DE60100565T2

DE60100565T2 - Verfahren zur Reinigung von Phosphatidylserin

Info

Publication number: DE60100565T2
Application number: DE60100565T
Authority: DE
Inventors: Lorenzo De Ferra; Pietro Massardo
Original assignee: Chemi SpA
Current assignee: Chemi SpA
Priority date: 2000-12-05
Filing date: 2001-10-15
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2021-10-16
Also published as: EP1213294A1; ATE246692T1; SI1213294T1; ITMI20002631A1; DE60100565D1; EP1213294B1; JP4156228B2; PT1213294E; EP1213294B2; JP2002193982A; US6645742B2; ES2203572T3; USRE43764E1; ES2203572T5; IT1319679B1; US20020103393A1; DK1213294T3; DE60100565T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Reinigungsverfahren für Phosphatidylserin, einem Phospholipid, welches insbesondere zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die bei der Behandlung von Involutions-Gehirnerkrankungen unterschiedlicher Natur verwendet werden, aber auch bei der Herstellung von besonderen Liposomenformulierungen und von Diätzusammensetzungen auf der Basis von natürlichen Lecithinen nützlich ist.
STAND DER TECHNIK
Phosphatidylserin ist ein Phospholipid, welches in der Natur weit verbreitet ist; es ist eine der Hauptkomponenten von Zellmembranen in tierischen Organismen und liegt in besonders großen Mengen in Hirngeweben von Säugetieren vor. Die Medizinliteratur erwähnt interessante Eigenschaften von Phosphatidylserin, von denen das signifikanteste sich auf seine Wirksamkeit zur Verbesserung mnestischer Fähigkeiten bezieht.
Die Trans-Phosphatidylierung von Phosphatidylcholin mit Serin in Gegenwart des Enzyms D-Phospholipase gemäß dem folgenden Schema ist die bequemste Reaktion zur industriellen Produktion von Phosphatidylserin.
Die Reaktion kann sowohl in wässriger Umgebung, wie in der EP 1 048 738 beschrieben, als auch in einem System durchgeführt werden, welches über die wässrige Phase hinaus auch ein mit Wasser unmischbares, organisches Lösungsmittel enthält, vorzugsweise Toluol; diese zweite Methode ist im US-Patent Nr. 5,700,668 beschrieben.
Egal welche Methode bei der Trans-Phosphatidylierung verwendet wird – das Phosphatidylserin, welches am Ende des Verfahrens isoliert werden kann, enthält in jedem Fall große Mengen an hydrophilen Verunreinigungen, wie Serin, Cholin und deren Salze, die in der wässrigen Phase vorliegen.
Ein anderer Aspekt, der erwähnt werden sollte, ist der, daß durch Messung der Enzymaktivität des Typs D-Phospholipase der Produkte gemäß dem in der verwandten Literatur beschriebenen Methode (Biotechn. Techn., 7, 795 (1993)) für jedes Gramm des Produkts etwa 2 internationale Einheiten der Enzymaktivität gefunden werden.
In Übereinstimmung mit dem allgemeinen Erfordernis von strikten Kriterien der Reinheit ist die Entfernung der besagten Verunreinigungen aus dem Produkt sehr wichtig.
Die Methoden, die im allgemeinen zum Entfernen von hydrophilen Substanzen aus organischen Lösungen von Phospholipiden verwendet wurden, haben wich als unwirksam erwiesen. Durch Extrahieren einer Toluollösung der Phospholipidmischung, die wie im US-Patent Nr. 5,700,668 beschrieben erhalten wurde, mit derselben Menge an Wasser und dann durch Trennen der Phasen wurde tatsächlich gefunden, daß der Gehalt an Serin in der organischen Phase und die Aktivität der D-Phospholipase praktisch unverändert sind im Vergleich zu den Werten, die vor der Extraktion mit Wasser gefunden wurden.
Die Eluierung derselben organischen Lösung von einer Chromatographiesäule, die mit Toluol konditioniertes Chromatographie-Siliziumdioxid enthält, wobei die Produkteluierung mit Toluol vervollständigt wird, führt ähnlich zu einer sehr geringen Entfernung des Serins und der enzymatischen Aktivität aus dem Phospholipid.
