DE1812204A1

DE1812204A1 - Verfahren zum Trennen von Phosphatiden

Info

Publication number: DE1812204A1
Application number: DE19681812204
Authority: DE
Inventors: Rajindra Aneja
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1967-12-01
Filing date: 1968-12-02
Publication date: 1969-08-07
Also published as: FR1593864A; NL6817199A; DK130705C; NL155715B; BR6804474D0; DE1812204C3; BE724743A; GB1217846A; SE354284B; IT943056B; NO128515B; DK130705B; DE1812204B2

Description

PATENTANWXLTI

DR. E. WIEGAND DIPL-ING. W. NIEMANN 181 220 Λ

DR. M. KÖHLER DIPL-ING. C. GERNHARDT ^U

MÖNCHEN HAMBURG TELEFON. 555474. 8000 MÜNCHEN 15, TELEGRAMME, KARPATENT NUSSBAUMSTRASSE 10

Z Dez. 1968

W. 14 003/68 7/de

Unilever, IT, V.
Rotterdam (Niederlande)

Verfahren zum !rennen von Phosphatiden

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Trennung von Phosphatiden aus diese, enthaltenden Mischungen.

Phosphatidmisohungen werden als Nebenprodukte bei der Herstellung von Pflanzenölen erhalten.und in der Margarine-Industrie wegen ihrer emulgierenden Eigenschaften in Wasser-in-ölemulsionen verwendet. Solche Phosphatidmischungen bestehen aus verschiedenen Phosphatiden und insbesondere Äthanolamin-, Serin-, Inosit- und Cholin-Phosphatiden, zusammen mit neutralem Triglyceridöl, freien Fettsäuren, Wasser und anderen Begleitsubstanzen, einschließlich von geringen Mengen von Steroiden. Die Mengen von in technischen Phosphatiden vorhanfeaem Triglyceridöl liegen oft innerhalb des Bereichs von 30 bis 40 Gew.-# des Gesamtmaterials, und die Produkte sind viskose Flüssigkeiten. In der Technik

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werden Mischungen dieser Phosphatide oft als Lecithin bezeichnet* Dieser Name wird jedoch auch spezieller für das Cholinphosphatid selbst benutzt) in dem vorliegenden Zusammenhang wird "Lecithin" in dem letztgenannten Sinne angewendet.

Äthanolamin- und Serinphosphatide haben die allgemeine Formel' .

It

■ ROCH₉.OH,CH₉OPOOH₉CHKHi

^l ^l ^l J

OR« 0~ R

worin R und R¹ langkettsige Pettsäurereste sind und R¹¹ ein Kohlenstoffatom bzw. ! ein Hydroxycarbonyl ist: Diese Phosphatide sind gemeinsam unter dem Namen Kephalin bekannt.

Inositphosphatide haben die allgemeine Formel

ROOH₉.OH.OH₉ΟΡΟ -,
OR¹ M⁺ 0" Ö

in· der R und R¹ langkett^ Fettsäurereste sind und M ein Metallatom, z. B. Natrium, Kalium, Calcium oder Magnesium, bedeutet; die Inositgruppe kann durch Glykosit- und andere Reste substituiert sein. Eine sehr aktive Emulgatorkomponente der Phosphatidmisohungen ist das Cholinphosphatid,

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Leolthin, welohee die allgemeine Formel "*

¹¹ +

ROOH₂.CH.OH₂OPOCH₂CH₂N(Ch₅)₃

OR' 0

hat, in der R und R* langkettige Fettsäurereste sind. Alle vier Phosphatide ha"ben eine saure IJr dr oxy gruppe, wie sie oben in Salzform gezeigt }st, von den drei etiolcstoffhaltigen Phosphatiden hat jedoch nur Lecithin eine freie Aminogruppe.

Wenn Kephalin und Lecithin zusammen in einer Phosphat idmischung vorhanden sind, wie in den obengenannten Nebenprodukten, hat das Kephalin eine schädliche Wirkung auf die Emulgierelgenschaften des Lecithins durch eine Art von antagonistischer Wirkung,- wenn es z. B. in Margarine angewendet wird. Andere unerwünschteEigenstaften sind dem Kephalin ebenfalls zuzuschreiben, so haben beispielsweise parenteral verabfolgte Fettemulsionen, die unter Verwendung von Kephalin enthaltenden Phosphatiden hergestellt worden sind, eine hypertensive Wirkung, für die das vorhandene Kephalin verantwortlich ist, und wenn Phosphatidmischungen hydriert werden, hat vermutlich das vorhandene Kephalin eine desaktivierende Wirkung auf den Katalysator. Andererseits werden durch die Gegenwart von Inositphosphatiden keine Nachteile herbeigeführt.

Dementsprechend sind Methoden gesucht worden, um die schädliche Wirkung des Kephalins zu vermeiden. Bei einem solchen Verfahren, wie^Sri der deutschen Patentanmeldung P 15 439 37. 9 vorgeschlagen ist, werden pflanzliche Phosphat idmiechungen dadurch modifiziert, daß man die freie

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Aminogruppe des vorhandenen Kephalins mit einem Acylierungsmittel umsetzt. Dabei bildet sich. Acylkephalin, das keine antagonistische Wirkung auf die Emulgiereigenschaften von Lecithin hat, so daß die Phosphatidmisehung, in der das A'cylkephalin anwesend bleibt, eine verbesserte Emulgier» wirkung hat.

