DE1812204C3

DE1812204C3 - Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem, nicht acylierbarem Phosphatid

Info

Publication number: DE1812204C3
Application number: DE19681812204
Authority: DE
Inventors: Rajindra Welwyn Garden City Hertfordshire Aneja (Ver. Koenigreich)
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1967-12-01
Filing date: 1968-12-02
Publication date: 1980-02-14
Also published as: IT943056B; SE354284B; NL155715B; NL6817199A; DK130705C; DK130705B; BR6804474D0; DE1812204A1; GB1217846A; BE724743A; DE1812204B2; NO128515B; FR1593864A

Description

ROCH₂ · CH · CH₂OPOCH₂CHNh.,'

OR' O R"

worin R und R' langkettige Fettsäurereste sind und R" ein Kohlenstoffatom bzw. ein Hydroxycarbonyl ist: Diese Phosphatide sind gemeinsam unter dem Namen Kephaiin bekannt
lnositphosphatide haben die allgemeine Formel

Phosphatidmischungen werden als Nebenprodukte bei der Herstellung von Pflanzenölen erhalten und in der Margarineindustrie wegen ihrer emulgierenden Eigenschaften in Wasser-in-Öl-Emulsionen verwendet. Solche Phosphatidmischungen bestehen aus verschiede- 4^r> nen Phosphatiden, insbesondere Äthanolamin-, Serin-, Inosit- und Cholin-Phosphatiden, zusammen mit neutralem Triglyceridöl, freien Fettsäuren, Wasser und anderen Begleitsubstanzen, einschließlich von geringen Mengen von Steroiden. Die Mengen von in technischen so Phosphatiden vorhandenem Triglyceridöl liegen oft innerhalb des Bereiches von 30 bis 40 Gew.-% des Gesamtmaterials, "md die Produkte sind viskose Flüssigkeiten. In der Technik werden Mischungen dieser Phosphatide oft als Lecithin bezeichnet. Dieser Name wird jedoch auch spezieller für das Cholinphosphatid selbst benutzt; in dem vorliegenden Zusammenhang wird »Lecithin« in dem letztgenannten Sinn angewendet.

Äthanolamin- und Serinphosphatide haben die t>o allgemeine Formel

b5 OH

ROCH₂ ■ CH · CH₂OPO
OR' M₊O"

OH

OH
OH

in der R und R' langkettige Fettsäurereste sind und M ein Metallatom, z. B. Natrium, Kalium, Calcium oder Magnesium, bedeutet; die Inositgruppe kann durch Glykosid- und andere Reste substituiert sein. Eine sehr aktive Emulgatorkomponente der Phosphatidmischungen ist das Cholinphosphatid, Lecithin, welches die allgemeine Formel

Il

ROCH₂ · CH · CH₂OPOCH₂CH₂N(Ch.,).,

OR'

hat, in der R und R' langkettige Fettsäurereste sind. Alle vier Phosphatide haben eine saure Hydroxygruppe, wie sie oben in Salzform gezeigt ist, von den drei stickstoffhaltigen Phosphatiden hat jedoch nur Lecithin keine freie Aminogruppe.

Wenn Kephaiin und Lecithin zusammen in einer Phosphatidmischung vorhanden sind, wie in den obengenannten Nebenprodukten, hat das Kephaiin eine schädliche Wirkung auf die Emulgiereigenschaften des Lecithins durch eine Art von antagonistischer Wirkung, wenn es z. B. in Margarine angewendet wird. Andere unerwünschte Eigenschaften sind dem Kephaiin ebenfalls zuzuschreiben, so haben beispielsweise parenteral verabfolgte Fettemulsionen, die unter Verwendung von Kephaiin enthaltenden Phosphatiden hergestellt worden sind, eine hypertensive Wirkung, für die das vorhandene Kephaiin verantwortlich ist, und wenn Phosphatidmischungen hydriert werden, hat vermutlich das vorhandene Kephaiin eine desaktivierende Wirkung auf den Katalysator. Andererseits werden durch die Gegenwart von Inositphosphatiden keine Nachteile herbeigeführt.

Dementsprechend sind Verfahren gesucht worden, um die schädliche Wirkung des Kephalins zu vermeiden. Bei einem solchen Verfahren (vgl. DE-OS 15 43 937) werden pflanzliche Phosphatidmischungen dadurch modifiziert, daß man die freie Aminogruppe des vorhandenen Kephalins mit einem Acylierungsmittel umsetzt. Dabei bildet sich Acylkephalin, das keine antagonistische Wirkung auf die Emulgiereigenschaften von Lecithin hat, so daß die Phosphatidmischung, in der das Acylkephalin anwesend bleibt, eine verbesserte Emulgierwirkung hat.

