CH666812A5

CH666812A5 - Composition pharmaceutique contenant de l'inositol triphosphate.

Info

Publication number: CH666812A5
Application number: CH4536/85A
Authority: CH
Inventors: Matti Siren
Original assignee: Matti Siren
Priority date: 1984-10-23
Filing date: 1985-10-22
Publication date: 1988-08-31
Also published as: AU4893085A; FI85490B; SE465951B; GB2167283A; JPS61171422A; IT1190403B; FR2573080B1; US4797390A; SE8504968L; US4851560A; NO168227B; DE3577851D1; FI854128L; NO854211L; SE8503164D0; AU4893285A; FR2573080A1; DE3537550A1; DK172852B1; FI82474B

Description

DESCRIPTION

60 La présente invention se rapporte à ime composition pharmaceutique contenant au moins un isomère de l'inositol triphosphate (IP3) utilisé pour le traitement des états provoqués par la présence de cadmium ou d'aluminium ou de radicaux libres dans le corps humain.

65 Des procédés de fabrication de HP3 et des isomères sont décrits dans le brevet espagnol N° 548.111.

Dès 1900, divers chercheurs ont fourni des rapports indiquant la découverte, dans des plantes, d'un composé organique phosphaté,

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l'acide phytique, c'est-à-dire le 1,2,3,4,5,6-hexakis(dihydrogénophos-phate)myo-inositol (appelé parfois acide inositol-hexaphosphori-que). La teneur de l'acide phytique varie considérablement dans les différentes plantes. La teneur dans le blé est habituellement d'environ 0,5 à 2%, avec certaines exceptions. Le riz glacé ne renferme que 0,1% d'acide phytique, alors que le riz sauvage en renferme 2,2%. Les fèves en contiennent environ 0,4 à 2%, les plantes oléagineuses environ 2 à 5% et le pollen 0,3 à 2%. La teneur en acide phytique dans les plantes varie durant la période de croissance. La teneur est également influencée, entre autres facteurs, par le climat.

Il existe dans la littérature des rapports sur la présence de l'inositol pentaphosphate (IP5) et de l'inositol tétraphosphate (ip4) dans un petit nombre de plantes. Il est connu par ailleurs que des dérivés phosphatés inférieurs à IP6 se forment lors de la germination du blé. Par exemple, les produits finals, à la germination, sont l'inositol et le phosphate. L'utilisation de l'IP6 a été décrite dans plusieurs publications scientifiques. La plupart des auteurs de ces articles ont observé plusieurs effets négatifs sur les êtres humains et les animaux lors de la consommation de l'IP6 ou de substances contenant de l'IPfi. Des chiens nourris avec des aliments à teneur trop élevée en IP6 souffriront par exemple de rachitisme. Chez l'être humain, une carence en zinc et, en conséquence, un ralentissement de la croissance des enfants, ont été observés. L'anémie a été observée principalement chez les femmes. En raison des effets négatifs qui viennent d'être mentionnés, se manifestant sur l'équilibre minéral chez l'être humain et les animaux, diverses tentatives ont été entreprises en vue de réduire l'apport d'IPs et de ses dérivés à un minimum.

On relève dans C.A. Vol. 33 (1939), Abstr. N° 7351, N° 3/4, un rapport mentionnant l'emploi de phosphates comprenant des phosphates d'inositol à titre d'alimentation antirachitique. Aucune référence n'est faite à des phosphates d'inositol spécifiques et rien n'est dit en ce qui concerne les propriétés complexantes de métaux.

Le brevet des Etats-Unis N° 4,473,563 décrit le traitement extracorporel des érythrocytes en vue de l'incorporation de phosphates d'inositol pour améliorer l'alimentation en oxygène. Les érythrocytes sont alors séparés du sang soutiré qui a été prélevé à cet effet par pompage dans le corps humain. Après un traitement compliqué des érythrocytes, ces derniers sont réintroduits dans le sang. Aucune description n'est faite en ce qui concerne l'administration des phosphates d'inositol directement au corps humain. Par ailleurs, rien n'est dit en ce qui concerne la réduction de l'effet négatif du cadmium dans le corps ou l'inhibition de la formation de radicaux libres dans le corps par un phosphate d'inositol spécialement choisi.

Le brevet des Etats-Unis N° 2,723,938 décrit l'utilisation de phosphates d'inositol pour la stabilisation de dispersions de suspension aqueuse de pénicilline. Il est assuré qu'une simple et brève agitation manuelle rétablit un état de dispersion complète et uniforme de la pénicilline après conservation prolongée.

On a trouvé que le cadmium était nuisible à la santé humaine. Bien que ce métal soit généralement présent à de faibles teneurs dans notre environnement, les quantités de cadmium auxquelles nous sommes exposés sont fonction de plusieurs facteurs. L'existence du cadmium, ainsi que sa présence éventuelle dans le sol, varient selon différentes zones, avec un apport relativement élevé dans la croissance des plantes dans des zones à pH relativement faible. Lors d'activités industrielles, principalement lors de la manipulation de • métaux, il peut y avoir libération de cadmium dans l'air, le sol et l'eau. Le cadmium dans le sol est absorbé par les plantes et peut donc parvenir, par ce moyen, dans la nourriture des êtres humains et des animaux. L'exposition au cadmium a lieu le plus souvent par la fumée de tabac, les aliments et, dans une certaine mesure, par l'eau potable.

Le cadmium est principalement absorbé dans l'intestin et dans les poumons, bien qu'une faible partie seulement du cadmium dans la nourriture soit absorbée. La quantité absorbée moyenne de cadmium par l'intermédiaire des aliments est estimée approximativement à 50 |xg par jour dans la plupart des pays, la variation étant toutefois importante suivant les différentes zones géographiques et suivant les individus. Des données résultant d'observations faites chez les fumeurs montrent que 50% du cadmium inhalé peuvent être absorbés. Plusieurs recherches ont mis en évidence des teneurs en cadmium deux fois plus grandes dans le sang et les organes chez les 5 fumeurs, comparativement aux non-fumeurs. L'excrétion du cadmium à partir du corps humain est lente; on indique à ce sujet des périodes de demi-vie de 10 à 30 ans. Cela signifie que le cadmium s'accumule dans le corps humain. La majeure partie, 80 à 90% du cadmium accumulé, est liée à une protéine, une métallothionéine, 10 notamment dans le foie et les reins. La formation de métallothionéine est occasionnée par des métaux, notamment le zinc et le cadmium. La liaison du cadmium à la métallothionéine est très forte et permet d'obtenir une désintoxication du cadmium. Le cadmium' restant demeure dans le corps humain, c'est-à-dire que le cadmium 15 qui n'est pas lié aux métallothionéines se trouve réparti parmi les autres organes du corps à des teneurs relativement importantes dans l'intestin, les poumons (principalement des fumeurs), le système circulaire (cœur, parois artérielles, rate) et des glandes telles que le pancréas et la prostate.

20 Parmi les effets négatifs, il est connu que le cadmium peut affecter le système élastine/élastase du corps humain. Il est également connu que le cadmium peut affecter différentes enzymes dans le corps humain, par exemple des enzymes Na+, K+ (Mg2+)-ATP-ase et Ca2+, Mg2+-ATP-ase, lesquelles sont importantes dans les systè-25 mes de transfert d'ions. D'autres exemples sont les enzymes cyto-chrome-P450 qui hydrolysent les stéroïdes, les acides gras, les composés aromatiques et les composés toxiques. D'autres enzymes importantes qui sont inhibées par le cadmium sont la glütathion-peroxydase et la superoxyde-dismutase, lesquelles exercent une pro-30 tection contre les effets de la peroxydation. Des enzymes tributaires du zinc, telles que la leucine-aminopeptidase, sont également inhi-■bées par le cadmium.