Es sind Versuche gemacht worden, um Kephalin von Lecithin in Phosphatidmisichungen zu trennen, um ein Phosphatid mit einer höheren Lecithinkonzentration mit verbesserten Eigenschaften zu erhalten, dies hat sich jedoch als ein schwieriges Problem erwiesen. Lösungsmittelfraktionierung ergibt eine teilweise Trennung, wobei mit Lecithin angereicherte und mit Kephalin angereicherte Fraktionen geliefert werden. In der britischen Patentschrift 1 113 241 ist ein Anreicherungsverfahren dieser Art beschrieben, bei dem eine wäßrige Alkoholextraktion zur Anwendung gelangt, durch welche der Anteil von Lecithin zu Eephalin von 1 : 1 auf 5 : 1 In dem Extrakt erhöht wird, es bleiben jedoch wesentliche Anteile von Lecithin in dem Rückstand.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Phosphatidmisclxungen, um freifließende feste Phosphatide zu ergeben, die praktisch frei von Kephalin sind.

Es ist gefunden worden, daß bei Acylierung von Kephalin und Lecithin enthaltenden Phosphatidmischungen zur Umwandlung des vorhandenen Kephalins in AcylkephäLin, das Lecithin und das Acylkephalin durch Lösungsmittelfraktionierung mit Aceton oder Methylacetat leicht getrennt werden können, wenn genügend, von einer acetonlöslichen oder methylacetatlösliohen Stickstoffbase vorhanden ist, um basische Bedingungen vorzusehen, die einem pH-Wert in Wasser von wenigstens 8,5 äquivalent sind. Das Acylkephalin wird durch das Lösungs-

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mittel extrahiert, wobei das Leoithin zurückbleibt. Überdies ist die Trennung selbst in Gegenwart von großen Mengen von Triglyoeridöl, wie sie in technischen Phosphatiden vorhanden sind, wirksam; Triglyceride werden mit dem Kephalin entfernt.

Demgemäß ist gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Trennung eines N-Aoylphosphatids von einem Phosphatid ohne eine acylierbare Aminogruppe vorgesehen, bei dem eine sie umfassende Mischung mit einer Stickstoffbase zu dem Äquivalent eines pH-Wertes von wenigstens 8,5 unter wäßrigen Bedingungen basisch gemacht und mit Aceton oder Methylacetat lösungsmittelfraktioniert wird.

In der Praxis wird eine Phosphatidmischung, die N-acylierbares und nicht-N-aoyIierbares Phosphatid enthält, mit einem Acylierungsmittel umgesetzt, um das N-acylierbare Phosphatid in N-Aoylphosphatid umzuwandeln, und das acylierte Produkt wird mit einer Stickstoffbase auf das Äquivalent eines pH-Wertes von wenigstens 8,5 unter wäßrigen Bedingungen basisch gemacht und mit Aceton oder Methylacetat lösungsmittelfraktioniert·

In der Praxis besteht das N-acylierbare Phosphatid aus Kephalin, und es ist wenigstens etwas Lecithin, vorzugsweise als nicht-acylierbares Phosphatid, vorhanden, so daß die Phosphatidmischung Kephalin und Lecithin umfaßt. Als Phosphatidausgangsmaterialien für das Trennungsverfahren können technische oder handelsübliche Phosphatide verwendet werden, z. B. die hydratisieren Pflanzenphosphatide, die durch Behandlung eines aus Pflanzen extrahierten, phosphat idhattigen Rohöle, z. B. rohen Sojabohnenöls, mit einer geringen Menge von Wasser erhalten sind, wobei die Phos-

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phatide hydratisiert und als gummiartige Substanz (gum) gefällt und dann abgetrennt werden. Eigelbphosphatide können auch zur Anwendung gelangen. Vorzugsweise enthält die Phosphatidmischung 0,1 bis 2o Gew.-Teile Lecithin je Gew.-Teil Kephalin. Derartige Phosphatide und Modifikatimen von ihnen, die zur Anwendung gelangen können, sind in der britischen Patentschrift 1 118 373 -beschrieben. Mit Lecithin angereicherte oder mit Kephalin angereicherte Phosphatide, die durch Lösungsmitljelfiaktionierung mit wäßrigen Alkoholen erhalten sind, wie dies in der britischen Patentschrift 1 113 241 beschrieben ist, können ebenfalls verwendet werden. Pflanzliche Phosphatidmischungen, die bis zu 80 ^, z. B. 2o bis 6o % Triglyceridöl enthalten, können auch Änwendung finden. Es können auch, die acylierten Phosphatidmischungen, die nach dem Verfahren gemäß der deutschen Patentanmeldung P 15 439 37. 9 erhalten werden, zur Anwendung gelangen.

