DE3125944C2 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die enzymkataly­ sierte Herstellung von Acetaldehyd aus Methanol. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren für die in situ-Erzeugung von Acet­ aldehyd in äthanolhaltiger Orangen-Essenz.

Die vorliegende Erfindung beruht auf Arbeiten, die sich mit der Erzeugung von Acetaldehyd in Orangen-Essenz befassen. Orangen-Essenz ist ein wäßriges Destillat, das während der anfänglichen Stufen der Verdampfungskonzentrierung von Orangen­ saft erhalten wird und die flüchtigeren Komponenten des Oran­ gengeschmacks enthält. Die wäßrige Essenz wird wieder zu konzentriertem Orangensaft vor dem Gefrieren gegeben, um den frischen Fruchtgeschmack wiederherzustellen, und sie wird auch in großem Umfang als Aromastoff in anderen, auf Zitrus­ früchten basierenden Produkten verwendet.

Es ist bekannt, daß Acetaldehyd, der primäre Aldehyd in der Orangen-Essenz, einen positiven Einfluß auf den Orangen­ geschmack ausübt. Darüber hinaus ist der Acetaldehyd ein wich­ tiger Bestandteil von zahlreichen anderen Fruchtessenzen und spielt daher nicht nur in Zitrusprodukten, sondern in der gesamten Aromaindustrie eine wichtige Rolle. Es ist daher wün­ schenswert, Verfahren zur Herstellung von Acetaldehyd zu unter­ suchen und zu finden, insbesondere zur Herstellung von natürli­ chem Acetaldehyd, das heißt von Acetaldehyd, der durch einen natürlichen Prozeß aus einer auf natürlichem Wege erhaltenen Quelle erzeugt wird.

Orangen-Essenz ist ein sehr geeigneter Stoff für ein solches Verfahren, da Äthanol bis zu 90% der gesamten flüchtigen Bestandteile des Essenz ausmacht, selbst aber keinen positiven Beitrag zu dem Geschmack leistet. Das Verhältnis von Äthanol zu Acetaldehyd in Orangen-Essenz liegt in der Größenordnung von 100 zu 1. Die natürliche in situ-Umwandlung des Äthanols in der Orangen-Essenz zu Acetaldehyd ist daher ein grundsätz­ lich möglicher Weg, um eine an Acetaldehyd angereicherte Essenz herzustellen, vorausgesetzt, daß eine solche Umwand­ lung durchgeführt werden kann, ohne daß die anderen wün­ schenswerterweise vorhandenen Bestandteile des Quellenmate­ rials für das Äthanol nachteilig beeinflußt oder verändert werden.

Die natürliche Oxidation von Äthanol kann auf zahlreichen verschiedenen Wegen erreicht werden. Das Verfahren der US-PS 36 42 581 verwendet Mikroorganismen, um die Oxidation durchzuführen, wobei die Äthanolquelle (Sub­ strat) zu dem Kulturmedium hinzugefügt und das Produkt aus diesem gewonnen wird. Dieses Verfahren eignet sich nicht bei Verwendung eines Materials komplexer Zusammensetzung, wie beispielsweise einer Essenz, wegen der möglichen Veränderung der restlichen Bestandteile außer dem Äthanol und dem Acet­ aldehyd.

Ein zweites, von Leavitt and Pennington gefundenes Verfahren (US-PS 33 44 037) verwendet den voll­ ständigen, zellfreien Enzymextrakt aus einem Mikroorganismus, der in einer Nährbrühe gewachsen ist, wobei das gewünschte Substrat die einzige Kohlenstoffquelle ist. Die Produkte werden entweder durch Lösungsmittelextraktion oder durch Emulgierung der wäßrigen Lösung mit einer Ölphase in welche das Produkt kontinuierlich extrahiert wird, gewonnen (Leavitt, US-PS 38 80 739). Die Ölphase/Produkt-Lösung wird durch Verwendung einer semi-permeablen Membrane gewonnen. Wäh­ rend dieses Verfahren selektiver ist als das zuvor beschriebe­ ne Verfahren, ist es für die Verwendung eines Material komple­ xer Zusammensetzung, wie beispielsweise eine Essenz, unge­ eignet, wegen der möglichen Anzahl ungewünschter Enzymreak­ tionen, die erfolgen können.

