DE1949399A1

DE1949399A1 - Glycolphosphatide und deren Herstellung aus Kephalinen

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Publication number: DE1949399A1
Application number: DE19691949399
Authority: DE
Inventors: Hans Dipl-Chem Dr Betzing
Original assignee: A Natterman und Cie GmbH
Current assignee: A Natterman und Cie GmbH
Priority date: 1969-09-30
Filing date: 1969-09-30
Publication date: 1971-04-01
Also published as: FR2070098B1; BE756778A; DK138183C; FR2070098A1; SE368017B; NL7014221A; AT296506B; US3681412A; ZA706676B; TR16587A; CH553220A; DK138183B; GB1277394A; ES384039A1; JPS4843336B1

Description

betreffend Glycolphosphatide und deren Herstellung aus Kephalinen,

Die bekannten Kephalinfraktionen enthalten bei Gewinnung aus pflanzlichem Material neben Lecithinen im wesentlichen Phosphatidylcolamin und im Falle der Gewinnung aus tierischen Quellen Phosphatidyloolamin und Phospha frdylserin. Diese Kephaline weisen je naoh dem speziellen Ausgangsmaterial unterschiedliche Fettsäurereste mit im allgemeinen 10 - 24 Kohlenstoffatomen auf. Die für therapeutische Zwecke bevorzugten Kephalinfraktionen enthalten Phosphatidyloolamine bzw. Phosphatidylserine, die einen großen Prozentsatz an ungesättigten, insbesondere mehrfaoh ungesättigten Fettsäureresten besitzen. Wegen der starken Reaktionsfähigkeit besonders der mehrfaoh ungesättigten Fettsäuren ist deren Isolierung nicht einfach. Sie fallen im allgemeinen bei der Extraktion von Rohphosphatiden mit niederen Alkoholen an.

Die Kephaline bzw. die diese enthaltenden Phoephatidfraktionen können unter anderem als natürliche Emulgatoren dienen, da sie neben den lipophilen lettsäuraresten nooh

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die hydrophile Glyoerinphosphorsäuregruppierung nebst den ebenfalls hydrophilen Golamin- oder Serinresten aufweisen. Allerdings ist die Emulgatorwirkung relativ gering, was darauf zurückgeführt werden kann, daß die freie Aminogruppe durch die Phosphorsäurβgruppe intramolekular salzartig gebunden ist.

Wegen der Anwesenheit der aus physikalisch-chemischen sowie biologischen Gründen wertvollen ungesättigten Fett- W säuren finden kephalinhaltige Phosphatidgemische auch als Arzneimittel Verwendung. Als Emulgatoren für eine intravenöse Jetternährung sind sie allerdings nur mit Vorsicht einzusetzen, da die Kephaline als,solche Aktivatoren der Blutgerinnung sind. Außerdem hat sich herausgestellt, daß die bisher für intravenöse Fetternährung verwendeten kephalinhaltigen Phosphatide unangenehme Nebenwirkungen wie Fieber und Sohüttelfrost hervorrufen können. Wie jetzt erkannt wurde, müssen diese nachteiligen Wirkungen in erster linie der Aminogruppe der Kephaline zugeschrieben werden.

Aus der US-Patentschrift 3 301 881 ist schon ein Verfahren bekannt, bei dem durch Behandlung wäßriger Phosphatidemulsionen mit organischen Säureanhydriden das Kephalin ganz oder teilweise acyliert wurde, wodurch die primäre Aminogruppe in ein Säureamid überführt wurde. Dadurch sollen die Phosphatide plastischer werden und in wäßrigen Medien leichter dispergiert werden können.

Es wurde nunmehr gefunden, daß es bei den Phosphatidyloolaminen ebenso wie bei den Phosphatidylserinen in einfacher Weise gelingt, die Aminogruppe zu eliminieren, ohne daß hierbei die Fettsäurereste abgespalten oder die empfindlichen ungesättigten oder mehrfach ungesättigten Fettsäurereste ohemisoh verändert werden. Die hierbei durch Desaminierung

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erhaltenen neuen Glycolphosphatide entsprechen der allgemeinen Formel