Les résultats émanant d'un grand nombre d'essais effectués sur des animaux pendant de nombreuses années font apparaître les 35 effets négatifs, même à de très faibles concentrations en cadmium. Cela signifierait qu'une grande proportion de la population subirait de tels effets négatifs, ce qui est valable avant tout pour les fumeurs. Des recherches entreprises dans le domaine de l'épidémiologie montrent qu'il existe une relation entre la présence de cancer, d'hyperten-40 sion et de maladies cardio-vasculaires (par exemple artériosclérose, infarctus, mort soudaine par arrêt cardiaque) et la présence de cadmium dans l'environnement. L'exposition au cadmium semble être également un facteur d'accroissement du risque de diabètes dus à l'âge.

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D'autres recherches montrent que le cadmium peut avoir des effets négatifs sur les reins, les poumons (fibrose, emphysème,

cancer), les parois des vaisseaux sanguins (dépôt de graisses, artériosclérose, élasticité et contraction des parois des vaisseaux,

maladie de Pendothélium), la production de prostacycline, la prostate, le cœur (système de conduction, force de contraction), le placenta, les testicules et le système nerveux central. Le cadmium peut également provoquer la formation de radicaux libres et causer ainsi une peroxydation lipidique, qui peut être importante dans l'origine d'autres maladies, telles que le rhumatisme. Les allergies et les bronchites peuvent être également liées à une exposition au cadmium. L'état des connaissances relatives à l'influence négative du cadmium sur les êtres humains et les animaux s'est considérablement développé au cours de ces dernières décennies.

60 En dépit d'un effort intensif de recherches poursuivies pendant de nombreuses années en vue de supprimer les effets négatifs mentionnés du cadmium et/ou de supprimer ou d'alléger les inconvénients précités occasionnés par le cadmium qui, dans bien des cas, conduisent à de très sérieuses maladies, aucun remède satisfaisant, 65 sans effets secondaires, n'a jusqu'à présent été trouvé.

L'aluminium a récemment été reconnu comme dangereux pour la santé. Lors de dialyses sur des patients, on a constaté que l'aluminium était la cause de démence et d'ostéomalacie.

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L'aluminium est soupçonné comme étant la cause de nombreuses anomalies, telles que la maladie d'Alzheimer chez les êtres humains. Des recherches ont également montré que l'aluminium pouvait provoquer plusieurs maladies chez les animaux. L'aluminium peut également accroître la peroxydation lipidique dans les membranes biologiques, vraisemblablement par déstabilisation de la structure des membranes. Comme pour le cadmium, aucun remède donnant satisfaction pour les maladies en rapport avec l'aluminium, sans production d'effets secondaires, n'a jusqu'à présent été trouvé.

Conformément à la présente invention, on a trouvé de façon tout à fait inattendue qu'il était possible d'apporter une solution aux effets négatifs précités du cadmium, de l'aluminium et des radicaux libres sur les êtres humains et les animaux et, par conséquent, de prévenir ou de soulager les maladies en rapport avec ces effets. On a ainsi trouvé une composition pharmaceutique contenant, comme constituant pharmaceutiquement actif, au moins un isomère de l'inositol triphosphate (IP3), de préférence sous forme de sel. La composition selon l'invention est destinée principalement à prévenir ou à alléger les états créés, provoqués ou favorisés par l'absorption de cadmium et d'aluminium et à prévenir ou à soulager les maladies en rapport avec le cadmium et l'aluminium. En outre, la composition est destinée à prévenir ou à soulager les maladies liées à la présence de radicaux libres dans le corps humain.

Comme exemples de maladies que la composition selon l'invention est en mesure de prévenir ou de soulager, on mentionne les maladies des différentes parties de l'œil, telles que tissu rétinien et cristallin, ainsi que bronchites, arthrite, changement de prolifération des cellules, cancer, hypertension, maladies cardio-vasculaires, diabètes dus à l'âge, altérations des membranes cellulaires, du placenta, du système nerveux central, des testicules, de la prostate ou du système conducteur du cœur, emphysème, fibrose du poumon, migraines, troubles menstruels, altérations de l'endothélium, troubles rénaux, sclérose multiple, maladies auto-immunes, allergies, thromboses, accroissement de l'agrégation des plaquettes sanguines ou inhibition de la production de prostacycline. On n'entend formuler aucune prétention selon laquelle la composition selon la présente invention prévient ou soulage toutes les formes d'états précités, mais elle prévient ou soulage les formes des états précités qui sont causés ou aggravés par la présence de cadmium, d'aluminium ou de radicaux libres dans le corps humain.

Pour la production de l'isomère, ou des isomères, d'IP3 permettant d'obtenir les buts précités, présent(s) dans la composition selon l'invention, un ou plusieurs des composés IP6, IP5, ou IP4, ou un produit naturel contenant au moins l'un de ces composés, peuvent être utilisés comme produit de départ. Dans le cas où le produit de départ est un produit naturel, on choisira de préférence un produit ayant une teneur d'au moins 0,3%, de préférence d'au moins 1% de phosphate d'inositol (IP6 + IPS + IP4). Des produits particulièrement appropriés sont les grains, le son, le pollen et les semences des plantes oléagineuses.

La composition conforme à la présente invention renfermera de préférence au moins 10%, de préférence au moins 20% ou mieux au moins 40%, d'IP3 par rapport à la teneur en inositol du produit de départ. Plus la teneur en IP3 est élevée, dans la mesure du possible, dans la composition, plus IP3 aura le meilleur effet thérapeutique, conformément aux essais spécifiés ultérieurement. Les isomères d'IP3, présents dans la composition conforme à l'invention, peuvent être produits par exemple par décomposition enzymatique à partir de la forme IP4, IP5 et/ou IP6.

On aura recours de préférence à un procédé où les phosphates d'inositol supérieurs précités IP6, IP5 et/ou IP4 sont décomposés en-zymatiquement en IP3, par exemple par l'enzyme phytase. L'enzyme phytase est habituellement présente dans toutes les plantes et les graines contenant du phosphate d'inositol. C'est la raison pour laquelle il n'est habituellement pas nécessaire d'ajouter l'enzyme si un produit naturel est utilisé comme produit de départ. Dans le cas où le produit naturel a une activité enzymatique trop faible, ou lorsque IP6, IP; ou IP4 ou un mélange de ces composés est utilisé comme produit de départ, une enzyme phytase provenant par exemple du son est ajoutée.

Un mode approprié de traitement du produit de départ naturel ou brut consiste à le soumettre à un prétraitement, par exemple par 5 fragmentation ou enlèvement de la membrane extérieure et élimination des constituants indésirables. Ainsi, lorsqu'on utilise du pollen, les allergènes doivent être éliminés. Le produit est ensuite imprégné d'eau afin de rendre le phosphate d'inositol utilisable pour le fractionnement et d'activer l'enzyme. Dans le cas où une quantité sup-io plémentaire d'enzymes est nécessaire, cette quantité est ajoutée à ce stade. On laisse ensuite l'enzyme agir aussi longtemps que nécessaire pour atteindre le degré d'hydrolyse recherché.

L'hydrolyse s'effectue à une température appropriée, habituellement de 20 à 70° C, de préférence de 30 à 60° C, et à un pH optimum 15 pour la phytase présente. Pour arrêter l'hydrolyse au stade désiré, l'enzyme peut être détruite ou inactivée, par exemple en chauffant rapidement le produit de départ hydrolysé. Cela permet également de s'assurer qu'une hydrolyse incontrôlée et indésirable d'IP3 ne se poursuit pas dans l'estomac lorsque la composition est administrée. 20 En vue d'amener le produit sous une forme qui soit stable au stockage, il pourra être lyophilisé de façon appropriée. De la levure peut être utilisée avantageusement comme source de phytase. On utilise de préférence de la levure de boulanger. Lorsqu'on utilise de la levure, on obtient essentiellement un seul isomère de l'IP3, à 25 savoir le D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate.

Le procédé précité, partiellement applicable avec des variantes éventuelles, peut être également mis en œuvre lorsqu'un ou plusieurs des composés IP6, IP5 ou IP4 en eux-mêmes sont utilisés comme produit de départ.