Es sind Versuche gemacht worden, um Kephaiin von Lecithin in Phosphatidmischungen zu trennen, um ein Phosphatid mit einer höheren Lecithinkonzentration mit verbesserten Eigenschaften zu erhalten, dies hat sich jedoch als ein schwieriges Problem erwiesen. Lösungsmittelfraktionierung ergibt eine teilweise Trennung, wobei mit Lecithin angereicherte und mit Kephaiin angereicherte Fraktionen geliefert werden. In der GB-PS 11 13 241 ist ein Anreicherungsverfahren dieser

Art beschrieben, bei dem eine Extraktion mit wäßrigem Alkohol zur Anwendung gelangt, durch welche der Anteil von Lecithin zu Kephalin von 1 :1 auf 5 :1 in dem Extrakt erhöht wird, es bleiben jedoch wesentliche Anteile von Lecithin in dem Rückstand.

Aus der NL-OS 2 51 530 bzw. der US-PS 30 47 597 ist es bekannt, rohe Pflanzenlecithine durch ein Lösungsmittelgemisch zu extrahieren. Gemäß beiden Veröffentlichungen findet zu diesem Zweck eine Aceton- oder Methylacetatextraktion von Pflanzenlecithin zur Entfernung von öl und Fettsäuren statt In den Veröffentlichungen ist ausdrücklich angegeben, daß die Lösungsmittel praktisch keine Lösungswirkung auf Phosphatide haben und daß bei Anwendung der bekannten Verfahren eine Fraktionierung der Phosphatide vermieden wird.

Eine Extraktion von Mischungen von Kephalin, Lecithin und Inositphosphatiden mit Aceton oder Methylacetat kann daher Kephalin nicht von den anderen Phosphatiden trennen.

Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Behandlung von Phosphatidmischungen, um frei fließende feste Phosphatide zu erhalten, die praktisch frei von dem störenden Kephalin sind.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem, nicht acylierbarem Phosphatid aus einer Phosphatidmischung, die Kephalin und ein Phosphatid ohne eine acylierbare Aminognippe, einschließlich von Lecithin, umfaßt, wobei das Kephalin durch Umsetzung mit einem Acylierungsmittel acyliert worden ist und ein acyliertes Gemisch, das eine Stickstoffbase enthält, hergestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das die Stickstoffbase enthaltende acylierte Gemisch einen pH-Wert von wenigstens 8,5 unter wäßrigen Bedingungen hat und einer Extraktion mit Aceton oder Methylacetat unterworfen wird.

Das Acylkephalin wird durch das Lösungsmittel extrahiert, wobei das Lecithin zurückbleibt. Überdies ist die Trennung selbst in Gegenwart von großen Mengen von Triglyceridöl, wie sie in technischen Phosphatiden vorhanden sind, wirksam; Triglyceride werden mit dem Kephalin entfernt

Andererseits wurde gefunden, daß durch Acetonextraktion N-acyliertes Phosphatid von nicht N-acylierbarem Phosphatid in einem pH-Bereich von 6,5 bis 8,25, wie er in der US-PS 33 01881 angegeben ist, nicht getrennt werden kann, während überraschenderweise eine Trennung bei einem pH-Wert von 8,5 und darüber leicht ausgeführt werden kann.

In der Praxis besteht das N-acylierbare Phosphatid aus Kephalin, und es ist wenigstens etwas Lecithin, vorzugsweise als nichtacylierbares Phosphatid, vorhanden, so daß die Phosphatidmischung Kephalin und Lecithin umfaßt. Als Phosphatidausgangsmaterialien für das Trennungsverfahren können technische oder handelsübliche Phosphatide verwendet werden, z. B. die hydratisierten Pflanzenphosphatide, die durch Behandlung eines aus Pflanzen extrahierten, phosphatidhaltigen Rohöls, z. B. rohen Sojabohnenöls, mit einer geringen Menge von Wasser erhalten sind, wobei die Phosphatide hydratisiert und als gummiartige Substanz gefällt und dann abgetrennt werden. Eigelbphosphatide können auch zur Anwendung gelangen. Vorzugsweise enthält die Phosphatidmischung 0,1 bis 20 Gew.-Teile Lecithin je Gew.-Teil Kephalin. Derartige Phosphatide und Modifikationen von ihnen, die zur Anwendung gelangen können, sind in der GB-PS Il 18 373 beschrieben. Mit Lecithin angereicherte oder mit Kephalin angereicherte Phosphatide, die durch Lösungsmittelfraktionierung mit wäßrigen Alkoholen erhalten sind, wie dies in der GB-PS 11 13 241 beschrieben ist, können ebenfalls verwendet werden. Pflanzliche Phosphatidmischungen, die bis zu 80%, z. B. 20 bis 60%, Triglyceridöl enthalten, können auch Anwendung finden. Es können auch die acylierten Phosphatidmischungen, die nach dem Verfahren gemäß

Ό der DE-OS 15 43 937 erhalten werden, zur Anwendung gelangen.