H₉O- 0 - R¹

¹ 2

HG- 0 - R

H₉G- Ο - P - 0 - GHp - CHOH

² /\ ²I

0 OH X

1 2

worin R und R Fettsäurereste mit 10-24 C-Atomen, vorzugsweise ungesättigte oder mehrfach ungesättigte Fettsäurereebe darstellen und X ein Wasserstoff oder die Carboxylgruppe (-COOH) ist. Diese neuen Glycolphosphatide, die man auch als Desaminokephaline bezeichnen kann, sind im Gegensatz zu den Kephalinen völlig alkohollöslich. Sie weisen gleichzeitig auch eine wesentlich größere Wasserlöslichkeit auf als die Phosphatidylcolamine und Phosphatidylserine. Da sie die störende Blutgerinnungsaktivität der Kephaline nicht mehr besitzen, sind die neuen Glycolphosphatide für die intravenöse Fetternährung vorzüglich geeignet. Gleichzeitig können sie auch als wirksamere Öl-in-Wasser-Emulgatoren zur Herstellung von Fettpräparaten und dergleichen dienen. Aufgrund der reaktionsfähigen freien Hydroxylgruppe sind die Glycolphosphatide auch zur Herstellung weiterer, an der OH-Gruppe substituierter Verbindungen, z.B. Esterverbindungen, geeignet und daher auch wertvolle Zwischenprodukte für neuartige Arzneimittel. Die Zusammensetzung der Fettsäuren schwankt je nach verwendetem Kephalinausgangsmaterial. Im allgemeinen überwiegt der Anteil an Fettsäuren mit der Kohlenstoffzahl 16 und 18, was auch für die ungesättigten Fettsäuren gilt. Bei Kephalinen aus Eidotter enthalten die daraus hergesbellten Glycolphosphatide u.a. auch G₂₀- und C₂₂-Fettsäuren, bei Gehirn als Ausgangssubstanz auch noch C₂*-Fettsäuren.

- 4 -1 0 9 8 U / 2 2 k 4

Die Erfindung betrifft nun die Herstellung der neuen G-lycolphosphatide der oben angegebenen Formel. Sie können dadurch, leicht hergestellt werden, daß das-Phosphatidylcolamin oder Phosphatidylserin in einem organischen Lösungsmittel gelöst, mit wäßriger salpetriger Säure versetzt wird, worauf die durch Diazotierung und Hydrolyse desaminierten Phosphatidverbindungen in bekannter Weise isoliert werden können. Bei vorsichtiger Einwirkung der salpetrigen Säure, z.B. in der fe Kälte, werden auch die mehrfach ungesättigten Fettsäurereste der Phosphatidylverbindungen chemisch nicht verändert. Me spektralanalytischen und gaschromatographischen Untersuchungen zeigten, daß die charakteristische IR-Bande des Kephalins bei 9,8 τα verschwunden ist, ohne daß die Doppelbindungen sich durch die Behandlung verändert haben.

Vorzugsweise erfolgt die Einwirkung der salpetrigen Säure auf die Kephaline in der Weise, daß man eine wäßrige Lösung eines Salzes der salpetrigen Säure und eines sauren Salzes einer organischen oder anorganischen Säure verwendet und diese wäßrige Lösung unter Rühren der kephalinhaltigen organischen Lösung zutropft. Diese milde Einwirkungsform der salpetrigen ) Säure ermöglüit, die Umsetzung auch bei Raumtemperatur oder unter schwacher Erwärmung sogar ohne Gefahr für die sterische Form der ungesättigten Fettsäurereste durchzuführen. Als Lösungsmittel für die kephalinhaltigen Ausgangssubstanzen eignen sich Alkohole oder chlorierte Kohlenwasserstoffe mit 1*- 4 C-Atomen. Auch Kohlenwasserstofflösungsmittel sind geeignet. Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Desaminierungsreaktion der Phosphatidylcolamine und/oder Phosphatidyl-. serine hat sich besonders Chloroform als ein sehr brauchbares Lösungaittel erwiesen.

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Das erfindungsgemäße Desaminierungsverfahren ermöglicht, die Glycolphosphatide leicht zu isolieren, da ihre große Alkohollöslichkeit die Extraktion und Abtrennung von anderen Begleitphosphatiden sehr erleichtert.