La composition pharmaceutique selon l'invention comprend, comme constituant pharmaceutiquement actif, au moins un isomère de l'inositol triphosphate (IP3) en une quantité suffisante pour réduire l'effet négatif du cadmium ou de l'aluminium dans le corps 3J humain ou inhiber ou réduire la formation de radicaux libres dans le corps humain.

Il convient que la composition selon l'invention se présente sous forme de dosage unitaire. Les comprimés, granulés ou capsules sont des formes appropriées pour l'administration d'un tel dosage uni-40 taire. En outre, les comprimés et granulats peuvent être facilement traités en surface, de manière à obtenir un enrobage entérique destiné à empêcher une hydrolyse incontrôlée et à produire l'absorption désirée dans l'intestin. D'autres formes d'administration appropriées sont l'administration avec libération lente et l'administration 45 transdermique. Un adjuvant, un excipient et/ou un véhicule de type courant, pharmaceutiquement acceptable, peut être inclus dans la composition. Les comprimés ou granulats peuvent également contenir un agent de désagrégation permettant à ces comprimés ou granulats de se désagréger facilement dans l'intestin. Dans certains cas, 50 spécialement dans des situations aiguës, il est préférable d'utiliser le dosage unitaire sous la forme d'une solution pour administration intraveineuse.

La composition pharmaceutique peut également être constituée comme telle, uniquement avec de l'IP3, sans aucun adjuvant, exci-55 pient ni véhicule.

Si on le désire, la composition peut être exempte d'autres phosphates d'inositol IPj, IP2, IP4, IP5 et IP6. En conséquence, le mélange d'isomères IP3 peut avoir une pureté de 90 à 100%, par exemple de 93 à 100% ou, de préférence, de 95 à 100%.

60 Selon une variante, la composition pharmaceutique peut comprendre un ou plusieurs isomères IP3 spécifiques, décrits ci-après, chacun d'eux étant présent sous une forme sensiblement pure. Les différents isomères peuvent être ainsi isolés les uns des autres sous une forme sensiblement pure, ce qui signifie qu'ils ont une pureté de 65 80 à 100%, par exemple de 82 à 100% ou de 85 à 100%, de préférence de 90 à 100%. Du fait que les isomères peuvent être produits sous une forme pure, ils peuvent bien entendu être mélangés en toutes proportions.

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La production d'IP3 et l'isolement de ses différents isomères sont décrits dans le brevet espagnol N° 548.111.

Il convient dans la plupart des cas que l'isomère ou les isomères IP3 soient présents dans la composition selon l'invention, sous forme de sel, afin de ne pas affecter l'équilibre minéral. Le sel comprendra de préférence un sel de sodium, de calcium, de zinc, de cuivre ou de magnésium ou un mélange de deux ou plusieurs de ces sels. Les sels de calcium et les sels de zinc, ou leurs mélanges, sont particulièrement préférés du fait que les ions calcium et zinc peuvent entrer en compétition avec des ions cadmium au niveau de la liaison à des sites vitaux dans le corps humain. De cette manière, la résorption et les effets négatifs du cadmium dans le corps humain sont encore réduits et l'on obtient un effet préventif et thérapeutique sur les maladies précitées. L'isomère IP3 peut également être partiellement présent sous forme de sel d'un ou de plusieurs composés physiologi-quement acceptables de la série des lanthanides à savoir La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb et Lu.

Pour les raisons précitées, il est également avantageux que la composition contienne un excès ou une addition supplémentaire d'au moins un sel pharmaceutiquement acceptable de calcium, de zinc, de magnésium ou de cuivre avec un acide minéral ou organique. Cela est particulièrement valable pour des personnes âgées, souvent déficientes en ces matières minérales.

La composition selon l'invention peut, de préférence, également contenir au moins une substance contenant du sélénium, un acide gras insaturé, tel que l'acide gamma linoléique, la vitamine E, la vitamine C ou un acide organique pharmaceutiquement acceptable ou un sel de cet acide, tel que citrate, Oxalate, malonate et tartrate. Ces substances contribuent également à contrecarrer l'effet négatif du cadmium dans le corps humain et/ou à conférer en outre, dans certains cas, un effet désirable, conjointement avec l'isomère IP3 dans la composition. La teneur en sélénium dans la composition est de préférence telle que l'absorption quotidienne soit d'environ de 0,7 à 0,8 ng/kg de poids du corps, de préférence de 0,7 à 3,3 jxg. Pour la vitamine E, les valeurs correspondantes sont d'environ, respectivement, 0,1 à 2 mg et 0,1 à 1 mg.

D'une manière appropriée, la composition est exempte de pénicilline.

Pour l'administration à des patients humains souffrant d'un état causé ou aggravé par la présence de cadmium, d'aluminium ou de radicaux libres dans le corps humain, des dosages appropriés peuvent couramment être déterminés par l'expert en la matière, par extension des résultats obtenus chez l'animal à divers dosages. Le dosage préféré pour l'être humain se dilue dans une plage comprise entre 0,1 et 10 mg d'IP3/jour/kg de poids de corps humain.

Lors d'essais sur les animaux aucun effet toxique n'a été observé après administration de doses très élevées d'IP3, à savoir 160 mg/kg de poids vif par injection intraveineuse chez la souris ou 1600 mg/kg de poids vif par injection intrapéritonéale chez la souris.

La composition selon l'invention contient au moins une substance et parfois deux ou plusieurs des substances suivantes, qui correspondent à l'isomère principal IP3 ou à des isomères mentionnés précédemment:

D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate ayant la formule:

n-Xz dans laquelle X est un hydrogène, au moins un cation monovalent, divalent ou polyvalent, ou un mélange de ces derniers, n est le nombre d'ions et z est la charge de l'ion respectif;

D-myo-inositol-l,2,5-triphosphate ayant la formule:

0P0

n • Xz où X, n et z ont la signification précitée; myo-inositol-l,2,3-triphos-phate ayant la formule:

n-X2

où X, n et z ont la signification précitée; L-moy-inositol-1,3,4-20 triphosphate ayant la formule:

n-Xz'

où X, n et z ont la signification précitée et D-myo-inositol-1,4,5-30 triphosphate ayant la formule:

n-Xz'

où X, n et z ont la signification précitée.

40 Dans chacune des formules précitées, n est compris entre 6 et 1 inclus et z est compris entre 1 et 6 inclus. De préférence, n est compris entre 3 et 6 inclus et z est égal à 3, 2 ou 1. Parmi les isomères précités, le D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate est préféré.

IP3 peut être le seul constituant pharmaceutiquement actif dans 45 la composition. Toutefois, d'autres constituants pharmaceutiquement actifs peuvent être également présents. La quantité d'IP3 représentera alors 5 à 95 ou 15 à 80, par exemple 25 à 60, % en poids desdits constituants actifs.

De plus, la composition peut être une unité polyvitaminée conteso nant 2 à 60, par exemple 2 à 40 ou, de préférence, 2 à 25% en poids d'IP3, par rapport au poids total de constituants pharmaceutiquement actifs.

La composition contient habituellement 0,01 à 1,5 g, par exemple 0,05 à 1,3 g ou, de préférence, 0,01 à 1 g d'IP3. 55 On décrit maintenant la méthode permettant de réduire les effets négatifs de l'ion cadmium ou aluminium ou des radicaux libres dans les tissus du corps humain. Cette méthode consiste à administrer à une personne ou à un animal, c'est-à-dire à des mammifères, une quantité d'inositol triphosphate destinée à interférer avec l'ion 6o cadmium ou aluminium ou à inhiber, ou à réduire, la formation de radicaux libres dans le corps humain.

