DE1949399C

DE1949399C - Glycolphosphatidgemische und deren Herstellung

Info

Publication number: DE1949399C
Application number: DE19691949399
Authority: DE
Inventors: Hans Dipl.-Chem.Dr. 5158 Horrem Betzing
Original assignee: A. Nattermann & Cie GmbH, 5000 Köln-Braunsfeld
Filing date: 1969-09-30
Publication date: 1973-01-18

Description

Die bekannten Kephalinfraktionen enthalten bei HC — O — R
Gewinnung aus pflanzlichem Material neben Leci-

thinen im wesentlichen Phosphatidylcolamin und im H₂C — O — P — O — CH₂CHOH

Falle der Gewinnung aus tierischen Quellen Phospha- 45 ^\ '

tidykolamin und Phosphatidylserin. Diese Kephaline O OH X
weisen je nach dem speziellen Ausgangsmaterial

unterschiedliche Feltsäurereste mit im allgemeinen worin R¹ und R² in pflanzlichen und tierischen Phosbis 24 Kohlenstoffatomen auf. Die für therapeu- phatiden vorkommende Fettsäurereste mit 10 bis tische Zwecke bevorzugten Kephalinfraktionen ent- 50 24 C-Atomen darstellen und X ein Wasserstoffatom halten Phosphatidylcolamine bzw. Phosphatidylserine, oder die — COOH-Gruppe ist.
die einen großen Prozentsatz an ungesättigten, ins- Glycolphosphatidgemische, in denen die Fettsäurebesondere mehrfach ungesättigten Fettsäureresten reste ungesättigt oder mehrfach ungesättigt sind, sind besitzen. Wegen der starken Reaktionsfähigkeit, bevorzugt.

besonders der mehrfach ungesättigten Fettsäuren, ist 55 Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur deren Isolierung nicht einfach. Sie fallen im allge- Herstellung der Glycolphosphatidgemische der vormeinen bei der Extraktion von Rohphosphatiden stehend angegebenen allgemeinen Formel, das dadurch mit niederen Alkoholen an. gekennzeichnet ist, daß man bei Raumtemperatur

Die Kephaline bzw. die diese enthaltenden Phos- oder unter schwacher Erwärmung zu einer Lösung

phatidfraktionen können unter anderem als natürliche 60 von Phosphatidylcolamin und/oder Phosphatidylserin

Emulgatoren dienen, da sie neben den lipophilen in einem organischen Lösungsmittel eine gekühlte

Fettsäurerester. noch die hydrophile Glycerinphos- wäßrige salpetrige Säure hinzufügt und die durch

phorsäuregruppierung nebst den ebenfals hydro- Diazotierung und Hydrolyse desaminierten Phospha-

philen Colamin- oder Seil^-^'en aufweisen. Aller- tidverbindungen in an sich bekannter Weise isoliert,

dings ist die Emulgatorwirkung relativ genug, was 65 Die Fettsäuren pflanzlicher und tierischer Zellen

darauf zurückgeführt werden kann, daß die freie besitzen bekanntlich immer eine gerade Anzahl von

Aminogruppe durch die Phosphorsäuregruppe intra- C-Atomen und sind bis auf ganz seltene Ausnahmen

molekular salzartig gebunden ist. geradkettiger Natur (Wolfgang Langenbeck

Lehrbuch der Organischen Chemie, 13./14. Auflage, 1953, Steinkopf-Verlag Dresden und Leipzig; Fortschritte der Medizin, Bd. 83, S. 517 bis 519, 1965). Die Phosphatide mit ungesättigten Fettsäuren, zu denen im wesentlichen die ölsäure sowie die Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure gehören, sind in pflanzlichen und tierischen (sowohl bei Warmblütern als auch bei Fischen) Fetten und ölen weit verbreitet. Sie sind wegen ihrer physiologischen Stoffwechselwirkungen von Bedeutung, weshalb die erfindungsgemäßen Glycolphosphatide mit ungesättigten oder mehrfach ungesättigten Fettsäureresten besonders wertvoll sind.

