DE1593035C3 - Verfahren zur Herstellung von aliphatischen Aldehyden oder aliphatischen Carbonsäuren durch enzymatische Oxydation - Google Patents

Description

Decanoldehydrogenase, die die Oxydation von Decanol beeinflußt, Decanaldehydrogenase, die die Oxydation von Decanal beeinflußt, und Decarboxylase, die die Oxydation von Decancarbonsäure beeinflußt, enthalten. Mindestens einige von diesen Enzymen sind von dem Gesamtgemisch oder -extrakt abtrennbar.

Der bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Kofaktor Diphosphorpyridinnucleotid wird zur Vereinfachung als DPN bezeichnet. Der Kofaktor wird auch oxydierter Kofaktor genannt und in der Form DPN⁺ geschrieben. Dieser Kofaktor wird von den Zellen erzeugt und folgt den Enzymen bei deren Extraktion. Die nachstehende Gleichung veranschaulicht seine Rolle bei der Oxydation eines Alkanals:

RCHO + DPN⁺ + HoO -> RCOOH + DPNH + H⁺

Diese Reaktion, die in Gegenwart des geeigneten Enzyms durchgeführt wird, erläutert die enzymatische Oxydation des Alkanals zu einer Alkancarbonsäure und die einhergehende Reduktion von DPN⁺ zu DPNH. Eine ähnliche Reaktion läuft ab, wenn ein Alkanol enzymatisch zu einem Alkanal oxydiert wird; dabei ergibt sich folgende Reaktion:

RCH₂OH + DPN⁺ -» RCHO + DPNH + H⁺ (2)

Das DPNH wird als reduzierter Kofaktor oder reduziertes Nucleotid bezeichnet. Aus den Reaktionen (1) und (2) ist ersichtlich, daß in jedem Falle eine Verschiebung von zwei Η-Atomen auftritt, wobei eines von diesen von dem DPN⁺ zur Bildung von DPNH aufgenommen wird und das andere als Proton an das Medium abgegeben wird. Die Gleichungen zeigen somit, daß für jedes Molekül der zur Oxydation kommenden Verbindung ein Molekül DPN⁺ erforderlich ist, d. h., es ist eine stöchiometrische Menge an DPN⁺ wesentlich.

Gemäß der nachstehenden Reaktion ist DPN⁺ auch aus DPNH erhältlich:

DPNH

DPNH-Oxydase plus Sauerstoff

-» DPN⁺

Die DPNH-Oxydase ist ein Enzym, das in dem vorstehend beschriebenen rohen Enzymextrakt und auch in anderen rohen Enzymextrakten, wie sie nachstehend beschrieben werden, anwesend ist. Neben anderen Merkmalen und Vorteilen sieht die Erfindung vor, enzymatische Oxydationen von Alkoholen und Aldehyden in Anwesenheit des erforderlichen DPN⁺ durchzuführen und weiterhin ein System zur Regeneration von DPN⁺ aus DPNH einzubringen, so daß ständig stöchiometrische Mengen an oxydiertem Kofaktor für die Oxydation des Alkohols oder Aldehyds anwesend sind.

Während, wie ausgeführt, der rohe Enzymextrakt bei der Enzymoxydationsstufe verwendet werden kann, hat es sich jedoch gezeigt, daß die Anwendung eines spezifischen, aus dem Enzymextrakt isolierten Enzyms den Vorteil hat, Verluste an Oxydationsprodukt zu vermeiden, wie sie bei Verwendung eines Gemischs von Enzymen auftreten können; dies beruht darauf, daß bei Verwendung eines Gemischs die Möglichkeit besteht, daß ein Enzym des Gemischs Spezifität für das Oxydationsprodukt hat, das sich durch die Aktivität eines anderen Enzyms ergibt.

Gegenüber der in »Biochemica et Biophysica Acta«, 1963, S. 40 bis 47, beschriebenen Oxydation von Kohlenwasserstoffen durch ein bakterielles Enzymsystem handelt es sich bei dem Verfahren gemäß der Erfindung um die Anwendung von Enzymen von induzierten und nichtinduzierten Kulturen, die in besonderer We.ise erhalten worden sind, für die Herstellung von aliphatischen Aldehyden oder Carbonsäuren. Bei Anwendung des Verfahrens gemäß der

ίο Erfindung ist es möglich, Produkte besonderer Reinheit zu erzielen.

Gegenüber dem bekannten chemischen Oxydationsverfahren zur Herstellung von aliphatischen Alkoholen und Carbonsäuren wird bei dem Verfahren gemäß der Erfindung unter vergleichsweise milden Bedingungen, d. h. bei einem neutralen pH-Wert und Temperaturen von etwa 30 bis 40⁰C, gearbeitet, wobei sich nur ein einziges Produkt ergibt, das praktisch frei von Nebenprodukten ist. Die Korrosion der Anlage für die Durchführung des Oxydationsverfahrens gemäß der Erfindung ist infolge der milden Reaktionsbedingungen auf ein Minimum herabgesetzt, was auch zu einem reineren Produkt führt.

Die enzymatisch oxydierbaren Kohlenstoffverbindüngen können aus einer breiten Stoffklasse ausgewählt werden, welche aliphatische Alkohole und Aldehyde unterschiedlicher Molekulargewichte und Kohlenstoffkonfigurationen umfaßt. Eine bevorzugte Verbindungsklasse umfaßt Alkanole und Alkanale mit bis zu 20 oder 30 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt jene Verbindungen, die bei normalen Temperaturen und Drücken flüssig sind, einschließlich geradkettiger und verzweigtkettiger, gesättigter und ungesättigter Verbindungen.