Teilweise hydrierte Phosphatidmischungen können zur Anwendung gelangen, wenn die ursprünglichen Fett-Acylgruppen, solche von ungesättigten Fettsäuren einschlossen und einige von diesen durch Hydrierung gesättigt worden sind. Die Phosphatidausgangsmateria- !ien können merkliche Mengen von Wasser, selbst vor der Acylierungsstufe enthalten, denn es ist gefunden worden, daß die Gegenwart von Wasser nicht ernsthaft die N-Acylierung stört und hilft, die O-Acylierung durch überschüssiges Acylierungsmittel zu verhindern, was zu Phosphatiden Veranlassung geben würde, in denen die Oxygruppen von vorhandenen Inositphosphatiden ebenso wie die an das Phosphoratom gebundene Oxygruppe acyliert werden. Die Acylierung an dem Phosphoratom verursacht kein Problem, da die Acylgruppe durch Nachbehandlung mit Wasser entfernt werden kann, die Acylierung der Inositgruppen kann jedoch einen nicht notwendigen Verlust von Acylie-

)() rungsmittel darstellen, denn Inositphosphatide können in großem Anteil vorhanden sein; die in Betracht kommenden Inosithydroxygruppen können auch, wenn sie einmal acyliert sind, nicht wieder gebildet werden, weil die Bedingungen, die hierfür notwendig sind, den

Vi die Acylgruppen veresternden Glycerylrest entfernen und so die Phosphatide zerstören würden.

Als Acylierungsmittel wird vorzugsweise ein Carbonsäureanhydrid, z. B. Essigsäure-, Propionsäure-, Caprinsäure-, ölsäure- oder Stearinsäureanhydrid oder eine Mischung von Anhydriden verwendet, wie eine solche, die aus Sojabohnenfettsäuren durch trans-Anhydridisierung mit Essigsäureanhydrid erhalten wird; es können auch Maleinsäure-, Bernsteinsäure- oder Phthalsäureanhydrid zur Anwendung gelangen. Andere Acylierungs-

Vi mittel, ζ. B. Acylchloride, wie Acetylchlorid, und Keten, können verwendet werden; da sie jedoch leichter mit Wasser und mit Hydroxygruppen von in den Ausgangsmaterialien vorhandenen Substanzen reagieren, sind sie weniger wirksam als die Anhydride. Die Menge an

w erforderlichem Acylierungsmittel ist diejenige, die zur Acylierung sämtlicher vorhandener freier Aminogruppen notwendig ist, mit einer gewissen Toleranz für Verlust von Reaktionsmittel, wenn vorhandenes Wasser durch Hydrolyse in Wettbewerb tritt. Da Phosphatide

Vi selten mehr als 30% Kephalin enthalten, ist gewöhnlich 4% Essigsäureanhydrid, bezogen auf das Phosphatidgewicht, ausreichend. Wenn das Phosphatidausgangsmaterial hochviskos ist, kann die Reaktion in einem geeigneten inerten Lösungsmittelmedium, z. B. in

bo Hexan, Benzol oder Chloroform oder sogar in Aceton oder Methylacetat, wenn wesentliche Mengen von Triglycerid vorhanden sind, ausgeführt werden, aber im allgemeinen ist kein Lösungsmittel notwendig, wenn die Phosphatidmischung genügend Triglyceridöle enthält,

bs υπ sie flüssig zu machen. Die Mischungsoll während der Umsetzung gerührt werden, und dies ist besonders erwünscht, wenn kein Lösungsmittel angewendet wird. Die Acylierung kann in einer inerten Atmosphäre, z. B.

unter Stickstoff, durchgeführt werden.

Die Acylierung wird vorzugsweise in Gegenwart eines nicht acylierbaren Amins als Katalysator ausgeführt Geeignete Katalysatoren sind tertiäre Amine, z. B. Pyridin und tertiäre Alkylamine, insbesondere Trimethyla min und Triäthylamin.

Wenn kein Katalysator verwendet wird, kann die Acylierung nicht zur Vollendung gehen, selbst bei einem beträchtlichen Überschuß an Acylierungsmittel, und die notwendigen Reaktionszeiten und Temperaturen sind länger bzw. höher und betragen z. B. 1 bis 2 Stunden bei Temperaturen von 55 bis 70⁰C oder 24 Stunden bei 30⁰C. Eine Reaktion bei 90⁰C erfordert nur wenige Minuten, aber Temperaturen über 8O⁰C werden vorzugsweise vermieden. Wenn ein Katalysator verwendet wird, ist nur ein geringer Überschuß notwendig, die Reaktion erfolgt rasch und geht bei niedrigen Feitsäureanhydriden, z. B. Essigsäureanhydrid, selbst bei Raumtemperaturen, innerhalb weniger Minuten vor sich. Vorzugsweise wird daher, wenn ein Katalysator angewendet wird, die Reaktion bei Raumtemperatur ausgeführt.

Das Fortschreiten der Acylierungsreaktion kann durch Dünnschichtchromatographie auf Siliciumdioxydgelplatten mit einer Mischung von Chloroform, Methanol und Wasser in Anteilen von 65:25:4 Volumina als bewegliche Phase und Behandlung des entwickelten Chromatogramms mit Ninhydrin-Reagenz verfolgt werden. Die Reaktion ist vollständig, wenn der rosa Fleck von Rr = etwa 0,6 infolge freier urimärer Aminoverbindung nicht länger sichtbar ist. Es können vorausgehende Versuche unter Anwendung dieser Arbeitsweise ausgeführt werden, um die Menge an Acylierungsmittel und die anderen Bedingungen zu bestimmen, die zur Verwendung bei der Acylierung irgendeiner besonderen Phosphatidmischung, z. B. einer Mischung von unbekanntem Gehalt an N-acylierbarem Phosphatid, am geeignetsten sind.