Die neuen Glycolphosphat'dgemische, die man auch als Desaminokephaline bezeichnen kann, sind im Gegensatz zu den Kephalinen völlig alkohollöslich. Sie weisen gleichzeitig auch eine wesentlich größere Wasserlöslichkeit auf als di^ Phosphatidylcolamine und Phosphatidylserine. Da sie die störende Blutgirinnungsaktivitäl der Kephaline nicht mehr besitzen, sind die neuen Glycolphosphatide für die intravenöse Fetternährung vorzüglich geeignet. Gleich-7citig können sie auch als wirksamere öl-in-Wasser-[ mulgatoren zur Herstellung von Fettpräparaten dienen. Auf Grund der reaktionsfähigen freien Hydroxylgruppe sind die Glycolphosphatide auch zur Herstellung weiterer, an der OH-Gruppe substituierter Verbindungen, z. B. Esterverbindungen, geeignet und daher auch wertvolle Zwischenprodukte l'ur neuartige Arzneimittel. Die Zusammensetzung der Fettsäuren schwankt je nach verwendetem Kephalinausgangsmaterial. Im allgemeinen überwiegt der Anteil an Fettsäuren mit der Kohlenstoff zahl 16 und 18, was auch für die ungesättigten Fettsäuren gilt. Bei Kephalinen aus Eidotter enthalten die daraus hergestellten Glycolphosphatide unter anderem auch C₂₀- und C₂₂-Fettsäuren, bei Gehirn als Ausgangssubstanz auch noch C₂₄-Fettsäuren.

Gegenüber den Kephalinen ist durch die Üesaminierung zu den Glycolphosphatiden sogar die Emulgierkraft verbessert, wie die nachfolgenden einfachen Versuche leicht erkennen lassen.

Ein einfacher Schütteltest zur Prüfung der Eignung als Emulgator bei einer Öl-in-Wasser-Emulsion wird wie folgt durchgeführt:

1 g eines Phosphatids wird in einem 100-ml-Schüttelzylinder in 10 g Sonnenblumenöl durch Erwärmen im Wasserbad auf 70⁰C unter Schütteln in Lösung gebracht. Nach dem Abkühlen auf 25°C werden 90 ml dest. Wasser von 25" C zugefügt und die Phasen durch scharfe Auf- und Abbewegungen des Zylinders jede 30 Sekunden emulgiert. Es wird die Zahl der Schüttelungen ermittelt, die notwendig sind, um eine Emulsion zu bilden, die wenigstens 30 Sekunden stabil ist.

Soja-Rohphosphatid

entöltes Soja-Rohphosphatid .......

alkoholunlösliche Fraktion
aus Soja-Rohphosphatid..

Handelsprodukt

ErfindungsgemäB desaminiertes

Anzahl der Schüttelungen Substanz

10 16 40 Bei vorsichtiger Einwirkung der salpetrigen Säure nach dem Verfahren der Erfindung, z. B. in der Kälte, werden auch die mehrfach ungesättigten Fettsäurereste der Phosphatidylverbindungen chemisch nicht

S verändert. Die spektralanalytischen und gaschromatographischen Untersuchungen zeigten, daß die charakteristische IR-Bande des Kephalins bei 9-,8 μ verschwunden ist, ohne daß die Doppelbindungen sich durch die Behandlung verändert haben.

Vorzugsweise erfolgt die Einwirkung der salpetrigen Säure in der Weise, daß man eine wäßrige Lösung eines Salzes der salpetrigen Säure und eines sauren Salzes einer organischen oder anorganischen Säure verwendet und diese wäßrige Lösung unter Rühren

der kephalinhaltigen organischen Lösung zutropft. Diese milde Einwirkungsform der salpetrigen Säure ermöglicht, die Umsetzung bei Raumtemperatur oder

. unter schwacher Erwärmung sogar ohne Gefahr für die sterische Form der ungesättigten Fettsäurereste

durchzuführen. Als Lösungsmittel für die kephalinhaltigen Ausgangssubstanzen eignen sich Alkohole oder chlorierte Kohlenwasserstoffe mit 1 bis 4 C-Atomen. Auch Kohlenwasserstofflösungsmittel sind geeignet. Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen

as Desaminierungsreaktion der Phosphatidylcolamine und/oder Phosphatidylserine hat sich besonders Chloroform als ein sehr brauchbares Lösungsmittel

erwiesen.