Teilweise hydrierte Phosphatidraischungen können zur Anwendung gelangen, wenn die ursprünglichen Fett-Acylgruppen, solche von ungesättigten !Fettsäuren e inschlossen, und ei-.nige von diesen durch Hydrierung gesättigt worden sind. Die Phosphatidausgangsmaterialien können merkliche Mengen von Wasser, selbst vor der Acylierungsstufe enthalten, denn es ist gefunden worden, daß die Gegenwart von Wasser nicht ernsthaft die N-Acylierung stört und hilft, die 0-Acylierung durch überschüssiges Acylierungsmittel zu verhindern, was zu Phosphatiden Veranlassung geben würde, in denen die Oxygruppen von vorhandenen Inositphosphatiden ebenso wie die an das Phosphoratom gebundene Oxygruppe acyliert werden. Die Acylierung an dem Phosphoratom verursacht kein Problem, da die Acylgruppe durch Nachbehandlung mit Wasser entfernt werden

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kann, die Acylierung der Inositgruppen kann jedoch einen nicht notwendigen Yerlust von Acylierungsmittel darstellen, denn Inositphosphatide können in großem Anteil vorhanden sein; die in Betracht kommenden Inosithydroxygruppen können auch, wenn sie einmal acyliert sind, nicht wieder gebildet werden, weil die Bedingungen, die hierfür notwendig sind, den die Acylgruppen veresternden Glycerylrest entfernen und so die Phosphatide zerstören wUrden.

Als Acylierungsmittel wird vorzugsweise ein Carbonsäur eanhydrid, z. B. Essigsäure-, Propionsäure-, Caprinsäure-, ölsäure- oder Stearinsäureanhydrid oder eine Mischung von Anhydriden verwendet, wie eine solche, die aus Sojabohnenfettsäuren durch trans-AnhyänLdisLerung mit Essigsäureanhydrid erhalten wird; es können auch Maleinsäure-, Bernsteinsäure- oder Phthalsäureanhydrid zur Anwendung gelangen. Andere Acylierungsmittel, z. B. Acylchloride, wie AcetylChlorid, und Keten, können verwendet werden; da sie jedoch leichter mit Wasser und mit Hydroxygruppen von in den Ausgangsmaterialien vorhandenen Substanzen reagieren, sind sie weniger wirksam als die Anhydride. Die Menge an erforderlichem Acylierungsmittel ist diejenige, die zur Acylierung sämtlicher vorhandener freier Aminogruppen notwendig ist, mit einer gewissen Toleranz für Verlust von Reaktionsmittel, wenn vorhandenes Wasser durch Hydrolyse in Wettbewerb tritt. Da Phosphatide selten mehr als 30 i> Kephalin enthalten, ist gewöhnlich 4 $ Essigsäureanhydrid, bezogen auf das Phosphatidgewüit, ausreichend. Wenn das Phosphatidausgangsmaterial hochviskos ist, kann die Reaktion in einem geeigneten inerten Lösungsmittelmedium, ζ. B. in Hexan, Benzol oder Chloroform oder sogar in Aceton oder Methylacetat, wenn wesentliche

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Mengen von Triglycerid vorhanden sind, ausgeführt werden, aber im allgemeinen ist kein Lösungsmittel notwendig, wenn die Phosphatidmischung genügend Triglyceridöle enthält, um sie flüssig zu machen. Die Mischung soll während der Umsetzung gerührt werden, und dies ist besonders erwünscht, wenn kein Lösungsmittel angewendet wird. Die Acylierung kann in einer inerten Atmosphäre, z. B. unter Stickstoff, durchgeführt werden.

Die Acylierung wird vorzugsweise in Gegenwart eines nicht acylierbaren Amins als Katalysator ausgeführt. Geeignete Katalysatoren sind tertiäre Amine, z. B. Pyridin und teriäre Alkylamine, insbesondere Trimethylamin und Triäthylamin.

Wenn kein Katalysator verwendet wird, kann die Acylierung nicht zur Vollendung gehen, selbst bei einem beträchtlichen Überschuß an Acylierungsmittel, und die notwendige Reaktionszeit und die Temperatur sind langer bzw. höher und betragen z. B. 1 bis 2 Stunden bei Temperaturen von 55 bis 70° G oder 24 Stunden bei 30° 0. Eine Reaktion bei 90° 0 erfordert nur wenige Minuten, aber Temperaturen über 80° 0 werden vorzugsweise vermieden. Wenn ein Katalysator verwendet wird, ist nur ein geringer Überschuß notwendig, die Reaktion erfolgt rasch und geht bei niedrigen Fettsäureanhydriden, ζ. Β. Essigsäureanhydrid, selbst bei Raumtemperaturen innerhalb weniger Minuten vor sich. Torzugsweise wird daher, wenn ein Katalysator angewendet wird, die Reaktion bei Raumtemperatur ausgeführt.

Das Portschreiten der Acylierungsreaktion kann durch Dünnschichtchromatographie auf Siliciumdioxydgelplatten mit

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einer Mischung von Chloroform, Methanol und Wasser in Anteilen von 65 : 25 ϊ 4 Volumina als bewegliche Phase und Behandlung des entwickelten Ohromatogramms mit Ninhydrin-Reagenz verfolgt werden. Sie Reaktion ist vollständig, wenn der rosa Fleck von R-=etwa 0,6 infolge freier primärer Aminoverbindung nicht länger sichtbar ist. Es können vorausgehende Prüfungen unter Anwendung dieser Arbeitsweise ausgeführt werden, um die Menge an Aoylierungsmittel und die anderen Bedingungen zu bestimmen, die zur Verwendung bei der Acylierung ^irgendeiner besonderen Phosphatldmischung, z. B. einer Mischung von unbekanntem Gehalt an N-acylierbarem Phosphatid, am geeignetsten sind.