In einem anderen Experiment wird zu der organischen Lösung von Phosphatidylserin, die aufgrund von Serin zu reinigen ist, Aceton hinzugefügt. Das gefällte Produkt zeigt nach der Analyse ein Verhältnis von Serin zu Phosphatidylserin, welches im Vergleich zum Anfangsprodukt im wesentlichen unverändert ist.
Deshalb gibt es stets das Problem bezüglich der Verfügbarkeit eines wirksamen Reinigungsverfahrens für Phosphatidylserine, die mittels Trans-Phosphatidylierung von Phosphatidylcholin mit Serin in Gegenwart des Enzyms D-Phospholipase hergestellt wurden, und als Verunreinigungen hydrophile Verbindungen, Proteine und anorganische Salze enthalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Anmelder hat nun überraschenderweise gefunden, daß hydrophile Verunreinigungen, Proteine und anorganische Salze aus einer Lösung von Phosphatidylserin in einem organischen Lösungsmittel durch Extraktion mit Wasser erfolgreicherweise entfernt werden können, mit der Maßgabe, daß ein polares organisches Lösungsmittel dem System zugefügt wird.
Deshalb ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Reinigungsverfahren für Phosphatidylserine mit der Formel (I).
worin R₁ und R₂, gleich oder verschieden, eine C₁₀-C₃₀-Acylgruppe sind; X OH oder OM ist, wobei M aus der Gruppe von Alkalimetallen, Erdalkalimetallen, Ammonium und Alkylammonium ausgewählt wird, und worin der Serinteil in D-, L- oder racemischer Form und vorzugsweise in L-Form vorliegt, umfassend die Extraktion der besagten Phosphatidylserine aus einer Lösung in einem Kohlenwasserstofflösungsmittel mit einer Mischung von Wasser und einem polaren organischen Lösungsmittel.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im speziellen Fall der Phosphatidylserine, die gemäß der im US-Patent Nr. 5,700,668 enthaltenen Beschreibung mittels Trans-Phosphatidylierung in einem Zweiphasensystem aus einer wässrigen Phase und einer Toluolphase hergestellt wurden, kann das Verfahren gemäß der Erfindung direkt mit der Toluolphase durchgeführt werden, nachdem letztere von der wässrigen Phase am Ende der Reaktion abgetrennt wurde.
Im Fall von Phosphatidylserinen, die anderen Methoden folgend hergestellt wurden, kann das Reinigungsverfahren vorteilhafterweise durchgeführt werden, indem das Produkt in einer Mi schung gerührt wird, die ein Kohlenwasserstofflösungsmittel, Wasser und ein polares organisches Lösungsmittel enthält.
Auch in diesem Fall liegt das betreffende Phospholipid in der Kohlenwasserstoffphase vor, wohingegen die hydrophilen Verunreinigungen in der wässrigen Phase zu finden sind.
Nach dem Abtrennen der Phasen kann das Phosphatidylserin unter Verwendung bekannter Methoden isoliert werden, wie der Fällung mit Aceton.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren können aromatische oder aliphatische Lösungsmittel als das Kohlenwasserstofflösungsmittel verwendet werden; unter den aromatischen Lösungsmitteln werden Toluol oder Xylol bevorzugt; unter den aliphatischen Lösungsmitteln ist es bevorzugt, n-Heptan, n-Hexan oder Cyclohexan zu verwenden.
Als polares organisches Lösungsmittel können alkoholische Lösungsmittel verwendet werden, die zum Beispiel 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthalten. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird das alkoholische Lösungsmittel unter sekundären und tertiären Alkoholen ausgewählt; weiter bevorzugt wird Isopropanol verwendet.
Die Extraktion gemäß der Erfindung kann bei Temperaturen zwischen 0 und 70°C und vorzugsweise zwischen 20 und 30°C durchgeführt werden.
Die Menge an Kohlenwasserstofflösungsmittel liegt zwischen 4 und 30 Litern/kg des zu reinigenden Phospholipids und vorzugsweise zwischen 6 und 12 Litern.
Das Volumenverhältnis zwischen Wasser und Kohlenwasserstofflösungsmittel liegt zwischen 0,2 und 5 und vorzugsweise zwischen 0,3 und 1. Das Volumenverhältnis zwischen polarem organischem Lösungsmittel und Kohlenwasserstofflösungsmittel liegt zwischen 0,2 und 2 und vorzugsweise zwischen 0,3 und 1.2.
