DE3537569A1

DE3537569A1 - Inositoltriphosphate, verfahren zu deren herstellung und zusammensetzungen, welche diese enthalten

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Publication number: DE3537569A1
Application number: DE19853537569
Authority: DE
Inventors: Matti Gordola Sirén
Original assignee: Individual
Current assignee: Perstorp AB
Priority date: 1984-10-23
Filing date: 1985-10-22
Publication date: 1986-05-22
Also published as: FR2571967B1; AU4893185A; US4794014A; JPS61171422A; US4777134A; JPS61171789A; SE8503165D0; GB8526079D0; ATE41853T1; DE3569188D1; IL76777A; JPH0515719B2; FI854128A0; FR2571967A1; GB2167283B; EP0179441B1; GB2169602A; NO168227B; FI82474C; NO854211L

Description

Inositoltriphosphate, Verfahren zu deren Herstellung und Zusammensetzungen, welche diese enthalten

Die Erfindung betrifft ein spezielles Inositoltriphosphat (IP-.) , ein Verfahren zur Herstellung desselben unc Zusammensetzungen, welche dieses enthalten.

Schon im Jahre 1900 haben verschiedene Forscher über das Auffinden der organischen Phosphatverbindungen Phitinsäure, d.h. 1,2,3,4,5,6-Hexakis(dihydrogenphosphat)-myo-inositol (manchmal auch Inositol-hexaphosphorsäure genannt) in Pflanzen berichtet. Der Gehalt an Phytinsäure in verschiedenen Pflanzen variiert erheblich. Im Getreide beträgt der Gehalt mit gewissen Ausnahmen ungefähr 0,5 bis 2 %. Polierter Reis hat ein Niveau von lediglich 0,1 %, während wilder Reise bis zu 2,2 % Phytin-

säure enthält. Bohnen enthalten etwa 0,4 bis 2 %, Ölpflanzen annähernd 2 bis 5 % und Pollen 0,3 bis 2 %. Der Gehalt an Phytinsäure in den Pflanzen variiert während der Wachstumsperiode. Weiterhin wird der Gehalt unter anderem auch durch das Klima beeinflusst.

In der Literatur finden sich Berichte über das Vorkommen von Inositolpentaphosphat (IP₁-) und Inositoltetraphosphat (IP₄)In einigen Pflanzen. Weiterhin ist es bekannt, dass Phosphatderivate, die niedriger als IP, sind, bei der Keimung von Getreide gebildet werden. Beispielsweise sind die Endprodukte bei der Keimung Inositol und Phosphat. Die Verwendung von IP, ist in verschiedenen wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben worden. Die Mehrheit der Autoren dieser Artikel haben eine Reihe von negativen Wirkungen beim Menschen und bei Tieren beim Verzehr von IP, oder von Substanzen, welche

IP, enthalten, beobachtet. Ernährt man Hunde z.B. mit zu

hohen Mengen an IP_r, dann wird dadurch eine Rachitis entwickelt. Beim Menschen hat man einen Zinkmangel und dadurch verursacht ein geringeres Wachstum der Kinder beobachtet. Hauptsächlich bei Frauen hat man eine Anämie festgestellt. Wegen der vorerwähnten negativen Wirkungen auf das Mineralgleichgewicht bei Mensch und Tier hat man sich bisher darum bemüht, die Aufnahme von IP, und dessen Derivaten auf ein Minimum zu reduzieren.

Weiterhin ist es beispielsweise aus Bull. S te. Chim. Biol. 36,9 (1957), S. 85, bekannt, Phytinsäure mit verdünnter Salzsäure bei erhöhter Temperatur zu hydrolysieren, unter Erhalt einer Mischung von niederen Inositol-

phosphaten, d.h. IPc' ^IP4 ' IPo / IP„ (Inositoltriphosphat) und IP (Inositolmonophosphat). Jedes dieser Inositolphosphate kann in. Form von zahlreichen Isomeren vorliegen. Bei IP., kann man bis zu 20 Isomere erwarten. 5

Ein spezielles Isomer von IP-., nämlich D-Myo-inositol-1,4,5-triphosphat, wird in Biochem. Biophys. Res. Commun. 120,2 (1984), S. 481, beschrieben. Diese Verbindung ist als ein intrazellularer Calciummobilisator im menschlichen Körper bekannt und kann leicht aus Zellmembranen isoliert werden.

Nichts ist jedoch über die Eigenschaften der anderen der speziellen Isomeren der unterschiedlichen Inositoltriphosphate in reiner Form bekannt. Es ist äusserst schwierig, die grosse Anzahl von ΐΡ-,-Isomeren voneinander zu isolieren und dadurch die Strukturformeln der jeweiligen Isomeren und deren Eigenschaften zu identifizieren und zu definieren. Bisher gab es keine bekannte Verfahrensweise, irgendein einzelnes Isomer von IP^, ausser dem vorerwähnten D-Myo-inositol-1,4,5-triphosphat, herzustellen. Weiterhin muss man ein Verfahren zur Herstellung von IP3/ bei dem ein Hydrolysesystem, eine Umlagerung der beiden Isomeren und/oder eine weitere Dephosphorylierung zu IP« oder IP₁ oder Inositol eingeschlossen ist, als ein spezielles Problem auffassen.

Aufgrund der obigen Schwierigkeiten liegen derzeit keine Daten vor über spezielle ΙΡ-,-Isomere in im wesentliehen reiner Form, ausser dem vorerwähnten D-Myoinositol-1 ,4 ,5-triphosphat.

Deshalb ist es gemäss der vorliegenden Erfindung ganz unerwartet möglich geworden, das obige Problem der Auftrennung von gewissen unterschiedlichen Isomeren von IP₃ voneinander zu lösen und diese in im wesentlichen reiner Form zu produzieren. Die ü^-Isomere kann man als Salze oder als Säuren erhalten. Die Salzform wird bevorzugt, weil sie leichter in reiner und in kcnzentrierterer Form als die Säure hergestellt werden kann.

Erfindungsgemäss ist ein Inositoltriphosphat (IP-.) aus der Gruppe D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat, D-Myoinositol-1,2,5-triphosphat, L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat und Myo-inositol-1,2,3-triphosphat in entweder der Säure- oder der Salzform in im wesentlichen reiner Form hergestellt und isoliert worden.

Wie vorerwähnt, kann man die individuellen IP.,-Isomere als Salze oder als Säuren erhalten. Beide Formen können erfindungsgemäss zum ersten Mal in im wesentlichen reiner Form erhalten werden.

Das IP₃ in Säureform wird im allgemeinen in Form einer wässrigen Lösung zur Verfügung gestellt. In einem solchen Fall beträgt die Konzentration der Säure 10 bis 45, vorzugsweise 15 bis 45 und ganz besonders bevorzugt 20 bis 45 Gew.% des Gesamtgewichtes der Lösung.

Die Salzform des ΙΡ-,-Isomers kann man leicht unter Anwendung üblicher Verfahren aus der Säureform erhalten.

So kann man sie als Salze mit Alkalimetallen oder Erd-

alkalimetallen, z.B. Lithium, Natrium, Kalium, Calcium oder Magnesium, herstellen. Aber auch die Aluminium-, Zink- und Eisensalze sind sehr brauchbar und ebenso auch die NH - und die organischen Aminsalze. Darüber hinaus kann man Mischsalze, welche unterschiedliche Kationen enthalten, verwenden.