Das erfindungsgemäße Desaminierungsverfahren

ermöglicht, die Glycolphosphatide leicht zu isolieren,

da ihre große Alkohollöslichkeit die Extraktion und

Abtrennung von anderen Begleitphosphatiden sehr erleichtert.

Praktisch geht das erfindungsgemäße Verfahren

zur Herstellung der Glycolphosphatide so vor sich, daß entweder reines Kephalin, wie es beispielsweise durch säulenchromatographische Trennung von kephalinreicben Phosphatidraktionen auf Kieselgelsäulen durch Elution mit Chloroform-Methanol-Gemischen

gewonnen werden kann, oder ein kephalinhaltiges Phosphatidgemisch — ölhaltig oder entölt — in einem Alkohol oder chlorierten Kohlenwasserstoff mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder in einem Kohlenwasserstofflösungsmittel wie Petroläther, Hexan, Cyclo-

*5 hexan, Benzol oder Mischungen dieser Lösungsmittel gelöst wird, diese Lösung dann unter Kühlung, bei Zimmertemperatur oder höheren Temperaturen mit der wäßrigen Lösung der salpetrigen Säure oder nacheinander oder gleichzeitig mit einer wäßrigen

Lösung eines Alkali- oder Erdalkalisalzes der salpetrigen Säure und einem sauren Salz einer anorganischen bzw. organischen Säue, vorzugsweise Natrium-dihydrogenphosphat, Natrium-hydrogencitrat oder Kaliumhydrogenphthalat, versetzt und unter

Luftabschluß gerührt wird, bis die den Kephalinphosphatiden zugehörige freie minogruppe nicht mehr mit Ninhydrin-Reagenz nachzuweisen ist. Danach wird bei Verwendung von Alkohol das Lösungsmittel ganz oder teilweise im Vakuum abgedampft

und vorzugsweise durch einen chlorierten Kohlenwasserstoff ersetzt. Zur Entfernung der wasserlöslichen Anteile kann die Lösung noch zwei- bis dreimal mit Wasser ausgewaschen, werden. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter Stickstoff resultiert

ein gelbes bis gelbbraunes plastisches Produkt.

Der besondere Vorteil des Verfahrens unter Verwendung von Salzlösungen liegt darin begründet, daß es möglich ist, bei der Diazotierung der freien

Aminogruppe auf die Säure ganz zu verzichten und die Freisetzung der salpetrigen Säure aus dem Nitrit durch saure Salze in situ so zu steuern, daß eine Umlagerung der .in «fen Phospriatiden vorhandenen Fettsäuren zu trans-Fettsäuren praktisch unterbleibt. Auch eine Veränderung in der Fettsäurezusammensetzung der behandelten Produkte tritt nicht auf. Insbesondere bleibt der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, speziell an Polyenfettsäuren mit ihren essentiellen Eigenschaften, durch das Verfahren unverändert.

In der Regel wird man die Diazotierung bis zur quantitativen Entfernung der primären NH₂-Gruppe des Kephalins durchführen; es ist aber auch unschwer möglich, mit weniger als den in den Beispielen angegebenen Mengen an Natriumnitrit und saurem Salz zu arbeiten, wobei eine tejiweise Entfernung des Stickstoffs aus dem Kephalinmolekül erreicht wird, was bereits zu einer guten Verteilung dieser Phosphatidprodukte in wäßrigen Medien führt.

Ein weiterer Vorteil des vorliegenden Verfahrens der Anmeldung ist die Tatsache, daß die kephalinfraien Produkte günstige Eigenschaften aufweisen, z. B. deutlich bessere Säurezahlen und Phosphor-Werte als die entsprechenden Ausgangsprodukte, wie aus der nachfolgend aufgeführten Tabelle hervorgeht.