Die beschriebene Methode kann auf Phosphatidylserine mit verschiedenen acyclischen Ketten angewandt werden und gestattet die Reinigung sowohl von Produkten, die aus der Trans-Phosphatidylierung von Phosphatidylcholinen natürlichen Ursprungs wie aus Sojabohne, Raps oder Eigelb stammen, als auch von Phosphatidylcholinen, die mit Fettsäuren synthetisiert wurden, sowohl gesättigten wie Myristinsäure, Palmitinsäure oder Stearinsäure, als auch ungesättigten wie Ölsäure oder Linolsäure.
Die folgenden Beispiele zielen lediglich darauf ab, die vorliegende Erfindung zu offenbaren, ohne ihren Gegenstand zu begrenzen.
BEISPIEL 1
Herstellung von Phosphatidylserin in einem Zweiphasensystem
400 g einer nicht entölten Fraktion von Sojabohnenlecithin, enthaltend 32% Phosphatidylcholin und 50% Triglyceride, werden zusammen mit 3 l Toluol in einen Kolben eingebracht. Eine Lösung von 22,7 g Calciumchlorid, 27,6 g trihyratisiertem Natriumacetat und 62,5 g L-Serin in 1,3 l einer Lösung von D-Phospholipase mit einer Aktivität von 3 KU/l wird getrennt hergestellt. Die Lösung wird mit Essigsäure auf einen pH von 4,2 gebracht. Die zwei Lösungen werden vereinigt und unter Rühren bei 25°C für 8 Stunden gehalten. Nach einer Filtrierung werden die Phasen getrennt, ein Zehntel der Toluolphase wird unter Vakuum konzentriert (der übrige Teil wird für die in den Beispielen 2, 3, 4, 5 beschriebenen Experimente verwendet); der Rückstand wird zu 500 ml Aceton bei Raumtemperatur zugegeben. Das Produkt wird filtriert und getrocknet, wodurch 27 g einer Mischung von Phospholipiden mit einem Gehalt an Phosphatidylserin von 50% erhalten wird.
Eine TLC-Analyse (Elusionsmittel: Mischung von Chloroform, Methanol, Wasser und 28%-ige wässrige Lösung von Ammoniak 300 : 100 : 10 : 12; Nachweismittel: Ninhydrin) zeigt die Gegenwart von 1,5% L-Serin im Endprdodukt.
Die Gegenwart der D-Phospholipase im Produkt wird mit einer Methode bestimmt, die in der verwandten Literatur beschrieben ist (Biotechn. Techn., 7, 795 (1993)); es wird eine Aktivität von 2,1 IU/g gefunden.
BEISPIEL 2
Reinigung von Phosphatidylserin mittels Extraktion mit i-Propanol und Wasser
330 ml der wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellten Toluol-lösung werden verwendet. Zu dieser Lösung werden 240 ml i-Propanol und 150 ml Wasser zugegeben. Das Ganze wird bei Raumtemperatur gerührt und absetzen gelassen, wonach sich die Phasen trennen. Die Toluolphase wird konzentriert, und ihr Rückstand wird unter Rühren zu 500 ml Aceton hinzugefügt.
Das Produkt besitzt einen Gehalt an L-Serin von 0,3%. D-Phospholipase ist unter der in der Methode verwendeten Bestimmungsgrenze (0,1 IU/g).
BEISPIEL 3
Reinigung von Phosphatidylserin mittels Extraktion mit i-Propanol und Wasser in unterschiedlichen Verhältnissen
330 ml der wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Toluol-lösung werden verwendet. Zu dieser Lösung werden 150 ml Isopropanol und 240 ml Wasser hinzugefügt. Das Ganze wird bei Raumtemperatur gerührt und absetzen gelassen, wonach sich die zwei Phasen trennen. Die Toluolphase wird konzentriert, und ihr Rückstand wird unter Rühren zu 500 ml Aceton zugegeben.
Da Produkt besitzt einen Gehalt an L-Serin von 0,2%. D-Phospholipase ist unter der in der Methode verwendeten Bestimmungsgrenze (0,1 IU/g).