Die größte Selektivität bei der natürlichen Oxidation von Äthanol wird durch Verwendung eines spezifischen Enzyms für die Katalysierung der Oxidation erreicht, in diesem Fall Alko­ holdehydrogenase (ADH). Während die in vivo-Verwendung dieses Enzyms schon seit Jahrhunderten bei der fermentativen Erzeu­ gung von Äthanol durch Hefe praktiziert worden ist, hat das reine Enzym wegen der Probleme, die mit der Zurückhaltung und Zurückführung seines erforderlichen Cofaktors, des Nicotin­ amid-adenin-dinucleotids (NAD+) verbunden sind, in der Industrie nur wenig Anwendung gefunden. Die Lösung des ersteren Problems wurde in jüngerer Zeit auf verschiedenen Wegen versucht. Weibel et al., "Enzyme Engineering", Vol. 2, S. 203 (Plenum Press, N.Y. 1973); Weibel, "Interdisciplinary Research on Enzyme Systems With Special Emphasis On Redox Reactions", Report No. NSF/RA 761624, S. 33 (Nat′1. Tech. Info. Serv., Washington, D.C. 1976) und Bright, Ibid., S. 10 haben das Nicotinamid-adenin-dinucleotid auf einem löslichen, hochmole­ kularen Dextrin immobilisiert und diesen immobilisierten Co­ faktor und das ADH-Enzym unter Verwendung einer semi-permeablen Membrane eingeschlossen. Während die Aktivität und die Stabili­ tät von solchen löslichen immobilisierten Cofaktoren ermutigend sind, ist die praktische Anwendung dieser Materialien zum ge­ genwärtigen Zeitpunkt wegen ihrer Zugänglichkeit und aufgrund von wirtschaftlichen Erwägungen ausgeschlossen. Davis (US-PS 39 15 799) lehrt die Zurückhaltung des Cofaktors unter Verwendung eines beträchtlichen Überschusses an Enzym über den Cofaktor, wobei der Cofaktor als ein an das Enzym gebundener Komplex zurückgehalten wird, welcher seiner­ seits durch eine semi-permeable Membrane zurückgehalten wird. Dieser Versuch einer Lösung hat den Nachteil, daß zu jeder Zeit ein großer Teil des Enzyms wegen der teilweisen Cofaktor­ beladung inaktiv ist. Während der Cofaktor zurückgehalten wird, kann ein Cofaktorverlust nicht verhindert werden.

Ein dritter Lösungsweg besteht in der Verwendung einer Mem­ brane, die genügend dicht ist, um sowohl das Enzym als auch den Cofaktor zurückzuhalten, während sowohl Substrat als auch Produkt hindurchwandern können (Chambers et al., "En­ zyme Engineering", Vol. 2, Seite 195 (Plenum Press, N.Y. 1973)). Dieser Lösungsweg ist insofern nachteilhaft, als Membranen, die genügend dicht sind, um NAD+ zurückzuhalten, gleichzeitig die Diffusion von kleineren Molekülen beträchtlich verzögern und so den Kontakt zwischen Enzym und Substrat verringern.

Bei der enzymkatalysierten Umwandlung des Äthanols oder Äthanol enthaltender Produkte zu Acetaldehyd ist die Regenerierung des erforderlichen Cofaktors, der bei der Oxidation des Äthanols reduziert wird, erwünscht, um ein auf kommerziellem Wege durchführbares Verfahren zu erhalten. Die Regenerierung des Cofaktors wurde unter Verwendung eines zweiten Enzyms er­ reicht, wie beispielsweise Lactatdehydrogenase, um den redu­ zierten Cofaktor (NADH) zu oxidieren, während ein zweites Substrat reduziert wird (Mosbach et al., "Enzyme Engineering", Vol. 2, Seite 143, Plenum Press, N.Y. 1973). Dies erfordert die Abtrennung der Produkte, die aus den beiden Enzymreaktio­ nen erhalten werden. Ein ähnlicher Lösungsweg wird von Fink in Enzyme Technology Digest, 5, 52 (1976) beschrieben, bei welchem jedoch kein zweites Enzym benötigt wird, und bei wel­ chem Benzaldehyd zu der Reaktionsmischung hinzugegeben wird, welcher während der Äthanoloxidation durch NADH reduziert wird und auf diese Weise eine Rückführung des NADH in NAD+ erfolgt. Dies macht wiederum die Abtrennung der Produkte er­ forderlich. Ein dritter Lösungsweg besteht darin, den redu­ zierten Cofaktor schließlich mit molekularem Sauerstoff zu oxidieren, entweder über einen geeigneten, zwischengeschalte­ ten Protonenakzeptor, wie beispielsweise Flavin, oder auf direktem Wege unter Verwendung eines Enzyms, wie beispiels­ weise Diaphorase (Chambers, supra; Jones, Enzyme Technology Digest, 5, 50 (1976)).

Neben diesen Schwierigkeiten zur Schaffung eines praktischen, enzymkatalysierten Verfahrens zur Umwandlung von Äthanol, ins­ besondere von Äthanol, das als Bestandteil in einer komplexen Mischung, wie einer Essenz, enthalten ist, zu Acetaldehyd, ist diese Gleichgewichtsumwandlung in thermodynamischer Hin­ sicht für eine merkliche Oxidation des Äthanols ungünstig. Tatsächlich begünstigen Gleichgewichtserwägungen die umgekehrte Reaktion, das heißt die Umwandlung des Acetaldehyds in Äthanol, selbst unter theoretisch ungünstigen Bedingungen, wie beispiels­ weise bei Vorliegen des Äthanols in einem beträchtlichen Über­ schuß. Das Gleichgewicht kann jedoch zugunsten der Bildung von Acetaldehyd verschoben werden, indem man den Acetaldehyd bei seiner Bildung entfernt. Bislang wurde dies dadurch er­ reicht, daß man entweder ein Carbonyladditionsprodukt des Acetaldehyds (beispielsweise mit Natriumbisulfit) bildete, oder eine enzymatische Umwandlung des Acetaldehyds zu einem anderen Produkt mittels einer irreversiblen oder thermodynamisch gün­ stigen Gleichgewichtsreaktion durchführte (beispielsweise durch Oxidation des Acetaldehyds zu Essigsäure). Es ist offensichtlich, daß ein solches Vorgehen unerwünscht ist, wenn man Acetaldehyd oder ein mit Acetaldehyd angereichertes Produkt erhalten will.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit welchem auf ökonomi­ sche Weise und auf natürlichem Wege beträchtlich erhöhte Men­ gen an Acetaldehyd in situ aus Äthanol erzeugt werden können. Sofern dabei Äthanol enthaltende Fruchtessenzen, insbesondere Orangen-Essenz, eingesetzt werden, sollen andere Änderungen in der Zusammensetzung der Essenzen, die unerwünscht sein könnten, auf einem Minimum gehalten werden.