Nach der Acylierung können die von Nebenproduk-

-OPOCH₂CH NHOCOCH₃ -

Il

OH R"

+ NEt₃

ten freie Fettsäure und überschüssiges Acylierungsmittel neutralisiert werden oder, wenn die Säure und das Acylierungsmittel flüchtig sind, können sie z. B. unter verringertem Druck abgedampft werden. Irgendwelches Lösungsmittel, das die darauf folgende Fraktionierung stören würde, kann auch durch Verdampfung entfernt werden. Das Lösungsmittel, Säure, überschüssiges Acylierungsmittel und Triglyceridöl können auch durch Extraktion des Produktes mit Aceton entfernt

ι ο werden, bevor es alkalisch gemacht wird.

Bei der Lösungsmittelfraktionierungsstufe. die gewöhnlich aus einem Extrahieren mit dem Lösungsmittel und einem Trennen der Phasen besteht die das N-Acylphosphatid ohne eine acylierbare Aminogruppe enthalten, wird Aceton oder Methylacetat (oder ein Gemisch von ihnen) zusammen mit einer Stickstoffbase von angemessener Basizität verwendet Die Stickstoffbase kann zu dem Acylierungsprodukt zugesetzt werden; wenn jedoch eine genügende Menge von Acylierungskatalysator von angemessener Basizität zurückbleibt, um geeignete alkalische Bedingungen zu schaffen, ist es nicht notwendig, weitere Stickstoffbase vor der Fraktionierung zuzusetzen; gegebenenfalls kann die Stickstoffbase dem Fraktionierungslösungsmittel einverleibt werden. Ferner können die Acylierung und die Lösungsmittelextraktion gleichzeitig ausgeführt werden, wenn z. B. ein festes von Triglyceridöl freies Phosphatid in Aceton suspendiert wird, das ein Acylierungsmittel und ein nichtacylierbares Amin enthält, das sowohl als Katalysator als auch als Base wirkt. Wenn eine Acylierung ohne einen Katalysator ausgeführt wird, wird vorzugsweise die Stickstoffbase zu der Acylierungsmischung zugesetzt, bevor nichtumgesetztes Acylierungsmittel davon abgetrennt wird, da dies gewährleistet, daß die Acylierung vollständig ist. Die Wirkung der Stickstoffbase bei der Fraktionierung besteht vermutlich darin, daß das Acylphosphatid in sein konjugiertes Anion umgewandelt wird, z. B.

-OPOCH₂CH · NHOCOCH₃
O" R"

+ HNEt₃

so daß möglicherweise, wenn Aceton oder Methylacetat zugegeben wird, die negativen Ionen einander abstoßen, nicht in der Lage sind, Aggregate zu bilden und sich in dem Lösungsmittel auflösen.

Geeignete Stickstoffbasen sind Amine von hohem pKa, vorzugsweise wenigstens 9, insbesondere primäre, sekundäre und tertiäre aliphatische Amine, wie Alkylamine, wobei die folgenden Verbindungen mit den angegebenen pKa-Werten eingeschlossen sind: Diethylamin 10,9, Diethylamin 10,8, Triäthylamin 10,7, Methylamin 10,6, Äthylamin 10,6, Triäthylamin 9,8; es bo können auch Äthanolamin 9,5 und Ammoniak 9,2 zur Anwendung gelangen, obwohl sie weniger wirksam sind, weil sie eine Aggregation durch Wasserstoffbindung fördern. Quaternäre Ammoniumhydroxyde, z. B. Tetraäthylammoniumhydroxyd, die mit dem Acylkepha- t,5 lin reagieren, und sein konjugiertes Anion und Wasser geben, können auch zur Anwendung gelangen. Es wird eine Menge von Stickstoffbase, die ausreicht, um basische Bedingungen äquivalent einem pH-Wert in Wasser von wenigstens 83 und vorzugsweise von wenigstens 9 zu liefern, angewendet. Die notwendige Menge wird einfach durch Prüfen der Menge von Stickstoffbase, die benötigt wird, um den erforderlichen pH-Wert zu geben, wenn eine Probe der acylierten Phosphatidzusammensetzung in Wasser bei 1% Konzentration dispergiert ist, bestimmt Die erforderliche Menge ist mehr als das Minimum, das zur Verwendung als Katalysator in der Acylierungsslufe notwendig ist

Die Fraktionierungsstufc kann unter Anwendung der Standardarbeitsweise der Acetonextrahierung zur Bestimmung von acetonunlöslichem Material in Phosphatiden, wie sie in der »American Oil Chemists' Society Official Method ja 4—46« beschrieben ist, ausgeführt werden. Die Acetonextrahierung beseitigt Acylkephalin und irgendwelches anwesendes Glyceridöl, wobei die lecithinreiche Fraktion als Rückstand zurückgelassen wird. Das zu fraktionierende Material kann mehrere

Male mit Stickstoffbase enthaltendem Aceton und schließlich mit Aceton allein extrahiert werden. Methylacetat kann in ähnlicher Weise zur Anwendung gelangen. Die Extraktion wird vorzugsweise bei Raumtemperatur ausgeführt.

