mischung bleibt 1 Stunde bei
-10° stehen, wonach ihr unter Utnschütteln eine Lösung von 0,075 ml Phosphoroxychlorid
in 2,5 ml Pyridin zugesetzt wird. Die Mischung bleibt dann 3 Stunden
bei
-10° und bei Zimmertemperatur noch 15 Stunden stehen. Danach wird feinzerquetsches
Eis zugesetzt, und die gewonnene Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft,
wonach die Aufarbeitung gemäß Beispiel 4 erfolgt. Die Ausbeute beträgt 0,33 g, und
das Produkt enthält 93°/o von nicht dialysierbarem Polytestosteronphloroglucinphosphat.
Beispiel 6 0,235 g östron werden in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung
wird unter Ums-chütteln zu einer Lösung von 0,095 ml Phosphoroxychlorid in 3 ml
wasserfreiem Pvridin gesetzt. Die Zusatzdauer ist 3 Minuten. Die Mischung bleibt
1/2 Stunde bei -10° stehen, wonach sie unter Umschütteln und Kühlung in eine Lösung
von 0,11 g Phloroglucin in 2,5 ml wasserfreiem Pyridin tropfenweise gegeben wird.
Zusatzdauer: 2 Minuten. Die Behandlung wird gemäß Beispiel 4 fortgesetzt. Die Ausbeute
beträgt 0,33 g. Das Produkt enthält 9111/9 von nicht dialysierbarem Polyöstronphloroglucinphosphat.
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Beispiel ? 0,47 g Ostron «erden in 10 ml wasserfreiem Pyridin gelöst.
Diese Lösung wird unter Umschütteln zu einer auf -10° abgekühlten Lösung von 0,18
ml Phosphoroxychlorid in-5 ml wasserfreiem Pyridin gesetzt. Die Zusatzdauer ist
4 Minuten. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei - 10° stehen, wonach sie unter Umschütteln
tropfenweise einer auf -10° gekühlten Lösung von 0,47 g Phloretin in 5 ml wasserfreiem
Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer: 3 Minuten. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei
-10° stehen, wonach ihr unter Abkühlung und Umschütteln eine Lösung von 0,15 ml
Phosphoroxychlorid in 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Die Mischung bleibt
11/z Stunde bei -10° stehen, wonach feinzerquetschtes Eis zugesetzt wird. Ein wenig
Niederschlag, der nicht in Lösung geht, wird abfiltriert, und das Filtrat wird im
Vakuum zur Trockne eingedampft, wonach es in derselben Weise wie im Beispiel 4 aufgearbeitet
wird. Die Ausbeute beträgt 1,05 g. Das Produkt enthält 951/o von nicht dialysierha.rem
Polyöstronphloretinphosphat. Beispiel 8 0,235 g östron werden in 5 nil wasserfreiem
Pyridin gelöst. Die Lösung wird unter Umschütteln zu einer auf -10° abgekühlten
Lösung von 0,095 ml Phosphoroxychlorid in 3 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Zusatzdauer:
2 Minuten. Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei - 10° stehen, wonach sie unter Urnschütteln
tropfenweise zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 0,264 g Quercetin in 2,5 ml
wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer: 2 Minuten. Die Mischung bleibt
1 Stunde bei -10° stehen, wonach sie unter weiterer Kühlung und Umschütteln zu einer
Lösung von 0,075 ml Phosphoroxychlorid in 2,5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt
wird. Zusatzdauer: 2 Minuten. Die Mischung bleibt 3 Stunden bei -10° stehen, wonach
feinzerquetschtes Eis zugesetzt wird. Die hierdurch gewonnene Lösung wird im Vakuum
zur Trockne eingedampft und gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet. Die Ausbeute ist 0,65
g. Das Produkt enthält 95 % von nicht dialysierbarem Polyöstronquercertinphosphat.
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Beispiel 9 0,235 g östron werden in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst.
Diese Lösung wird unter Umschütteln zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 0,095
ml Phosphoroxychlorid in 3 ml- wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Zusatzdauer: 2 Minuten.
Die Mischung bleibt 1/2 Stunde bei -10° stehen, wonach sie unter Umschütteln tropfenweise
zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 0,37 g Phloridzin (wasserfrei) in 5 ml wasserfreiem
' Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer: 2 Minuten. Die Mischung bleibt 11/2 Stunde
bei -10° stehen, wonach unter fortgesetzter Kühlung und Umschütteln eine Lösung
von 0,12 ml Phosphoroxychlorid in 4 ml wasserfreiem Pyridin zugegeben wird. Zusatzdauer:
2 Minuten. Die Mischung bleibt 2 Stunden bei -10° stehen, wonach feinzerquetschtes
Eis zugesetzt wird. Die Aufarbeitung erfolgt dann wie im Beispiel 4 angegeben. Die
Ausbeute beträgt 1,1 g. Das Produkt enthält 94% nicht dialysierbares Polyöstronphloridzinphosphat.