Gelöst wird diese Aufgabe durch das in den Ansprüchen be­ schriebene Verfahren.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die enzymkatalysierte in situ-Umwandlung von in einer Fruchtessenz vorhandenem Äthanol, insbeson­ dere Orangen-Essenz, zu Acetaldehyd, um eine mit Acetaldehyd angereicherte Essenz zu erhalten. Im speziellen umfaßt das Verfahren die Verwendung von Alkoholdehydrogenase und ihres Cofaktors Nicotinamid-adenin-dinucleotid, um das in der Orangen- Essenz vorhandene Äthanol zu Aldehyd umzuwandeln, wobei ledig­ lich das Alkoholdehydrogenase-Enzym durch eine semi-permeable Membrane zurückgehalten oder isoliert wird, während eine freie Diffusion der Essenz, des Cofaktors und der Reaktionsprodukte durch die Membrane gestattet wird. Darüber hinaus beinhaltet das Verfahren die Verwendung eines speziellen Materials, das heißt Tri-(hydroxymethyl)-methylamin, um die Reaktionslösung zu puffern und, was noch wichtiger ist, einen Anlagerungs­ komplex mit dem Acetaldehyd zu bilden, der bei der Umsetzung gebildet wird. Durch diese Komplexbildung wird der Acetaldehyd im wesentlichen aus dem Reaktionssystem "entfernt", und dadurch verschiebt sich die Gleichgewichtsreaktion zugunsten der Bil­ dung von zusätzlichen Acetaldehyd. Der gebildete Komplex ändert die chemische Natur des Acetaldehydproduktes per se nicht, und der Acetaldehyd kann durch sehr einfache Maßnahmen quanti­ tativ aus dem Komplex zurückgewonnen werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Orangen-Essenz behandelt, um erhöhte Mengen an gewünschtem Acetaldehyd in situ zu erzeugen, und zwar durch ein Verfahren, welches die Inberührung-Bringung von Orangen-Essenz, Alkohol­ dehydrogenase, Nicotinamid-adenin-dinucleotid und Tri-(hydroxy­ methyl)-methylamin unter solchen Bedingungen beinhaltet, bei denen das in der Essenz enthaltene Äthanol zu Acetaldehyd um­ gewandelt wird, wobei der erzeugte Acetaldehyd mit dem Tri- (hydroxymethyl)-methylamin einen Anlagerungskomplex bildet. Während des Ablaufes der Oxidationsreaktion wird der Cofaktor Nicotinamid-adenin-dinucleotid reduziert. Die Regenerierung dieses Cofaktors, die erforderlich ist, um die Umwandlung des Äthanols zu Acetaldehyd zu unterhalten, wird dadurch erreicht, daß man den reduzierten Cofaktor mit einem Oxidationsmittel unter geeigneten Bedingungen in Berührung bringt. Dieses Oxi­ dationsmittel, das selbst während der Regenerierung des redu­ zierten Cofaktors reduziert wird, wird seinerseits durch ge­ eignete Oxidationsmittel regeneriert.

Gemäß weiterer spezieller Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung wird ein bevorzugtes Verfahren, wie das oben be­ schriebene, unter Verwendung besonders günstiger Materialien skizziert. Das Gesamtreaktionsschema kann wie folgt dargestellt werden:

Bei dieser Umsetzung wird Äthanol (beispielsweise vorhanden in Orangen-Essenz) in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase und Nicotinamid-adenin-dinucleotid zu Acetaldehyd umgewandelt, in zusätzlicher Gegenwart von Tri-(hydroxymethyl)-methylamin (nicht dargestellt), um die Reaktion zu puffern und den gebil­ deten Acetaldehyd zu komplexieren. Der Cofaktor wird durch lichtkatalysierte Oxidation des reduzierten Cofaktors mit Flavinmononucleotid (FMN) regeneriert. Das reduzierte Flavin­ mononucleotid (FMNH₂) wird durch Oxidation mit molekularem Sauerstoff wieder in FMN umgewandelt. Das Nebenprodukt dieser letzteren Umwandlung, Wasserstoffperoxid, wird durch Einwirkung der Enzymkatalase zu Sauerstoff und Wasser zersetzt, wobei der auf diese Weise erzeugte Sauerstoff für die Oxidation von FMNH₂, wie oben beschrieben, zur Verfügung steht.