Geeignete Amine sind beispielsweise Triethanolamin, Diethanolamin, Triisopropanolamin, N,N-Dimethyl-2-amino-2-methyl-i-propanol, Ν,Ν-Dimethyl-ethanolamin, Tetrabutylamin und Cyclohexylamin. Auch andere Salze können brauchbar sein. Ganz besonders bevorzugt sind Salze, die physiologisch annehmbar sind.

Für die Herstellung des Isomers oder der Isomeren von IP., gemäss der vorliegenden Erfindung können eine oder mehrere der Verbindungen IP,, IP,- oder IP. oder Naturprodukte, welche wenigstens eine dieser Verbindungen enthalten, als Ausgangsmaterial verwendet werden. Vorzugsweise verwendet man IP₆ enthaltende Materialien,

weil diese am besten verfügbar sind. In den Fällen, in denen das Ausgangsmaterial· als Naturprodukt vorliegt, werden solche mit einem Gehalt von wenigstens 0,3 % und vorzugsweise wenigstens 1 Gew.% Inositolphosphat

25 (^Ip ₆ ^{+ IP}5 ^{+ 1}^V bevorzugt ausgewählt.

Besonders geeignete Produkte sind Getreide, insbesondere Kleie, Pollen, Bohnen und Ölpflanzen. Alle dieses Produkte enthalten IPg.
30

In der Theorie kann man IP-,-Isomere wahrscheinlich nach

den folgenden Verfahrensweisen herstellen:

(1) durch enzymatischen Abbau, ausgehend von IP., IP,- und/oder IP,-;

4 b b

(2) durch chemische Hydrolyse, ausgehend von IP₄, IP₅ und/oder IPg;

(3) durch chemische Synthese, indem man bei-

spielsweise von Inositol, IPw IP₂ und Phos

phat ausgeht;

(4) durch enzymatische Synthese, indem man beispielsweise von Inositol, IP₁/ IP-> und Phos-

15 phat ausgeht;

(5) durch mikrobiologische Produkten, einschliesslich Hybrid-DNA-Techniken; und

(6) durch chemische oder enzymatische Migration von Inositolphosphaten oder chemische oder enzymatische Hydrolyse von substituiertem Inositolphosphat.

Kombinationen von zwei oder mehr der vorerwähnten Verfahrensweisen sind ebenfalls möglich. Jedoch werden bei zahlreichen dieser Verfahrensweisen nur Mischungen einer Anzahl von Isomeren gebildet, die dann im besten Fall ausserordentlich schwierig in die einzelnen Iso-

30 meren, wenn überhaupt, aufgetrennt werden können.

Erfindungsgemäss wird ein Verfahren bevorzugt, bei dem man ein IP, enthaltendes Material vorzugsweise anwendet. Denn IP, wird enzymatisch mittels Phytaseenzym zu IP₃ aufgebrochen. Phytaseenzym liegt normalerweise bei allen Inositolphosphat enthaltenden Pflanzen und Samen vor. Deshalb ist es bei der vorliegenden Erfindung im allgemeinen nicht erforderlich das Enzym zuzugeben, wenn ein Naturprodukt als Ausgangsmaterial verwendet wird. In den Fällen, in denen das Naturprodukt eine zu TO niedrige enzymatisch^ Aktivität aufweist oder wenn man IP,, IP₅ oder IP. oder eine Mischung davon als Ausgangsmaterial verwendet, wird Phytaseenzym von beispielsweise Kleie zugegeben.

Phytaseenzym aus Pflanzen, Samen und Mikroorganismen hat die überraschende Wirkung, dass man erfindungsgemäss die vorerwähnten ΙΡ-,-Isomere in hohen Konzentrationen und in im wesentlichen reiner Form erhalten kann.

Das IP,- kann entweder als reines Material oder in

Form einer IP, enthaltenden Quelle zur Verfügung gestellt werden. Ein geeigneter Weg, ein natürliches IP, enthaltendes Ausgangsmaterial, wie beispielsweise Kleie, zu behandeln, besteht darin, dass man dieses vorbehandelt, z.B. indem man die äusseren Membranen aufbricht oder entfernt und unerwünschte Bestandteile entfernt. Anschliessend wird das Material in Wasser eingeweicht, um das Inositolphosphat für den Aufschluss verfügbar zu machen und das Enzym zu aktivieren. Wird zusätzliches Enzym benötigte, so kann man dies in dieser Stufe oder einer späteren Stufe zugeben. Dann lässt

man das Enzym solange einwirken wie erforderlich, um den erwünschten Hydrolysegrad zu erzielen.

Die Hydrolyse findet bei einer geeigneten Temperatur im allgemeinen bei 20 bis 70⁰C und vorzugsweise 30 bis 60⁰C und einem pH-Wert von 4 bis 8 statt. Um die Hydrolyse bei dem beabsichtigten Niveau abzubrechen, kann man das Enzym zerstören oder inaktivieren, beispielsweise durch schnelles Erhitzen des hydrolysierten Ausgangsmaterials. Um das Material in eine Form zu bringen, bei welcher es während der Lagerung stabil ist, kann man es in geeigneter Weise gefriertrocknen.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Inositoltriphosphat (IP-,) , ausgewählt aus der Gruppe D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat, D-Myo-inositol-1,2,5-triphosphat, L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat und Myo-inositol-1,2,3-triphosphat in entweder der Säure- oder Salzform, wobei ein IP, enthaltendes Material bei einer Temperatur im Bereich zwischen 20 und 70⁰C und vorzugsweise 30 bis 50⁰C bei einem pH-Wert von 4 bis 8 mit Phytase inkubiert wird, bis etwa 30 bis 60 % und im allgemeinen etwa 50 % des gesamten Esterphosphors freigesetzt worden sind. In diesem Stadium hat sich ein hoher Anteil an gewünschten IP-x-Isomer oder -Isomeren durch die Hydrolyse des IPg~ haltigen Materials gebildet.

Das Gemisch der so erhaltenen Inositolphosphate kann anschliessend säulenchromatografisch unter Isolierung

der ΙΡ,,-enthaltenden Fraktionen aufgetrennt werden. Bei einer chromatografischen Trennung wird dann die Fraktion gewünschtenfalls einer weiteren chromatograf ischen Trennung, vorzugsweise in einer Säule, unterworfen. Eine solche Trennung kann vorteilhaft sein, falls die Fraktion mehr als ein.IP--Isomer enthält. Das IP,.-Isomer oder die IP^-Isomere werden dann vorzugsweise in der Säureform isoliert. Durch Zugabe einer Base zu der Säure kann man gewünschtenfalls das IP₃ in der Salzform erhalten.

Von den zahlreichen Quellen für Phytase, die erfindungsgemäss eingesetzt werden können, ist Hefe und insbesondere Bäckerhefe bevorzugt. Schwedische Bäckerhefe, hergestellt von Jästbolaget, Schweden, sowie Bäckerhefe, hergestellt von Rajamäki, Finnland, und Hefefabriken AG, Schweiz, sind beispielsweise bei der vorliegenden Erfindung verwendet worden. Bei der Verwendung solcher Hefen wurde sehr überraschend festgestellt, dass man im wesentlichen nur ein Isomer erhält, nämlich D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat. Selbstverständlich ist die Verwendung von Hefe ein sehr wertvolles Verfahren, wenn es nur erwünscht ist, dieses eine Isomer zu erhalten.