La méthode est destinée à prévenir ou à soulager l'un des états suivants: arthrite, bronchite, changement de prolifération des cellules, cancer, hypertension, maladies cardio-vasculaires, diabètes dus à 65 l'âge, altérations du placenta, des testicules, des différentes parties de l'œil, telles que tissu rétinien et cristallin, altérations de la prostate, des membranes cellulaires, du système nerveux central, du système conducteur du cœur, emphysème, fibrose du poumon, migraines,

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troubles menstruels, altérations de l'endothélium, troubles rénaux, allergies, thromboses, sclérose multiple, accroissement de l'agrégation des plaquettes sanguines ou inhibition de la production de pros-tacycline, ledit état étant attribuable à — ou provoqué ou aggravé par — la présence de cadmium ou de radicaux libres dans le corps humain.

La méthode consiste à administrer à un être humain ou à un animal une quantité d'inositol triphosphate suffisante pour obtenir ladite prévention ou ledit soulagement.

On décrit une méthode permettant d'atténuer les effets nuisibles des rayonnements dans le corps humain, cette méthode consistant à administrer à un être humain ou à un animal une quantité d'inositol triphosphate suffisante pour atténuer lesdits effets des rayonnements. Les rayonnements peuvent être par exemple des rayons X ou des radiations nucléaires, d'autres types de rayonnements étant toutefois également envisagés.

L'invention sera maintenant décrite plus en détail en référence aux exemples qui suivent, parmi lesquels l'exemple 1 illustre le cas de l'agrégation des plaquettes dans des échantillons de sang, chez le lapin, après injection par du cadmium. Les exemples 2 à 5 montrent qu'une telle agrégation peut être contrecarrée par injection ou administration orale d'IP3. L'exemple 6 illustre le cas de la présence du cadmium dans différents organes de la souris après injection par du cadmium. L'exemple 7 illustre l'effet, respectivement d'IP2, IP3 et IP4, sur la teneur en cadmium dans différents organes de la souris ayant reçu une injection de cadmium. Comme décrit dans l'exemple 8, le D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate provoque une forte diminution de la concentration en cadmium dans les poumons, l'artère aorte, le cœur et la rate d'une souris ayant reçu une injection de cadmium. L'exemple 9 montre que l'IP3 empêche un accroissement de l'agrégation des plaquettes sanguines, provoqué par la fumée de tabac, chez des êtres humains. Dans l'exemple 10, on montre qu'une teneur accrue en glucose dans le sang, chez la souris, provoquée par des radicaux libres, peut être contrecarrée par injection d'IP3. Les exemples 11 à 15 montrent que l'IP3 empêche ou réduit la formation de radicaux libres. Les exemples 16 et 17 illustrent des essais sur des constantes de liaison pour le zinc et le cadmium, respectivement à IP<5 et à IP3. Les exemples 18 à 24 illustrent la production d'IP3 et sa séparation dans différents isomères. L'exemple 25 illustre la production d'une solution d'un sel de calcium de D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate pour l'injection. Dans l'exemple 26, on décrit la production de comprimés de sel de calcium de D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate.

Méthode pour les exemples 1 à 5

On utilise des lapins (blancs, de Nouvelle-Zélande, mâles) pesant de 2 à 2,5 kg. Ceux-ci reçoivent une nourriture exempte de phosphates d'inositol pendant 10 jours avant l'essai.

Mode opératoire pour les essais sur les animaux

Dans les exemples 1 à 3 (injection intraveineuse de substances d'essai), on applique le mode opératoire ci-après:

Temps Traitement

0 minute: injection intraveineuse de phosphate d'inositol dans 1 ml de solution physiologique ou 1 ml de solution physiologique, respectivement;

1 minute: prélèvement d'un échantillon de sang 1 (9 ml + 1 ml de citrate de sodium à 3,8%);

2 minutes: injection intraveineuse de 4 microgrammes de Cd sous forme de CdCl2 dans 0,5 ml de solution physiologique ou 0,5 ml de solution physiologique, respectivement; 5 minutes: prélèvement d'un échantillon de sang 2 (9 ml + 1 ml de citrate de sodium à 3,8%).

Dans les exemples 4 et 5 (administration orale de substances d'essai), on applique le même mode opératoire, excepté que la première injection est remplacée par une administration orale, respectivement des phosphates d'inositol ou de solution physiologique. Les volumes d'injection sont les mêmes que précédemment. Le dosage oral est effectué 1 heure avant l'échantillon de sang 1. L'échantillonnage du sang et la seconde injection intraveineuse sont effectués comme précédemment. Les lapins ne sont pas anesthésiés durant les essais.

Traitement des échantillons

Les deux échantillons de sang provenant de chaque animal sont centrifugés à 1200 tr/min, pendant 10 minutes; on obtient ainsi le plasma avec les plaquettes sanguines.

Le plasma avec les plaquettes, provenant des deux échantillons, est analysé relativement à la réponse à une addition d'ADP (adéno-sine diphosphate) dans un agrégomètre (Chronopar Corp. Mod. 440) selon Born (J. Physiol. : 67,1968). Les deux échantillons sont analysés simultanément à la même concentration (1 à 20 micromolaire) d'ADP dans les deux canaux de l'appareil.

Le principe de cet essai est fondé sur le fait que le plasma chargé de plaquettes est trouble et présente une faible transmission à la lumière. Lorsqu'on ajoute de l'ADP, les plaquettes s'agglomèrent et forment des blocs. Il en résulte un accroissement de la transmission, lequel est quantifié par l'appareil. La réponse à l'ADP est mesurée en unités d'échelle, 80 unités représentant une agrégation maximale. Afin d'obtenir une sensibilité maximale de la méthode, pour relever les changements de réactivité des plaquettes, la dose d'ADP devra entraîner une réponse de 5 à 30 unités. Cela est habituellement obtenu avec 5 jiM d'ADP mais, chez certains animaux, une dose plus faible ou plus élevée (1 à 20 |iM) est nécessaire.

Le résultat de l'essai est exprimé en agrégation maximale dans l'échantillon 2 (unités d'échelle), moins l'agrégation maximale dans l'échantillon 1. Dans l'exemple 1, les valeurs moyennes de l'agrégation dans les deux échantillons sont également données.

On a constaté qu'il se produisait une augmentation de l'agrégation des plaquettes après avoir fumé et dans les maladies cardio-vasculaires et l'on estime que des agents supprimant l'agrégation des plaquettes présentent de l'intérêt dans le traitement, par exemple des maladies cardio-vasculaires.

Exemple 1:

Les méthodes sont telles que précédemment décrites. L'injection 1 est toujours une solution physiologique et l'injection 2 est une solution physiologique (13 animaux) ou de Cd (14 animaux).

Les résultats sont indiqués ci-après:

Agrégation Echantillon 1 (unités d'échelle)

Agrégation Echantillon 2 (unités d'échelle)

Variation de l'échantillon 1 à l'échantillon 2 (unités d'échelle)

Traitement par une solution saline

18,2

17,1

-u

Traitement au Cd

21,4

24,8

+ 3,4

Un traitement au Cd provoque donc un accroissement de l'agrégation des plaquettes, bien qu'un légère diminution soit observée chez les animaux traités par une solution saline physiologique.

Exemple 2:

Les méthodes sont telles que précédemment décrites. Les lapins sont traités par injection intraveineuse de 2 x 10-6 mol d'inositol diphosphate (IP2), d'inositol triphosphate (IP3) ou d'inositol tétra-phosphate (IP4) dissous dans une solution physiologique. Le phosphate d'inositol IP2, IP3 ou IP4 est composé respectivement de mé-

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60

65

7

666 812

langes des isomères qui se forment lorsque IP6 est hydrolyse par la phytase de blé.

On obtient les résultats indiqués ci-après. Les lapins traités au Cd, de l'exemple 1, sont inclus à titre de comparaison.