Wie bereits erwähnt, besteht ein wichtiger Gesichtspunkt des oben beschriebenen Verfahrens in der Verwendung von Tri-(hydroxy­ methyl)-methylamin, um mit dem gebildeten Acetaldehyd einen Anlagerungskomplex zu bilden und dabei die enzymkatalysierte Gleichgewichtsumwandlung des Äthanols zu verstärken. Ein anderer wichtiger Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung der Alkoholdehydrogenase in der Reaktion. So wurde gefunden, daß, obgleich es theoretisch möglich ist, die gesamte Reaktionsabfolge auf eine Weise durchzuführen, bei der sämtliche Reaktionsteilnehmer und Produkte miteinander ver­ mischt und den geeigneten Reaktionsbedingungen unterworfen werden können, ein solches Verfahren zu einer oder mehreren unerwünschten Reaktionen führen kann. Beispielsweise kann die Einwirkung der lichtkatalysierten Regenerierung des Nicotinamid­ adenin-dinucleotids oder die sauerstoffinduzierte Oxidation des reduzierten Flavinmononucleotids oder die Einwirkung beider Reaktionen auf die Alkoholdehydrogenase zu einem Abbau, einer Inaktivierung oder Zerstörung dieses Enzyms führen. Die glei­ chen nachteiligen Auswirkungen können dann eintreten, wenn die­ ses Enzym während der Verfahrensmaßnahmen und -bedingungen anwesend ist, die zur Rückgewinnung des Acetaldehyds aus dem Anlagerungskomplex mit Tri-(hydroxymethyl)-methylamin angewandt werden, und selbst durch das einfache Nebeneinandervorliegen des Enzyms und des freien Acetaldehyds für irgendeinen Zeit­ raum.

Demzufolge wurde ein Verfahrensschema entwickelt, welches auf der Isolierung der Alkoholdehydrogenase während der Reaktions­ abfolge beruht. Ungleich bestimmten bekannten Verfahren muß jedoch nur die Alkoholdehydrogenase isoliert werden (wie dies nachfolgend diskutiert werden wird, wobei andere Enzyme, wie beispielsweise Katalase, die in dem Verfahren Anwendung fin­ den, ebenfalls irgend eine Form von Isolierung von besonde­ ren Reaktionsmaterialien oder -bedingungen erforderlich ma­ chen), das heißt, der Nicotinamid-adenin-dinucleotid-Cofaktor muß nicht auf ähnliche Weise isoliert und eingeschlossen werden.

Gemäß diesem Verfahren wird eine erste Zone gebildet, die die Alkoholdehydrogenase und die anderen Materialien und Reaktionsteilnehmer, die in dem Verfahren verwendet werden, enthält (beispielsweise Quellenmaterial für das Äthanol, Cofaktor, Flavinmononucleotid und Tri-(hydroxymethyl)-methyl­ amin (THAM)). Weiterhin wird eine zweite Zone gebildet, die die gleichen Materialien mit Ausnahme der Alkoholdehydrogenase enthält. Die Zonen werden durch eine semi-permeable Membrane getrennt, die solche Abmessungen aufweist, daß die Alkohol­ dehydrogenase in der ersten Zone zurückgehalten wird, jedoch den Durchgang aller anderen Ausgangsmaterialien und auch der während der Reaktionen gebildeten Produkte (einschließlich des Acetaldehyd/Tri-(hydroxymethyl)-methylamin-Komplexes) zwischen den Zonen gestattet. Zu Beginn des Verfahrens reagiert das Äthanol in der ersten Zone in Gegenwart von Alkoholdehydro­ genase und ihres Cofaktors unter Bildung von Acetaldehyd, welcher dann mit dem THAM-Puffer einen Anlagerungskomplex bildet. Der sich dadurch ergebende Konzentrationsmangel an Äthanol in der ersten Zone stellt eine Treibkraft für die Diffusion des Äthanols in der zweiten Zone durch die Membrane dar, und dieses reagiert dann in der ersten Zone in Gegenwart des Enzyms und des Cofaktors, während der Acetaldehyd/THAM- Komplex aufgrund eines ähnlichen Konzentrationsgradienten durch die Membrane in die zweite Zone diffundiert. Auf gleiche Weise erfolgt eine Diffusion des reduzierten Cofaktors aus der ersten in die zweite Zone und eine Diffusion des Cofaktors aus der zweiten in die erste Zone.

Die in der zweiten Zone vorhandenen Materialien können ge­ trennt unter solchen Bedingungen behandelt werden (beispiels­ weise Beleuchtung, Sauerstoffzugabe, Entfernung von Acet­ aldehyd), welche zu den gewünschten Regenerierungs-, Zerset­ zungs- (beispielsweise von H₂O₂) oder Dekomplexierungsreak­ tionen führen, welche jedoch wünschenswerterweise von der Alkoholdehydrogenase entfernt gehalten werden. Die zweite Zone kann dann wieder mit der ersten Zone in Kontakt gebracht wer­ den (durch die Membrane hindurch), um die erste Zone mit rege­ nerierten Materialien zu ergänzen, zusätzliches Quellenmate­ rial für das Äthanol zur Verfügung zu stellen und das Acet­ aldehydprodukt und andere Produkte für die Regenerierung aus der ersten Zone aufzunehmen.