Der den Zellen als Kohlenstoffquelle zugeführte Kohlenwasserstoff wird so gewählt, daß er bezüglich seiner Kohlenstoffkonfiguration und zweckmäßig hinsichtlich der Anzahl an Kohlenstoffatomen im wesentlichen der zu oxydierenden Kohlenstoffverbindung entspricht. Demgemäß stehen für die Auswahl des Kohlenwasserstoffs entsprechende Stoffklassen wie bei den zu oxydierenden Kohlenstoffverbindungen zur Verfügung, wobei es nur notwendig ist, den Kohlenwasserstoff auszuwählen, der dem zu oxydierenden Alkohol oder Aldehyd entspricht. Wenn es sich bei der zu oxydierenden Kohlenstoffverbindung beispielsweise um Decanol oder Decanal handelt, wird als entsprechender Kohlenwasserstoff vorzugsweise Decan verwendet.

Das oxydierte Produkt entspricht ebenfalls der eingesetzten Kohlenstoffverbindung hinsichtlich der Kohlenstoffkonfiguration und der Anzahl an Kohlenstoffatomen. Das Produkt ist gewöhnlich ein stärker oxydiertes Derivat der Ausgangsverbindung. Üblicherweise handelt es sich bei dem Produkt um einen Aldehyd, wenn die Ausgangsverbindung aus einem Alkohol besteht, oder um eine Carbonsäure, wenn die Ausgangsverbindung aus einem Aldehyd besteht. Es ist aber auch möglich, durch Anwendung geeigneter Enzyme einen Alkohol enzymatisch zu einer Säure zu oxydieren.

Mikroorganismen, die zur Anwendung im Verfahren gemäß der Erfindung geeignet sind, können vorzugsweise aus folgenden Gattungen ausgewählt werden: Achromobacter, Pseudomonas, Nocardia, Bacillus und Mycobacterium, einschließlich solcher Arten, wie A. xerosis, A. gutatus, A. superficialis, A. parvulus, A. cycloclastes, Ps. aeruginosa, Ps. öle-

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ovorans, Ps. putida, Ps. fluorescens, Ps. boreopolis, Das Lösungsmittel kann in der sich ergebenden

Ps. methanica, N. corallinus, N. opacus, N. paraf- Lösung belassen oder es kann daraus entfernt werden,

finae, N. salmonicolor, B. hexacarbovorum, B. mesen- Das chromatographische Abtrennverfahren ent-

tericus, B. toluolicum, M. phlei, M. rubrum, M. Iu- fernt den Kofaktor DPN⁺, der, wie vorstehend be-

teum, M. Iacticola, M. album, M. byalinicum, 5 schrieben für die enzymatische Oxydation von Alko-

M. leprae. Bevorzugte Organismen sind jene der holen und Aldehyden notwendig ist. Es wird auch

Gattung Achromobacter. DPNH-Oxydase entfernt, d. h. das Enzym, mittels

Das Kulturgemisch wird unter geeigneten Bedin- dessen DPN⁺ aus seiner reduzierten Form DPNH

gungen gehalten, um ein optimales Wachsen des regeneriert werden kann. Sowohl DPN⁺ als auch die

Mikroorganismus sicherzustellen. Die Temperatur io DPNH-Oxydase sowie DPNH, können zu einem

sollte beispielsweise zwischen etwa 20 und etwa 55°C, gegebenen Enzym zugesetzt werden. Im Falle von

vorzugsweise in Nähe von 3O⁰C, gehalten werden. DPN⁺, das im Handel mehr oder weniger leicht

Der pH-Wert wird in Nähe des Neutralpunkts, d. h. erhältlich ist, besteht eine vorteilhafte Methode zur

bei etwa 7,0, gehalten, er kann jedoch auch im Bereich Zuführung darin, es durch Extraktion aus wachsenden

zwischen etwa 5,5 und 8,5 liegen. 15 Zellen zu gewinnen; jedoch sollten die Zellen nicht

Nach einer geeigneten Wachstumsperiode werden auf dem gleichen Kohlenwasserstoff, wie er für die die Zellen geerntet, gewaschen und dann in einem Herstellung des Enzymextrakts verwendet wird, und wäßrigen Medium suspendiert und aufgerissen, um selbst nicht auf einem verwandten Kohlenwasserstoff intracellulare Enzymkomponenten der Zellen in Frei- wachsen gelassen werden; um die Induzierung von heit zu setzen oder zugänglich zu machen. Das Auf- 20 unerwünschten Enzymen zu vermeiden, sollten die reißen der Zellen kann erfolgen, indem man die Zellen Zellen vielmehr auf einem wesentlich anderen kohlenhochfrequenten Schwingungen aussetzt, oder nach stoffhaltigen Substrat wachsen gelassen werden, z. B. irgendwelchen herkömmlichen Methoden, einschließ- auf einem Kohlenhydrat, wie Glucose, Maltose, lieh Mahlen in Anwesenheit von Schleifmitteln, Fructose, Sucrose, Xylose, Lactose, Galactose, Mais-Schütteln mit Schleifmitteln, Einwirkung von Lysozym, 25 oder Kornmelasse, Rübenzuckerm;lasse, Stärke oder Verdichtung und Druckentspannung, wie in einer einem anderen herkömmlichen Substrat, z. B. Brenz-Französischen Druckzelle oder durch andere physi- traubensäure, Glycerin, /9-Hydroxybuttersäure usw. kalisch-chemische Behandlungen, die zum Aufreißen DPNH-Oxydase wird zweckmäßig aus einem rohen der Zellen und Freisetzen löslicher Komponenten aus ungereinigten Zellextrakt erhalten. Eine bevorzugte den Zellen geeignet sind. 30 Arbeitsweise besteht darin, sowohl DPN¹" als auch

Die in Freiheit gesetzten und andere Komponenten DPNH-Oxydase aus dem gleichen rohen nichtindu-

lösen sich in dem umgebenden wäßrigen Medium, bei zierten Zellextrakt zu gewinnen, wobei die Zellen auf

dem es sich üblicherweise um eine schwache wäßrige einem nichtinduzierenden Medium, wie Glucose, als