Nach der Acylierung können die von Nebenprodukten freie Fettsäure und überschüssiges Acylierungsmittel neutralisiert werden oder, wenn die Säure und das Acylierungsmittel flüchtig eind, können sie e. Β. unter verringertem Druok abgedampft werden. Irgendwelches lösungsmittel, das die darauf folgende Fraktionierung stören würde, kann auch durch Verdampfung entfernt werden. Das lösungsmittel, Säure, überschüssiges Acylierungemittel und Triglyceridöl können auch durch Extraktion des Produkts mit Aceton entfernt werden, bevor es alkalisch gemacht wird.

Bei der I»ösungsmitt"elfraktionierungsstufe, die gewöhnlich aus einem Extrahieren mit dem Lösungsmittel und einem Trennen der Phasen besteht, die das N-Acylphosphatid ohne eine aoylierbare Aminogruppe enthalten, wird Aceton oder Methylacetat (odor ein Gemisoh von ihnen) zusammen mit

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einer Stickstoffbase von angemessener Basizität verwendet. Die Stickstoffbase kann zu dem Acylierungsprodukt zugesetzt werden; wenn jedoch eine genügende Menge von Acylierungskatalysator von angemessener Basizität zurückbleibt, um geeignete alkalische Bedingungen zu schaffen, ist es nicht notwendig, weitere Stickstoffbase vor der Fraktionierung zuzusetzen; gegebenenfalls kann die Stickstoffbase dem Fraktionierungslösungsmittel einverleibt werden. Ferner können die Acylierung und die* Lösungsmittelextraktion gleichzeitig ausgeführt werden, -wenn z. B-. ein festes von Triglyceridöl freies Phosphatid in Aceton suspendiert wird, das ein Acylierungsmittel und ein nicht-äcylierbares Amin enthält, das sowohl als Katalysator als auch als Base wirkt. Wenn eine Acylierung ohne einen Katalysator ausgeführt wird, wird vorzugsweise die Stickstoffbase zu der Acylierungsmischung zugesetzt, bevor nicht-umgesetztes Aeylierungsmittel davon abgetrennt wird, da dies gewährleistet, cle.' die Acylierung vollständig ist. Die Wirkung der Stickstoffbase bei der Fraktionierung besteht vermutlich darin, daß das Acylphosphatid in sein konju.g iertes Anion umgewandelt wird, z. B.

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so, daß möglicherweise, wenn Aceton oder Methylacetat zugegeben wird, die negativen Ionen einander abstoßen, nicht in der Lage sind, Aggregate zu bilden, und sich in dem Lösungsmittel auflösen.

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Geeignete Stickstoffbasen sind Amine von hohem pKa, vorzugweise wenigstens 9» insbesondere primäre, sekundäre und tertiäre aliphatische Amine, wie Alkylamine, wobei die folgenden Verbindungen mit den angegebenen pKa-Werten eingeschlossen sind: Diäthylamin 10,9, Dimethylamin .10,.,% Triäthylamin 10,7ι Methylamin 10,6, Ä'thylamin 10,6, Triäthylamin 9»8j es können auch Ä'thanolamin 9,5 und Ammoniak 9,2 zur Anwendung gelangen, obwohl sie weniger wirksam sind, weil sie eine Aggregation durch Wasserstoffbindung fördern. Quarternäre Ammoniumhydroxyde, z. B. Tetraäthylammoniumhydroxyd, die mit dem Aoylkephalin reagieren, und sein konjugiertes Anion und Wasser geben, können auch zur Anwendung gelangen. Es wird eine Menge von Stickstoffbase, die ausreicht, um basische Bedingungen äquivalent einem pH-Wert in Wasser von wenigstens 8,5 und vorzugpweise von wenigstens 9 zu liefern, angewendet. Die notwendige Menge wird einfach durch Prüfen der Menge von Stickst of fbas,. tie benötigt wird, um den erforderlichen pH-Wert zu geben, wenn eine Probe der acylierten Phosphatidzusammensetzung in Wasser bei 1 # Konzentration dispergiert ist, bestimmt. Die erforderliche Menge ist mehr als das Minimum, das zur Verwendung als Katalysator in der Acylierungsstufe notwendig ist.

Die Fraktionierungsstufe kann unter Anwendung der Standardarbeitsweise der Acetonextrahierung zur Bestimmung von acetonunlöslichem Material in Phosphatiden, wie sie in der "American Oil Chemists' Society Official Method Ja 4-46" beschrieben ist, ausgeführt werden. Die Acetonextrahierung beseitigt Acylkephalin und irgendwelches anwesendes Glyceridöl, wobei die lecithinreiche Fraktion als Rückstand zurückgelassen wird. Das zu fraktionierende Material kann mehrere Mal mit Stickstoffbase enthaltendem Aceton und schließ-

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lieh mit Aceton allein extrahiert werden. Methylaoetat kann in ähnlicher Weise zur Anwendung gelangen. Die Extraktion wird vorzugsweise "bei Raumtemperatur ausgeführt.