Obwohl eine vollständige Trennung von Acylkephalin und Lecithin in einem besonderen Fall möglicherweise nicht erreicht werden kann, wird eine viel vollständigere Fraktionierung ausgeführt, als wenn Versuche gemacht werden, die Komponenten mit Aceton ohne Anwesenheit der Stickstoffbase zu trennen. Die Rückstände der Extraktion enthalten sehr wenig Acylkephalin und werden als strohfarbene Feststoffe erhalten, die beim Mahlen frei fließende Pulver bilden, die leicht in Wasser oder Triglyceridölen dispergierbar sind. Sie sind besonders wertvoll als Emulgatoren und Dispergierungsmittel. Das erzeugte Acylkephalin kann aus den Acetonextrakten nach Entfernung von Stickstoffbase und Aceton durch geeignete Methoden, z. B. Verdampfen, gewonnen werden; die Acylkephaline können auch als Emulgatoren Anwendung finden. Acylkephalin kann wieder in Kephalin umgewandelt werden, wenn die Acylgruppe von solcher Art ist, daß sie ohne Zerstörung des Kephalins entfernt werden kann; wenn z. B. eine Acylierung mit Phthalsäureanhydrid ausgeführt wird, kann das sich ergebende o-Carboxybenzoylkephalin durch Erhitzen oder die Wirkung von Essigsäureanhydrid unter Bildung von Phthaloylkephalin cyclisiert und Kephalin hiervon durch Erhitzen mit Hydrazin freigesetzt werden.

Diejenigen Produkte des Verfahrens gemäß der Erfindung, die sowohl Lecithin als auch Inositphosphatide enthalten, können weiter mit Alkohol fraktioniert werden, um alkohollösliche Fraktionen, die an Lecithin angereichert sind, und alkoholunlösliche Fraktionen, die an Inositphosphatiden angereichert sind, zu bilden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert, in denen sämtliche Temperaturen in °C angegeben und die in Aceton unlöslichen Stoffe nach der obengenannten A.O.C.S.-Methode bestimmt wurden.

Beispiel 1

Ein handelsübliches ungebleichtes kanadisches Soyaphosphatid einer mittleren Qualität mit der folgenden annähernden Zusammensetzung wurde als Ausgangsmaterial verwendet.

Gew.-Teile

Triglyceride 40

AcPtoniinlösliche Stoffe., insgesamt 60

Lecithin 15

Kephalin 12

Inosit-phosphatide 23

Zucker, Steroide und Salze 10

Wasser < 1

Gesamtphosphorgehalt 12

Dieses Phosphatid (100 g) und Essigsäureanhydrid (4 g) wurden kräftig unter Stickstoff bei 74° (Badtemperatur) 2 Stunden gerührt und dann rasch auf 20" gekühlt Die acylierte Mischung wurde mit siedendem Aceton (200 ml, mit 4 ml zugesetztem Wasser) gerührt, auf 0° in einem Eiswasserbad gekühlt, und es wurde die Acetonlösung, welche TriglyceridöL, Essigsäure und Essigsäureanhydrid enthielt, abdekantiert. Der unlösliche Rückstand von dieser ersten Extraktion wurde mit einer siedenden Mischung von Aceton (200 ml und 4 ml Wasser) und Triethylamin (6 ml, entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer l°/oigen wäßrigen Dispersion) gerührt, auf 0° gekühlt, und das Lösungsmittel wurde abdekantiert; diese Extraktion wurde unter Verwendung von Aceton (200 ml und 4 ml Wasser) und Triethylamin (2 ml) wiederholt. Das Produkt wurde mit siedendem Aceton (200 ml) verrieben und das heiße Aceton wurde abdekantiert; diese vierte Acetonextraktion wurde wiederholt, und das Produkt wurde schließlich mit Aceton (200 ml) bei 20⁰C verrieben, abfiltriert und unter verringertem Druck bei 20⁰C getrocknet. Es ergab sich dabei ein bröckeliger, strohfarbener Feststoff (42,1 g), der 3,2% Phosphor, 32% Lecithin, 1% Triglyceridöl und praktisch kein Kephalin, aber etwa 1 bis 2% Acetylkephalin enthielt, wie dies durch Dünnschichtchromatographie bestimmt wurde.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Caprinsäureanhydrid (10,0 g) an Stelle von Essigsäureanhydrid als Acylierungsmittel und unter Anwendung einer Badtemperatur innerhalb des Bereiches von 70 bis 82° wiederholt. Eine Hälfte (55 g) des acylierten Materials wurde aufgearbeitet und ergab ein festes Produkt (22 g).