Injection 1

Injection 2

Nombre d'animaux

Modification de l'agrégation des plaquettes,

de l'échantillon 1 à l'échantillon 2 (unités d'échelle)

IP2

Cd

9

+ 1,9

IP3

Cd

8

- 0,2

IP4

Cd

9

+ 5,6

Solution saline

Cd

14

+ 3,4

Les résultats montrent que IP3 empêche l'effet d'agrégation dû au cadmium. IP2 exerce un effet faiblement préventif, cependant que les animaux traités par l'IP4 présentent davantage d'agrégation.

Exemple 3:

Les méthodes sont telles que précédemment décrites. Quatre isomères différents d'IP3 sont testés; la quantité injectée est 2 x 10~7 mol. Les isomères sont le D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate (1.2.6), le L-myo-mositol-l,3,4-triphosphate (1.3.4), le myo-inositol-1,2,3-triphosphate (1.2.3) et le D-myo-inositol-l,2,5-triphosphate (1.2.5).

Les résultats sont les suivants (les animaux traités au Cd de l'exemple 1 sont inclus à titre de comparaison):

Injection 1

Injection 2

N°

Modification de l'agrégation des plaquettes, de l'échantillon 1 à l'échantillon 2 (unités d'échelle)

1.2.6

Cd

15

-0,4

1.2.3

Cd

12

+ 0,3

1.3.4

Cd

13

+ 0,6

1.2.5

Cd

14

+ 1,7

Solution saline

Cd

14

+ 3,4

Les résultats montrent que tous les isomères testés présentent un effet satisfaisant pour empêcher l'agrégation provoquée par le cadmium et que le meilleur effet est obtenu avec 1.2.6.

Exemple 4:

Les méthodes sont telles que précédemment décrites. L'IP3 (D-myoinositol-l,2,6-triphosphate), à une dose de 2 x 10~6 mol en solution saline physiologique, ou uniquement une solution saline physiologique, est administré oralement.

Les résultats sont les suivants:

Administration orale

Injection

N°

Solution saline

Cd

23

+ 1,9

IP3

Cd

20

+ 1,1

Comme dans l'exemple 1, le Cd provoque un accroissement de l'agrégation des plaquettes. A cette dose, IP3, administré oralement, empêche partiellement cet accroissement.

Exemple 5:

Les méthodes sont telles que précédemment décrites. L'IP3 (D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate), à une dose de 2 x 10-5 mol, est administré oralement. Les animaux traités par une solution saline physiologique et les animaux traités au Cd, de l'exemple 4, sont inclus à titre de comparaison.

On obtient les résultats suivants:

Administration orale

Injection

N°

Modification de l'agrégation-des plaquettes, de l'échantillon 1 à l'échantillon 2

Solution saline

Cd

23

+ 1,9

IP3

Cd

15

- 0,4

A la dose utilisée dans cet essai, IP3 empêche l'effet du Cd sur l'agrégation des plaquettes.

Un accroissement de l'agrégation des plaquettes est considéré comme l'un des plus importants facteurs provoquant l'artériosclérose et l'aptitude de l'IP3 à empêcher l'agrégation provoquée par le cadmium (exemples 2 à 5) et par le fumage du tabac (exemple 9) montre que l'IP3 est d'un grand intérêt pour la prévention ou le soulagement de telles maladies.

Exemple 6:

14 souris sont maintenues à un régime exempt d'acide phytique et de phosphates d'inositol pendant une semaine avant l'essai et pendant la durée de l'essai. On pratique sur les souris une injection intraveineuse avec 2,5 microcuries de 109Cd, sous forme de CdCl2, dissous dans 50 microlitres de solution saline physiologique. 7 jours après l'injection, les souris furent tuées et plusieurs organes furent disséqués et pesés. La teneur en cadmium radioactif dans les organes est déterminée par comptage au compteur gamma. Les résultats sont les suivants:

Organe Comptage/minute/mg de tissu

Foie 542,3

Reins 356,3

Cœur 53,5

Paroi aortique . 29,4

Poumons 31,5

Muscle 7,3

Tissus gras 1,8

Comparativement aux tissus généraux du corps, tels que les muscles et les tissus gras, on a trouvé, chez les animaux soumis à l'essai, des quantités importantes de Cd accumulées dans les organes (cœur, paroi aortique, poumons), où l'on a observé des maladies provoquées par le Cd.

La haute teneur en Cd dans le foie et les reins s'explique par le fait que ces tissus contiennent de la métallothionéine qui s'associe au cadmium et le rend moins toxique. De ce fait, bien que ces organes fixent la majeure partie du Cd, aucun dommage ne se produit jusqu'à ce que de très hautes teneurs soient atteintes.

Exemple 7:

Des souris pesant de 18 à 20 grammes sont utilisées au début de l'essai. Durant l'essai et pendant au moins 7 jours avant l'essai, les souris reçurent une alimentation semi-synthétique exempte de phosphates d'inositol. Les souris furent divisées en quatre groupes.

On leur administra quotidiennement, par voie intrapéritonéale, des injections d'une solution physiologique, d'inositol diphosphate (IP2), d'inositol triphosphate (IP3) ou d'inositol tétraphosphate (IP4), pendant 9 jours. La dose de phosphates d'inositol est de 10-8 mol/jour. Le volume injecté est de 0,2 ml. IP2, IP3 et IP4 sont

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

666 812

8

des mélanges d'isomères qui se forment lorsque l'acide phytique est dégradé par la phytase du blé.

Au deuxième jour de l'essai, 5 à 10 minutes après la seconde injection intrapéritonéale, toutes les souris reçurent une injection intraveineuse de 2,5 microcuries de 109Cd, sous forme de chlorure de cadmium, dans 50 (il de solution saline. Après la dernière injection intrapéritonéale, les souris furent tuées et plusieurs organes furent disséqués et pesés.

La radioactivité dans les différents organes a été mesurée par comptage au compteur gamma. La radioactivité dans les organes des animaux traités à l'IP3 a été comparée à celle d'animaux témoins traités par une solution saline pendant la même période de temps. Dans les résultats, la radioactivité dans les organes des animaux traités par les différents phosphates d'inositol est exprimée en % de la radioactivité trouvée chez les témoins. Les résultats sont indiqués ci-après :

Teneurs en cadmium dans les organes des souris traitées par IP2, IP3, IP4 en % des teneurs témoins (témoins = 100) — 15 souris dans chaque groupe

Organe

IP2

ip3

IP4

Poumons

111

80

113

Cœur

99

77

89

Aorte

95

89

81

Rate

151

81

132

Glande salivaire

104

82

89

Foie

100

101

Reins

101

102

94

30

Les résultats montrent que IP3 provoque une réduction des teneurs en cadmium dans tous les organes étudiés, à l'exception du foie et des reins. Avec l'IP4, on a observé une réduction dans certains organes, mais non dans tous, cependant qu'aucun effet positif n'a été observé avec IP2.

Exemple 8:

On répète l'essai de l'exemple 7, mais en utilisant l'isomère pur D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate. La dose est de 10-6 mol par jour et les souris ont reçu 4 injections par jour. On a adminitré à un groupe témoin des injections de solution physiologique. Les résultats sont indiqués ci-après:

Teneurs en cadmium dans les organes des souris traitées par le D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate,

exprimées en % des valeurs témoins

Organe Teneur en Cd

Poumon 74

Cœur 67

Aorte 65

Rate 57

Glande salivaire 87

Foie 100

Reins 104

Ces résultats montrent que l'isomère 1.2.6 de l'IP3 provoque une forte diminution de la concentration en cadmium dans les poumons, l'artère aorte, le cœur et la rate. Les teneurs dans le foie et les reins ne sont pas affectées.

Exemple 9:

On étudie l'effet d'IP3 sur l'agrégation des plaquettes sanguines chez les fumeurs.

Quatre jeunes non-fumeurs masculins, en bonne santé, ont absorbé à deux reprises une capsule contenant 50 mg d'IP3 ou 50 mg d'un placebo. L'IP3 utilisé était le sel de Ca du D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate. Aucun sujet, ni chercheur, ne savait si l'on avait administré au patient de l'IP3 ou un placebo.