Obwohl eine vollständige Trennung von Acylkephalin und Lecithin nicht in einem besonderen Fall erreicht werden kann, wird eine viel vollständigere Fraktionierung ausgeführt als wenn Versuche gemacht werden, die Komponenten mit Aceton ohne Anwesenheit der Stickstoffbase zu trennen. Die Rückstände von der Extraktion enthalten sehr wenig Acylkephalin und. werden als strohfarbene Feststoffe erhalten, die beim Mahlen freifließende Pulver bilden, die leicht in Wässer oder Triglyceridölen dispergierbar sind. Sie sind besonders wertvoll als Emulgatoren und Dispergierungsmittel. Das erzeugte Acylkephalin kann aus den Acetonextrakten nach Entfernung von Stickstoffbase und Aceton durch geeignete Methoden, z. B. Verdampfen, gewonnen werden; die Acylkephaline können auch als Emulgatoren Anwendung finden. Ein Acylkephalin kann wieder in Kephalin umgewandelt werden, wenn die Acylgruppe von solcher Art ist, daß sie ohne Zerstörung des Kephalins entfernt werden kann; wenn z. B. eine Acylierung mit Phthalsäureanhydrid ausgeführt wird, kann das sich ergebende o-Garboxybenzoylkephalin durch Erhitzen .oder, die Wirkung von Essigsäureanhydrid unter Bildung von Phthaloylkephalin cyclisiert und Kephalin hiervon durch Erhitzen mit Hydrazin freigesetzt werden.

Diejenigen Produkte des Verfahrens gemäß der Erfindung, die sowohl Lecithin als auch Inositphosphatide enthalten, können weiter mit Alkohol fraktioniert werden, um alkohollösliche Fraktionen, die an Lecithin angereichert sind, und alkoholunlösliche Fraktionien, die an Inositphosphatiden angereichert sind, zu bilden.

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Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert, in denen samtHohe Temperaturen in ⁰C angegeben und die in Aceton unlöslichen Stoffe nach

bestimmt wurden.

Beispiel 1

Ein handelsübliches ungebleichtes kanadisches Soyaphosphatid einer mittleren Qualität mit der folgenden annähernden Zusammensetzung wurde als Ausgangamaterial verwendet.

Gew.Teile

Triglyceride	4o	15	2
acetonunlöslioher Stoffe insgesamt	6o	12
Lecithin		23
Kephalin		Io
Inosit -phosphatide
Zucker, Steroide und Salze
Wasser	< 1
Gesamtphosphorgehalt	2,

Dieses Phosphatid (loo g) und Essigsäureanhydrid (4g) wurden kräftig unter Stickstoff bei 74° (Badtemperatur) 2 Stunden gerührt und dann rasch auf 2o° gekühlt. Die acylierte Mischung wurde mit siedendem Aceton (2öo ml, mit 4 ml zugesetztem Wasser) gerührt, auf 0° in einem Eiswasserbad gekühlt,und es wurde die Acetonlösung, welche Triglyceridöl, Essigsäure und Essigsäureanhydrid enthielt, abdekantiert· Der unlösliche Rückstand von dieser ersten Extraktion wurde mit einer siedenden Mischung von Aceton (2oo ml und 4 ml Wasser) und Triäthylamin (6 ml, entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer l^igen wäßrigen Dispersion) gerührt, auf 0°0 gekühlt,und das Lösungsmittel wurde

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abdekantiert} diese Extraktion wurde unter Verwendung von Aceton (2oo ml und 4 ml Wasser) und Triethylamin (2 ml) wiederholt. Das Produkt wurde mit siedendem Aceton (2oo ml) verrieben und das heiße Aceton wurde- abdekantiert ; diese vierte Acetonextraktion wurde wiederholt, und das Produkt wurde schließlich mit Aceton (2oo ml) bei 2o°C verrieben, abfiltriert und unter verringertem Druck bei 2Q⁰C getrocknet. Es ergab sich dabei ein bröckeliger, strohfarbener Peststoff (42,1 g), der 3,2% Phosphor, 32% Lecithin, 1?S Triglyceridöl und praktisch kein Kephalin, aber etwa 1 bis 2% Acetylkephalin enthielt, wie dies durch Dünnschiohtchromatographie bestimmt wurde.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde unter, Verwendung von Gaprinsäureanhydrid (lo,o g) anstelle von EssAgsäureanhydrid als Acy lierungsmittel und unter Anwendung einer Badtemperatur innerhalb des Bereichs von 7ο bis 82⁰C wiederholt. Eine Hälfte (55 g) des acylierten Materials wurde aufgearbeitet und ergab ein festes Produkt (22 g).

Beispiel 5

Das handelsübliche Phosphatid des Beispiels 1 (loo g) wurde bei 75⁰C 2 Stunden unter Stickstoff mit einem Anhydridgemisch (2o g) erhitzt, das aus Sojabohnenölfettsäuren durch trans-Anhydridisierung mit Essigsäureanhydrid hergestellt war. Ein Anteil von Io g des Acylierungsgemisches wurde fünf Extraktionen mit Aceton (4ö ml und o,8 ml Wasser), wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen, wobei

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das Aceton bei der zweiten und der dritten Extraktion Triäthylamin (0,6 g bzw. o,2 g Amin, ausreiohend, um eine Basizität, äquivalent einem pH-Wert von über 9» in einer l^igen wäßrigen Dispersion vorzusehen) enthielt. Das Endprodukt wurde in Form eines festen Rückstands (3,6 g) erhalten.

Wenn eine ähnliche Reihe von Extraktionen mit einem zweiten Anteil (Io g) der Acylierungsmischung, jedoch ohne Zusatz von Amin ausgeführt wurde, war die Ausbeute an unlöslichem Rückstand 4,6 g, und das Produkt enthielt einen wesentlichen Anteil von Acylkephalin.

Beispiel 4

Eine handelsübliche alkohollösliche Phosphatidzubereitung mit einem Gehalt von 3o$ an acetonunlöslichen Stoffen und an Lecithin angereichert, wurde teilweise durch Acetonextraktion entfettet, um einen acetonunlöslichen Rückstand mit der folgenden annähernden Zusammensetzung zu geben.