Beispiel 3

Das handelsübliche Phosphatid des Beispiels 1 (100 g) wurde bei 75°C 2 Stunden unter Stickstoff mit einem Anhydridgemisch (20 g) erhitzt, das aus Sojabohnenölfettsäuren durch trans-Anhydridisierung mit Essigsäureanhydrid hergestellt war. Ein Anteil von 10 g des Acylierungsgemisches wurde fünf Extraktionen mit Aceton (40 ml und 0,8 ml Wasser), wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen, wobei das Aceton bei der zweiten und der dritten Extraktion Triäthylamin (0,6 g bzw. 0,2 g Amin, ausreichend, um eine Basizität, äquivalent einem pH-Wert von über 9, in einer l%igen wäßrigen Dispersion vorzusehen) enthielt. Das Endprodukt wurde in Form eines festen Rückstandes (3,6 g) erhalten.

Wenn eine ähnliche Reihe von Extraktionen mit einem zweiten Anteil (10 g) der Acylierungsmischung, jedoch ohne den Zusatz von Amin ausgeführt wurde, war die Ausbeute an unlöslichem Rückstand 4,6 g, und das Produkt enthielt einen wesentlichen Anteil von Acylkephalin.

Beispiel 4

Eine handelsübliche alkohollösliche Phosphatidzubereitung mit einem Gehalt von 30% an acetonunlöslichen Stoffen und an Lecithin angereichert, wurde teilweise durch Acetonextraktion entfettet, um einen acetonunlöslichen Rückstand mit der folgenden annähernden Zusammensetzung zu geben.

Gew.-Teile

Triglyceride 15

Acetonunlösliche Stoffe, insgesamt 85

Lecithin 55

Kephalin 10

Inosit-phosphatide 5

Zucker, Steroide und Salze 15

Wasser 1

Dieses Phosphatid (8,5 g) wurde in Chloroform (50 ml) gelöst, Essigsäureanhydrid (2 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde unter Rückfluß 1 Stunde erhitzt. Das Lösungsmittel, Essigsäure und überschüssiges Anhydrid wurden durch Verdampfen in einem

umlaufenden Verdampfer unter verringertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurde Aceton (100 ml, mit einem Gehalt von 2% Wasser) zugesetzt, dem Triäthylamin (0,2 ml, genügend, um eine Basizität entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer l%igen wäßrigen Dispersion vorzusehen) einverleibt worden war, und die Mischung wurde zum Sieden erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und dann in Eiswasser gekühlt. Das Aceton wurde abdekantiert, und Spuren von Aceton wurden von dem Rückstand bei Raumtemperatur unter verringertem Druck entfernt, wobei sich ein Produkt (5,2 g) ergab, das, wie eine Dünnschichtchromatographie zeigte, Lecithin als überwiegenden Bestandteil und nur geringe Spuren von Kephaiin und Acyikephaiin enthielt.

Bei Vergleichsversuchen wurde gefunden, daß, wenn die Acylierung bzw. das Amin fortgelassen wurde, Ausbeuten von 7,5 g bzw. 6,4 g unlösliches Produkt erhalten wurden, die wesentliche Mengen an Kephaiin bzw. Acyikephaiin enthielten.

Beispiel 5

Eine handelsübliche alkoholunlösüche entfettete Phosphatidfraktion, die an Kephaiin angereichert war und die folgende annähernde Zusammensetzung hatte, wurde als Ausgangsmaterial verwendet.

	Gew.-Teile
Triglyceride	4
Acetonunlösliche Stoffe, insgesamt	96
Lecithin	4
Kephaiin	28,5
Inosit-phosphatide	55
Zucker, Steroide und Salze	8,5

Gewinnung des Rückstandes hergestellt war und die folgende Zusammensetzung hatte:

10

45

Dieses Phosphatid (25 g) wurde in η-Hexan (100 ml) gelöst, und es wurde Essigsäureanhydrid (1,5 g) zugegeben; die Mischung wurde unter Rückfluß in einer Stickstoffatmosphäre 1 Stunde erhitzt, auf 30°C gekühlt, und es wurde Triäthylamin (5 ml) zugegeben. Nach gründlichem Mischen wurde die sich ergebende Lösung (die genügend Base enthielt, um einen pH-Wert von über 9 in einer wäßrigen Dispersion vorzusehen) langsam während 15 Minuten in stark gerührtes Aceton (250 ml) eingeführt. Nach Vollendung des Zusatzes wurde der Niederschlag abfiltriert, mit Aceton (250 ml) gerührt, und die Suspension wurde wieder filtriert; der Rückstand wurde unter verringertem Druck getrocknet und ergab ein Produkt (18,4 g), das, wie eine Dünp.schichtchrornatographie zeigte, praktisch frei von Kephaiin und Acetylkephalin war.

Bei einem Vergleichsversuch, der in jeder Hinsicht, mit Ausnahme, daß das Essigsäureanhydrid fortgelassen wurde, ähnlich war, betrug die Ausbeute an Rückstand 23,2 g, wobei dieser das meiste des ursprünglichen Kephalins enthielt.