Praktisch geht das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Glycolphosphatide so vor sich, daß entweder reines Kephalin, wie es beispielsweise durch säulenohrbmatographische Trennung von kephalinreichen Phosphatidfraktionen auf Kieselgelsäulen durch Elution mit Chloroform-Methanol-Gemischen gewonnen werden kann, oder ein kephalinhaltiges Phosphatidgemisch - ölhaltig oder entölt - in einem Alkohol oder chlorierten Kohlenwasserstoff mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder in einem Kohlenwasserstofflösungsmittel wie Petroläther, Hexan, Gyclohexan, Benzol, usw. oder Mischungen dieser Lösungsmittel gelöst wird, diese Lösung dann unter Kühlung, bei Zimmertemperatur oder höheren Temperaturen mit der wäßrigen Lösung der salpetrigen Säure oder nacheinander oder gleichzeitig mit einer wäßrigen Lösung eines Alkali- oder Erdalkalisalzes der salpetrigen Säure und einem sauren Salz einer anorganischen bzw. organischen Säure, vorzugsweise Natrium-dihydrogenphosphat, Natrium-hydrogenoitrat oder Kaliumhydrogenphthalat, versetzt und unter Luftabschluß gerührt wird, bis die den Kephalinphosphatiden zugehörige freie Aminogruppe nicht mehr mit Ninhydrin-Reagenz nachzuweisen ist. Danach wird bei Verwendung von Alkohol das Lösungsmittel ganz oder teilweise im Vakuum abgedampft und vorzugsweise durch einen chlorierten Kohlenwasserstoff ersetzt. Zur Entfernung der wasserlöslichen Anteile kann die Lösung nooh 2 - 3 mal mit Wasser ausgewaschen werden. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter Stickstoff resultiert ein gelbes bis gelbbraunes plastisches Produkt.

Der besondere Vorteil des Verfahrens unter Verwendung von Salzlösungen liegt darin begründet, daß es möglioh ist, bei

1 0 9 fJ1 A / Ί 2 /* 4 " ⁶ "

der Diazotierung der freien Aminogruppe auf die Säure ganz * zu verzichten und die Freisetzung der salpetrigen Säure aus dem Uitrit durch saure Salze in situ so zu steuern., daß eine Umlagerung der in den Phosphatiden vorhandenen Fettsäuren zu trans-lettsäuren praktisch unterbleibt. Auch eine Veränderung in der Fettsäurezusammensetzung der behandelten Produkte tritt nicht auf. Insbesondere bleibt der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, speziell an Polyenfettsäuren mit ihren essentiellen Eigenschaften, durch das Verfahren unver- W ändert.

In der Regel wird man die Diazotierung bis zur quantitativen Entfernung der primären HHp-Gruppe des Kephalins durchführen; es ist aber auch unschwer möglich, mit weniger als den in den Beispielen angegebenen Mengen an Natriumnitrit und saurem Salz zu arbeiten, wobei eine teilweise Entfernung des Stickstoffs aus dem Kephalinmolekül erreicht wird, was bereits zu einer guten Verteilung dieser Phosphatidprodukte in wäßrigen Medien führt.

Ein weiterer Vorteil des vorliegenden Verfahrens der Anmeldung ist die !Tatsache, daß die kephalinfreien Produkte

günstige Eigenschaften aufweisen, z.B. deutlich bessere Säurezahlen und Phosphor-Werte ala die entsprechenden Ausgangsprodukte, wie aus der nachfolgend aufgeführten Tabelle hervorgeht.

1098 U/22AA'

	— 7 —	Säurezahl	# Phosphor
	TABELLE I	20,3	2,1
Substanz	Jodzahl	9,4	2,34
handelsübliches Roh- pho sphatid	86,5	30,1	3,1
nach, dem Verfahren der Anmeldung desaminiert	87,2
entöltes Rohphosphatid	70,3

nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert

alkoholunlösliche Sojapho aphatid-Fraktion

nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert

alkohollösliche Sojaphosphatid-Fraktion

nach dem Verfahren der Anmeldung desaminiert

77,4

66,7

70,2

85,0

86,7

5,5

32,3 14,4 18,0 4,0

3,28

3,0

3,23

3,1

3,12

Für die Umsetzung mit der salpetrigen Säure gemäß der Erfindung kann man die reinen Kephalinverbindungen oder auch die diese enthaltenden Phosphatidgemische verwenden. Die in diesen noch enthaltenen Lecithine können die Umsetzung nicht stören,, denn sie werden von der salpetrigen Säure unter den milden Reaktionsbedingungen nicht angegriffen, da sie keine primären Aminogruppen enthalten.