Gew.Teile

Triglyceride	insgesamt	15	55
acetonunlösliche Stoffe,		85	Io
Lecithin			VJl
Kephalin			15
Inosit - phosphatide	Salze
Zucker, Steroide und
Wasser	1

Dieses Phosphatid (8,5 g) wurde in Chloroform (5o ml) gelöst, Essigsäureanhydrid (2 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde unter Rückfluß 1 Stunde erhitzt. Das Lö-

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sungsmittel, Essigsäure und überschüssiges Anhydrid wurden durch Verdampfen in einem umlaufenden Verdampfer unter verringertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurde Aceton (loo ml, mit einem Gehalt von 2$ Wasser) zugesetzt, dem Triäthylamin (o,2 ml, genügend, um eine Basizität entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer l^igen wäßrigen Dispersion vorzusehen) einverleibt worden war, und die Mischung wurde zum Sieden erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und'dann in Eiswasser gekühlt. Das Ace-. ton wurde abdekantiert, und Spuren von Aceto,n wurden von ' dem Rückstand bei Raumtemperatur unter verringertem Druck entfernt, wobei sich ein Produkt (5,2 g) ergab, das, wie eine DünnschichtChromatographie zeigte. Lecithin als überwiegenden Bestandteil und nur geringe Spuren von Kephalin und Acylkephalin enthielt.

Bei Vergleichsversuchen wurde gefunden, daß, wenn die Acylierung bzw. das Amin fortgelassen wurde, Ausbeuten von 7,5 g bzw.6,4 g unlösliches Produkt erhalten wurden,die wesentliche Mengen an Kephalin bzw. Acylkephalin enthielten.

Beispiel 5

Eine handelsübliche alkoholunlösliche entfettete Phosphatidfraktion, die an Kephalin angereichert war und die folgende annähernde Zusammensetzung hatte, wurde als Ausgangsmaterial verwendet.

	insgesamt	. Gew.Teile	■	4	5
Triglyceride		4		28",
acetonunlösliche Stoffe,		96	55	5
Lecithin			8,
Kephalin	Salze
Inosit - phosphatide
Zucker, Steroide und

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Dieses Phosphatid (25 g) wurde in η-Hexan (loo ml) gelöst und es wurde Essigsäureanhydrid (I₁5 g) zugegeben; die Mischung wurde unter Rückfluß in einer Stickstoff atmosphäre 1 Stunde erhitzt, auf 3o°C gekühlt,und es wurde Triäthylamin (5 ml) zugegeben. Nach gründlichem Mischen wurde die sich ergebende Löoung (die genügend Base enthielt, um einen pH-Wert von über 9 in einer wäßrigen Dispersion vorzusehen) langsam während 15 Minuten in stark gerührtβ$Aceton (25o ml) eingeführt. Nach Vollendung des Zusatzes wurde der Niederschlag abfiltriert, mit Aceton (25o ml) gerührt und die Suspension wurde wieder filtriert; der Rückstand wurde unter verringertem Druck getrocknet und ergab ein Produkt (18,4 g), das, wie eine Dünnschichtchromatographie zeigte, praktisch frei von Kephalin und Acetylkephalin war.

Bei einem Vergleichsversuch, der in jeder Hinsicht, mit Ausnahme, daß das Essigsäureanhydrid fortgelassen wurde, ähnlich war, betrug die Ausbeute an Rückstand 23,2 g, wobei dieser das meiste des ursprünglichen Kephalins enthielt.

Beispiel 6

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei anstelle des handelsüblichen kanadischen Sojaphosphatids eine handelsübliche alkoholunlösliche Fraktion verwendet wurde, die aus Sojaphosphatid durch Extrahieren von 1 Gew.^ des Phosphatide mit 3,5 Teilen wäßrigem 9o$igem Äthanol bei Raumtemperatur während einiger Minuten, Abdekantieren des. Äthanols und Gewinnung des Rückstandes hergestellt war und die folgende Zusammensetzung hatte:

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Gew.Teile

Triglyceride 41

acetonunlösliche Stoffe, insgesamt 59

lecithin 12

Kephalin 12

Inosit - phosphatide . 29

Zucker, Steroide und Salze " - 6

Wasser < 1

I
Aus dem Phosphatidausgangsmaterial (loo g) wurde

ein festes Produkt (34 g) erhalten, das nur Spuren von Kephalin und Acylkephalin enthielt.

Beispiel 7

Die alkoholunlösliche Ihosphatidfraktion gemäß Beispiel 6 (loo g) wurde mit Essigsäureanhydrid (4 g) wie in Beispiel 1 acetyliert, und zu der acetylierten Mischung wurden bei 2o Ms 22⁰C 25 ml· Aceton und Triethylamin (Io ml, ausreichend, um eine Basizität entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer l^igen wäßrigen Dispersion zu geben) zugesetzt und die Mischung wurde Io Minuten gerührt und dann langsam in stark gerührtes. Aceton (looo ml und 2o ml Wasser) gegossen. Der !riederschlag wurde abfiltriert, in Aceton suspendiert (looo ml) und die Suspension wurde zum Sieden erhitzt und dann unter Rühren während 3o Minuten auf 15 bis 18⁰C albgekühlt.