Tabelle I

Substanz	Jodzahl	Säurezahl	Phosphor
Handelsübliches Roh- phosphatid	86,5	20,3	2,1
Nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert	87,2	9,4	2,34
Entöltes Rohphosphatid	70,3	30,1	3,1
Nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert	77,4	5,5	3,28
Alkoholunlösliche Soja- phosphatid-Fraktion...	66,7	32,3	3,0
Nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert	70,2	14,4	3,23
Alkohollösliche Soja phosphat id-Fraktion. ..	85,0	18,0	3,1
Nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert	86,7	4,0	3,12

Tabelle!!

Fettsäurezusammensetzung des Phosphatidylglycols aus Sojaphosphatid

Laurinsäure 0,1%

Myristinsäure 0,2 %

Palmitinsäure ...' 26,0%

Stearinsäure 2,0%

ölsäure 7,0%

Linolsäure 60,0%

Linolensäure 4,5%

Arachinsäure 0.2 ⁰Z₀

100,0%

Bei einem aus Ei erhaltenen Gemisch aus Phosphatidylcolamin und Phosphatidylserin wurde nach dem Desaminieren folgende Fettsäurezusammensetzung ermittelt:

-,ο Tabelle IH

Fettsäurezusammensetzung des Glycolphosphatids aus Ei-Kephalin (Gemisch aus Colamin- und Serin-

Kephalin)

,j Caprinsäure 1,2 %

Laurinsäure 0,4%

Myrislinsäure 2,0 %

Myristoleinsäure 0,2 %

Palmitinsäure 22,6 %

Palmitoleinsäure 0,7 %

Stearinsäure 23,0%

ölsäure 17,2%

Linolsäure 16,0%

Linolensäure 2,0 %

Arachinsäure 0,4 %

Arachidonsäure 12,8 %

Behensäure 1,5%

100,0%

Für die Umsetzung mit der salpetrigen Säure gemäß der Erfindung kann man die reinen Kephaünverbindungen oder auch die diese enthaltenden Phosphatidgemische verwenden. Die in diesen noch enthaltenen Lecithine können die Umsetzung nicht stören, denn sie werden von der salpetrigen Säure unter den milden Reaktionsbedingungen nicht angegriffen, da sie keine primären Aminogruppen enthalten.

Bei der Untersuchung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Desaminierung von Phosphatidylcolamin erhaltenen neuen Glycolphosphatide wurden im Falle des Sojaphosphatids als Ausgangsmaterial bei der gaschromatographischen Untersuchung .olgende Fettsäuren ermittelt:

Beispiel 1

200 g reines Kephalin (Phosphatidylcolamin), hergestellt aus alkoholunlöslicher Sojaphosphatidfraktion durch säulenchromatographische Trennung auf Kieselgel mit Chloroform-Methanol 80:20 als Elutionsmittel, werden in einem Gemisch von 1000 ml Chloroform und 1000 ml Methanol gelöst und unter Rühren und Einleiten von N_t mit einer Lösung von 125 g Natriumnitrit in 200 ml dest. Wasser versetzt.

Die Mischung wird im Wasserbad auf 37 ⁰C erwärmt. Dann läßt man langsam eine Lösung von 230 g Natriumdihydrogenphosphat mal 2 Wasser in 200 ml dest. Wasser zutropfen. Nach insgesamt 2stündigem Rühren bei 37°C ist alles Kephalin diazotiert, und es läßt sich dünnschichtchromatographisch mit Ninhydrin-Reagenz keine Aminogruppe, d. h. kein Kephalin mehr nachweisen.

Zur Aufarbeitung wird vom Unlöslichen dekantiert, der Rückstand mit wenig Chloroform ausgewaschen und verworfen. Die Chloroform-Lösungen werden in einen Scheidetrichter überführt und, falls erforderlich, mit so viel Wasser versetzt, bis sich zwei Schichten ausbilden. Die untere chloroformhaltige Schicht wird abgetrennt und mit etwa 400 ml Wasser gewaschen und erneut im Scheidetrichter von der Wasserphase getrennt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum unter N₂ bleiben 190 g Glycoiphosphatid zurück.