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Bei der Untersuchung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Desaminierung von PhosphatidyLcolamin erhaltenen neuen Glycolphosphatide wurden im Falle des Sojaphosphatids als Ausgangsmaterial bei der gaschromatographischen Untersuchung folgende Fettsäuren ermittelt:

TABELLE II

Fettsäurezusammensetzung des Phosphatidylglycols aus Sojaphosphatid

C₁₂ ^= 0,1 ^

C₁₄ = 0,2 io

C₁₆ = 26,0 io

C₁₈ = 2,0 io

C₁₈I = 7,0 io

C₁₈2 = 60,0 io

0₁₈3 = 4,5 io

C₂₀ = 0,2 io

100,0

Bei einem aus Ei erhaltenen Gemisch aus Phosphatidylcolamin und Phosphatidylserin wurde nach dem Desaminieren folgende Fettsäurezusammensetzung ermittelt:

— 9 —

1090 1 kl Ilk U

. - 9 TABELLE III

Fettsäurezusammensetzung des G-lycolphosphatids aus Ei-Kephalin (Gemisch aus Colamin- und Serin-Kephalin)

O₁₀ = 1,2 Jt

C₁₂ = 0,4 io

O₁₄ = 2,0 Jt

O₁₄I = 0,2 £

O₁₆ = 22,6 io

O₁₆I = 0,7 io

C₁₈ = 23,0 f>

C₁₈I = 17,2 io.

C₁₈2 = 16,0 i>

Ö₁₈3 = 2,0 9t

O₂₀ = 0,4 %

0₂₀4 = 12,8$

100,0

Beispiel 1

g reine3 Kephalin (Phosphatidylcolamin), hergestellt aus alkoholurilösliciier Sojaphoaphatidfraktion durch säulen-

chromatograpiaische Trennung auf Kieaelgel mit Chloroform-Methanol

- 10 1 0 9 ", U / ? 2 Iy A

- ίο -

80 s 20 als Elutionsmittel, werden in einem Gemisch von 1000 ml Chloroform und 1000ml Methanol gelöst und unter Rühren und Einleiten von Np &it einer lösung von 125 g Natriumnitrat in 200 ml dest. Wasser versetzt. Die Mischung wird im Wasserbad auf 37⁰C erwärmt. Dann läßt man langsam eine lösung von 230 g Natriumdihydrogehphosphat χ 2 Wasser in 200 ml dest. Wasser zutropfen. Nach insgesamt 2-stündigem Rühren bei 37°C ist alles Kephalin diazotiert und es läßt sich dünnschichtchromatographisch mit Ninhydrin-Reagenz keine Aminogruppe, d.h. kein Kephalin mehr nachweisen.

Zur Aufarbeitung wird vom Unlöslichen dekantiert, der Rückstand mit wenig Chloroform ausgewaschen und verworfen. Die Chloroform-Lösungen werden in einen Scheidetrichter überführt und, falls erforderlich, mit soviel Wasser versetzt, bis sich zwei Schichten ausbilden. Die untere chloroformhaltige Schicht wird abgetrennt und mit ca.- 400 ml Wasser gewaschen und erneut im Soheidetrichter von der Wasserphase getrennt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum unter No bleiben 190 g Glycolphosphatid zurück.

Beispiel 2

500 g alkoholunlösliche Sojabohnenphosphatidfraktion, wie sie durch Entölen von handelsüblichem Sojaphosphatid mit Aceton und anschließendem mehrmaligen Extrahieren des entölten Produktes mit Äthanol in der Wärme als Rückstand verbleibt (Kephalingehalt ca. 30 #), werden in einem Gemisch von 700 ml Chloroform und 500 ml Methanol unter Rühren und Einleiten von N₉ gelöst und mit einer Lösung von 69 g NaNO₀ in 80 ml dest. Wasser versetzt. Zu dieser Mischung läßt man dann unter Rühren eine Lösung von 138 g NaH₂PO₄ χ 1-hydrat in 100 ml dest. Wasser zutropfen, worauf das Reaktionsgemisch noch weiter bei Zimmertemperatur unter N₂ gerührt wird. Nach 3,5 Stunden zeigt eine Probe der Substanz nach dünnschiohtchroinatographischer Trennung