Das Produkt (4-4,8 g) wurde durch Filtrieren, Waschen mit Aceton (5oo ml) und Trocknen unter verringertem Druck isoliert.

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Beispiel 8

Die alkoholunlösliche PhoBphatidfraktion von Beispiel 6 (loo g) wurde mit EBSigaäureanhydrid (4 g) wie in Beispiel 1 acetyliert. Diäthylarain (5,3 g) wurde in der acetylierten Mischung dispergiert (was eine Basizität entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer l#igen wäßrigen Dispersion ergab), und sie wurde dann langsam in kräftig gerührtes Aceton (looo ml und 2ο ml Wasser) bei 54⁰C gegossen; das Rühren wurde 3o Minuten während Kühlung auf Raumtemperatur fortgesetzt,' das suspendierte Material wurde durch Filtrieren abgetrennt, in Aceton (looo ml) wieder suspendiert und 5o Minuten gerührt und schließlich filtriert, mit Aceton (5oo ml) gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet, um das Produkt (42,8 g) zu ergeben.

Beispiel 9

Beispiel 8 wurde in jeder Hinsicht wiederholt, mit der Ausnahme, daß Aceton bei Raumtemperatur durchweg verwendet wurde. Die Ausbeute an Produkt betrug 44,ο g

Beispiel Io

Die Arbeitsweise von Beispiel 9 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Trlmebhylamin (4,4 g) anstelle von Diäthylamin verwendet wurde. Da dieses Amin stark flüchtig ist (Kp 3,5⁰C),wurde es der acylierten Mischung,auf -5⁰C gekühlt, in Form einer 2o$igen Lösung in kaltem Aceton zugesetzt, und die Mischung wurde dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Ausbeute an Produkt war 49,1 g.

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-2ο -

Beispiel 11

Beispiel 7 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Triäthylamin als Stickstoffbase eine konzentrierte wäßrige Ammoniaklösung (15 ml, spez. Gew. o,88, ausreichend," um eine Basizität entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer l$igen wäßrigen Dispersion zu liefern) verwendet wurde. Es wurde eine Ausbeute von 47,4 g Produkt erhalten.

Beispiel 12

Die alkoholunlösliche, kephalinangereicherte Phosphat idf rak ti on von Beispiel 6 (loo g) wurde in Aceton (5o ml und 2$ Wasser) dispergiert; Essigsäureanhydrid (2,75 g) und Triäthylamin (6,5 g) wurden zu der Dispersion zugegeben und die Mischung wurde Io Minuten bei Raumtemperatur (2o°0) geschüttelt. Ein Versuch zeigte, daß eine l^igeDispersicnder Reaktionsmischung in Wasser einen pH-Wert von 9,6 hatte. Eine Untersuchung durch Dünnschichtchromatographie auf Siliciumdioxyd mit einem Gemisch von Chloroform, Methanol und Wasser (65 :' 25 ! Volumenanteile) zeigte die Abwesenheit'von ninhydrinpo- ■ sitiven Substanzen, was die Abwesenheit von nichtaoyliertem Kephalin zeigte.

Die acetylierte Mischung wurde während Io Minuten in kräftig gerührtes Aceton (looo ml) eingeführt, das■Io ml Wasser und loo ml butyliertes Kresol als Antioxydationsmittel enthielt, und die Mischung wurde während weiterer 15 Minuten gerührt und dann filtriert. Der Rückstand wurde in Aceton (5oo ml, 5 ml Wasser),das butyliertes Kresol (5o mg) enthielt, suspendiert,^ gerührt und filtriert; dieses Waschen wurde mit dem Lösungsmittel bei 4o bis

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5o°0 wiederholt und das Endprodukt wurde bei Raumtemperatur unter verringertem Druok getrooknet.

Daa Produkt (4o,3 g) enthielt, wie DünnechichtChromatographie zeigte, Spuren von Acetylkephalin, aber kein Kephalin.

Beispiel 13

I
Das Sojaphosphatidausgangsmaterial von Beispiel 6

(5o g) wurde in Methylacetat (5o ml) suspendiert, und es wurden Essigsäureanhydrid (1,38 g) und Triäthylamin (3,25 g) zugegeben, und die Mischung wurde Io Minuten bei Io bis 2o G geschüttelt. Das Produkt wurde einer Dünnschicht Chromatographie unterworfen und die Prüfung zeigte die Abwesenheit von ninhydrinpositivem Material, was anzeigte, daß die Acetylierung vollständig war.

Die acetylierte Mischung (die genügend basisch war, um einen pH-Wert von über 9 in einer l^igen wäßrigen Dispersion zu liefern) wurde während Io Minuten zu kräftig gerührtem Methylacetat- (5oo ml) zugesetzt und weitere 15 Minuten gerührt. Die unlöslichen Stoffe wurden abfiltriert, und der Rückstand wurde wieder in Methylacetat (25o ml) suspendiert, 15 Minuten gerührt,und die Suspension wurde wieder filtriert. Diese Extraktion wurde mit Mothylacetat bei 5o bis 55°C (25o ml) wiederholt, wobei sich eine dunkle gummiartige Masse ergab, die im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet wurde, wobei sich ein dunkelbrauner bröckeliger Peststoff (25,1 g) ergab, dessen Dünnachichtchromatographie die Gegenwart von kleinen Mengen von Acylkephalin, aber kein Kephalin zeigte.