Lösung eines Phosphatsalzes handeln kann; dies er- der einzigen Kohlenstoffquelle wachsen gelassen wer-

gibt eine wäßrige Enzymlösung mit einem pH-Wert 35 den und der sich ergebende Zellextrakt als solcher zur

von 6 bis 8. Nach Entfernung von Zellresten, etwa Verwendung herangezogen wird,

durch Zentrifugieren oder Filtration, ist der sich er- Das bei der chromatographischen Trennung der

gebende Rohextrakt zur Durchführung von enzyma- Enzyme erhaltene isolierte Enzym in konzentrierter

tischen Oxydationen brauchbar. Wie vorstehend er- Form kann in diesem Zustand zur Oxydation einer

läutert, ist es jedoch vorzuziehen, einzelne Enzyme 40 geeigneten Kohlenstoffverbindung, z. B. eines Alko-

aus dem Extrakt abzutrennen und diese bei geeigneten hols oder Aldehyds, eingesetzt werden. Es wird der

Oxydationsreaktionen zu verwenden. Geeignete Ab- Verbindung zusammen mit einer Quslle für DPN⁺,

trennmethoden können eine oder mehrere voraus- zweckmäßig auch mit einer Quelle für DPNH-Oxydase,

gehende Reinigungsstufen umfassen, gefolgt von einer zugesetzt und das sich ergebende Gsmisch, dessen

chromatographischen Trennung der Enzyme unter 45 pH-Wert 5,5 bis 8,5 und vorzugsweise 7 beträgt, wird

Verwendung einer Säule eines geeigneten Absorptions- dann bei etwa 20 bis etwa 55° C, vorzugsweise in der

mittels. Beispielsweise kann der rohe Enzymextrakt, Gegend von 3O⁰C, über Zeitspannen, die sich allgemein

wie das im einzelnen im Beispiel 1 dargelegt ist, zur bis zu mehreren Stunden erstrecken, gebrütet. Während

Ausfällung von Feststoffen, wie Nucleinsäuren, be- der Brütung wird das Gsmisch vorzugsweise gerührt,

handelt werden, worauf dann die Enzyme aus der 5° und natürlich wird für einen Zutritt von atmosphäri-

Lösung mittels eines geeigneten Salzes ausgefällt schem Sauerstoff Sorge getragen,

werden können; der Niederschlag wird dann entsalzt, Durch Vergleich des Adsorptionsvermögens des

in einer Pufferlösung suspendiert und in einer Ab- Gemischs mit dem einer Kontrollprobe kann das

sorptionsmittelsäule zur Absorption gebracht. Danach Ausmaß der Reduktion des Tetrazoliumsalzes be-

können die adsorbierten Enzyme durch Eluierung 55 stimmt werden, und dieses entspricht wiederum dem

selektiv entfernt und getrennt gesammelt werden. Ausmaß der Oxydation der Kohlenstoffverbindung.

Geeignete Adsorptionsmittel für die chromato- Bei Abschluß der Oxydation kann eine kleine graphische Trennung sind beispielsweise Diäthyl- Menge einer starken Mineralsäure zugegeben werden, aminoäthylcellulose (DEAE), Triäthylaminoäthylcel- um die Reaktion anzuhalten. Die oxydierten Produkte lulose (TEAE), ECTEOLA-Cellulose, Carboxymethyl- 60 werden gewonnen, zweckmäßig durch Extraktion des cellulose (CMC), Sulfoäthylcellulose, Sulfomethyl- Brütgemischs mit einem Lösungsmittel, z. B. Äther, cellulose u. dgl. Bei dem eluierenden Lösungsmittel und nach Abdampfen des Äthers aus dem Extrakt handelt es sich um eine Flüssigkeit, in der die Enzym- kann das gewünschte Produkt nach herkömmlichen komponenten löslich sind; hierzu können solche Ver- Arbeitsmethoden, wie Destillation, Lösungsmittelbindungen, wie Wasser, Äthanol, Aceton, Methanol, 65 extraktion, fraktionierte Kristallisation u. dgl., weiter Butanol-Wasser-Gemische, eine wäßrige Lösung (0,01- getrennt und gereinigt werden.

bis 5molar) von Natriumchlorid oder Natriumphos- Die Erfindung wird nachstehend an Hand von Aus-

phat oder Natriumeitrat usw., verwendet werden. führungsbeispielen weiter veranschaulicht.

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. · ι ι ^von 6 hatte. Die Fraktionen von je 5 ml Volumen

Beispiel 1 wurden gesammelt und auf die Anwesenheit von En-

Es wurde eine enzymatische Oxydation von De- zymen untersucht. Die Fraktionen 62 bis 80 enthielten

canol durchgeführt, wobei (1) ein roher zellfreier hohe Gehalte an Decanoldehydrogenase, während die

Enzymextrakt, hergestellt aus auf Decan gewachsenen 5 Fraktionen 82 bis 106 in bezug auf Decanaldehydro-

Zellen, und (2) ein gereinigtes Enzym, isoliert aus genäse konzentriert waren. Es wurde nichts unter-

;inem rohea Enzymextrakt und identifiziert als De- nommen, um Decanoxydase oder Decarboxylase, die

janoldehydrogenase, verwendet wurden. offensichtlich in der Säule verblieben, zu gewinnen.