7 8

Beispiel 2 Rückstand dekantiert, der Rückstand mit wenig

Chloroform ausgewaschen und dieses Chloroform

500 g alkoholunlösliche Sojabohnenphosphatidfrak- zur dekantierten Lösung zugegeben. Die vereinigten tion, wie sie durch Entölen von handelsüblichem Lösungen werden dann mit 500 ml Wasser unter N₂ Sojaphosphatid mit Aceton und anschließendem S gerührt, die Lösung im Scheidetrichter kurz absitzen mehrmaligem Extrahieren des entölten Produktes lassen und dann die untere Chloroformschicht von mit Äthanol in der Wärme als Rückstand verbleibt dem Waschwasser abgetrennt. Das Auswaschen der (Kephalingehalt etwa 30%), werden in einem Gemisch Chloroformlösung wird noch zweimal mit je 400 ml von 700 ml Chloroform und 500 ml Methanol unter Wasser wiederholt. Zum Schluß wird die Chloroform-Rühren und Einleiten von N₂ gelöst und mit einer io lösung im Vakuum unter Stickstoff vom Lösungs-Lösung von 69 g NaNO₂ in 80 ml dest. Wasser ver- mittel befreit. Es bleiben 1,8 kg (= 90°/₀) eines setzt. Zu dieser Mischung läßt man dann unter Rühren gelbbraunen, plastischen Phosphatidgemisches zurück, eine Lösung von 138 g NaIi₂PO₄ · 1-hydrat in 100 ml das folgende Kennzahlen aufweist: JZ — 78, SZ dest. Wasser zutropfen, worauf das Reaklioiisgemisch = 5,5, P = 3,3 °/„. Im Emulsionsbildungs-Test, wie noch weiter bei Zimmertemperatur unter N₂ gerührt 15 er im Beispiel 2 beschrieben ist, wurde bereits nach wird. Nach 3.5 Stunden zeigt eine Probe der Substanz einer Drehung, gegenüber 16 beim Ausgangsmaterial, nach dünnschichtchromatographischer Trennung auf eine stabile Emulsion erhalten.
Kieselsäuregel-Platten im Laufmittel Chloroform-Methanol-Wasser (65:25:4) und nach Ansprühen Beispiel 4
mit Ninhydrin-Reagenz, daß kein Kephalin mehr 20

im Gemisch vorhanden ist. Die Lösung wird von 1 kg einer alkohollöslichen Phosphatidfraktion.

dem ausgeschiedenen halbfesten Phosphat abdekan- wie sie durch Entölung von handelsüblichen Roh-

tierl und so lange mit dest. Wasser versetzt, bis sich phosphatiden mit Aceton und anschließendem wieder-

zwei Schichten gebildet haben. Dazu sind etwa 150 ml hohem Extrahieren des entölten Phosphatidgemisches

Wasser erforderlich. Die Wasserphase (obere Phase) 25 mit Alkohol gewonnen werden kann, wird in 3 1

wird in Scheidetrichtern abgetrennt und verworfen. Äthanol gelöst und unter Rühren und Einleiten von

Nach Zugabe von etwa 200 ml Wasser wird gut N₂ mit einer Lösung von 120 g NaNO₂ in 120 ml

durchgemischt und erneut von der Wasserphase Wasser und einer Lösung von 200 g NaH₂PO₄ ■ 1 H₂O

abgetrennt. Sollte die zweite Wasserphase noch merk- in 200 ml Wasser versetzt. Beide Salze werden unter

lieh sauer sein, wird ein weiteres Mal mit Wasser 30 Erwärmen in dest. Wasser in Lösung gebracht. Das

gewaschen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels Reaktionsgemisch wird bei 50⁰C unter Rühren und

im Vakuum unter N₂ resultieren aus der Chloroform- unter Einleiten von N₂ erwärmt. Nach etwa 1 Stunde

phase 400 g eines Phosphatidgemisches mit folgenden ist das gesamte Kephalin diazotiert. Die Reaktions-