Es ist offensichtlich, daß die vorliegende Er­ findung, was die Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd be­ trifft, auf jede Äthanolquelle anwendbar ist, unabhängig da­ von, ob das Äthanol im wesentlichen rein ist oder in Mischung mit anderen Komponenten vorliegt, ob es aus einer künstlichen oder einer natürlichen Quelle stammt, oder ob das gewünschte Produkt Acetaldehyd per se oder ein an Acetaldehyd angerei­ chertes Produkt ist.

Die verschiedenen Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung werden nachstehend mit Hilfe von Zeichnungen und einer Anzahl von Ausführungsbeispielen im einzelnen weiter erläutert.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Äthanol oder ein Äthanol enthaltendes Produkt (Substrat) in flüssiger Phase in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase (ADH), ihres Cofaktors Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+) und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin (THAM) umgesetzt, um Acet­ aldehyd in Form eines Anlagerungskomplexes mit THAM zu bilden. Die Bedingungen dieser Reaktion werden so gewählt, daß sowohl die gewünschte Reaktion als auch die Bildung des Anlagerungs­ komplexes erfolgen. Die Reaktion erfolgt bei einer Tempe­ ratur im Bereich von etwa 18° bis etwa 40°C, vorzugsweise etwa 20°C bis etwa 30°C und insbesondere 25°C bis etwa 30°C, und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 9,0, vorzugsweise von etwa 8,2 bis 8,7, durchgeführt. Bei Temperaturen unterhalb etwa 18°C wird die Geschwindigkeit der enzymkatalysierten Reaktion als unökono­ misch gering erachtet, während Temperaturen oberhalb etwa 40°C in die Nähe solcher Temperaturen kommen, bei denen das Enzym durch Denaturierung inaktiv wird. Bei dieser Reaktion werden die relativen Mengen an Reaktionsteilnehmern (ein­ schließlich Substrat und NAD+), Enzym-Katalysator (ADH) und Puffer (THAM) so gewählt, daß eine hohe Reaktionsgeschwindig­ keit erzielt wird, um die Komplexbildung von im wesentlichen allem erzeugten Acetaldehyd zu gewährleisten (die Anwesenheit von freiem Acetaldehyd beeinflußt in nachteilhafter Weise die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Vollständigkeit der Reak­ tion und hat eine inhibierende Wirkung auf die ADH-Aktivi­ tät), und um eine ausreichende Pufferkapazität in dem Reak­ tionssystem sicherzustellen.

Die Menge an eingesetztem THAM muß ausreichend sein, um ein Molverhältnis von 0,5 : 1 bis 5,0 : 1 in der Reaktionslösung, bezogen auf den darin erzeugten Acetaldehyd, zu ergeben, vorzugsweise von etwa 1,5 : 1 bis etwa 2,5 : 1, insbesondere von 1,5 : 1 bis 2,0 : 1. Die praktische obere Grenze dieses Ver­ hältnisses von THAM zu Acetaldehyd wird in erster Linie eher durch ökonomische als durch chemische oder funktionel­ le Erwägungen bedingt. Das Molverhältnis von NAD+ zu ADH wird typischerweise in einem Bereich von etwa 50 : 1 bis etwa 500 : 1 gehalten, wobei die maximale Reaktions­ geschwindigkeit bei einem Molverhältnis von etwa 380 : 1 er­ reicht wird.

Um eine länger unterhaltene Reaktion zur weiteren Herstellung von Acetaldehyd zu erhalten, ist es notwendig, daß das bei der Reaktion reduzierte Nikotinamid-adenin-dinucleotid regene­ riert wird, um für die weitere Reaktion zur Verfügung zu ste­ hen. Zu diesem Zweck enthält das Reaktionssystem ein Oxidations­ mittel, das in der Lage ist, reduziertes NAD+ (NADH) zu NAD+ zu oxidieren. Die funktionellen Erfordernisse für dieses Oxidationsmittel bestehen einfach in der Fähigkeit, diese Regenerierung zuwege zu bringen, ohne daß ein Teil des NAD+- Moleküls so zerstört wird, daß es nicht mehr als effektiver Cofaktor für ADH in der Hauptreaktion wirken kann, in der chemischen Verträglichkeit mit anderen Bestandteilen des Reaktionssystems, darin, daß andere gewünschte Reaktionen nicht gestört werden, und in der Wasserlöslichkeit. Die sekun­ dären, aber dennoch wichtigen Erfordernisse umfassen Kosten und Zugänglichkeit, und, sofern Nahrungsmittel betroffen sind, Nahrungsmittelverträglichkeit. Wenn darüber hinaus die Äthanol­ quelle eine komplexe Geschmacks- und/oder Aromafraktion ist, ist es offensichtlich wünschenswert, daß das Oxidationsmittel so gewählt wird, daß es keine ungewünschten Änderungen bei den anderen Bestandteilen der Fraktion hervorruft. Weiterhin ist es wünschenswert, wenn die Reaktionsabfolge die weitere Regenerierung von in der Reaktion verwendeten Materialien um­ faßt, daß das Oxidationsmittel so gewählt wird, daß es seine eigene Regenerierung auf eine solche Weise gestattet, die nicht übermäßig komplex ist und keinen nachteiligen Einfluß auf die anderen Materialien in dem System hat oder zu Nebenproduk­ ten führt, die solche nachteiligen Auswirkungen ausüben.