Nach dem derzeitigen Wissensstand gibt es keine andere Methode, bei der man nur ein einziges isomeres Produkt erhält. Im allgemeinen erhält man ein Gemisch von zahlreichen Isomeren.

Das oben angewendete Verfahren kann mit geeigneten

Modifizierungen auch dazu verwendet werden, wenn eine oder mehrere der Verbindungen IP_fi, IPc oder IP₄ per se als Ausgangsmaterial verwendet werden.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung betrifft diese auch eine Inositolphosphat-Zusammensetzung aus D-Myo-inositol-1,2,6-triphopshat und wennigstens eine der Verbindungen D-Myo-inositol-1,2,5-triphosphat, L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat und Myoinositol-1,2,3-triphosphat in Säure- oder Salzform. Die Zusammensetzung enthält im allgemeinen 20 bis 99,5 und vorzugsweise 30 bis 99,5 Gew.% an IP3. Der Gehalt an D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat liegt im Bereich von 50 bis 100 %, bezogen auf das Gewicht des Gesamtgehalts an Inositoltriphosphaten und der Rest schliesst Inositolphosphate, die von IP₃ verschieden sind, ein.

Manchmal ist es bevorzugt, dass das IP₃ in der Zusammensetzung im wesentlichen allein aus D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat besteht.

Darüber hinaus kann ausser IP₃ der Rest der Inositolphosphat-Zusammensetzung auch Inositoltetraphosphat (IP₄) und Inositoldiphosphat (IP₂) enthalten.

Die Zusammensetzung kann aus 20 bis 99,5 Gew.% und vorzugsweise 60 Gew.% IP₃ und 80 bis 0,5 Gew.%, vorzugsweise weniger als 40 Gew.% an anderen Inositolphosphaten bestehen. 40 bis 85 Gew.% und vorzugsweise

30 50 bis 85 Gew.% an den anderen Inositolphosphaten

sollten dann aus IP„ plus IP. bestehen. Es kann bevor-

zugt sein, dass das IP^ im wesentlichen aus D-Myoinositol-1 , 2 ,6-triphosphat besteht.

Die Zusammensetzung enthält manchmal geringere Mengen, d.h. weniger als 10 Gew. % und vorzugsweise 1 bis

8 Gew.% IP. und/oder IP₁-, berechnet auf den Gesamt-I b

gehalt an Inositolphosphaten in der Zusammensetzung.

Solche Arten der Zusammensetzung erhält man, indem man das ursprüngliche Fermentations-Inositolphosphat-Produkt durch Zugabe von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat auf die gewünschte Endkonzentration des Isomers in der Zusammensetzung anreichert. Solche Methoden sind aus dem Stand der Technik bekannt und schliessen beispielsweise einfaches mechanisches Vermischen ein. Alternativ kann man diese Zusammensetzung direkt herstellen, indem man unter Verwendung von Hefe und insbesondere von Bäckerhefe als Phytasequelle fermentiert. Wie schon zuvor angegeben, ergibt die Verwendung von Bäckerhefe die nahezu ausschliess-.liehe Produktion von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat, d.h. , dass im wesentlichen die gesamte ΙΡ-,-Fraktion D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat ist.

Das erfindungsgemässe Inositoltriphosphat in der Säureoder Salzform kann als Arzneimittel-oder als Nahrungsmittelzusatz oder als Stabilisator für verschiedene Produkte verwendet werden. Darüber hinaus kann IP bei Samen eine Schutzwirkung haben. Es kann als Additiv für Zahnpasten, als Korrosionsinhibitor in Farben, Lacken, Schmierölen, und bei der Oberflächenbehandlung

von Metallen, als Komponente in Reinigungsmitteln, als schlammbeständiges Mittel für lithografische Anwendungen, für die Inhibierung, z.B. die Aflatoxin-Produktion bei Mikroorganismen, und für eine Modifizierung oder Erhöhung der Enzymaktivität von Amyläse beispielsweise verwendet werden.

Die entweder direkt durch Fermentation erhaltene Inositolphosphat-Zusammensetzung oder die, die in der zuvor beschriebenen Weise durch Anreicherung erhaltene, ist für all die vorerwähnten Anwendungen geeignet.

Die zuvor genannten ΙΡ,,-Isomere haben die folgenden Formeln:

D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat der Formel

worin X Wasserstoff, wenigstens ein einwertiges, zweiwertiges oder dreiwertiges Kation bedeutet, oder eine Mischung davon und η die Anzahl der Ionen und ζ die jeweilige Ladung des Ions bedeuten;

30 D-Myo-inositol-1,2,5-triphosphat der Formel

ΟΡΟ

r\ . χ

ΟΡΟ

2-

worin X, η und ζ die zuvor angegebenen Bedeutungen haben ;

Myo-inosItol-1,2,3-triphosphat der Formel

η . X

worin X, η und ζ die zuvor angegebenen Bedeutungen haben; und

L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat der Formel

η- . X

worin X, η und ζ die zuvor angegebenen Bedeutungen haben

In all den obigen Formeln hat η die Bedeutung 6 bis

und ζ liegt im Bereich von 1 bis 6. Vorzugsweise beträgt η 3 bis 6 und ζ 3, 2 oder 1·

Die neuen IP^-Isomere gemäss der Erfindung sind besonders für die schon erwähnte therapeutische Anwendung geeignet und sie weisen bei dieser Verwendung insbesondere keine unerwünschten Nebenwirkungen auf. Insbesondere ist D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat besonders wirksam und zeigt eine grössere Aktivität im Vergleich zu den anderen Isomeren, insbesondere D-Myo-inositol-1,4,5-triphosphat. Komplexe, die sich aus D-Myo-inositol-1 ,2 ,6-triphosphat mit Cadmium bilden, sind wesentlich stabiler als Cd-Komplexe, die sich z.B. mit D-Myo-inositol-1,4,5-triphosphat bilden. In einem weniger grossen Masse sind D-Myo-inositol-1,2,5-triphosphat, L-Myo-inositol-1,3,4-tr!phosphat und Myo-inositol-1,2,3-triphosphat auch wünschwenswerte für therapeutische Anwendungen als D-Myo-inositol-1,4,5-triphosphat aus im wesentlichen den gleichen Gründen.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Ausführungsbeispiele und unter Bezugnahme auf die Figuren und Tabellen näher erläutert. Beispiele 1 und 2 zeigen die Hydrolyse von_Natriumphytat mit Weizenphytase und die Fraktionierung einer Mischung von Inositolphosphaten. Beispiele 3 und 4 beziehen sich auf die Strukturbestimmung von Isomeren von IP3· Beispiel 5 beschreibt die Bestimmungen von pKa-Werten für IP^ . Beispiel 6 zeigt die Bestimmung der relativen Bindungskonstanten für IP₃ mit Ca, Zn und Cd. Beispiele 7 bis 10 beziehen sich auf die Aufarbeitungsverfahren für

Calciumsalze von ΙΡ,-Isoraeren gemäss der Erfindung. Beispiel 11 beschreibt das Infrarotspektrum des CaI-ciumsalzes von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphaten. Beispiele 12 und 13 zeigen die Hydrolyse von Natriumphytase mit Weizenkleie und eine Fraktionierung des so erhaltenen Inositolphosphat-Gemisches. Beispiel 14 bezieht sich auf ein Aufarbeitungsverfahren für das Zinksalz von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat. Beispiele 15 bis 17 zeigen eine Hydrolyse von Natriumphytat mit Bäckerhefe, eine Fraktionierung des erhaltenen Gemisches von Inositolphosphat und die Bestimmung des einzigen von IP₃ erhaltenen Isomers.