Deux heures après ingestion de la capsule, on a prélevé un échantillon de sang. Le sujet a alors fumé deux cigarettes successivement. On a ensuite prélevé un second échantillon de sang. Les réponses de l'agrégation des plaquettes vis-à-vis de l'ADP et du collagène dans les deux échantillons furent déterminées en utilisant essentiellement le même mode opératoire que dans l'exemple 1. Les résultats sont exprimés sous forme de changement intervenant dans l'agrégation, d'échantillon avant fumage des cigarettes à un échantillon après fumage. Le signe + indique que l'agrégation est plus forte après fumage.

Agent d'agrégation

Concentration de l'agent d'agrégation

IPs

Placebo

Différence entre IP3 et placebo

ADP

0,5 mmol

+ 1,5

+ 7,25

5,85

ADP

1 mmol

- 1,5

+ 0,25

1,75

ADP

2,5 mmol

- 1,5

0

1,5

ADP

5 mmol

-2,5

- 0,75

1,75

Collagène

0,5 mg

+ 5,15

+ 12,25

6,5

Collagène

1 mg

- 8,25

+ 1,75

10,0

Collagène

2,5 mg

- 3,75

0

3,75

Collagène

5 mg

- 1,5

- 0,25

1,25

Dans le groupe du placebo, le fait de fumer a provoqué un accroissement de l'agrégation, ce qui était le plus souvent marqué à de faibles concentrations des agents d'agrégation. Dans tous les cas, cet effet a été contrecarré par l'IP3. L'IP3 empêche donc l'accroissement de l'agrégation des plaquettes provoqué par le fumage des cigarettes.

Exemple 10:

65 A des souris (10 dans chaque groupe), on a injecté par voie intrapéritonéale de l'IP3 (sel de Na du D-myo-inositol-l,2,6-triphos-phate), en trois teneurs de doses, ou une solution saline physiologique. 30 minutes après cette injection, toutes les souris, à l'exception

9

666812

d'un groupe témoin, reçurent une injection, par voie intraveineuse, d'alloxane à 50 mg/kg en solution saline.

Les animaux furent abandonnés sans nourriture pendant 12 heures avant et 1 heure après l'injection d'alloxane. 72 heures après l'injection d'alloxane, un échantillon de sang prélevé sur les souris fut analysé au point de vue teneur en glucose. Les résultats sont les suivants:

Dose d'IP3 (mg/kg)

Dose d'alloxane (mg/kg)

Glucose dans le sang

0

216

0

50

864

800

50

857

1600

50

677

L'alloxane provoque le diabète et accroît le taux de glucose dans le sang en favorisant les réactions des radicaux libres dans les cellules produisant de l'insuline. Avec l'IP3, on a constaté une diminution, fonction de la dose, des taux de glucose dans le sang, la dose maximale procurant une certaine protection vis-à-vis de l'alloxane.

Exemple 11:

On prépare une solution aqueuse contenant 0,3 mM de FeCl3, 50 mM d'acide éthylènediaminotêtraacétique (EDTA), 50 mM de tris(hydroxyméthyl)aminoéthane (TRIS) et 1,0 M de NaN3. Dans cette solution, il se forme le complexe Fe3+-EDTA-N3.

Un maximum dans l'absorption lumineuse est détecté à la longueur d'onde de 409 nm.

On prépare une autre solution aqueuse contenant 0,3 mM de FeCl3, 50 mM de EDTA et 50 mM de TRIS. Dans cette solution, il se forme le complexe Fe+3-EDTA-H20. Il n'y a aucun maximum d'absorption lumineuse, détecté à la longueur d'onde de 409 nm.

La différence précitée dans le résultat dépend de ce que N3+ remplace concurremment une molécule d'eau qui est liée au complexe Fe3+-EDTA. Cela montre par ailleurs que le complexe Fe3+-EDTA présente un site de liaison qui est occupé par une molécule d'eau dissociable.

Il est connu en outre que le fer catalyse la formation de radicaux hydroxyles. Pour la formation de ceux-ci, la liaison d'une molécule d'eau au fer est nécessaire.

Cela signifie que l'EDTA dans le complexe EDTA-Fe3+ ne peut inhiber la formation des radicaux hydroxyles catalysée par le fer.

L'essai précité est répété, à la différente que l'IP3 est remplacé par l'EDTA.

On n'obtient aucun maximum dans l'absorption à la longueur d'onde de 409 nm.

Ce résultat signifie que le complexe Fe3+ avec IP3 n'est pas lié à l'eau. Il s'ensuit que la formation des radicaux libres est empêchée.

Exemple 12:

Un mélange réactionnel comprenant 48 mmol de KH2P04, 2 mmol d'ascorbate de Na, 0,1 mmol de H202, 0,5 mmol de Fe et 1,7 mmol de déoxyribose est incubé à 37° C pendant 1 heure. Des mélanges réactionnels similaires comprenant 1 mmol de EDTA ou 1 mmol d'inositoltriphosphate (IP3) furent incubés de la même façon. L'IP3 utilisé était le D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate.

Après incubation, 1,65 ml d'acide thiobarbiturique dans 50 mmol de NaOH et 1,65 ml d'acide trichloroacétique à 2,8% sont ajoutés à 2 ml du mélange réactionnel. Le mélange est chauffé à 100° C pendant 20 minutes et l'on mesure l'absorbance à 532 nm, en prenant l'eau comme valeur à blanc.

Les essais sont effectués avec le fer sous la forme de Fe2+[Fe(NH4)S04] et de Fe3+(FeCl3).

Les résultats sont les suivants:

Production de radicaux libres, catalysée par Fe2+ et Fe3+ en présence d'IP3 ou d'EDTA, exprimée en absorbance à 532 nm

Groupe

Fe2+

Fe3+

Témoin

0,76

0,79

EDTA

2,2

1,86

IP3

0,46

0,43

Ces résultats montrent que la formation de radicaux libres dans le mélange réactionnel est diminué de 40% après addition d'IP3. L'addition d'EDTA a un effet opposé. Elle accroît fortement la production de radicaux libres. On voit donc que IP3 réduit la formation, dépendante du fer, des radicaux libres.

Exemple 13:

La peroxydation des lipides a été étudiée dans des micelles de lipides. Le mélange réactionnel ci-après a été incubé pendant 2 heures à 37° C:

0,4 ml Tampon de Clark-Lubs, pH 5,5 0,2 ml Liposomes phospholipidiques 0,1 ml IP3 0,5 à 5 mM ou 0,1 ml H20 0,1 ml Fe2+ 1 mM ou 0,1 ml H20 0,1 ml Al3+ 4 mM ou 0,1 ml H20 0,1 ml H20

L'IP3 est le D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate. Après incubation, on ajoute 0,5 ml d'acide thiobarbiturique + 0,5 ml d'HCL à 25% et l'on chauffe le mélange à 100° C pendant 15 minutes. On ajoute 1 ml de lubrol PX à 1 % (Sigma) et l'on détermine la peroxydation des lipides en mesurant l'absorbance à 532 nm. Les résultats sont les suivants:

Concentration, mM

Essai

Fe2+

Al3+

ip3

Absorbance 532 nm

1

0,1

0

0,36

2

0

0,4

0

0,12

3

0,1

0,4

0

0,89

4

0,1

0,4

0,5

0,36

5

0,1

0

0,5

0,30

6

0,1

0

0,4

0,26

7

0,1

0

0,2

0,29

8

0,1

0

0,1

0,28

9

0,1

0

0,05

0,27

10

0

0,13

Fe2+ provoque une peroxydation des lipides (groupe 1 par rapport à 10). Al3+ ne cause en lui-même aucune peroxydation (2 par rapport à 10), alors que la combinaison Fe2+ + Al3+ entraîne une peroxydation bien plus marquée que Fe2+ seul (1 par rapport à 3). Une addition d'IP3 empêche complètement l'interaction entre Fe2+ et Al3+ (3 par rapport à 4). Dans les systèmes renfermant uniquement Fe2+, IP3 provoque une réduction marquée dans la formation radicalaire (1 par rapport à 5-9).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