Das bevorzugte Oxidationsmittel, das all diese Kriterien erfüllt, ist Flavinmononucleotid (FMN). Andere Mittel umfassen Ribo­ flavin, Cytochrome, Chinone, Phenazinmethosulfat, 2,6-Dichlor­ phenylindophenol, Acriflavin und Flavin-adenin-dinucleotid.

Die Verwendung des bevorzugten Oxidationsmittels, FMN, erfor­ dert eine Beleuchtung, um die Oxidation des NADH zu NAD+ her­ beizuführen. Dies wiederum verursacht das Problem von möglicher­ weise nachteiligen Auswirkungen durch die Beleuchtung auf das ADH-Enzym infolge von fotokatalytischen Effekten. Es wird da­ her vorgezogen, die lichtkatalysierte Oxidation mit FMN in Abwesenheit des ADH-Enzyms durchzuführen. Wie bereits oben beschrieben und nachfolgend im einzelnen erläutert werden wird, ist die Verwendung einer semi-permeablen Membrane, um ADH auf der einen Seite zurückzuhalten, ein wirksames Mittel, um dies zu erreichen.

Im Hinblick auf das Reaktionsschema bleiben die Bedingungen insoweit für die grundlegende Reaktion des Äthanols zu Acet­ aldehyd im wesentlichen unverändert, trotz der Anwesenheit des Oxidationsmittels in der Reaktionslösung. Im allgemeinen ist das Oxidationsmittel, beispielsweise FMN, in der Reaktions­ mischung in einem Molverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 17 : 1, bezogen auf NAD+, vorzugsweise in einem Bereich von etwa 3 : 1 bis etwa 10 : 1, vorhanden. Wenn die Oxidation von NADH zu NAD+ unter Verwendung von FMN erfolgt, wird die Belichtung dieser Reaktionsteilnehmer mit einer Beleuchtungsquelle wie beispiels­ weise Tageslicht oder kaltes, weißes Fluoreszenzlicht bevor­ zugt, obgleich auch kurzwelliges UV-Licht, langwelliges UV- Licht oder Glühlicht verwendet werden kann. Im allgemeinen wird Licht eines Wellenlängenbereichs von etwa 400 nm bis etwa 520 nm bevorzugt, wobei ein optimaler Bereich im Bereich von etwa 440 nm bis etwa 460 nm liegt.

In weiterer Optimierung des Reaktionsschemas können Mittel vor­ gesehen sein, um das Oxidationsmittel zu regenerieren, das während der Oxidation von NADH zu NAD+ reduziert worden ist. Auch hier müssen die Mittel zur Durchführung dieser Regenerie­ rung, sowohl im Hinblick auf die angewandten Bedingungen als auch im Hinblick auf die erzeugten Nebenprodukte, verträglich mit den anderen Bestandteilen und den Reaktionen sein, ob­ gleich, wie bereits oben erwähnt, die Isolierung des ADH- Enzyms ein wirksames Mittel ist, um nachteilige Auswirkungen irgendeiner gewählten Regenerierungstechnik auf einem Minimum zu halten.

In dieser Hinsicht bevorzugt, insbesondere wenn FMN als Oxi­ dationsmittel verwendet wird, ist die einfache Oxidation von reduziertem FMN (FMNH₂) zu FMN in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff. Da Sauerstoff das ADH-Enzym abbauen kann, wird auch hier diese Regenerierung von FMN vorzugsweise in Abwesen­ heit von ADH durchgeführt. Der Oxidationsgrad von FMNH₂ zu FMN kann dadurch kontrolliert bzw. verfolgt werden, daß man die Farbe der Lösung mit dem Auge oder spektrofotometrisch überwacht. Wenn FMN reduziert wird, wird ein Abklingen der Absorption bei 450 nm beobachtet, und die reflektierte Farbe ändert sich von gelb-orange in amber und schließlich in bläulich-grün. Demzufolge kann die Sauerstoffzugabegeschwindig­ keit so eingestellt werden, daß die gelb-orange Farbe beibe­ halten wird.

Das Nebenprodukt der Sauerstoffregenerierung von FMN ist Wasserstoffperoxid, eine Verbindung, die auf das ADH-Enzym einen zerstörenden Einfluß hat. Es ist deshalb äußerst wün­ schenswert, diese Reaktion nicht nur in Abwesenheit von ADH durchzuführen, sondern auch das H₂O₂ so schnell wie möglich nach seiner Bildung zu entfernen, um einen möglichen Kontakt mit ADH in solchen Fällen auf ein Minimum zu beschränken, bei denen die Reaktionslösung für die Berührung damit rezirkuliert wird. Ein wirksames Mittel, dies zu erreichen, besteht darin, das H₂O₂ durch die Einwirkung von Enzymkatalase zu Wasser und Sauerstoff zu zersetzen. Die Katalase kann zusammen mit dem ADH-Enzym anwesend sein (die Isolierung wegen abbauender Ein­ flüsse durch beispielsweise Belichtung ist in gleicher Weise auch auf die Katalase anwendbar). Vorzugsweise ist die Katalse selbst jedoch während der Reaktionsabfolge von ADH getrennt, so daß die Peroxid-Zersetzung ohne besonderes Augenmerk auf eine mögliche Berührung mit ADH durchgeführt werden kann.