Zur Herstellung der Enzyme wurde ein Achromo- Die spezifische Aktivität der gereinigten Decanoloacter Sp., isoliert nach einer Kulturanreicherungs- io dehydrogenase (Nr. 2 in der nachstehenden Tabelle) methode aus Erdboden von Hopewell Township, N.J., für die Oxydation von Decanol wurde dann bestimmt unter Verwendung eines herkömmlichen Mineralsalz- und mit der des rohen Sephadex-behandelten Enzymnährmediums und n-Decan als der einzigen Kohlen- extrakts (Nr. 1 in der Tabelle) verglichen; es wurden stoffquelle wachsen gelassen. Das Mineralsalzmedium die nachstehenden Ergebnisse erhalten:

hatte die nachstehende Zusammensetzung, bezogen 15

auf 1 Liter: Nr. Enzym-Material Spezifische Aktivität*)

Ammoniumsulfat 1,0 g kein DPN⁺ DPNH

Kaliumdihydrogenphosphat 2,0 g Zusatz Zusatz Zusatz

Natriummonohydrogenphosphat .... 3,0 g

Magnesiumsulfat 0,2 g ²⁰ 1 _roher zellfreier 0,00 5,0 4,5

Calciumchlorid 0,01 g Extrakt

Ferrosulfat 0,005 g ₂ gereinigte Decanol- 0,00 180,0 19,0

Mangansulfat 0,002 g dehydrogenase

Natriumcarbonat 0,1 g

Harnstoff 1,5 g ²⁵ *) Millimikromol Alkohol oxydiert/h/mg Protein.

Die Zellen wurden geerntet, in verdünnter wäßriger Jedes Reaktionsgemisch enthielt die nachstehenden

Pufferlösung suspendiert und aufgerissen, und dann Substanzen:

wurde die Suspension bei 34 OOOfacher Schwerkraft ₍₁₎ jris-HCl Puffer, pH-Wert 8,0, 33 Mikromol;

30 Minuten zentrifugiert. Die sich ergebende über- 3° W Decanol 0 01ml·

stehende Flüssigkeit, die rohen Enzymextrakt um- ιτ\ DPN⁺ oder DPNH 0 1 mg·

faßte, wurde gewonnen. ₍₄₎ Cystein, 10 Mikromol;

Der rohe Enzymextrakt wurde in zwei Teile unter- ₍₅₎ bakterieller Extrakt, 0,2 ml·

teilt; der erste Anteil wurde durch eine Polydextran- ₍₆₎ Tetrazoliumchlorid, 10 Mikromol;

Säule geleitet, um Kofaktoren zu entfernen, so daß 35 ₍₇₎ Wasser zur Herstellung eines Gesamtvolumens

bei nachfolgender Prüfung der Einfluß von zugesetzten _von ι q _m\
Kofaktoren untersucht werden konnte. Der zweite

Anteil wurde benutzt, um gereinigte Decanoldehydro- Die beiden Gemische wurden in einer Luft-Stick-

genase herzustellen, wie das nachstehend beschrieben stoff-Atmosphäre bei 25° C gebrütet. Es ist ersichtlich,

ist: 40 daß bei diesem Test Decanol durch das gereinigte

Der letztgenannte zweite Anteil des Enzymextrakts Enzym, d. h. Decanoldehydrogenase, oxydiert wird wurde mit einer 1,0 %igen Lösung von Protaminsulfat und beim Voranschreiten dieser Reaktion der urbehandelt, wobei die Lösung tropfenweise in der sprünglich farblose Farbstoff, d. h. Tetrazoliumchlorid, Kälte zugegeben wurde, und zwar in einem Verhältnis reduziert wird und bei diesem Vorgang eine Farbvon 1 ml je 10 ml Extrakt. Das sich ergebende Ge- 45 änderung von farblos zu rot erfährt. Die Menge an misch wurde zentrifugiert und die Feststoffe, die reduziertem Farbstoff ist äquivalent der Menge an Nucleinsäuren umfaßten, wurden verworfen. Zu der oxydiertem Decanol, so daß der Test eine Messung der klaren überstehenden Flüssigkeit wurde tropfenweise Farbänderung gestattet. Am Ende der Reaktion wurde eine gesättigte Lösung von Ammoniumsulfat zu- daher ein aliquoter Anteil des Reaktionsgemischs entgegeben, bis die überstehende Flüssigkeit zu 50% 5° nommen, in Äthanol gelöst, in ein Kolorimeter einmit dem Salz gesättigt war. Das sich ergebende Ge- gebracht, und dann wurde das Adsorptionsvermögen misch wurde 30 Minuten bei 0 bis 5⁰C gerührt, dann der Äthanollösung unter Verwendung von Licht einer in der Kälte zentrifugiert, und der sich ergebende Wellenlänge von 500 Millimikron bestimmt. Der Wert Niederschlag wurde gewonnen und wieder in einer des Adsorptionsvermögens wurde zu der spezifischen kalten verdünnten Lösung, die Kaliumsulfatpuffer ent- 55 Aktivität in Beziehung gesetzt, letzteres ist der in der hielt, suspendiert. Das letztgenannte Gemisch, das in vorstehenden Tabelle angegebene Wert,
dem Puffer suspendierten Niederschlag umfaßte, Aus der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß sowurde durch eine Polydextransäule geleitet um jeg- wohl der Rohextrakt als auch das gereinigte Enzym liches Ammoniumsulfat zu entfernen, und die sich inaktiv waren, wenn kein Kofaktor zugesetzt wurde, ergebende entsalzte Lösung wurde dann durch eine 60 In Anwesenheit von DPN⁺ war die Decanoldehydro-Säule von Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE) ge- genäse sehr aktiv und oxydierte das Decanol viel leitet, die vorausgehend mit O.Olmolarem Phosphat, rascher als irgendeines der anderen Gemische. Es ist pH-Wert 6,0, beschickt worden war; hierdurch wurden ersichtlich, daß das gereinigte Enzym in Anwesenheit die Enzyme in der Säule adsorbiert. Aus der Säule von zugegebenem DPNH eine spezifische Aktivität wurden Fraktionen eluiert, und zwar mit wäßrigen 65 von nur 19 hatte; dies kann durch die Tatsache er-Natriumchloridlösungen mit Konzentrationen im Be- klärt werden, daß während der Reinigung des Enzyms reich zwischen 0- und 0,3molar, wobei die Lösung im wesentlichen die Gesamtmenge des Enzyms auch O.Olmolar an Phosphat war und einen pH-Wert DPNH-Oxydase, das für die Regeneration von DPN⁺

aus DPNH verantwortlich ist, verloren gegangen war. Die Werte zeigen, daß DPN⁺ für die enzymatische Oxydation von Decanol mittels Decanoldehydrogenase notwendig ist. Im Falle des rohen Extrakts (Nr. 1) wurden niedrige Werte der spezifischen Aktivität, nämlich 5,0 und 4,5, erhalten, da dieses Material einen großen Anteil an fremdem Protein enthielt; in diesem Zusammenhang ist zu bemerken, daß die spezifische Aktivität auf die Menge an Protein bezogen ist.