Kennzahlen: JZ = 70, SZ ^ 14, P = 3,2%, das lösung wird vom Rückstand dekantiert und der

an Stelle des Kephalins das neue Glycolphosphatid 35 Rückstand mit etwas Äthanol nachgewaschen. Durch

enthält. Destillation im Vakuum unter N₂ wird der Alkohol

Die verbesserte Emulsionsbildung dieses Produktes bis auf etwa 700 ml abdestilliert und zum Rückstand

zeigt der folgende Versuch: etwa 1,51 Chloroform zugegeben. Die Lösung wird

1 g des glycolphosphatidhaltigen Phosphatidge- zwei- bis dreimal mit je etwa 300 ml Wasser ausmisches wird durch Rühren und Erwärmen auf 60 40 gewaschen und das Waschwasser verworfen. Die bis 70 C in 10 g Sonnenblumenöl gelöst. Nach Chloroform-Lösung wird im Vakuum unter N₂ ein-Abkühlen auf 20'C wird die Mischung in einen gedampft. Es bleiben 950 g (= 95%) eines kephalin-100-ml-Schüttelzylinder überführt und 90 ml dest. freien, Glycolphosphatid enthaltenden Gemisches zuWasser von 20⁰C zugefügt. Durch eine scharfe rück mit den folgenden Kennzahlen: JZ 82. Drehung des Zylinders um 90° alle 30 Sekunden 45 SZ = 4. P = 3,2%.

werden die beiden Phasen emulgiert. Gemessen wird

die Anzahl der Drehungen, die erforderlich sind, Beispiel 5

eine für 30 Sekunden stabile Emulsion zu erhalten.

Für das kephalinfreie Produkt sind nur zwei Dre- 1 kg handelsübliches Sojabohnenrohphosphatid wire

hungen erforderlich, während bei Verwendung des 50 in 1,21 Dichloräthan und 600 ml Äthanol unlei Ausgangsmaterials, d. h. der kephalinhaltigen aiko- N₂-Schutz gelöst und unter Rühren bei einer Tem holunlöslichen Phosphatidfraktion, auch nach 50 Dre- peratur von 50°C nacheinander mit einer Lösunj hungen keine Emulsion erhalten wurde. von 100 g NaNO₂ in 120 ml Wasser und 170 j

NaH₂PO₄-IH₂O in 175 ml Wasser versetzt. Dabe B e ι s ρ 1 e I J 55 ist es zweckmäßig, die Natriumhydrogenphosphat

2 kg lediglich durch wiederholte Behandlung mit lösung langsam zutropfen zu lassen. Nach 2,5 Slundei Aceton vom Öl befreites Sojabohnen-Rohphosphalid Rühren ist das Reaktionsgemisch kephalinfrei. Nacl werden in einem Gemisch von 41 Chloroform und dem Abkühlen auf Zimmertemperatur dekantier 11 Methanol unter Rühren und Schutz eines inerten man die Lösung, wäscht den halbfesten Rückstant Gases (N₂) gelöst und mit einer Lösung von 250 g 60 mit Dichloräthan nach, gibt die Waschflüssigkei NaNO₂ in 220 ml warmem dest. Wasser versetzt. zur Hauptlösung dazu und wäscht die Dichloräthan Das Reaktionsgemisch wird auf 50⁰C erwärmt und Äthanol-Lösung zwei- bis dreimal mit je etwa 250 m tropfenweise mit einer Lösung von 460 g NaH₂PO₄ · Wasser aus. Nach dem Abdestillieren des Lcsungs IH₂O in 450 ml warmem dest. Wasser zugegeben. mittels im Vakuum unter N₈ bleiben 950 g ölhaltiges Nach insgesamt 2,5stündigem Rühren bei 50¹¹C 65 kephalinfreies Rohphosphatid zurück. Zur stabile) unter N₂ war das Reaktionsprodukl kephalinfrei. Emulsion gemäß dem unter Beispiel 2 aufgeführte! Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wird die Test ist nur eine Drehung erforderlich gegenübe Chloroform-Methanol-Lösung vom anorganischen 10 beim handelsüblichen Rohphosphatid.