666812

10

Exemple 14:

0,4 ml Tampon de Clark-Lubs, pH 5,5 0,2 ml Liposomes phospholipidiques 0,1ml Ip3 10 mM ou 0,1 ml H20 0,1 ml Fe2+ 1 mM

0,1 ml Cd2+ 1 mM ou 1 ml Pb2+ 1 mM ou 0,1 ml H20 0,1 ml H20

L'IP3 est le D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate. Après incubation, on ajoute 0,5 ml d'acide thiobarbiturique + 0,5 ml d'HCl à 25% et l'on chauffe le mélange à 100° C pendant 15 minutes. 1 ml de lubrol PX à 1 % (Sigma) est ajouté et l'on détermine la peroxydation en mesurant l'absorbance à 532 nm. Les résultats sont les suivants:

Concentration, mM

Essai

Cd2+

Pb2+

ip3

Absorbance 532 nm

1

0

0,63

2

0,1

0

1,08

3

0,1

0

1,0

0,73

4

0

0,1

0

1,79

5

0

0,1

1,0

1,32

La peroxydation des lipides provoquée par Fe2+ (groupe 1) est fortement accrue par Cd (2) et par Pb (4). Les effets de ces deux métaux sont fortement contrecarrés par IP3 (3 par rapport à 2 et 5 par rapport à 4).

Exemple 15:

Des mélanges réactionnels ayant les compositions suivantes sont incubés pendant 5 minutes à 37°C:

Tampon de KH2P04, pH 7,4

EDTA

Salicylate

Ascorbate h2o2

20 mM 0,1 mM 1 mM 1 mM 3,3 mM

FeJ+ 0,05 mM

IP3 0, 2,5 ou 10 mM

Les produits formés par oxydation du salicylate sont dosés par HPLC (Chromatographie liquide à haute pression). L'IP3 est le D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate.

On étudie dans le système la migration radicalaire. Dans ces conditions réactionnelles, la totalité de Fe3+ formera un complexe avec l'EDTA. Le complexe Fe-EDTA entraînera la formation de radicaux libres et l'on étudie l'aptitude de l'IP3 à empêcher l'oxydation du salicylate. Les résultats de l'essai sont les suivants:

Concentration en IP3 (mM) Quantité relative de salicylate oxydé

0 100

2,5 44

5 43

10 19

IP3 est donc en mesure de se comporter comme entraîneur radicalaire, empêchant ainsi les altérations provoquées par les radicaux libres des autres molécules.

Exemple 16:

5 ml d'une solution aqueuse contenant 2 |xmol d'IPfi et une quantité équivalente de cations sont titrés avec 10 mM d'une solution d'hydroxyde de sodium.

Les cations sont des ions cadmium et zinc, sous la forme de chlorure de cadmium et de sultate de zinc.

Le pH est déterminé en fonction de la quantité d'hydroxyde de sodium ajoutée.

5 L'essai précité est répété avec IP3.

Les essais ont montré que dans l'intervalle de pH 4 à 8, le zinc était lié plus fortement que Cd à PIP6. Pour l'IP3, c'est l'inverse qui se produit, c'est-à-dire que le cadmium est lié plus fortement que le zinc.

10

Exemple 17:

La constante de liaison pour le complexe IP3-cadmium a été évaluée par RNM.

Les constantes furent évaluées par des études comparatives 15 d'autres complexes, tels que l'EDTA-cadmium et le parvalbumine-cadmium.

La constante de liaison (K) pour IP3-cadmium est de 109. Exemple 18:

20 Hydrolyse du phytate de sodium avec la phytase du blé et fractionnement d'un mélange d'inositol.

Une quantité de 1,6 g de phytate de sodium (provenant du maïs, Sigma Chemical Co.) est dissoute dans 650 ml de tampon acétate de sodium, pH 5,2.2,7 g de phytase du blé (EC 3.1.3.26, 0,015 u/mg, de 25 Sigma Chemical Ço.) sont ajoutés et le mélange est incubé à 38° C.

La déphosphorylation est suivie par la détermination du phosphore inorganique libéré. Au bout de 3 heures, lorsque 50% du phosphate inorganique sont libérés, l'hydrolyse est arrêtée en ajoutant 30 ml d'ammoniaque à pH 12. On obtient un mélange liquide 30 contenant des phosphates d'inositol.

350 ml de ce mélange sont passés sur une colonne échangeuse d'ions (Dowex I, forme chlorure, 25 mm x 250 mm) et élués avec un gradient linéaire d'acide chlorhydrique (HCl 0 à 0,7N). Des parties aliquotes des fractions éluées sont complètement hydrolysées 35 en vue de déterminer les teneurs en phosphore et en inositol. Les pics correspondent à différents phosphates d'inositol, c'est-à-dire qu'un pic présentant un rapport phosphore/inositol de trois à un est composé d'inositoltriphosphate, etc. Deux fractions présentant un rapport phosphore/inositol de trois à un sont obtenues.

40

Exemple 19:

Fractionnement des inositoltriphosphates.

100 ml de la première fraction obtenue dans l'exemple 18 ayant un rapport phosphore/inositol de trois à un sont neutralisés et préci-45 pités sous forme de sel de baryum après addition d'un excès de 10% d'une solution 0,1M d'acétate de baryum. 600 mg du sel précipité sont dissous dans 50 ml d'acide chlorhydrique dilué. La solution est séparée sur colonne échangeuse d'ions (Dowex 1, forme chlorure, 25 mm x 2500 mm) avec de l'acide chlorhydrique dilué comme 50 éluant. Des parties aliquotes des fractions éluées sont analysées quant à leurs teneurs en phosphore. On constate l'existence de trois pics formés d'isomères d'inositoltriphosphates.

Exemple 20:

55 Détermination de la structure des isomères d'inositoltriphosphates par RNM.

Les trois pics obtenus par l'exemple 19 sont analysés par H-RNM. Les résultats montrent que les pics sont composés, respectivement, de myo-inositol-l,2,6-triphosphate, de myo-inositol-1,2,3-60 triphosphate et de myo-inositol-l,3,4-triphosphate.

La seconde fraction obtenue dans l'exemple 18, présentant un rapport phosphore/inositol de trois à un, est analysée par H-RMN. Les résultats montrent que la fraction est composée de myo-inositol-1,2,5-triphosphate.

65

Exemple 21:

Détermination des isomères optiques des inositoltriphosphates.

11

666812

20 mg des composés déterminés par RNM, conformément à l'exemple 20, comme étant le myo-inositol-l,2,6-triphosphate et le myo-inositol-l,3,4-triphosphate, sont encore chromatographiés sur colonne chirale à base de cellulose acétylée (20 mm x 300 mm, Merck) avec un mélange d'éthanol et d'eau comme éluant. Les fractions sont analysées au polarimètre. Comme on peut le constater, chaque composé est formé d'un isomère optique, respectivement, le D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate et le L-myo-inositol-1,3,4-triphosphate.

Exemple 22:

Hydrolyse du phytate de sodium par la levure de boulanger et fractionnement d'un mélange de phosphates d'inositol.

Une quantité de 0,7 g de phytate de sodium (provenant du maïs, Sigma Chemical Co.) est dissoute dans 600 ml de tampon acétate de sodium, pH 4,6. 50 g de levure de boulanger, de Jästbolaget, Suède (substance sèche: 28%; teneur en azote: 2%; teneur en phosphate: 0,4%) sont ajoutés tout en agitant et l'incubation est poursuivie à 45° C. La déphosphorylation est suivie par la détermination du phosphore inorganique libéré. Au bout de 7 heures, lorsque 50% de phosphore inorganique sont libérés, l'hydrolyse est arrêtée en ajoutant 30 ml d'ammoniaque à pH 12. La suspension est centrifugée et l'on rassemble le surnageant.