In einem anderen Reaktionsgemisch, das gereinigte Decanoldehydrogenase enthielt und weiterhin das Dreifache der angegebenen Zusätze aber unter Fortlassung des Tetrazoliumsalzes aufwies, wurde ein Reaktionsprodukt isoliert, bei dem es sich um Decanal handelte. Die Anwesenheit von Decanal wurde nachgewiesen durch Umwandlung in das 2,4-Dinitrophenylhydrazon von Decanal, das identifiziert wurde.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde die spezifische Aktivität von gereinigter Decanoldehydrogenase bei der Oxydation von Decanol mit der eines Gemischs des gleichen Enzyms und eines rohen Enzymextrakts aus auf Glucose gewachsenen Zellen verglichen.

Der letztgenannte Extrakt wurde hergestellt, indem zunächst Zellen von Pseudomonas aeruginosa auf herkömmlichen Mineralsalzen unter Verwendung einer 0,5%igen Glucoselösung als einziger Kohlenstoffquelle wachsen gelassen ν urden. Die wäßrige Lösung wurde bei 34 OOOfacher Schwerkraft 30 Minuten zentrifugiert, und die klare überstehende Flüssigkeit wurde gewonnen. Sie umfaßte den rohen Enzymextrakt der auf Glucose gewachsenen Zellen und enthielt DPN⁺ und DPNH-Oxydase. Es wurden die spezifischen Aktivitäten der nachstehend aufgeführten Reaktionsgemische bestimmt:

Nr. Enzym-Material

Spezifische Aktivität*)

kein
Zusatz

DPN-Zusatz

DPNH Zusatz

1 zellfreier Glucose- 0,00 0,00 0,00 extrakt

2 gereinigte Decanol- 0,00 180,0 19,0 dehydrogenase

3 Gemisch von 1 0,00 210,0 210,0 und 2

*) Millimikromol oxydierter Alkohol/h/mg Protein.

Die übrigen Bedingungen waren die gleichen wie im Beispiel 1. Es ist ersichtlich, daß das Reaktionsgemisch Nr. 3 die höchsten Werte der spezifischen Aktivität ergab, unabhängig ob DPN⁺ oder DPNH zugegeben wurde. Das letztgenannte Ergebnis ist der Verwendung des rohen zellfreien Glucoseextrakts zuzuschreiben, der das Enzym DPNH-Oxydase sowie oxydierten Kofaktor DPN⁺ enthielt. Im Falle von zugesetztem DPN⁺ wird also, wie aus der Tabelle ersichtlich, bei Reduktion von DPN⁺ zu DPNH letztere Verbindung in Anwesenheit von DPNH-Oxydase und Sauerstoff zu DPN⁺ oxydiert, so daß der oxydierte Kofaktor ständig in dem Reaktionsgemisch anwesend war und demgemäß eine beträchtliche Menge an Decanol oxydiert wurde. Im Falle von zugesetztem DPNH wurde dieser Kofaktor in Anwesenheit der DPNH-Oxydase und Sauerstoff zu DPN⁺ oxydiert, so daß wiederum der letztgenannte Kofaktor ständig in dem Reaktionsgemisch vorlag.

Beispiel 3
5

Es wurde ein roher Enzymextrakt aus auf Decen gewachsenen Zellen benutzt, um Decanal zur Herstellung von Decansäure zu oxydieren. Die in Beispiel 1 verwendete Achromobacter-Sorte wurde in

ίο einer in Bewegung gehaltenen Anordnung auf einem herkömmlichen Mineralsalzmedium mit n-Decan als einziger Kohlenstoffquelle wachsen gelassen. Nach etwa 48 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet, mit einer 0,02molaren wäßrigen Phosphatlösung eines pH-Werts von 7,0 gewaschen und dann in einer 0,05molaren wäßrigen Phosphatlösung mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert, um eine Konzentration von etwa 1 g Zellen je 4 ml Suspension herzustellen. Die Suspension wurde dann den hochfrequenten Schwingungen eines Ultraschallgeräts ausgesetzt, um die Zellen zu zerreißen und lösliche Zellbestandteile, einschließlich Enzyme und Kofaktoren, ^ freizusetzen; letztere lösten sich in der Phosphat- "* lösung. Zellreste wurden durch Zentrifugieren der Lösung entfernt. Der rohe Extrakt, der DPN⁺ und DPNH-Oxydase enthielt, wurde dann auf seine Fähigkeit zur Oxydation von η-Decanal geprüft. Zu diesem Zweck wurde er mit 100 Mikromol Decanal und 1 Mikromol des Indikators 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid gemischt, und das sich ergebende Gemisch wurde unter Schütteln 10 Minuten bei 25° C gebrütet. Dabei wurde ein Zutritt von Luft zu dem Gemisch gestattet. Die Oxydation des Decanals wurde durch Zugabe von 0,1 ml einer 3 n-Schwefelsäure unterbrochen, und das Gemisch wurde dann auf seine Adsorption von sichtbaren Lichtwellen einer Wellenlänge von 500 Millimikron (0,5 Mikron) in einem Kolorimeter untersucht. Der rohe Extrakt hatte ein Adsorptionsvermögen von 0,78 optischen Dichteeinheiten, nach Korrektur für endogene Reduktion des Tetrazoliumsalzes. Der Wert von 0,78 Einheiten bedeutet eine wesentliche Verringerung der Lichtdurchlässigkeit der Probe infolge der Anwesenheit der gefärbten Form des Tetrazoliumsalzes und ist etwa ( äquivalent einer Menge von 0,25 Mikromol (250 Millimikromol) oxydiertem Decanal.