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auf Kieselgel G-Platten im Laufmittel Chloroform-Methanol-Wasser (65:25:4) und nach Ansprüchen mit Ninhydrin-Reagenz, daß kein Kephalin mehr im Gemisch vorhanden ist. Die Lösung wird von dem ausgeschiedenen halbfesten Phosphat abdekantiert und solange mit dest. Wasser versetzt, "bis sich zwei Schichten gebildet haben. Dazu sind ca. 150 ml Wasser erforderlich. Die Wasserphase (obere Phase) wird in Schneidetrichtern abgetrennt und verworfen. Nach Zugabe von ca. 200 ml Wasser wird gut durchgemischt und erneut von der Wasserphase abgetrennt. Sollte die zweite Wasserphase noch merklich sauer sein, wird ein weiteres Mal mit Wasser gewaschen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum unter Ng resultieren aus der Chloroformphase 400 g eines Phosphatidgemisches mit folgenden Kennzahl/e« JZ = 70, SZ = 14, P β 3,2 $, das anstelle des Kephalins das neue Glycolphosphatid enthält.

Die verbesserte Emulsionsbildung dieses Produktes zeigt der folgende Versuch:

1 g des glycolphosphatidhalUgen Phosphatidgemisches wird durch Rühren und Erwärmen auf 60 - 70⁰C in 10 g Sonnenblumenöl gelöst. Nach Abkühlen auf 20⁰C wird die Mischung in eiasn 100 ml-Schüttelzylinder überführt und 90 ml dest. Waseer von 20⁰C zugefügt. Durch eine scharfe Drehung des Zylinders um 90° alle 30 Sek. werden die beiden Phasen emulgiert. Gemessen wird die Anzahl der Drehungen, die erforderlich sind, eine für 30 Sek. stabile Emulsion zu erhalten. Für das kephalinfreie Produkt sind nur

2 Drehungen erforderlich, während bei Verwendung des Ausgangsmaterials, d.h. der kephalinhaltigen alkoholunlöslichen Phosphatidf raktion auch nach 50 Drehungen keine Emulsion erhalten wurde.

Beispiel 3

2 kg lediglich durch wiederholte Behandlung mit Aceton vom öl befreites· Sojabohnen-Rohphosphatid werden in einem Gemisch von 4 1 Chloroform und 1 1 Methanol unter Rühren und

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Schutz eines inerten Gases (N₂) gelöst und mit einer Lösung von 250 g NaNO₂ in 220 ml warmem dest. Wasser versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf 50⁰C erwärmt und tropfenweise mit einer Lösung von 46O g NaHgPO, x 1 H₂O in 450 ml warmem dest. Wasser zugegeben. Nach insgesamt 2-stündigem Rühren bei 5O⁰C unter N₂ war das Reaktionsprodukt kephalinfrei. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wird die Chloroform-Methanol-Lösung vom anorganischen Rückstand dekantiert, der Rückstand mit wenig Chloroform ausgewaschen und dieses Chloroform zur dekantierten Lösung zugegeben. Die vereinigten Lösungen werden dann mit 500 ml Wasser unter N₂ gerührt, die Lösung im Scheidetrichter kurz absitzen lassen und dann die untere Chloroformschicht von dem Waschwasser abgetrennt. Das Auswaschen der Chloroformlösung wird noch 2 χ mit je 400 ml Wasser wiederholt. Zum Schluß wird die Chloroformlösung im Vakuum unter Stickstoff vom Lösungsmittel befreit. Es bleiben 1,8 kg (= 90$) eines gelb-braunen, plastischen Phosphatidgemisches zurück, das folgende Kennzahlen aufweist: JZ .= 78, SZ = 5,5, P = 3,3 #. Im Emulsionsbildungs-Iest, wie er im Beispiel 2 beschrieben ist, wurde bereits nach einer Drehung, gegenüber 16 beim Ausgangsmaterial, eine stabile Emulsion erhalten. ·