Die Kombination und Wechselwirkung der oben beschriebenen Merk­ male und Maßnahmen können im Hinblick auf das schematische Diagramm des in Fig. 1 dargestellten halbkontinuierlichen Reaktionssystems auf einfachere Weise erläutert werden.

Die Mittel, um ADH in diesem Reaktionssystem getrennt zu halten, umfassen eine Hohlfasereinheit 10, die aus einer Mehrzahl von hohlen Fasern 12 aus semi-permeablem Membranematerial mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von etwa 10.000 besteht, wobei diese Fasern in einer Patronenhülse 14 angeordnet sind. Wie in Fig. 1 dargestellt, sind drei dieser Einheiten parallel geschaltet, um erhöhte Durchsätze zu gestatten. Es ist jedoch offensicht­ lich, daß die Anzahl, Größe und Anordnung dieser Einheiten je nach besonderen Verfahrensvorteilen variiert werden können.

Das im Gefäß 16 enthaltene Äthanol enthaltende Substrat wird mit einer aus dem Gefäß 18 kommenden, THAM-gepufferten (pH-Wert 8,5) und NAD+, FMN und Zinkchlorid enthaltenden Lösung in Leitung 20 vermengt und in dem statischen Mischer 22 ver­ mischt. Zinkchlorid ist ein weiterer Cofaktor, der die Reak­ tion unterhält und einen schützenden Einfluß auf das ADH- Enzym ausübt, und es kann typischerweise in einem Molverhält­ nis, bezogen auf Alkoholdehydrogenase, von etwa 5 : 1 bis 500 : 1, vorzugsweise von etwa 20 : 1 bis 100 : 1, angewandt werden, wobei optimale Ergebnisse bei einem Molverhältnis von etwa 50 : 1 erzielt werden. Die erhaltene Lösung wird aus dem Bewegungs­ gefäß 24 herausgepumpt und durch die in den Fasereinheiten 10 enthaltenen Fasern 12 zirkuliert. ADH-Enzym und Katalase wer­ den in dem gleichen THAM/NAD+/FMN/ZnCl₂-Medium aufgelöst und aus dem Gefäß 26 in Leitung 28 eingeführt und in den Patronen­ hülsen 14 der Fasereinheiten 10 zirkuliert (so daß die Zirku­ lation an der Außenseite der Faser 12 erfolgt), und zwar über Leitungen 30 oder 32, je nachdem, ob ein Gegenstrom oder ein Gleichstrom gewünscht wird.

Innerhalb der Fasereinheiten 10 findet die Umsetzung des Äthanols zu Acetaldehyd in Anwesenheit von ADH statt, das in den Patronenhülsen 14 zirkuliert, wobei das Äthanol zu Beginn durch den ADH-Zuführungsstrom, und bei Fortschreiten des Ver­ fahrens durch Diffusion des Äthanols aus dem in den Hohlfa­ sern 12 zirkulierenden Strom durch die die Membrane bildenden Fasern hindurch in den ADH enthaltenden Strom, zur Verfügung gestellt wird. Auf ähnliche Weise diffundiert der bei der Reaktion erzeugte und mit THAM komplexierte Acetaldehyd durch die Membrane in den Strom, der innerhalb der Hohlfasern zir­ kuliert.

Der aus den Fasern austretende abfließende Strom verläßt die Fasereinheiten über Leitungen 34, 35 und 36 und wird in Leitung 38 vermischt, von wo aus er zur Belichtung mit Fluores­ zenzlicht, um NADH zu NAD+ zu oxidieren, durch die Belich­ tungseinheit 40 geführt wird, wobei NADH in diesem abfließen­ den Strom wegen seiner Diffusion durch die Membrane aus dem Enzym enthaltenden Strom, wo es durch Reduktion des NAD+ bei der Äthanolreaktion gebildet wurde, anwesend ist. Nach der Durchführung durch die Bestrahlungseinheit wird ein Teil des abfließenden Stromes in das Titrationsgefäß 42 gepumpt, wo der pH-Wert so eingestellt wird, daß eine Dekomplexierung des Acetaldehyd von THAM erfolgt, und dann in den Verdampfer 44 gepumpt, um flüchtige Bestandteile abzuziehen und in der Kühl­ falle 46 aufzufangen. Nach Wiedereinstellen des pH-Wertes wird das verbleibende Konzentrat im Verdampfer zu dem Gefäß 18 zurückgeführt.