Ein zweiter roher Extrakt aus Decan gewachsenen Zellen wurde in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt und zur Oxydation von Decanal benutzt, genau so wie das vorstehend erläutert wurde, mit der Ausnahme, daß kein Indikator Anwendung fand. Nach der Oxydation hatte das Extraktgemisch ein Absorptionsvermögen von 0,78 optischen Dichteeinheiten. Die Anwesenheit von Decansäure in dem Gemisch wurde dann durch Gasmischchromatographie mit einer bekannten Probe von Decancarbonsäure nachgewiesen. Weiterhin hatte der rohe Extrakt nach Oxydation des Decanals den Geruch der bekannten Decancarbonsäureprobe.

In dem Fließbild gemäß der Zeichnung geben die ausgezogenen Linien bevorzugte Arbeitsmethoden und die gestrichelten Linien andere wertvolle Arbeitsmethoden für einige Beispiele von Verbindungen wieder.

Die im Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise unter Verwendung von Decanoldehydrogenase geht aus dem Fließbild hervor. So werden Zellen auf Decan in der Brütstufe 10 wachsen gelassen, der rohe Enzym-

extrakt 11 wird von den Zellen abgetrennt und dann in der Trennstufe 12 weiter in die Enzyme Decanoldehydrogenase und Decanaldehydrogenase getrennt. Die erstgenannte Verbindung folgt dem Weg 13 und wird bei 14 mit einer Quelle für DPN⁺ vermischt, bei 15 mit Decanol gebrütet, und das gebildete Decanal wird identifiziert, bei 16 abgetrennt und bei 17 gewonnen. In der Stufe 15 wird das DPN⁺ zu DPNH reduziert. Das Beispiel 1 zeigt, daß eine beträchtliche Menge an Decanol oxydiert wird.

In ähnlicher Weise ist die Arbeitsmethode des Beispiels 2, Versuchslauf Nr. 3, zu entnehmen; danach wird Decanoldehydrogenase bei 18 mit dem DPN⁺ und DPNH-Oxydase enthaltenden rohen Extrakt aus Glucose gewachsenen Zellen, der mit dem Bezugszeichen 19 angedeutet ist, vermischt, das sich ergebende Gemisch wird bei 15 mit Decanol gebrütet, und hieraus ergibt sich eine Bildung von Decanal, das bei 17 gewonnen wird. Wie bei der vorstehenden Arbeitsweise wird im Verlauf der Brütstufe 15 DPN⁺ zu DPNH reduziert, aber in diesem Fall enthält der rohe Enzymextrakt 19 auch DPNH-Oxydase, so daß in Anwesenheit dieser Oxydase und in Gegenwart von Sauerstoff das DPNH in der dargestellten Weise zu DPN⁺ zurückoxydiert wird. In dieser Weise steht eine ständige Zufuhr von DPN⁺ für die kontinuierliche Oxydation des Decanols zur Verfügung, so daß beträchtliche Mengen an Decanol oxydiert werden, wie das aus dem Beispiel 2 hervorgeht.

Die im Beispiel 3 beschriebene Arbeitsweise ist ebenfalls aus dem Fließbild ersichtlich; hiernach werden Zellen auf Decan in der Brütstufe 10 wachsen gelassen, es wird roher Enzymextrakt 11 gewonnen, letzterer wird auf dem Weg 20 in die Brütstufe 21 geführt, dann wird Decanal aus der Stufe 17 zugegeben, und das Decanal wird zu Decancarbonsäure oxydiert, das dann gewonnen werden kann. Der rohe Enzymextrakt enthält das für diese Oxydationsstufe notwendige DPN⁺ und weiterhin DPNH-Oxydase für die Regeneration von DPN⁺. Wie in dem Beispiel 3 angegeben ist, wird eine beträchtliche Menge an Decanal oxydiert.

Außer den vorgenannten Verfahrensweisen sind andere Arbeitsmethoden von Interesse. Sb können sowohl Decanal als auch Decancarbonsäure erzeugt werden, indem man bei 12 sowohl Decanol- als auch Decanaldehydrogenasen aus dem rohen Enzymextrakt 11 isoliert, bei 15 Decanoldehydrogenase mit Decanol und einer Quelle für DPN⁺ (entweder aus 14 oder 19) zur Erzeugung von Decanal brütet, einen Teil des letzteren als Produkt gewinnt, einen anderen Teil zu der Brütstufe 21 leitet, Decanaldehydrogenase zusammen mit einer Quelle für DPN"¹ durch die Leitungen 22 und 23 zu dieser Stufe führt, das Decanal enzymisch zu Decancarbonsäure oxydieit und letztere gewinnt. Vorzugsweise wird der rohe Enzymextrakt 19 als Quelle für das erforderliche DPN⁺ verwendet, da er DPNH-Oxydase zur Regeneration von DPN⁺ aus reduziertem Kofaktor enthält.

Es ist ersichtlich, daß das Decanol aus dem Verfahren selbst stammen oder dem Verfahren von außen zugeführt werden kann. Dies gilt für alle Fließwege.