Beispiel 4

1 kg einer alkohollöslichen Phosphatidfraktion, wie sie durch Entölung von handelsüblichen Rohphosphatiden mit Aceton und anschließendem wiederholtem Extrahieren des entölten Phosphatidgemisches mit Alkohol gewonnen werden kann, wird in 3 Äthanol gelöst und unter Rühren und Einleiten von N₂ mit einer · Lösung von 120 g NaNO₂ in 120 ml Wasser und einer Lösung von 200 g NaH₂PO, χ 1 H₂O in 200 ml Wasser versetzt. Beide Salze werden unter Erwärmen in dest. Wasser in Lösung gebracht. Das Reaktionsgemisch wird bei 50⁰C unter Rühren und unter Einleiten von Np erwärnt. "Nach ca. 1 Stunde ist das gesamte Kephalin di--

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azotiert. Die Reaktionslösung wird vom Rückstand dekantiert und der Rückstand mit etwas Äthanol nachgewaschen. Durch Destillation im Vakuum unter U₂ wird der Alkohol bis auf ca. 700 ml abdestilliert und zum Rückstand ca. 1,5 1 Chloroform zugegeben. Die Lösung wird 2 -3 x mit je ca. 300 ml Wasser" ausgewaschen und das Waschwasser verworfen. Die Chloroform-Lösung wird im Vakuum unter N₂ eingedampft. Es bleiben 950 g (= 95 io) eines kephalinfreien, Glycolphosphatid enthaltenden Gemisches zurück4it den folgenden Kennzahlen: JZ » 82, SZ = 4-, P = 3,2 ji.

Beispiel 5

1 kg handelsübliches Sojabohnenrohphosphatid wird in 1,2 1-Dichloräthan und 600 ml Äthanol unter N₂-Schutz gelöst und unter Rühren bei einer Temperatur von 5O⁰C nacheinander mit einer Lösung von 100 g NaHO₂ in 120 ml Wasser und 170 g NaH₂PO. χ 1 HpO in 175 ml Wasser versetzt. Dabei ist es zweckmäßig, die Natriumhydrogenphosphatlösung langsam zutropfen zu lassen. Nach 2,5 Stunden Rühren ist das Reaktionsgemisch kephalinfrei. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur dekantiert man die Lösung, wäscht den halbfeten Rückstand mit Dichloräthan nach, gibt die Waschflüssigkeit zur Hauptlösung dazu und wäscht die Dichloräthan-Äthanol-Lösung 2 - 3 χ mit ^e ca. 250 ml Wasser aus. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum unter N₂ bleiben 950 g ölhaltiges, kephalinfreies Rohphosphatid zurück. Zur stabilen Emulsion gemäß dem unter Beispiel 2 aufgeführten Test ist nur 1 Drehung erforderlich gegenüber 10 beim handelsüblichen Rohphosphatid.

Beispiel 6

1 kg einer alkoholunlöslichen Sojaphosphatidfraktion, wie sie auch im Beiopicl 2 verwendet wurde, werden unter Rühren und Schutz elnea Inerten Gaaea in 2 1 Hexan gelöst und nach Er-

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•wärmen auf 5O⁰C mit einer Lösung von 200 g Natriumnitrit in 525 ml Wasser versetzt. Zu dem Reaktionsgemisch fügt man tropfenweise eine lösung von 400 g Natriumdihydrogenphosphat in 550 ml Wasser zu. Nach insgesamt 2,5 Stunden intensivem Rühren ist die Phosphatidfraktion kephalinfrei. Man läßt das Reaktionsprodukt zweekmäßigerweise im Eisschrank abkühlen und dekantiert dann die überstehende Lösung ab. Der Rückstand wird wiederholt mit Hexan ausgewaschen, die Hexanlösungen werden vereinigt und dann ca. dreimal mit je 300 ml Wasser ausgeschüttelt. Die wässerigen Phasen werden abgetrennt, falls erforderlich durch kurzes Zentrifugieren, und verworfen; die Hexanlösungen im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Es resultieren 750 g eines Phosphatidgemisches, das anstelle des Kephalins das G-lycolphosphatid enthält.

Beispiel 7

500 g einer alkohollöslichen Phosphatidfraktion, die nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift 1 047 597 gewonnen wurde, werden in einer Mischung von 700 ml Chloroform und 500 ml Methanol gelöst und unter Rühren und Erwärmen auf 50⁰C nacheinander mit einer Lösung von 70 g Natriumnitrit in 200 ml Wasser und einer Aufschlämmung von 185 g Kaliumhydrogenphthalat in 100 ml Wasser versetzt. Mach 7 Stunden ist das ReaktionsgemiBch kephalinfrei. Nach dem Abkühlen wird die überstehende Lösung vom Unlöslichen dekantiert, der Rückstand mit Chloroform nachgewaschen, öie Waschflüssigkeit mit der Chloroform-Methanol-Lösung vereinigt und wiederholt mit ca. 120 ml Wasser ausgewaschen. Dann wird die Chloroform-Lösung im Vakuum unter Stickstoff eingedampft. Ausbeutet 45Ο g eines Glycolphosphatid enthaltenden, alkohollöslichen Phosphatidgemisches.