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Beispiel 14

Zu der alkoholunlöslichen Fraktion von Sojaphosphatid von Beispiel 6 (lot) g) wurde Aceton (15 ml) zugegeben. 3Die Mischung wurde gerührt, bis sie homogen war,,und dann in Aceton (looo ml, mit einem Gehalt von 2o ml Wasser) gegossen. Der Niederschlag wurde abfiltriert, das fettenthaltende Piltrat wurde verworfen und der Niederschlag wurde wieder in Aceton (2oo ml, mit einem Gehalt von 4 ml Wasser) wte<ie-r suspendiert. Zu der gerührten Suspension wurde Triäthylamin (6,5 g, ausreichend, um der endgültigen Reaktionsmischung eine .Basizität entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer wäßrigen Dispersion zu erteilen) und Essigsäureanhydrid (2,75 ml) zugegeben, und die Mischung wurde bei Umgebungstemperatur 3o Minuten gerührt und dann filtriert. Der gerührte Rückstand würde zweimal mit Aceton (2oo ml, mit einem Gehalt von 4 ml Wasser) extrahiert, wobei die ersteExtraktionbei 'Raumtemperatur und die zweite bei 5o°0 erfolgte, und unter verringertem Druck bei 35⁰C getrocknet, wobei sich ein Produkt (48 g) ergab, das nur eine geringe Menge von H-Acetylkephalin enthielt.

Beispiel 15

Die alkoholunlösliche entfettete Phosphatidfraktion von Beispiel 5 (Io g), Phthalsäureanhydrid (2,8 g) und Triäthylamin (Io ml, genügend, um die erforderlichen basischen Bedingungen zu liefern) wurden zusammen in Chloroform (3o ml) gelöst,und die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur 15 Minuten stehengelassen. Eine Dünnschichtchromatographie zeigte, daß die Mischung dann kein freies Kephalin enthielt. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt und der Rückstand wurde dreimal mit Aceton (loo ml, mit einem Gehalt von 2 ml Wasser) bei Umgebungstemperatur extrahiert; der unlösliche Rückstand wurde unter verringertem Druck getrocknet und ergab ein Produkt (5,9 g)>

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das, wie DünnBchichtchromatographie zeigte, praktiBch frei von Kephalin und o-Carboxybenzoylkephalin war. Der Acetonextrakt ergab bei Verdampfung o-Carboxybenzoylkephalin in Form erner gummi artigen Masse.

Me bo erhaltene gummiartige Masse (Io g) wurde auf einer neutralen Siliciumdioxydgelsäule chromatographiert, und die Säule wurde zuerst mit Chloroform und dann mit lo?£ Methanol /enthaltendem Chloroform eluiert. Aus demEluat wurde das o-Carboxybenzoylkephalin (3,73 g) als Peststoff isoliert} zu diesem wurde Essigsäureanhydrid (3 ml) und Chloroform (3o ml) zugegeben, und die gebildete Lösung wurde 3o Minuten stehengelassen. Eine dünnschichtchromatographiBche Untersuchung der Mischung zeigte, daß ein Ringschluß zu der Phthalimidoverbindung» N-Phthaloylkephalin vollständig war. Die Mischung wurde dann zur Trockene unter verringertem Druck eingedampft, Hydrazinhydrat (o,6 g) in Äthanol (3o ml) wurde zugegeben, die Lösung wurde unter schwachem Rückfluß 2 Stunden erhitzt und das gekühlte Produkt wurde durch Dünnschichtchromatographie untersucht, wobei festgestellt wurde, daß es aus freiem Kephalin bestand.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Trennen eines N-Acylphosphatids von einem Phosphatid ohne eine acylierbare Aminogruppe, dadurch gekennzeichnet, daß man eine diese Phosphatide enthaltende Mischung mit einer Stickstoffbase auf das Äquivalent eines pH-Wertes von wenigstens 8,5 unter wäßrigen' Bedingungen "basisch macht und einer Lösungsmittelfraktion mit Aceton oder Methylacetat unterwirft.

2. Verfahren nach Anspruch "I₉ dadurch gekennzeichnet, daß die zu trennende Mischung aus einer solchen besteht, die durch Umsetzung einer K-acylierbaresund nicht-N-acylierbares Phosphatid umfassenden Phosphat idmieclmng mit einem Acylierungsmittel erhalten lot .

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die N-acylierbares und nicht-H-acylierbaresPhosphatid enthaltende Mischung Kephalin und Lecithin enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß 0,1 bis 2o Gew.-Teile Lecithin je Gew.-Teil Kephalin vorhanden sind.

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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Acylierungsmittel ein Fettsäureanhydrid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das Säureanhydrid aus Essigsäureanhydrid besteht.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zu trennende Mischung aus einer solchen besteht, bei welcher die Acylierung in Gegenwart eines nicht-acylierbaren Amins als Katalysator ausgeführt worden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung und die Lösungsmittelextraktion gleichzeitig ausgeführt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung ohne Katalysator ausgeführt wird und die Stickstoffbase dem Acylierungsgemisch zugegeben wird, bevor nicht-umgesetztes Acylierungsmittel von ihm abgetrennt ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Fraktionierungslosungsmittel aus Aceton besteht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Fraktionierungslosungsmittel aus Methylacetat besteht.

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12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffbase einen pKa-Wert von wenigstens 9 hat.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffbase aus Ammoniak, Biäthylamin, Trimethylamin oder Triäthylamiii besteht.

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