Eine weitere Arbeitsmethode umfaßt eine Bildung von Decanal aus Decanol und eine Erzeugung von Decanol aus Decan. Entweder der Aldehyd oder der Alkohol oder beide können als Produkt gewonnen werden. So kann der rohe Enzymextrakt 11 ohne Trennung durch eine Leitung 24 und die Mischzone 18 zu der Brütstufe 15 geführt werden, wo er mit Decanol vermischt wird, um die Oxydation des Decanols zu Decanal herbeizuführen. Der rohe Extrakt enthält sowohl DPNH-Oxydase als auch DPN⁺, so daß keine Zugaben des letzteren notwendig sind. Das aus der Brütstufe 15 abfließende Material umfaßt, nach Abtrennung des Decanals in der Stufe 16, einen DPNH enthaltenden Rest, der durch eine Leitung 25 zu einer Brütstufe 26 zur Oxydation von Decan geführt wird, letzteres wird durch eine Leitung 27 zugebracht. Für die enzymatische Oxydation von Decan ist das erforderliche Enzym Decan-Oxydase, und der erforderliche Kofaktor ist das reduzierte Nucleotid, d. h. DPNH. Die für die Oxydation des Decans notwendige Decan-Oxydase wird in der Trennstufe 12 erhalten. Es sei in diesem Zusammenhang daran erinnert, daß bei der Trennung des rohen Enzymextrakts, wie sie vorstehend im Beispiel 1 beschrieben ist, das Enzym Decan-Oxydase eines der Materialien war, die in der Adsorptionsmittelsäule zurückblieben. Dieses Enzym kann aus der Säule mittels eines geeigneten Lösungsmittels desorbiert und durch die Leitung 28 geführt werden, so daß es sich mit dem Decan in der Leitung 27, das zu der Brütstufe 26 fließt, vereinigt. Das Material in der Leitung 25 enthält sowohl DPNH-Oxydase als auch DPNH, so daß in der Stufe 26 DPNH in Anwesenheit der DPNH-Oxydase zu DPN⁺ oxydiert wird. Decanol, das in der Stufe 26 gebildet worden ist, zusammen mit begleitendem DPN⁺, kann vollständig durch die Leitung 29 zur Umwandlung in Decanal zu der Brütstufe 15 geleitet werden, oder es kann zu der Trennstufe 30 geführt und in Decanol und DPN⁺ getrennt werden, worauf ein Teil oder die Gesamtmenge des Decanols gewonnen oder ein Teil oder die Gesamtmenge, zusammen mit DPN⁺, durch die Leitungen 31, 32 und 29 zu der Brütstufe 15 geleitet werden kann.

Eine weitere Arbeitsmethode richtet sich auf die Herstellung von Decancarbonsäure aus Decanal und Decanol aus Decan. Decancarbonsäure kann in der Stufe 21 aus Decanal gebildet werden, wobei letzteres in der dargestellten Weise aus der Stufe 17 zugebracht und das notwendige Enzym, d. h. Decanal-Dehydrogenase, durch die Leitungen 22 und 23 zugeführt werden. Der DPN'"-Kofaktor wird durch die Leitung 33 zugesetzt und kommt vorzugsweise aus dem rohen Enzymextrakt 19 durch nicht dargestellte Einrichtungen. Decanol kann aus Decan in der Stufe 26 gebildet werden, wobei dieser Stufe ein DPNH enthaltendes Material sowie Decan aus der Leitung 27 und das erforderliche Enzym aus der Leitung 28 zugebracht werden. Das DPNH enthaltende Material kann aus der Trennstufe 16 stammen und durch die Leitung 25 zufließen, vorzugsweise kann es sich aber auch um ein Material handeln, das in der Stufe 21 erzeugt worden ist, wo DPN⁺ zu DPNH reduziert wird, und das nach Entfernung von Decancarbonsäure aus dem Brütgemisch zur Benutzung zur Verfügung steht; dieses DPNH enthaltende Material kann durch nicht dargestellte Einrichtungen zu der Stufe 26 geführt werden. Eine weitere Arbeitsmethode umfaßt die Herstellung von Decanal, Decancarbonsäure und Decanol. Das Decanal wird in der Stufe 15 aus Decanol unter Verwendung von Decanoldehydrogenase und dem DPN⁺ enthaltenden Rohextrakt 19 gebildet. Ein Teil des erzeugten Decanals wird gewonnen, und ein Teil wird zu der Stufe 21 geleitet, zusammen mit Decanaldehydrogenase und einer Quelle für DPN⁺ aus den

Leitungen 22 und 23; in der Stufe 21 wird Decanal zu Decancarbonsäure oxydiert, und letztere wird gewonnen. Decanol kann in der Stufe 26 erzeugt werden, wo Decan aus der Leitung 27 in Gegenwart des DPNH enthaltenden Materials, das durch die Leitung 25 ein-

geführt wird, und des geeigneten Enzyms, das. durch die Leitungen 28 und 27 zugebracht wird, oxydiert wird. Ein Teil des Decanols kann nach Trennung in der Stufe 30 gewonnen und ein anderer Teil durch die Leitungen 31,32 und 29 zu der Stufe 15 geführt werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1 2

von aliphatischen Aldehyden oder aliphatischen Car-

Patentanspruch: bonsäuren durch enzymatische Oxydation von ali

phatischen Alkoholen oder aliphatischen Aldehyden

Verfahren zur Herstellung von aliphatischen mit der gleichen Zahl von Kohlenstoffatomen unter Aldehyden oder aliphatischen Carbonsäuren durch 5 Verwendung von Enzymen, die dadurch erhalten enzymatische Oxydation von aliphatischen Aiko- worden sind, daß man Zellen eines kohlenwasserstoffholen oder aliphatischen Aldehyden mit der oxydierenden Mikroorganismus auf einem Kohlengleichen Zahl von Kohlenstoffatomen unter Ver- wasserstoff, der etwa die gleiche Anzahl an Kohlenwendung von Enzymen, die dadurch erhalten Stoffatomen wie die zu oxydierende Kohlenstoffverworden sind, daß man Zellen eines kohlenwasser- io bindung aufweist, als einzige Quelle für Kohlenstoff stoffoxydierenden Mikroorganismus auf einem als Nährmedium wachsen läßt, die Zellen erntet und Kohlenwasserstoff, der etwa die gleiche Anzahl aufreißt, daraus die gebildeten Enzyme extrahiert, aus an Kohlenstoffatomen wie die zu oxydierende dem Enzymextrakt ein Enzym isoliert, das Spezifität Kohlenstoffverbindung aufweist, als einzige Quelle für die Kohlenstoffverbindung aufweist, und dieses für Kohlenstoff als Nährmedium wachsen läßt, die 15 Enzym mit der Kohlenstoffverbindung vermischt, ist Zellen erntet und aufreißt, daraus die gebildeten dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem sich erEnzyme extrahiert, aus dem Enzymextrakt ein gebenden Gemisch einen rohen DPN⁺ und DPNH-Enzym isoliert, das Spezifität für die Kohlenstoff- Oxydase enthaltenden Enzymextrakt zusetzt, welcher verbindung aufweist, und dieses Enzym mit der aus Zellen gewonnen worden ist, die auf einem nicht Kohlenstoffverbindung vermischt, dadurchge- 20 aus einem Kohlenwasserstoff bestehenden, Kohlenstoff kennzeichnet, daß man zu dem sich er- enthaltenden Substrat als einziger Quelle für Kohlengebenden Gemisch einen rohen DPN⁺ und DPNH- stoff gewachsen sind, und das Gemisch brütet.
Oxydase enthaltenden Enzymextrakt zusetzt, wel- Das Verfahren gemäß der Erfindung hat den Vorteil,