Beispiel 18 beschreibt die Aufarbeitungsweise des Natriumsalzes von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat.

Beispiel 19 zeigt eine chemische Hydrolyse von Natriumphytat mit Chlorwasserstoffsäure und die Fraktionierung des erhaltenen Inositolphosphat-Gemisches. Beispiel 21 bezieht sich auf eine chemische Synthese von Inositolphosphaten aus Polyphosphorsäure und Myoinositol und eine Strukturbestimmung von IP^ mit H-NMR. Beispiel 21 zeigt die Hydrolyse von Phytinsäure in Reiskleie und die Extraktion und Analyse der so erhaltenen Inositolphosphate. Beispiel 22 bezieht sich auf die Charakterisierung der verschiedenen Salze von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat. Beispiel 23 zeigt dass IP-, eine Erhöhung der Plättchenaggregations, die durch Rauchen verursacht wird, beim Menschen inhibiert. In Beispiel 24 wird gezeigt, dass durch die Injizierung von IP-. einem erhöhten Blutglucoseniveau bei Mäusen, verursacht durch freie Radikale, entgegengewirkt werden kann.

BEISPIEL 1 ........

Hydrolyse von Natriumphytat mit Weizenphytase und Fraktionierung eines Inositolphosphat-Gemisches. 5

1,6 g-Mengen von Natriumphytat (Mais, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri/USA) wurden in 650 ml Natriumacetat-Puffer bei einem pH von 5,2 gelöst. 2,7 g Weizenphytase (EC 3.1.3.26, 0,015 U/mg, von Sigma Chemical Co.) wurden zugegeben und die Mischung wurde bei 38°C inkubiert.

Die Dephosphorylierung erfolgte, indem man den freigegebenen anorganischen Phosphor bestimmte. Nach 3 Stunden, nachdem 50 % anorgansicher Phosphor freigegeben worden waren, wurde die Hydrolyse durch Zugabe von 30 ml Ammoniak bis zu einem pH-Wert von 12 unterbrochen. Man erhielt eine flüssige Mischung, die Inositolphosphat enthielt.

350 ml der Mischung wurden über eine Ionenaustausch-kolonne (Dowex 1, Chloridform, 25 mm χ 250 mm) gegeben und mit einem Lineargradienten von Chlorwasserstoff säure, 0 bis 0,7 N HCl, eluiert. Aliquote der eluierten Fraktionen wurden vollständig hydrolysiert, um den Gehalt an Phosphor und Inositol zu bestimmen. Die Menge an Phosphor gegenüber dem eluierten Volumen wird in Fig. 1 gezeigt; Die Peaks entsprechen den verschiedenen Inositolphosphaten, d.h. ein Peak mit einem Verhältnis von Phosphor zu Inositol von 3:1 besteht aus Inositoltriphosphat etc.. Zwei Fraktionen

_:ϊ Λ fi

- 21 -

mit einem Verhältnis von Phosphor zu Inositol von 3:1 wurden erhalten.

BEISPIEL 2

Fraktionierung von Inositoltriphosphaten.

100 ml der ersten gemäss Beispiel 1 erhaltenen Fraktion mit einem Phosphor/Inositol-Verhältnis von 3:1 wurden neutralisiert und als Bariumsalz nach Zugabe einer 10 %-igen überschüssigen Menge von 0,1 M Bariumacetatlösung ausgefällt. 600 mg des ausgefällten SaI-zes wurden in 50 ml verdünnter Salzsäure gelöst. Die Lösung wurde über eine Ionenaustauschsäule (Dowex 1, Chloridform, 25 mm χ 2500 mm) mit verdünnter Chlorwasserstoff säure als Eluiermittel aufgetrennt. Aliquote der eluierten Fraktion wurden auf Phosphor analysiert. Die Menge des Phosphors gegenüber dem eluierten Volumen wird in Fig. 2 gezeigt. Drei Peaks, bestehend aus Isomeren von Inositoltriphosphat sind in der Figur erkennbar.

BEISPIEL 3

Struktürbestimmimg von Isomeren von Inositoltriphosphaten mit H-NMR.

it tv ■? a f ν -

- 22 -

Die drei Peaks, erhalten gemäss Beispiel 2, würden mittels H-NMR analysiert. Die Spektren werden in den Fig. 3a, b und c gezeigt. Die Daten zeigen, dass die Peaks aus Myo-inositol-1,2,6-triphosphat, Myo-inositol-1,2,3-triphosphat und Myo-inositol-1,3,4-triphosphat bestehen.

Die zweite gemäss Beispiel 1 erhaltene Fraktion mit einem Phosphor/Inositol-Verhältnis von 3:1 wurde mittels H-NMR analysiert. Das Spektrum wird in Fig. 4 gezeigt und die Daten zeigen, dass die Fraktion aus Myo-inositol-1,2,5-triphosphat besteht. Bei diesem Ausführungsbeispiel sowie auch bei allen folgenden, bei denen H-NMR angewendet wurde, war das H-NMR-Instrument ein Nicolet 360 WB-Spektrometer. Der interne Standard war Tetramethylsilan.

20 BEISPIEL 4

Bestimmung der optischen Isomeren von Inositoltriphosphaten.

20 mg der gemäss Beispiel 3 mit H-NMR als Myo-inositol-1 ,2,6-triphosphat und Myo-inositol-1,3,4-triphosphat bestimmten Verbindungen wurden weiterhin auf einer chiralen Säule, basierend auf acetylierter Cellulose (20 mm χ 300 mm von Merck) mit einer Mischung aus Ethanol und Wasser als Eluiermittel chromatografiert. Die Fraktionen wurden mittels eines Polarimeters

analysiert. Aus Fig. 5 wird ersichtlich, dass jede Verbindung aus einem optischen Isomer, D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat und L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat besteht.

BEISPIEL 5
Bestimmung des pKa-Wertes für Inositoltriphosphate.

Eine 10 ml-Menge der ersten gemäss Beispiel 1 erhaltenen Fraktion mit einem Phosphor/Inositol-Verhältnis von 3:T wurde mit 0,01 M NaOH titriert. Der pH während der Titrierung wurde mit einer Elektrode gemessen. Fig. 6 zeigt den pH-Wert gegenüber dem Volumen NaOH.