Beispiel 10
0,235g östron werden in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die
Lösung wird unter Umscbütteln zu einer auf -10° gekühlten Lösung von 0,095 ml Phosphoroxychlorid
in 3 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Zusatzdauer: 2 Minuten. Die Mischung bleibt
1/2 Stunde bei - 10° stehen, wonach sie unter Umschütteln zu einer auf - 10° gekühlten
Lösung von 0,53 g Rutin (wasserfrei) in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst zugesetzt
wird. Zusatzdauer: 2 Minuten. Die Mischung bleibt bei - 10° 11/2 Stunde stehen,
wonach ihr unter fortgesetzter Kühlung und Umschütteln eine Lösung von 0,19 ml-
Phosphoroxychlorid in 6 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt wird. Zusatzdauer: 3 Minuten.
Die Mischung bleibt 15 Minuten bei - 10° stehen, wonach feinzerquetschtes Eis. zugesetzt
wird. Die Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 4. Die Ausbeute ist 0,6 g. Das Produkt
enthält 901/0 nicht dialy sierbares Polyöstronrutinphosphat. Beispiel
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0,25g östradiol werden in 10m1 wasserfreiem Pyridin gelöst. Unter Abkühlung
und Umschütteln wird bei -10° eine Lösung von 0,13m1 Thiophosphorylchlorid in 5
ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Zusatzdauer: 5 Minuten. Die Mischung bleibt 3
Stunden bei -10° stehen und dann noch 15 Stunden bei Zimmertemperatur. Dann wird
feinzerquetschtes Eis zugesetzt, wonach die gewonnene Lösung im Vakuum zur Trockne
eingedampft wird. Der Rest wird nach Eindampfung mit 2 n--Salzsäure verrieben, filtriert,
mit Wasser gewaschen und schließlich im Vakuumexsikkator getrocknet. Die Ausbeute
beträgt 0,3 g. Das Produkt enthält 95 % nicht dialysierbares Polyöstradiolthiophosphat.
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Beispiel 12 0,272g östradiol und 0,11g Resorcin werden in 5 ml wasserfreiem
Pyridin gelöst. Unter Umschüttelii wird bei -10° eine Lösung von 0,19 ml Phosphoroxychlorid
in 5 ml wasserfreiem Pyridin zugesetzt. Zusatzdauer: 3 Minuten. Die Mischungbleibt
3 Stunden bei -10° und danach weitere 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen.. Dann
wird feinzerquetschtes Eis zugesetzt, und nach 24stündigem Sbehenlassen hat sich
eine klare Lösung gebildet, die im Vakuum zur Trockne eingedampft wird. Das Produkt
wird in 10 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung gelöst und mit 5 ml 5 n-Salzsäure gefällt.
Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und mit einigen ml Wasser gewaschen
und danach im Vakuumexsikkator getrocknet. Die
Ausbeute beträgt
0,5 g. Das Produkt enthält 96% nicht dialysierbares Polyöstradiolresorcinphosphät.
Beispiel 13 0,55g Östradiol werden unter Erwärmen in 5m1 wasserfreiem Dioxan gelöst.
Danach werden 0,19M1 Phosphoroxyclilorid zugesetzt und die Lösung auf dem Dampfbad
unter Rückkühlung erwärmt. Nach Ablauf von 17 Stunden hat sich eine amorphe Masse
gebildet. Die Mischung wird abgekühlt, und 20 ml Wasser werden zugesetzt. Man erhält
einen Niederschlag, welcher abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuumexsikkator
getrocknet wird. Die Ausbeute. beträgt 0,71 g. Das Produkt enthält 75 0/0 nicht
dialysierbares Polyöstradiolphosphat. Die Analyse ergibt einen Feuchtigkeitsgehalt
von 3,1%, während der Phosphorgehalt der getrockneten Probe 8,2 % beträgt. Beispiel
14 0,3g Testosteron werden in 10m1 wasserfreiem Pyridin gelöst. Bei 20° werden auf
einmal 0,11m1 Phosphoroxychlorid zugesetzt. Die Mischung bleibt 48 Stunden bei Zimmertemperatur
stehen, wonach sie auf dem Dampfbad 1 Stunde erwärmt wird. Dann wird sie abgekühlt,
und es wird feinzerquetschtes Eis zugesetzt. Die gebildete Lösung wird im Vakuum
zur Trockne eingedampft. Der Rest nach der Eindampfung wird mit verdünnter Salzsäure
bearbeitet. Man erhält ein rötliches Pulver, das bei Dialyse einen Gehalt von 90%
nicht dialysierbarem Polytestosteronphosphat enthält. Beispiel 15 0,55g Östradiol
werden in S ml Dioxan gelöst. Nach Zusatz von 0,18 ml Phosphortrichlorid wird die
Lösung 25 Stunden auf dem Dampfbad unter Rückfluß erwärmt. Nach Abkühlung wird feinzerquetschtes
Eis zugesetzt, wobei sich ein weißer Niederschlag bildet. Dieser wird abfiltriert
und mit Wasser gewaschen. Nach Trocknung im Vakuumexsikkator erhält man 0,66 g eines
weißen Pulvers. Das Produkt enthält etwa 50% nicht dialysierbares Polyöstradiolphosphit.
Der Phosphorgehalt beträgt 9,3%.