Beispiel 6 t>o

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei an Stelle des handelsüblichen kanadischen Sojaphosphatids eine handelsübliche alkoholunlösüche Fraktion verwendet wurde, die aus Sojaphosphatid durch Extrahieren von 1 Gew.-% des Phosphatids mit 3,5 Teilen wäßrigem 90%igem Äthanol bei Raumtemperatur während einiger Minuten, Abdekantieren des Äthanols und

55

	Gew.-Teile	12
Triglyceride	41	12
Acetonunlösliche Stoffe, insgesamt	59	29
Lecithin		6
Kephaiin
Inosit-phosphatide
Zucker, Steroide und Salze
Wasser	<1

15

20

25

30

J5 Aus dem Phosphatidausgangsmaterial (100 g) wurde ein festes Produkt (34 g) erhalten, das nur Spuren von Kephaiin und Acyikephaiin enthielt.

Beispiel 7

Die alkoholunlösliche Phosphatidfraktion gemäß Beispiel 6 (100 g) wurde mit Essigsäureanhydrid (4 g) wie in Beispiel 1 acetyliert, und zu der acetylierten Mischung wurden bei 20 bis 22°C 25 ml Aceton und Triäthylamin (10 ml, ausreichend, um eine Basizität entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer 1%igen wäßrigen Dispersion zu geben) zugesetzt, und die Mischung wurde 10 Minuten gerührt und dann langsam in stark gerührtes Aceton (1000 ml und 20 ml Wasser) gegossen. Der Niederschlag wurde abfiltriert, in Aceton suspendiert (1000 ml), und die Suspension wurde zum Sieden erhitzt und dann unter Rühren während 30 Minuten auf 15 bis 18°C abgekühlt.

Das Produkt (44,8 g) wurde durch Filtrieren, Waschen mit Aceton (500 ml) und Trocknen unter verringertem Druck isoliert.

Beispiel 8

Die alkoholunlösüche Phosphatidfraktion von Beispiel 6(10Og) wurde mit Essigsäureanhydrid (4 g) wie in Beispiel 1 acetyliert. Diäthylamin (5,3 g) wurde in der acetylierten Mischung dispergiert (was eine Basizitiu entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer l°/oigen wäßrigen Dispersion ergab), und sie wurde dann langsam in kräftig gerührtes Aceton (1000 ml und 20 ml Wasser) bei 54°C gegossen; das Rühren wurde 30 Minuten während Kühlung auf Raumtemperatur fortgesetzt, das suspendierte Material wurde durch Filtrieren abgetrennt, in Aceton (1000 ml) wieder suspendiert und 30 Minuten gerührt und schließlich filtriert, mit Aceton (500 ml) gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet, um das Produkt (42,8 g) zu ergeben.

Beispiel 9

Ausnahme, daß Aceton bei Raumtemperatur durchweg verwendet wurde. Die Ausbeute an Produkt betrug 44,0 g.

Beispiel 10

Die Arbeitsweise von Beispiel 9 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß Trimethylamin (4,4 g) an Stelle von Diäthylamin verwendet wurde. Da dieses Amin stark flüchtig ist (Kp 3,5° C), wurde es der acylierten Mischung, auf -5°C gekühlt, in Form einer 20%igen Lösung in kaltem Aceton zugesetzt, und die Mischung wurde dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Ausbeute an Produkt war 49,1 g.

Beispiel 11

Beispiel 7 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß an Stelle von Triäthylamin als Stickstoffbase eine

konzentrierte wäßrige Ammoniaklösung (15 ml, spez. Gew. 0,88, ausreichend, um eine Basizität entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer l°/oigen wäßrigen Dispersion zu liefern) verwendet wurde. Es wurde eine Ausbeute von 47,4 g Produkt erhalten.

Beispiel 12

Die alkoholunlösliche, kephalinangereicherte Phosphatidfraktion von Beispiel 6 (100 g) wurde in Aceton (50 ml und 2% Wasser) dispergiert; Essigsäureanhydrid (2,75 g) und Triäthylamin (6,5 g) wurden zu der Dispersion zugegeben und die Mischung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur (20⁰C) geschüttelt. Ein Versuch zeigte, daß eine 1%ige Dispersion der Reaktionsmischung in Wasser einen pH-Wert von 9,6 hatte. Eine Untersuchung durch Dünnschichtchromatographie auf Siliciumdioxyd mit einem Gemisch von Chloroform, Methanol und Wasser (65 : 25 :4 Volumenanteile) zeigte die Abwesenheit von ninhydrinpositiven Substanzen, was die Abwesenheit von nichtacyliertem Kephalin zeigte.

Die acetylierte Mischung wurde während 10 Minuten in kräftig gerühr·, js Aceton (1000 ml) eingeführt, das 10 ml Wasser und 100 ml butyliertes Kresol als Antioxydationsmittel enthielt, und die Mischung wurde während weiterer 15 Minuten gerührt und dann filtriert. Dor Rückstand wurde in Aceton (500 ml, 5 ml Wasser), das butyliertes Kresol (50 mg) enthielt, suspendiert, gerührt und filtriert; dieses Waschen wurde mit dem Lösungsmittel bei 40 bis 50⁰C wiederholt, und das Endprodukt wurde bei Raumtemperatur unter verringertem Druck getrocknet.

Das Produkt (40,3 g) enthielt, wie Dünnschichtchromatographie zeigte, Spuren von Acetylkephalin. aber kein Kephalin.