Die nachfolgenden pKa-Werte wurden erhalten: 20

pKa1 = 4,7 pKa2 =7,5

BEISPIEL 6

Bestimmung der relativen Bindungskonstanten von Inositoltriphosphaten und Calcium, Zink bzw. Cadmium.
30

Eine 10 ml-Menge der ersten gemäss Beispiel 1 erhaltenen

Fraktion mit einem Phosphor/Inositol-Verhältnis von 3:1 wurde mit 0,01 M NaOH in Gegenwart von 0,2 mMol Calcium-, Zink-bzw. Cadmiumionen titriert. Eine grössere Tendenz zur Ausbildung eines Inositoltriphosphat-Metall-Komplexes ergibt einen niedrigeren pH-Wert bei einem bestimmten zugegebenen NaOH-Volumen... Wie aus ._ Fig. 7 ersichtlich ist, nehmen die Bindungskonstanten für IP^ in der folgenden Ordnung zu:

10 Ca < Zn < Cd

BEISPIEL 7 15

Das Aufarbeitungsverfahren für das Calciumsalz von D-Myo-inositol-1,2 ,6-triphosphat.

100 ml der gemäss Beispiel 2 erhaltenen Fraktion von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat wurden auf einen pH von etwa 7 mit einer wässrigen Lösung von Ca(OH)~ neutralisiert. Das Calciumsalz wurde durch Zugabe von 100 ml Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde zentrifugiert, umkristallisiert und im Vakuum getrocknet.

Das gereinigte Calciumsalz von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat wurde strukturell durch Analyse mit H-NMR bestätigt.
30

Das obige umkristallisierte Calciumsalz von D-Myo-

inositol-1,2,6-triphosphat wurde auch chemisch analysiert, um den Gehalt an Kohlenstoff, Phosphor, Sauerstoff und Calcium zu bestimmen. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Die Formel des Salzes ist Ca₃IP₃.

BEISPIEL 8

Aufarbeitungsverfahren für das Calciumsalz von L-Myoinositol-1,3,4-triphosphat.

100 ml der gemäss Beispiel 2 erhaltenen Fraktion mit einem Gehalt an L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat wurde auf einen pH-Wert von etwa 7 mit einer wässrigen Lösung von Ca(QH)₂ neutralisiert. Durch Zugabe von 100 ml Ethanol wurde das Calciumsalz ausgefällt. Der Niederschlag wurde zentrifugiert, umkristallisiert und im Vakuum getrocknet. Durch H-NMR-Analyse wurde bestätigt, dass das gereinigte Calciumsalz L-Myo-inositol-1 ,3 ,4-triphosphat war.

Das obige, umkristalliserte Calciumsalz L-Myo-inositol-1 ,3 ,4-triphosphat wurde auch chemisch analysiert, um den Gehalt an Kohlenstoff, Phospyor, Sauerstoff und Calcium zu bestimmen. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Die Formel des Salzes ist Ca₃IP₃.

BEISPIEL 9

Aufarbeitung des Calciumsalzes von Myo-inositol-1,2,3-triphosphat. 5

100 ml der in Beispiel 2 erhaltenen Myo-inositol-1,2,3-triphosphat enthaltenden Fraktion wurden auf einen pH-Wert von etwa 7 mit einer wässrigen Lösung von Ca(OH)2 neutralisiert. Das Calciumsalz wurde mit 100 ml Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde umkristallisiert und im Vakuum getrocknet.

Es wurde durch H-NMR-Analyse bestätigt, dass das gereinigte Calciumsalz Myo-inösitol-1,2,3-triphosphat war.

Das obige, umkristallisierte Calciumsalz von Myo-inositol-1 , 2 ,3-triphosphat wurde auch chemisch analysiert, um den Gehalt an Kohlenstoff, Phosphor, Sauerstoff und Calcium festzustellen. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Die Formel des Salzes ist Ca^IP,.

25 BEISPIEL 10

Aufarbeitung des Calciumsalzes von D-Myo-inositol-1,2,5-triphosphat.

100 ml der gemäss Beispiel 1 erhaltenen Fraktion mit

einem Gehalt an D-Myo-inositol-1,2, 5-triphosphat wurde auf einen pH-Wert von etwa 7 mit einer wässrigen Lösung von Ca(OH)„ neutralisiert. Das Calciumsalz wurde durch Zugabe von 100 ml Ethanol ausgefällt und der Niederschlag wurde zentrifiguiert, umkristallisiert und im Vakuum getrocknet.

Durch H-NMR-Analyse wurde bestätigt, dass das gereinigte Calciumsalz die Struktur von D-Myo-inositol-1,2,5-triphosphat hatte.

Das obige umkristalliserte Calciumsalz vonD-Myo-inositol-1,2,5^triphosphat wurde auch chemisch analysiert, um den Gehalt an Kohlenstoff, Phosphor, Sauerstoff und Calcium festzustellen-. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Die Formel für das Salz ist Ca-IP.,.

20 BEISPIEL 11

Infrarot (IR)-Spektrum des Calciumsalzes von D-Myoinositol-1 ,2,6-triphosphat.

Das in Beispiel 7 erhaltene gereinigte Calciumsalz von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat wurde mit IR analysiert. Die charakteristischen Banden sind:

3500	cm	OH
2900	cm	CH
1600	cm	OH

1100 cm"¹ - C-O und -P

1000 cm"¹ - C-O und -P

_ -1

800 cm ■ - C-C

BEISPIEL 12

Hydrolyse von Natriumphytat mit Weizenkleie und Fraktionierung eines Gemisches von Inositolphosphaten.

Eine 10 g-Menge von Natriumphytat (aus Mais von der Sigma Chemical Co.) wurden in 500 ml Natriumacetat-Puffer bei einem pH-Wert von 5,0 aufgelöst. Nach Erhöhung der Temperatur auf 37⁰C wurden 10g Weizenkleie unter Rühren zugegeben. Dann wurde die Inkubierung begonnen und bei 37⁰C forgeführt. Die Dephosphorylierung wurde beobachtet, indem man den freigegebenen anorganischen Phosphor bestimmte. Die Hydrolyse

20. ■ wurde durch Zugabe von 100 ml Ammoniak nach 2 Stunden gestoppt, nachdem 50 % anorganischer Phosphor freigegeben worden waren. Die erhaltene Suspension wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gesammelt.

300 ml der überstehenden Flüssigkeit wurden durch eine Ionenaustauschsäule (dowex 1, Chloridform, 25 mm χ 250 mm) laufen gelassen und mit einem Lineargraduenten von Chlorwasserstoffsäure (0 bis 0,7 N HC19 eluiert.

Aliquote Teile der eluierten Fraktion wurden vollständig hydrolysiert, um den Gehalt an Phosphor und an

β -ι 's ■>■ *

- 29 -

Phosphor und an Inositol zu bestimmen. Zwei Fraktionen mit einem Phosphor/Inositol-Verhältnis von 3:1 (IP₃) wurden gesammelt.

BEISPIEL 13

Fraktionierung von Inositoltr!phosphaten.

Das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde angewendet, mit dem Unterschied, dass die erste in Beispiel 12 gesammelte Fraktion chromatografiert wurde. Es wurden drei Peaks erhalten und diese wurden mittels H-NMR analysiert. Die Peaks bestanden aus Myo-inositol-1,2,6-triphosphat, Myo-inositol-1,2,3-triphosphat bzw. Myo-inositol-i,3,4"tr!phosphat.

BEISPIEL 14

Aufarbeitungsverfahren für das Zinksalz von D-Myoinositol-1',2,6-triphosphat.