BEISPIEL 4
Reinigung des Phosphatidylserins mittels Extraktion mit Ethanol und Wasser
330 ml der wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellten Toluol-lösung werden verwendet. Zu dieser Lösung werden 150 ml Ethanol und 150 ml Wasser hinzugefügt. Das Ganze wird bei Raumtemperatur gerührt und absetzen gelassen, wonach die zwei Phasen sich trennen. Die Toluolphase wird konzentriert, und ihr Rückstand wird unter Rühren zu 500 ml Aceton hinzugefügt. Das Produkt besitzt einen Gehalt an L-Serin von 0,2%. D-Phospholipase ist unter der in der Methode verwendeten Bestimmungsgrenze (0, 1 IU/g) .
BEISPIEL 5
Herstellung des Phosphatidylserins in einem Zweiphasensystem Wasser/n-Heptan und Reinigung mit i-Propanol und Wasser
40 g desselben Typs Sojabohnenlecithin, welches als Rohmaterial im Beispiel 1 verwendet wurde, werden zusammen mit 300 ml n-Heptan in einen Kolben eingebracht. Getrennt davon wird eine Lösung von 2,3 g Calciumchlorid, 2,8 g trihydratisiertem Natriumacetat und 6,3 g L-Serin in 0,13 1 einer Lösung von D-Phospholipase einer Aktivität von 3 KU/I hergestellt. Die Lösung wird mit Essigsäure auf pH = 4,2 gebracht. Die beiden Lösungen werden vereinigt und 24 Stunden unter Rühren bei 25°C gehalten. Nach einer Filtrierung werden die Phasen getrennt; der Heptanphase werden 150 ml i-Propanol und 150 ml Wasser hinzugegeben. Nach Rühren und Setzenlassen werden die beiden Phasen getrennt. Die Heptanphase wird bei niedrigem Druck konzentriert. Der Rückstand wird bei Raumtemperatur zu 500 ml Aceton hinzugefügt. Das Produkt wird filtriert und getrocknet, wonach 26,5 g einer Mischung von Phospholipiden mit einem Gehalt an Phosphatidylserin von 48% erhalten wird.
Das Produkt besitzt einen Gehalt an L-Serin von 0,2%. D-Phospholipase ist unter der Bestimmungsgrenze der Methode (0,1 IU/g).
BEISPIEL 6
Herstellung von Phosphatidylserin mittels Trans-Phosphatidylierung in Abwesenheit von organischem Lösungsmittel
40 g einer durch Extraktion von Sojabohnenlecithin mit Ethylalkohol erhaltenen Mischung von Phospholipiden, deren Haupt komponente Phosphatidylcholin ist (65%), werden in einen Trenntrichter eingebracht zusammen mit einer Lösung, die durch Auflösen von 60 g Calciumchlorid in 800 ml Wasser hergestellt wurde; die Mischung wird für eine Stunde unter Rühren bei 25°C gehalten. Nach 4 Stunden Ruhe werden 700 ml der wässrigen Phase vom unteren Zapfen entnommen. Eine Lösung, die 64 g L-Serin in 130 ml 0,1 M-Acetatpuffer bei pH 4,5 enthält, wird getrennt davon hergestellt. Zu dieser Lösung werden 300 mg D-Phospholipase in lyophilisierter Form mit einer Aktivität von 1,0 IU/mg zugegeben. Die resultierende Lösung wird zu der zuvor hergestellten, wässrigen Dispersion der Phospholipide zugegeben. Die Mischung wird für 3 Stunden unter Rühren bei 45°C gehalten. Das Reaktionsprodukt wird mittels Filtrierung abgetrennt. Nach dem Waschen mit Wasser wiegt es 60 g.
Ein Volumenanteil wird getrocknet, um Serin und D-Phospholipase zu bestimmen. Das Ergebnis besteht darin, daß der Gehalt an Serin 7 Gew.-% ist und die Aktivität der D-Phospholipase 2 IU/g beträgt.
BEISPIEL 7
Reinigung des im Beispiel 6 erhaltenen Phosphatidylserins
5 g Volumenanteile des wie im Beispiel 6 beschrieben erhaltenen, feuchten Produkts werden für Reinigungstests verwendet durch Auflösen in einer Mischung von Lösungsmitteln, die Wasser, ein Kohlenwasserstofflösungsmittel (Lösungsmittel 1) und ein Alkohollösungsmittel (Lösungsmittel 2) enthält.