Beispiel 6

1 kg einer alkoholunlöslichen Sojaphosphatidfraktion, wie sie auch im Beispiel 2 verwendet wurde, werden unter Rühren und Schutz eines inerten Gases in 21 Hexan gelöst und nach Erwärmen auf 5O⁰C mit einer Lösung von 200 g Natriumnitrit in 325 ml Wasser versetzt. Zu dem Reaktionsgemisch fügt man tropfenweise eine Lösung von 400 g Natriumdihydrogenphosphat in 550 ml Wasser zu. Nach insgesamt 2,5 Stunden intensivem Rühren ist die Phosphatidfraktion kephalinfrei. Man läßt das Reaktionsprodukt zweckmäßigerweise im Eisschrank abkühlen und dekantiert dann die überstehende Lösung ab. Der Rückstand wird wiederholt mit Hexan ausgewaschen, die Hexanlösungen werden vereinigt und dann etwa dreimal mit je 300 ml Wasser ausgeschüttelt. Die wässerigen Phasen werden abgetrennt, falls erforderlich durch kurzes Zentrifugieren, und verworfen; die Hexanlösungen im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Es resultieren 750 g eines Phosphatidgemisches, das an Stelle des Kephalins das Glycolphosphatid enthält.

Beispiel 7

500 g liner alkohollöslichen Phosphatidfraktion, die nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 1 047 597 gewonnen wurde, werden in einer Mischung von 700 ml Chloroform und 500 ml Methanol gelöst und unter Rühren und Erwärmen auf 50⁰C nacheinander mit einer Lösung von 70 g Natriumnitrit in 200 ml Wasser und einer Aufschlämmung von 185 g Kaliumhydrogenphthalat in 100 ml Wasser versetzt. Nach 7 Stunden ist das Reaktionsgemisch kephalinfrei. Nach dem Abkühlen wird die überstehende Lösung vom Unlöslichen dekantiert, der Rückstand mit Chloroform η ach gewaschen, dieWaschflüssigkeit mit der Chloroform-Methanol-Lösung vereinigt und wiederholt mit etwa 120 ml Wasser ausgewaschen. Dann wird die Chloroform-Lösung im Vakuum unter Stickstoff eingedampft. Ausbeute: 450 g eines Glycolphosphatid enthaltenden, alkohollöslichen Phosphatidgemisches.

Beispiel 8

180 g Ei-Rohphosphatid, das aus frischem Eigelb zunächst durch Behandlung mit Aceton zur Entfernung der Neutraliipide und des Cholesterins und dann durch Extrahieren des ölfreien Rückstands mit Chloroform-Methanol 2:1 und Auswaschen der wasserlöslichen Anteile nach J. F ο 1 c h und Mitarbeiter (J. Biol. Chem. 191, S. 833, 1951) hergestellt

ίο worden war, das sowohl Serinphosphatid als auch Colaminphosphatid enthält, werden in einem Gemisch von 1 1 Chloroform und 11 Methanol gelöst und unter Rühren und Erwärmen auf 37⁰C nacheinander mit einer Lösung von 120 g Natriumdihydrogen-

t5 phosphat und 60 g Natriumnitrit in jeweils 200 ml Wasser versetzt. Nach 3,5stündigem Rühren ist das Reaktionsprodukt frei von ninhydrinpositiven Phosphatiden. Die chloroformhaltige Lösung wird von der gebildeten Wasserphase abgetrennt und noch einbis zweimal mit je 200 ml Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum unter Stickstoff bleiben 169 g eines kephalinfreien, die entsprechenden Glycolphosphatide enthaltenden Phosphatidgemisches zurück.

Beispiel 9

500 g einer alkohollöslichen Phosphatidfraktion (gewonnen wie unter Beispiel 4 beschrieben) werden

in 1,51 Äthanol gelöst und bei Zimmertemperatur mit einer auf 0⁰C gekühlten wässerigen Lösung von salpetriger Säure versetzt, die aus 200 g Natriumnitrit, gelöst in einer Mischung von 800 ml Wasser und 250 ml Äthanol, durch Zutropfen von 470 ml 12.5°/_Oiger Salzsäure unter Eiskühlung hergestellt * wurde. Nach 3stündigem Rühren unter Stickstoffschutz zeigte das Phosphatidgemisch keine Reaktion mehr auf Ninhydrin-Reagenz. Durch Zugabe vor Chloroform bilden sich zwei Schichten, wovon dif untere abgetrennt und mit Wasser nachgewascher wird. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels in Vakuum unter Stickstoffschutz resultieren 470 g eine: Glycolphosphatid enthaltenden Gemisches.