100 ml der gemäss Beispiel 13 erhaltenen Fraktion mit einem Gehalt an D-Myo-inositoi-1,2,6-triphosphat wurden auf einen pH-Wert von etwa 7 mit einer wässrigen Lösung von ZnO neutralisiert. Das Zinksalz wurde durch Zugabe von 100 ml Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde zentrifugiert, umkristallisiert und im Vakuum

getrocknet. Das obige, umkristallisierte Zinksalz von D-Myo-inositol-i,2,6-triphosphat wurde auch chemisch analysiert, um den Gehalt an Kohlenstoff, Phosphor und Sauerstoff und Zink zu bestimmen. Tabelle zeigt die Ergebnisse. Die Formel des Salzes ist Zn-IP-.

BEISPIEL 15 10

Hydrolyse von Natriumphytat mit Bäckerhefe und Fraktionierung eines Inositolphosphat-Gemisches.

Eine 0,7 g-Menge von Natriumphytat (aus Mais, Sigma Chemical Co.) wurde in 6 00 ml Natriumacetat-Puffer bei einem pH-Wert von 4,6 gelöst. 50 g Bäckerhefe vom Jästbolaget, Schweden, (Feststoffgehalt 28 %, Stickstoffgehalt 2 %, Phosphorgehalt 0,4 %) wurden unter Rühren zugegeben. Dann begann man mit der Inkubierung und führte diese bei 45⁰C fort. Die Dephosphorylierung wurde durch Bestimmung des freigegebenen anorganischen Phosphors verfolgt. Nach 7 Stunden, nachdem 50 % anorganischer Phosphor freigegeben worden waren, wurde die Hydrolyse durch Zugabe von 30 ml Ammoniak bis zu einem pH-Wert von 12 abgestoppt. Die Suspension wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt.

400 ml der überstehenden Flüssigkeit wurden durch eine lonenaustauschsäule (Dowex 1, Chloridform, 25 m χ 250 mm) laufen gelassen und mit einem Lineargradien-

ten von Chlorwasserstoffsäure (0- bis 0,7 N HCl) eluiert.

Aliquote der eluierten Fraktionen wurden vollständig hydrolysiert, um den Gehalt an Phosphor und Inositol zu bestimmen. Die Menge an Phosphor gegenüber dem eluierten Volumen wird in Fig. 8 gezeigt. Die Peaks entsprechen den verschiedenen Inositolphosphaten, d.h. einem Peak mit einem Verhältnis von Phosphor zu Inosi-1Ö toi von 3:1, bestehend aus Inositolphosphat etc

BEISPIEL 16 15

Strukturbestimmung von Isomeren von Inositoltriphosphat.

Die in Beispiel 15 mit einem Pfosphor/Inositol-Verhältnis von 3:1 erhaltene Fraktion wurde neutralisiert und eingedampft und dann mittels H-NMR analysiert. Das Spektrum war identisch mit dem in Fig. 3a gezeigten. Die Daten zeigten, dass das Peak aus Myο-inositöl-1,2,6-tr!phosphat bestand. 25

BEISPIEL 17

Bestimmung der optischen Isomeren von Myo-inositoltriphosphat.

- 32 -

Die gleiche Methode wie in Beispiel 4 wurde angewendet, mit dem Unterschied, dass 10 mg der mittels NMR nach Beispiel 16 bestimmten Verbindung analysiert wurden. Wie aus Fig. 9 ersichtlich wird, besteht die Verbindung aus einem optischen Isomer, nämlich D-Myoinositol-1,2,6-triphosphat. Dieses Isomer kann in L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat durch Behandeln mit Säure, z.B. mit Salzsäure, umgelagert werden.

BEISPIEL 18

Aufarbeitungsverfahren für das Natriumsalz von D-Myoinositol-1,2,6-triphosphat.

100 ml der gemäss Beispiel 15 erhaltenen Fraktion mit einem Gehalt an D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat wurden auf einen pH-Wert von etwa 7 mit einer wässrigen Lösung von NaOH neutralisiert. Nach Zugabe von 100 ml Ethanol wurde das Volumen der Lösung durch Eindampfen verringert und das Natriumsalz ausgefällt, zentrifugiert, umkristallisiert und im Vakuum getrocknet. Das gereinigte Natriumsalz von D-Myo-inositol 1,2,6-triphosphat wurde mittels H-NMR strukturell als solches bestätigt.

Das umkristallisierte Natriumsalz von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat wurde chemisch untersucht, um den Gehalt an Kohlenstoff, Phosphor, Sauerstoff und Natrium zu bestimmen. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Die Formel des Salzes ist Na,IP,.

BEISPIEL 19

Chemische Hydrolyse von Natriumphytat und Fraktionierung eines Inositolphosphat-Gemisches. .'.■;..■ Eine 1,0 g-Menge von Natriumphytat (aus Mais, Sigma Chemical Co.) wurde in 15 ml 6 N HCl gelöst. Die Probe wurde im Vakuum in einem verschlossenen Rohr in einem Ofen (105⁰C) während 5 Stunden erhitzt. Nach dieser Zeit waren 34 % des anorganischen Phosphors freigegeben.

5 ml des flüssigen Gemisches wurden mit einer wässrigen Lösung von NaOH auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert und durch eine Ionenaustauschsaule (Dowex 1, Chloridform, 10 mm χ 150 mm) gegeben und mit einem Lineargradienten von Chlorwasserstoffääure (0 bis 0,7 N HCl) eluiert. Aliquote der eluierten Fraktionen wurden vollständig hydrolysiert, um den Gehalt an Phosphor und Inositol zu bestimmen. Die Menge an Phosphor gegenüber dem eluierten Volumen wird in Fig. 10 gezeigt. Die Fraktion mit einem Verhältnis von Phosphor zu Inositol von 3:1 wurde gesammelt. Das H-NMR-Spektrum zeigte eine erhebliche Anzahl an isomeren Produkten an.

BEISPIEL 20

30 Chemische Synthese von Inositolphosphaten,

Polyphosphorsäure (80 % P₂ ⁰S' ^{3/5 g}^ wurde in einen mit Glasstopfen versehenen Kolben eingeführt und auf 150⁰C erwärmt. 0,2 g Myo-inositol wurden dazugegeben und die Mischung wurde bei der Temperatur während 2 Stunden gehalten und dann mit einer wässrigen Lösung von NaOH auf den pH-Wert 7 neutralisiert. Die erhaltene Mischung wurde nach Zugabe eines 10 %-igen Überschusses an 0,1 M Natriumacetatlösung ausgefällt.

20 mg des Bariumsalzes wurden durch Zugabe von verdünnter Salzsäure in die Säureform überführt und mit HPLC analysiert. Die Analysenmethode wurden mittels gut definierter Inositolphosphate kalibriert. Fig. zeigt das Chromatogramm. Die Fraktion, welche als Inositoltriphosphat bestimmt wurde, wurde gesammelt. Das H-NMR-Spektrum zeigte eine erhebliche Anzahl an isomeren Produkten.