Beispiel 13

Das Sojaphosphatidausgangsmaierial von Beispiel 6 (50 g) wurde in Methylacetat (50 ml) suspendiert, und es wurden Essigsäureanhydrid (1,38 g) und Triäthylamin (3,25 g) zugegeben, und die Mischung wurde 10 Minuten bei 10 bis 20⁰C geschüttelt. Das Produkt wurde einer Dünnschichtchromatographie unterworfen, und die Prüfung zeigte die Abwesenheit von ninhydrinpositivem Material, was anzeigte, daß die Acetylierung vollständig war.

Die acetylierte Mischung (die genügend basisch war, um einen pH-Wert von über 9 in einer l%igen wäßrigen Dispersion zu liefern) wurde während 10 Minuten zu kräftig gerührtem Methylacetat (500 ml) zugesetzt und weitere 15 Minuten "erührt. Die unlöslichen Stoffe wurden abfiltriert, und der Rückstand wurde wieder in Methylacetat (250 ml) suspendiert, 15 Minuten gerührt, und die Suspension wurde wieder abfiltriert. Diese Extraktion wurde mit Methylacetat bei 50 bis 55°C

■> (250 ml) wiederholt, wobei sich eine dunkle gummiartige Masse ergab, die im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet wurde, wobei sich ein dunkelbrauner bröckeliger Feststoff (25,1 g) ergab, dessen Dünnschichtchromatographie die Gegenwart von kleinen

ίο Mengen von Acylkephalin, aber kein Kephalin zeigte.

Beispiel 14

Zu der alkoholunlöslichen Fraktion von Sojaphosphatid von Beispiel 6 (100 g) wurde Aceton (15 ml) zugegeben. Die Mischung wurde gerührt, bis sie homogen war, und dann in Aceton (1000 ml, mit einem Gehalt von 20 ml Wasser) gegossen. Der Niederschlag wurde abfiltriert, das fettenthaltende Filtrat wurde verworfen, und der Niederschlag wurde wieder in Aceton (200 ml, mit einem Gehalt von 4 ml Wasser) suspendiert. Zu der gerührten Suspension wurde Triäthylamin (6,5 g, ausreichend, um der endgültigen Reaktionsmischung eine Basizität entsprechend einem pH-Wert von über 9 in einer wäßrigen Dispersion zu erteilen) und Essigsäureanhydrid (2,75 ml) zugegeben, und die Mischung wurde bei Umgebungstemperatur 30 Minuten gerührt und dann filtriert. Der gerührte Rückstand wurde zweimal mit Aceton (200 ml, mit einem Gehalt von 4 ml Wasser) extrahiert, wobei die

ίο erste Extraktion bei Raumtemperatur und die zweite bei 50° C erfolgte, und unter verringertem Druck bei 35⁰C getrocknet, wobei sich ein Produkt (48 g) ergab, das nur eine geringe Menge von N-Acetylkcphalin enthielt.

_n Beispiel 15

Die alkoholunlösliche entfettete Phosphatidfraktion von Beispiel 5 (10 g), Phthalsäureanhydrid (2,8 g) und Triäthylamin (10 ml, genügend, um die erforderlichen basischen Bedingungen zu liefern) wurden zusammen in

4i! Chloroform (30 ml) gelöst, und die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur 15 Minuten stehengelassen. Eine Dünnschichtchromatographie zeigte, daß die Mischung dann kein freies Kephalin enthielt. Das Losungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt, und

4i der Rückstand wurde dreimal mit Aceton (100 ml, mit einem Gehalt von 2 ml Wasser) bei Umgebungstemperatur extrahiert: der unlösliche Rückstand wurde unter verringertem Druck getrocknet und ergab ein Produkt (5,9 g), das, wie Dünnschichtchromatographie zeigte.

w praktisch frei von Kephalin und o-Carboxybenzoylke-

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem, nicht acylierbarem Phosphatid aus einer Phosphatidmischung, die Kephaiin und ein Phosphatid ohne eine acylierbare Aminogruppe, einschließlich von Lecithin, umfaßt, wobei das Kephaiin durch Umsetzung mit einem Acylierungsmittel acyliert worden ist und ein acyliertes Gemisch, das eine Stickstoffbase ι ο enthält, hergestellt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das die Stickstoffbase enthaltende acylierte Gemisch einen pH-Wert von wenigstens 8,5 unter wäßrigen Bedingungen hat und einer Extraktion mit Aceton oder Methylacetat unterworfen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das acylierte Gemisch durch eine Stickstoffbase mit einem pKa-Wert von wenigstens 9 auf den pH-Wert gebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffbase aus Ammoniak, Diethylamin, Trimethylamin oder Triäthylamin besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffbase ein nichtacylierbares Amin ist und als Katalysator in der Acylierungsstufe vorhanden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungsmittelextraktion gleichzei- so tig mit der Acylierung ausgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung ohne einen Katalysator ausgeführt wird und daß die Stickstoffbase vor der Extraktion dem Acylierungsgemisch J5 zugesetzt wird.