Claims

ι 2 Wegen der Anwesenheit der aus physikalisch- Patentanspruche: chemischen sowie biologischen Gründen wertvollen

1. Glycolphosphatidgemische der allgemeinen ungesättigten Fettsäuren finden kephalinhaltige Phos-Formel phatidgemische auch als Arzneimittel Verwendung.

HX — O — R¹ 5 Als Emulgatoren für eine intravenöse Fetternährung

"ι sind sie allerdings nur mit Vorsicht einzusetzen, da

ΗΓ — O-R* die Kephaline als solche Aktivatoren der Blutgerinnung sind Auß-rdem hat sich herausgestellt, daß ^{die bisher för} '^^ravenöse Fetternährung verwen-₁₀ <ι_ε1εη kephalinhaltigen Phosphatide unangenehne

I Nebenwirkungen wie Fieber und Schüttelfrost her-

O OH X vorrufen können. Wie jetzt erkannt wurde, müssen

worin R¹ und R² in pflanzlichen und tierischen diese nachteiligen Wirkungen in erster Linie der

Phosphatiden vorkommende Fettsäurereste mit Aminogruppe der Kephaline zugeschrieben werden.

10 bis 24 C-Atomen darstellen und X ein Wasser- is Aus der USA.-Patentschnft 3 301 881 ist schon

stoffatom oder die — COOH-Gruppe ist. ein Verfahren bekannt, bei dem durch Behandlung

2. GFycolphosphaiidgemische nach Anspruch I. wäßriger Phosphatidemulsionen mit organischen dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäurereste Säureanhydriden das Kephahn ganz oder teilweise ungesättigt oder mehrfach ungesättigt sind. acyliert wurde, wodurch die primäre Aminogruppe

3. Veifaliicu zui Herstellung dci Glycolplios- ao ja ein Säurcamid überführt wurde. Dadurch sollen phatidgemische nach Anspruch 1 oder 2, dadurch die Phosphatide verträglicher werden und in waßgekennzeichnet, daß man bei Raumtemperatur rigen Medien leichter dispergiert werden können, oder unter schwacher Erwärmung zu einer Lösung Allerdings ist ihre Emulgierfähigkeit doch nicht von Phosphatidylcolamin und/oder Phosphatidyl- besser als die der nicht acylierten Kephaline. Es wäre serin in einem organischen Lösungsmittel eine 25 daher wünschenswert, wenn man solche Emulgatoren gekühlte wäßrige salpetrige Säure hinzufügt und einsetzen könnte, die nicht nur arm an Kephalinen die durch Diazotierung und Hydrolyse desami- sein würden, sondern bei denen diese Substanzen nierten Phosphatidverbindungen in an sich be- völlig fehlen, doch hat sich gezeigt, daß reine Lecithine kannter Weise isoliert. keine ausreichenden emulgatorischen Eigenschaften

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- 30 aufweisen. Die gänzliche Abtrennung der Kephaline zeichnet, daß man an Stelle von salpetriger Säure führt daher auch nicht zur Lösung des Problems, eine wäßrige Lösung eines Salzes der salpetrigen Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Säure und eines sauren Salzes einer anorganischen durch Desaminierung von Phosphatidylcolaminen bzw. organischen Säure verwendet. oder Phosphatidylserinen für den vorstehend ange-

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn- 35 gebenen Verwendungszweck geeignete und gut verzeichnet, daß man als Lösungsmittel Chloroform trägliche Emulgatoren erhalten werden können.

und an Stelle von salpetriger Säure eine wäßrige Gegenstand der Erfindung sind Glycolphosphatid-Lösung von Natriumnitrit und Natriumdihydrogen- gemische der allgemeinen Formel
phosphat verwendet. _DI
₄o ^H2^C — O — κ