eher aus Zellen gewonnen worden ist, die auf daß durch die kombinierte Verwendung eines indueinem nicht aus einem Kohlenwasserstoff bestehen- 25 zierten und nichtinduzierten Enzymextrakts zur enden, Kohlenstoff enthaltenden Substrat als einziger zymatischen Oxydation eine wesentliche Aktivitäts-Quelle für Kohlenstoff gewachsen sind, und das steigerung gegenüber der Verwendung eines indu-Gemisch brütet. zierten Enzymextrakts allein erhalten wird.

Das Gemisch wird nicht nur zur enzymatischen

30 Oxydation der Kohlenstoffverbindung bebrütet, son-

dern auch zu der einhergehenden Reduktion des

DPN⁺-Kofaktors zu reduziertem Kofaktor DPNH,

wobei die DPNH-Oxydase eine Regeneration von

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung DPN⁺ aus DPNH herbeiführt und hierdurch eine von aliphatischen Aldehyden oder aliphatischen 35 Aufrechterhaltung stöchiometrischer Mengen anDPN⁺ Carbonsäuren durch enzymatische Oxydation von in dem Gemisch unterstützt.

aliphatischen Alkoholen oder aliphatischen Aide- Dadurch, daß man die Zellen auf einem Kohlen-

hyden. wasserstoff wachsen läßt, der der zu oxydierenden

Die Herstellung von aliphatischen Aldehyden oder Kohlenstoffverbindung beispielsweise bezüglich seiner aliphatischen Carbonsäuren durch chemische Oxy- 40 Kohlenstoffkonfiguration chemisch verwandt ist, wird dationsverfahren ist bekannt. Derartige Oxydations- sichergestellt, daß die Enzyme die erwünschte Speziverfahren erfordern jedoch strenge Oxydationsbedin- fität aufweisen. Wenn beispielsweise Decanol oxydiert gungen (üblicherweise einen pH-Wert im sauren werden soll, ist der Kohlenwasserstoff, der den Zellen Bereich und hohe Temperaturen). Bei diesem Ver- zugeführt wird, zweckmäßig ein Alkan, wie Decan, fahren wird neben dem gewünschten Produkt eine 45 und in diesem Fall ist der erhaltene Enzymextrakt wesentliche Anzahl von Nebenprodukten erzeugt. - aktiv hinsichtlich der Oxydation des Decanols. Die Aus einer wissenschaftlichen Arbeit, veröffentlicht Enzyme, die von den Zellen bei Verwendung des in Biochimica und Biophysica Acta, 69, S. 40 bis 47 Decans erzeugt werden, werden als »induzierte En-(1963), ist die Verwendung von Mikroorganismen zyme« bezeichnet, und es wurde gefunden, daß sie zur Oxydierung von Kohlenwasserstoffen bekannt. 50 dazu neigen, Gruppenspezifität zu zeigen, d. h., daß Auf S. 41 der Veröffentlichung ist beschrieben, wie sie Oxydationsaktivität nicht nur für Decanol besitzen, eine Kultur von P. oleovorans unter Verwendung von sondern auch für eng verwandte Alkohole und Alden-Heptan, n-Octan und n-Nonan gezüchtet wurde. Es hyde, z. B. Nonanol, Octanol, Undecanol, Decanal, wurde ein Enzymextrakt der Zellen hergestellt und Octanal, Undecanal usw. Die decaninduzierten Enzur Oxydierung von Octan zu Octansäure angewendet. 55 zyme können also zur enzymatischen Oxydation einer In der Veröffentlichung befindet sich kein Hinweis Anzahl von oxydierbaren Alkoholen und Aldehyden darauf, daß ein Alkohol oder Alkanal in der gleichen mit beispielsweise 8, 9, 10, 11, 12 usw. Kohlenstoff-Weise oxydiert werden soll; es wird jedoch ausgeführt, atomen je Molekül verwendet werden,
daß die Oxydation über Octanol und Octanal als Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kann entZwischenprodukte vor sich geht. 60 weder der gesamte Enzymextrakt, der aus den Zellen

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines erhalten wird, oder eine ausgewählte Komponente Verfahrens zur Herstellung von aliphatischen Aide- oder Fraktion verwendet werden. Der Gesamtenhyden oder aliphatischen Carbonsäuren, bei dem zymextrakt kann verschiedene Enzyme umfassen, von Produkte hoher Reinheit erzielt werden und die denen eins zur Oxydation einer bestimmten Kohlenmikrobiologische Oxydation zur Herstellung von ali- 65 Stoffverbindung aktiv sein kann, während dies bei den phatischen Aldehyden oder aliphatischen Carbon- anderen nicht der Fall ist. Beispielsweise kann der säuren wesentlich verbessert wird. - Rohextrakt von decaninduzierten Enzymen Decan-

Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung oxydase, die die Oxydation von Decan beeinflußt,