BEISPIEL 21

1,0 kg Reiskleie, enthaltend ca. 1 % Inositolhexaphosphat (IP_fi) wurde in 10 1 Natriumacetat-Puffer bei

einem pH-Wert von 5 bei 25⁰C suspendiert. Nach 4 Stunden, nachdem 50 % anorganischer Phosphor in der Aufschlämmung freigegeben worden waren, wurde durch Zugabe von 1 1 2 M HCl extrahiert. Die Suspension wurde 1 Stunde geschüttelt und anschliessend zentrifugiert.

Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einer wässrigen Lösung von Ca(OH)₂ auf den pH-Wert 7 neutralisiert.

Nach Zugabe von 5 1 Ethanol erhielt man einen Niederschlag. Das Calciumsalz, bestehend aus einer Zusammen^ setzung von verschiedenen Inositolphosphaten, wurde zentrifugiert, getrocknet und umkristallisiert. 20 mg des umkristallisierten Calciumsalzes Wurden durch Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoffsäure in die Säureform überführt und dann mittels HPLC analysiert. Die Zusammensetzung bestand aus 4Ö % Inositoltriphosphat, wovon 70 % D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat warp-n. Tier Rest bestand aus anderen Inositolphosphaten.

BEISPIEL 22 15

Charakterisierung von verschiedenen Salzen von D-Myo inositol-1 ,2,6-triphosphat.

70 ml der gemäss Öeispiel 15 erhaltenen Fraktion mit einem Phösphor/Inositol-Verhältniö von 3:1 wurden in sieben Anteile aufgeteilt. Nach einer pH-Einstellung mit 0,1 M NaOH wurden verschiedene positive Ionen in der Chloridform zugegeben und zwar eine lonenart zu jedem Teil. Die verwendeten Salze waren FeCl₃, MgCl₂, AlCl₃, KCl, NH₄Cl, (CH₃CH₂CH₂CH₂)₄N Cl bzw.

Nach Zugabe von 10 ml Ethanol bildeten sich Niederschläge. Die Salze wurden umkristallisiert und auf den Gehalt an Phosphor, Kohlenstoff, Sauerstoff und Metallen nach dem Umkristallisieren untersucht. Tabelle 1 zeigt die Zusammensetzung der gereinigten Salze.

BEISPIEL 23

Die Wirkung von IP₃ auf die Plättchenaggregation nach dem Rauchen beim Menschen wurde untersucht.

Vier junge gesunde, männliche Nichtraucher erhielten bei zwei Gelegenheiten eine Kapsel, enthaltend 50 mg IP_ oder. 50 mg eines Placebos. Das verwendete IP₃ war das Calciumsalz von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat.

Keiner der Probanden noch der Untersucher, wusste, welcher der Probanden IP₃ oder den Placibo erhalten hatte.

2 Stunden nach dem Schlucken der Kapsel wurden Blutproben entnommen. Dann rauchten die Probanden in schneller Reihenfolge 2 Zigaretten. Nach dem Rauchen wurde eine zweite Blutprobe entnommen. Die Aggregationsansprechung der Plättchenauf ADP und Kollagen bei den beiden Proben wurde bestimmt, wobei man im wesentlichen das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 1 anwendete. Die Ergebnisse werden als Veränderung der Aggregation vor dem Rauchen und nach dem Rauchen ausgedrückt. Ein positives Zeichen zeigt, dass die Aggregation nach dem Rauchen stärker war.
25

Aggrega tions- mitt el	Konzentration des Aggregations mittels	IP₃	Placebo	Unterschied zwischen IP₃ und Placebo
ADP	0,5 mMol	+ 1,5	+ 7,25	5,85
11	1 mMol	-1,5	+ 0,25	1,75
ti	2,5 mMol	-1,5	0	1,5
Il	5 mMol	-2,5	- 0,75	1,75
Kollagen	0,5 mg	+ 5,15	+12,25	6,5
Il	1 mg	-8,25	+ 1 ,7S	10,0
Il	2,5 mg	-3,75	0	3,75
II-	5 mg	-1,5	- 0,25	1 ,25

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Bei der Placebo-Gruppe verursachte das Rauchen eine Erhöhung der Aggregation, die am deutlichsten bei niedrigen Konzentrationen des Aggregationsmittels war. In allen Fällen wurde diesem Effekt durch IP₃ entgegengewirkt. Das heisst, dass IP, die Erhöhung der durch Rauchen verursachten Plättchenaggregation verhindert.

10 BEISPIEL 24

Mäuse, in Gruppen von jeweils 10, erhielten intraperitoneal IP₃ (Natriumsalz von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat) in drei Dosisniveaus oder physiologische Kochsalzlösung injiziert. 30 Minuten nach dieser Injektion erhielten alle Mäuse, bis auf eine Kontrollgruppe, eine intravenöse Injektion von Alloxan, 50 mg/kg, in Kochsalzlösung.

Man liess die Tiere 12 Stunden vor und 1 Stunde nach der Alloxan-Injektion fasten. 72 Stunden nach der Alloxan-Injektion wurden von den Mäusen entnommene Blutproben auf das Glucoseniveau analysiert, wobei die folgenden Ergebnisse erzielt wurden:

Dosis IP3 mg/kg	Dosis Alloxan mg/kg	Blutglucose
0	0	216
0	50	864
800	50	857
1600	50	677

Alloxan verursacht Diabetes und erhöhte Blutglucoseniveaus durch Promotion der freiradikälischen Reaktion in den insulinproduzierenden Zellen. Mit IP₃ erfolgte eine dosisäbhängige Verringerung des Blutglucoseniveaus und in den höchsten Dosen erhielt toän einen gewissen Schutz gegenüber Alloxän.

TABELLE 1: Chemische Formulierung der verschiedenen Salze von

Verbindung	Ca:	Me %	Elementaranalyse	O %	P	% N %	Formel
	Ca:	22,0	C %	44,2	17	,1
Calciumsalz von 1,2,6-IP₃	Ca:	21 ,4	14,1	42,9	16	/ 3	Ca₃IP₃
Calciumsalz von 1 ,3,4-IP₃	Ca:	22,7	13,8	45,6	18	, Δ "" ~ — —	Ca₃IP₄
Calciumsalz von 1 ,2,3-IP₃	Zn:	23,2	12,9	44,7	16	,9	Ca₃IP₃
Calciumsalz von 1,2,5-IP₃	Na:	31,5	13,3	38,2	14	,7	Ca₃IP₃
Zinksalz von 1 ,2,6-IP₃	Fe:	23,1	12,1	44,6	15	,8 - —	Zn₃IP₃
Natriumsalz von 1 ,2,6-IP₃	K : Mg:	21,5	12,8	43,4	18	,2	Na₆IP₃
Eisensalz von 1,2,6-IP₃	Mg:	27,5 3,8	13,1	38,7	14	,1 ι	Fe₂IP₃
Kalium,· Magnesium salz von 1,2,6-IP₃	Al:	15,8	11,3	50,8	18	Y , y ————	K₄MgIP₃
Magnesiumsalz von 1 ,2,6-IP₃		12,6	16,0	53,3	21	,2	Mg₃IP₃
Aluminiumsalz von 1,2,6-IP₃	15,8		Al₂IP₃