400 ml de surnageant sont passés sur colonne échangeuse d'ions (Dowex 1, forme chlorure, 25 mm x 250 mm) et élués avec un gradient linéaire d'acide chlorhydrique (HCl 0 à 0,7N).

Des parties aliquotes des fractions éluées sont complètement hy-drolysées en vue de déterminer les teneurs en phosphore et en inositol. Les pics correspondent à différents phosphates d'inositol, c'est-à-dire qu'un pic présentant un rapport phosphore/inositol de trois à un est composé d'inositoltriphosphates, etc.

Exemple 23:

Détermination de la structure des isomères d'inositoltriphos-phate.

La fraction obtenue dans l'exemple 22, présentant un rapport phosphore/inositol de trois à un, est neutralisée et évaporée avant analyse par H-RNM. Les résultats montrent que le pic est formé de myo-inositol-l,2,6-triphosphate.

Exemple 24:

Détermination des isomères optiques du myo-inositoltriphos-phate.

On utilise la même méthode que celle décrite dans l'exemple 21, à la difiérence que 10 mg du composé déterminé par RMN, conformément à l'exemple 23, sont analysés. Comme on peut le constater, le composé est formé d'un isomère optique, le D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate.

Exemple 25:

Solution de sel de potassium de D-myo-inositol-l,2,6-triphos-phate pour injection.

0,5 g de sel de potassium d'IP3 et 0,77 g de NAC1 sont dissous dans 98,73 ml d'eau pour injection, afin de former une solution appropriée pour l'injection à une personne ou à un animal.

Exemple 26:

Comprimé de sel de calcium de D-myo-inositol-l,2,6-triphos-phate.

Des comprimés de sel de cadmium de D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate sont préparés de la manière suivante. 50 g de sel de calcium de D-myo-inositol-l,2,6-triphosphate, 132 g de lactose et 6 g d'acacia sont mélangés. De l'eau purifiée est alors ajoutée au mélange, puis on continue de malaxer jusqu'à ce qu'on obtienne une consistance appropriée. Le mélange est tamisé et séché. Le mélange est ensuite homogénéisé avec 10 g de talc et 2 g de stéarate de magnésium. Ledit mélange est ensuite compressé de manière à obtenir des comprimés pesant chacun 200 mg.

Afin de mieux faire comprendre l'invention, on a indiqué ci-après les formules des isomères IP3 de l'invention. Les formules sont également données pouf IP6, IP5, IP4 et IP2.

Les phosphates-esters inférieurs de myo-inositol sont désignés suivant la position des groupes acides phosphoriques sur le cycle inositol, la numérotation étant donnée sous forme d'indices de position aussi faibles que possible. L et D sont indiqués pour le comptage, respectivement, dans le sens et dans le sens contraire des aiguilles d'une montre et sont utilisés en fonction du résultat donnant le plus faible indice de position. L'atome de carbone, lequel présente un groupe axial acide phosphorique, aura toujours l'indice de position 2. Les formules de structure représentées ci-après sont simplifiées sous la forme acide.

i

OH

HO

OH

HO

OH

i i

myo-inositol; C6H6 (OH)6

_D2

D4

D5

D6

l,2,3,4,5,6-hexakis(dihydrogénophosphate)myo-inositol

également appelé myo-inositol hexakis (phosphate) ou ÏP6

OH

.OH

OH

D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate, désigné également D-1,2,6-IP3

OH.

OH

D-myo-inositol-1,2,5-triphosphate, désigné également D-1,2,5-IP3

p = -o-po3h2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

12

myo-inositol-1,2,3-triphosphate, désigné également 1,2,3-IP3

D-myo-inositol-l,2,5,6-tétraphosphate ou D-1,2,5,6-IP4 ®

L-myo-inositol-l,2,3,4,5-pentaphosphate ou L-1,2,3,4,5-IPS

L-my o-inositol-1,2-diphosphate,

désigné également L-1,2-IP! P= —O—P03H2

Claims

666 812

2

REVENDICATIONS

1. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, comme constituant pharmaceutiquement actif, au moins un isomère de l'inositol triphosphate.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme d'unités dosées comprenant en outre un véhicule, un excipient ou un adjuvant pharmaceutiquement acceptable.
3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit inositol triphosphate est sous la forme d'un sel.
4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit sel d'inositol triphosphate est un sel de calcium, de zinc, de cuivre ou de magnésium ou un mélange de deux ou plusieurs de ces sels.
5. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de comprimés ou de granulés.
6. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une solution.
7. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un sel pharmaceutiquement acceptable d'acide minéral ou d'acide organique avec au moins l'un des éléments : calcium, zinc, magnésium ou cuivre.
8. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un adjuvant choisi dans le groupe comprenant un composé du sélénium, la vitamine E, la vitamine C et un acide organique pharmaceutiquement acceptable ou un sel de cet acide.
9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit sel est un citrate, Oxalate, manolate ou tartrate.
10. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit inositol triphosphate comprend le D-myo-inositol-1,2,6-triphosphate ayant la formule:

n-X2'

dans laquelle X est un hydrogène ou au moins un cation univalent, divalent ou polyvalent, n est le nombre d'ions et z est la charge de l'ion respectif.
11. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que n et z sont compris respectivement entre 1 et 6 inclus, n étant de préférence compris entre 3 et 6 inclus et z étant égal à 1, 2 ou 3.
12. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit inositol triphosphate comprend le D-myo-inositol-1,2,5-triphosphate ayant la formule:

opo2"v

OH

1-

3

0P0

n-Xz dans laquelle X est un hydrogène ou au moins un cation univalent, divalent ou polyvalent, n est le nombre d'ions et z est la charge de l'ion respectif.
13. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit inositol triphosphate comprend le myo-inositol-l,2,3-triphos-phate ayant la formule:

2 -N

n-Xz'

dans laquelle X est un hydrogène ou au moins un cation univalent, divalent ou multivalent, n est le nombre d'ions et z est la charge de l'ion respectif.
14. Composition selon-la revendication 1, caractérisée en ce que 5 ledit inositol triphosphate comprend le L-myo-inositol-l,3,4-triphos-phate ayant la formule:

n-Xz"

dans laquelle X est un hydrogène et/ou au moins un cation univa-15 lent, divalent ou polyvalent, n est le nombre d'ions et z est la charge de l'ion respectif.
15. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit inositol triphosphate comprend le D-myo-inositol-1,4,5-triphosphate ayant la formule:

"> _

0P0

n-Xz dans laquelle X est un hydrogène et/ou au moins un cation univalent, divalent ou multivalent, n est le nombre d'ions et z est la charge de l'ion respectif.

30 16. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inositol triphosphate est le seul constituant pharmaceutiquement actif.
17. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient, en plus de l'inositol triphosphate, au moins un autre

35 constituant pharmaceutiquement actif.
18. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce que la quantité d'inositol triphosphate se situe dans la gamme de 5 à 95% en poids des constituants actifs.
19. Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce

40 qu'elle se présente sous forme d'unités polyvitaminées contenant de 2 à 60% en poids d'inositol triphosphate par rapport au poids total de constituants pharmaceutiquement actifs.
20. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,01 à 1,5 g d'inositol triphosphate.

45 21. Utilisation d'inositol triphosphate pour la préparation d'un médicament efficace contre des états pathologiques attribuables à— ou causés ou agravés par — la présence d'ion cadmium ou aluminium ou de radicaux libres dans le corps humain, notamment l'arthrite, la bronchite, le changement de prolifération des cellules, le so cancer, l'hypertension, les maladies cardio-vasculaires, les diabètes dus à l'âge, les maladies du placenta, des testicules, de la prostate, du système nerveux central, du système conducteur du cœur, l'emphysème, la fibrose pulmonaire, les maladies de l'endothélium, des reins, l'allergie, la thrombose, l'agrégation accrue des plaquettes san-

55 guines ou l'inhibition de la production de prostacycline.