Beispiel 8

180 g Ei-Rohphoaphatid, das aus frischem Eigelb zunächst durch Behandlung mit Aceton zur Entfernung der Neutraliipide

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und des Cholesterins und dann durch Extrahieren des ölfreien · Rückstands mit Chloroform-Methanol 2:1 und Auswaschen der wasserlöslichen Anteile nach J. Folch und Mitarbeiter (j.Biol. Chem. 191, 833, 1951) hergestellt worden war, das sowohl Serinphosphatid als auch Colaminphosphatid enthält, werden in einem Gemisch von 1 1 Chloroform und 1 1 Methanol gelöst und unter Rühren und Erwärmen auf 37°C nacheinander mit einer Lösung von 120 g Natriumdihydrogenphosphat und 60 g Natriumnitrit in jeweils 200 ml Wasser versetzt. Nach 3»5-stündigem Rühren ist das Reaktionsprodukt frei von ninhydrinpositiven Phosphatiden. Die chloroformhaltige Lösung wird von der gebildeten Wasserphase abgetrennt und noch 1-2 mal mit je 200 ml Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum unter Stickstoff bleiben 169 g eines kepha- · unfreien, die enieprechenden Glycolphosphatide enthaltenden Phosphatidgemisch.es zurück.

Beispiel 9

500 g einer alkohollöslichen Phosphatidfraktion (gewonnen wie unter Beispiel 4 beschrieben) werden in 1,5 1 Äthanol gelöst und bei Zimmertemperatur mit einer auf O⁰C gekühlten wässerigen Lösung von salpetriger Säure versetzt, die aus 200 g Natriumnitrit, gelöst in einer Mischung von 800 ml Wasser und 250 ml Äthanol, durch Zutropfen von 470 ml 12,5 $iger Salzsäure unter Eiskühlung hergestellt wurde. Nach 3-stündigem Rühren unter Stickstoff-Schutz zeigte das Phosphatidgenösch keine Reaktion mehr auf Ninhydrin-Reagenz. Durch Zugabe von Chloroform bilden sich zwei Schichten, wovon die untere abgetrennt und mit Wasser nachgewaschen wird. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum unter Stickstoff-Schutz resultieren 470 g eines Glycolphosphatid enthaltenden Gemisches.

PATENTANSPRÜCHE

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Claims

Patentansprüche

1. / G-lycolphosphatide der allgemeinen Formel

H₀C - O - R

¹ 2
HC-O-R

H₀C- O - P - O - CH₉ CHOH

² /V ²I O OH X

1 2

worin R und R Fettsäurereste mit 10-24 C-Atomen, vorzugsweise ungesättigte oder mehrfach ungesättigte Fettsäurereste darstellen und X ein Wasserstoffatom oder die -COOH-Gruppe ist.

2. Verfahren, zur Herstellung der Glycolphösphatide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man zu einer Lösung von Phosphatidylcolamin. und/oder Phosphatldylserin. in. einem organischen. Lösungsmittel salpetrige Säure hinzufügt und die durch Diazotierung und Hydrolyse desaminierten Phosphatidverbindungen in. an sich bekannter Weise isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g e k e η η ζ e i 6 h η e t , dass man die Lösung des Phosphatidylcolamins und/oder Phosphatidylserins mit einer wässrigen

10':

Lösung eines Salzes der salpetrigen Säure und eines sauren Salzes einer anorganischen bzw. organischen Säure versetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3ι dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel einen Alkohol oder chlorierten Kohlenwasserstoff mit 1-4 C-Atomen oder ein Kohlenwasserstofflösungsmittel oder eine Mischung dieser Lösungsmittel verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Chloroform verwendet und eine wässrige Lösung von Hatriumnitrit und Uatriumdihydrogenphosphat bei Zimmertemperatur oder leicht erhöhten Temperaturen unter Rühren hinzufügt.

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