Fortsetzung Tabelle 1

Verbindung	Me %	Elementaranalyse	O	^%	P	,9	N	^%	Formel
	....	C %	47	,8	16	,8	15	,6
Ammoniumsalz von 1 ,2,6-IP₃		13,1	20	,1	7	,6	3	,5	(NH₄)₆IP₃
.Tetrabutylammonium- salz von 1,2,6-IP₃		57,0	35	,1	12		6	«2	/TcH₃ (CH₂) ₃y₄N7₃H₃iP₃
Cyclohexylammonium- salz von 1 ,2,6-IP₃	39,5			/C₆H₃NH₃J₃H₃IP₃

- 42 -

Für das weitere Verständnis der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend die Formeln der IP_-Isomeren gemäss der Erfindung gezeigt· Ebenfalls werden die Formeln für IP₆, IPc/ ^IP4 ^{und Ip}o gezeigt.
5

Die niedrigen Phosphatester von Myoinositol werden in Abhängigkeit, je nachdem wie die Phosphorsäuregruppen an dem Inositolring angeschlossen sind, bezeichnet, wobei die Numerierung die niedrigste mögliche Positionsnummer ist. L und D stehen für im Uhrzeigersinn bzw. im Gegenuhrzeigersinn und werden angewendet für Ergebnisse, bei denen man die niedrigste Positionszahl erhält. Das Kohlenstoffatom mit einer axialen Phosphorsäuregruppe hat immer die Positionszahl· 2. Die nachfol·- gend angegebenen Formel sind der Einfachheit halber in der Säureform ausgedrückt.

25 Myo-inositol, CgHg(OH) ;

10

- 43 -

1,2,3,4,5,6,-Hexakis-(dihydrogenphosphat)-myo-inositol, alternativ Myo-inositol-hexakis(phosphat) oder IP₆;

15

20

D-Myo

-inositol-1,2,6-triphosphat, alternativ D-1,2,6,-IP₃?

25

D-Myo-inositol-1,2,5-triphosphat, alternativ D-1,2,5-IP₃;

10

Myo-inositol-1,2,3-triphosphat, alternativ 1,2,3-IP₃;

OH

L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat, alternativ L-1,3,4-IP-;

20

L-Myo-inositol-1,2-diphosphat, alternativ L-1,2-

25

D-Myo-inositol-1,2,5,6-tetra-phosphat oder D-1 ,2,5,6-

IP₄;

P =. -Q-

L-Myo-inositol-1,2,3,4,5-pentaphosphat oder L-1,2,3,4,5-

Mb

— Leerseite -

Claims

PATENT-UND RECHTSANWÄLTE PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ΙΝβ. W. LEHN DIPL.-1NG. K. FÜCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN . DR. RER. NAT. H-A. BRAUNS ■ DIPL.-ING. K. GDRS DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE 355B 4 2 763 o/wa MATTI SIRElN, GORDOLA / SCHWEIZ Inositoltriphosphate, Verfahren zu deren Herstellung und Zusammensetzungen, welche diese enthalten PATENTANSPRÜCHE

1. Inositoltriphosphat (IP₃), ausgewählt aus der Gruppe D-Myo-inositol-1,2/6-tr!phosphat, D-Myo-inositol-1,2,5-triphosphat, L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat und Myo-inositol-1,2,3-triphosphat in entweder der Säure- oder der Salzform.

2. IP-. gemäss Anspruch 1, nämlich D-Myo-inositol-1 ,2,6-triphosphat.

3. IP_ gemäss Anspruch 1, nämlich Myo-inositol-1,2,3-triphosphat.

4. IP- gemäss Anspruch 1 in im wesentlichen reiner Form.

5. IP., in Säureform gemäss Anspruch 1 , dadurch g e kennzeichnet, dass es als wässrige Lösung vorliegt.

6. IP, in der Säureform gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass es in einer wäss· rigen Lösung vorliegt, in welcher die Konzentration der Säure 10 bis 45 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, beträgt.

7. IP₃ in Salzform gemäss Anspruch 1, dadurch g e kennzeichnet, dass die Kationen ausgewählt sind aus Alkalimetallen und Erdalkalimetallen.

8. Salz gemäss Anspruch 7, dadurch g e k e η η -

20. zeichnet, dass die Kationen ausgewählt sind aus Lithium, Natrium, Kalium, Calcium oder Magnesium.

9. IP, in Salzform gemäss Anspruch 1, dadurch g e kennzeichnet, dass die Kationen ausgewählt sind aus Aluminium, Zink oder Eisen.

10. IP, in Salzform gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Salz ein Ammoniumsalz oder ein organisches Aminsalz ist.

. Verfahren zur Herstellung eines Inositol—triphosphats (IP-.), ausgewählt aus der Gruppe D-Myo-inositol-1 ,2 ,6-triphosphat, D-Myo-inositol-1,2 ,5-triphosphat, L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat und Myο-inositol-1/2,3-triphosphat in entweder der Säureoder der Salzform, dadurch g ekenn ζ e ichn e t , dass man ein Inositolhexaphosphat enthaltendes Material bei einer Temperatur im Bereich zwischen 20 und 70⁰C und bei einem pH-Wert von 4 bis 8 mit Phytase inkubiert, bis die Freisetzung von etwa 30 bis 60 % des gesamten Esterphosphors erzielt ist, dass man anschliessend chromatografisch die erhaltene Mischung zum Isolieren der IP₃ enthaltenden Fraktion trennt, gewünschtenfalls die Fraktion einer weiteren chromatografischen Trennung unterwirft und das spezifische Isomere IP., in der Säure- oder Salzform in der Lösung gewinnt.

12. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch g e k e η η zeichnet, dass die Phytase eine Hefephytase

ist.

13. Verfahren gemäss Anspruch 12, dadurch g e k e n.n zeichnet, dass die Hefe Bäckerhefe ist.

14. Verfahren zur Herstellung von D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat in entweder der Säure- oder der Salzform, dadurch ge k e η η ze i ch net , dass ein Inositol-hexaphosphat enthaltendes Material bei einer Temperatur im Bereich zwischen 20 und 70⁰C mit Hefephytase inkubiert wird, bis etwa 30 bis 60 %

des gesamten Esterphosphors freigesetzt sind, dass man anschliessend chromatografisch die erhaltene Mischung zur Isolierung der IP_ enthaltenden Fraktion trennt und D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat in der Säure- oder Salzform in Form einer Lösung isoliert.

15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass die Hefe Bäckerhefe ist.

16. Inositol-phosphat-Zusammensetzung, umfassend D-Myoinositol-1 ,2, 6-triphosphat und wenigstens eine der Verbindungen D-Myo-inositol-1,2,5-triphosphat, L-Myo-inositol-1,3,4-triphosphat und Myo-inositol-1,2,3-triphosphat in Säure- oder Salzform, dadurch gekennzeichnet, dass sie 20 bis 99,5 Gew.% des IP-, enthält und dass der Gehalt an D-Myoinositol-1 ,2 ,6-triphosphat im Bereich von 50 bis 100 Gew.%, bezogen auf den Gesamtgehalt an den Inositoltriphosphaten, beträgt und der Rest Inositol-

20 phosphate, die sich von IP₃ unterscheiden, einschliesst.

17. Zusammensetzung gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , dass die IP₃-Fraktion i: einer Menge von 30 bis 99,5 Gew.% vorliegt.

18. Zusammensetzung gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , dass das IP₃ im wesentlichen D-Myo-inositol-1,2,6-triphosphat ist. 30