In allen Tests liegt nach dem Rühren und Absetzen Phosphatidylserin nur in der Kohlenwasserstoffphase vor. Die Kohlenwasserstoffphase wird konzentriert und mit Aceton gefällt. Die getrockneten Produkte werden durch Messen des Gehalts an Serin und der Aktivität der D-Phospholipase analysiert. Die folgende Tabelle 1 zeigt die Reinigungsbedingungen, die für das Phosphatidylserin verwendet wurden, sowie die Mengen an Serin und D-Phospholipase, die im Endprodukt vorliegen.
Tabelle 1 – Reinigung von Phosphatidylserin
BEISPIEL 8
Herstellung und Reinigung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS)
40 g von Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) werden zusammen mit 0,3 1 Toluol in einen Kolben eingebracht. Getrennt wird eine Lösung von 2,3 g Calciumchlorid, 2,8 g trihydratisiertem Natriumacetat und 6,3 g L-Serin in 0,13 1 einer Lösung von D-Phospholipase mit einer Aktivität von 3 KU/I hergestellt. Die Lösung wird mit Essigsäure auf einen pH von 4,2 gebracht. Die beiden Lösungen werden vereinigt und für 8 Stunden unter Rühren bei 25°C gehalten. Dann werden die Phasen getrennt, zu der oberen Phase werden 240 ml i-Propanol und 150 ml Wasser hinzugegeben. Das Ganze wird bei Raumtemperatur gerührt und absetzen gelassen, dann werden die Phasen getrennt. die Toluolphase wird konzentriert, und ihr Rückstand wird unter Rühren zu 500 ml Aceton zugegeben. Der Feststoff wird filtriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch 39 g DOPS als Calciumsalz erhalten werden.
Das Produkt besitzt einen Gehalt an L-Serin von 0,2%. D-Phospholipase ist unter der in der Methode verwendeten Bestimmungsgrenze (0,1 IU/g).

Claims

Reinigungsverfahren für Phosphatidylserin mit der Formel (I)
worin R₁ und R₂, gleich oder verschieden, eine C₁₀-C₃₀-Acylgruppe sind; X OH oder OM ist, wobei M aus der Gruppe von Alkalimetallen, Erdalkalimetallen, Ammonium und Alkylammonium ausgewählt wird, und worin der Serinteil in D-, L- oder racemischer Form und vorzugsweise in L-Form vorliegt, umfassend die Extraktion des Phosphatidylserins aus einer Lösung in einem Kohlenwasserstofflösungsmittel mit einer Mischung von Wasser und einem polaren organischen Lösungsmittel.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Kohlenwasserstofflösungsmittel unter Toluol, Xylol, n-Heptan, n-Hexan oder Cycolhexan ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Kohlenwasserstofflösungsmittel in einer Menge zwischen 4 und 30 Litern/kg des zu reinigenden Phosphatidylserins verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem das Kohlenwasserstofflösungsmittel in einer Menge zwischen 6 und 12 Litern/kg des zu reinigenden Phosphatidylserins verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das polare organische Lösungsmittel ein Alkohollösungsmittel ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Alkohollösungsmittel unter Alkoholen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Alkohollösungsmittel unter sekundären und tertiären Alkoholen ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Alkohollösungsmittel i-Propanol ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das polare organische Lösungsmittel in einer Menge zwischen 0,2 und 2 Litern/kg des verwendeten Kohlenwasserstofflösungsmittels verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das polare organische Lösungsmittel in einer Menge zwischen 0,3 und 1,2 Litern/kg des verwendeten Kohlenwasserstofflösungsmittels verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Menge des verwendeten Wassers zwischen 0,2 und 5 Litern/kg des verwendeten Kohlenwasserstofflösungsmittels liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Menge des verwendeten Wassers zwischen 0,3 und 1 Liter/kg des verwendeten Kohlenwasserstofflösungsmittel liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Extraktion bei einer Temperatur zwischen 0 und 70°C durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Extraktion bei einer Temperatur zwischen 20 und 30°C durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Phosphatidylserin mit der Formel (I) hergestellt wurde durch trans-Phosphatidylierung von Phosphatidylcholinen natürlichen oder synthetischen Ursprungs.
Verfahre n gemäß den Ansprüchen 1 bis 15, welches das Rühren des Phosphatidylserins mit der Formel (I) in einer Mischung umfaßt, die das Kohlenwasserstofflösungsmittel, Wasser und das polare organische Lösungsmittel enthält.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß nach Trennung der Phasen das Phosphatidylserin mittels Fällung mit Aceton isoliert wird.