Der restliche Teil des abfließenden Stromes wird über Lei­ tung 50 in das Bewegungsgefäß 24 gepumpt, wo eine Sprinklung mit Sauerstoff durchgeführt wird, um in der Bestrahlungsvorrichtung 40 erzeugtes FMNH₂ in FMN zurückzuver­ wandeln. Das Bewegungsgefäß 24 ist typischerweise mit einer Kühlfalle 52 ausgerüstet, um Verluste von mitgerissenen flüchtigen Materialien während der Sauerstoffanreicherung zu verhindern. Die Bestandteile des Bewegungsgefäßes 24 wer­ den, wie zuvor beschrieben, durch die Hohlfasern 12 rezirku­ liert, wobei zusätzliche Mengen an THAM, NAD+, FMN und Äthanol enthaltendem Substrat hinzugefügt werden (aus den Gefäßen 16 und 18), soweit erforderlich, um die Reaktion zu unterhalten und die gewünschten Konzentrationsgradienten einzustellen.

NAD+ kann periodisch gereinigt werden, beispielsweise durch Acetonausfällung aus der Pufferlösung, oder durch Gelfiltra­ tion auf Sephadex G-10, gefolgt von der Abtrennung von FMN und Nucleotidfragmenten auf einer DEAE-Sephadex-Anionen­ austauschersäule, wobei mit Natriumacetatpuffer (pH-Wert 4,7) eluiert wird. Die NAD+-Fraktion wird durch Gelfiltration ent­ salzt und gefriergetrocknet. Das FMN wird mit Ammoniumsulfat aus der DEAE-Sephadex-Säule ausgewaschen und verworfen. Diese NAD+-Reinigungsstufe ist eine wahlweise Vorsichtsmaßnahme, um sicherzustellen, daß Fragmente von NAD+, die sich gegenüber ADH hemmend auswirken (in erster Linie Adenosinmonophosphat, Adenosindiphosphat und ADP-Ribose) keine hemmenden Konzentra­ tionen im Reaktionsgefäß erreichen. Die durchschnittliche Wiedergewinnung von NAD+ liegt bei diesem Verfahren bei 97%.

Die Verwendug von THAM dient in dem oben beschriebenen Ver­ fahren, und auch im Hinblick auf andere Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung, nicht nur dazu, das Reaktionssystem zu puffern, sondern auch dazu, das sonst ungünstige Gleichgewicht der enzymkatalysierten Äthanolreaktion zu verändern, indem sie ein Mittel darstellt, um den Acetaldehyd, so wie er entsteht, zu "entfernen" (das heißt zu binden).

Es wurde aufgrund von Experimenten festgestellt (von denen einige nachfolgend als Beispiele beschrieben werden), daß Acetaldehyd in alkalischer Lösung einen schwachen, nichtgebun­ denen Anlagerungskomplex mit dem Puffermittel (THAM) bildet. In alkalischen Lösungen des Komplexes kann der freie Acet­ aldehyd quantitativ durch herkömmliche Destillation bei atmo­ spärischem Druck (100°C) wiedergewonnen werden. Die teil­ weise Rückgewinnung des reinen Acetaldehyds aus alkalischer Lösung kann durch wiederholte Lösungsmittelextraktionen oder wiederholte Vakuumdestillation bei niedriger Temperatur er­ reicht werden. Wenn der pH-Wert einer Lösung des Komplexes jedoch geringfügig auf unterhalb des Neutralpunkts verringert wird, wird die Anlagerung geschwächt, der Acetaldehyd befreit, und er kann dadurch quantitativ durch Vakuumdestillation bei niedriger Temperatur zurückgewonnen werden (beispielsweise 8 bis 15°C). Der Mechanismus der Komplexbildung scheint nur eine Wasserstoffbindung zwischen den Hydroxyl- und Amino­ gruppen von THAM und der hydratisierten Form des Acetaldehyds zu beinhalten. Die spektroskopische Überwachung des Komplexes in Lösung ergibt keine Anhaltspunkte für die Bildung einer Schiff′schen Base zwischen der Carbonylgruppe des Acetaldehyds und der Aminofunktion von THAM, wahrscheinlich deshalb, weil THAM bei dem pH-Wert der Reaktionsmischung eine stärkere Base ist als die Aldehydcarbonylgruppe, und es (THAM) deshalb dazu neigt, eher protoniert zu werden als einen nucleophilen Charak­ ter zu zeigen. Der komplexierte Acetaldehyd kann quantitativ durch Gasflüssigchormatographie (GLC) oder durch colorimetri­ sche Standardanalyse bestimmt werden. Die Pufferkapazität von THAM wird durch die Komplexbildung nicht augenscheinlich be­ einträchtigt. Von allen möglichen Puffern in diesem pH-Bereich, die im Rahmen der Erfindung so untersucht wurden, zeigte nur THAM die Fähigkeit, einen solchen Komplex mit Acetaldehyd zu bilden. Glycin und Glycylglycin beispielsweise reagieren lang­ sam und irreversibel mit Acetaldehyd unter Bildung von Iminen.

Diese Funktionalität von THAM in Gegenwart von Acetaldehyd macht es möglich, die enzymkatalysierte Äthanolumwandlungs­ reaktion trotz des sonst ungünstigen Gleichgewichtes durch­ zuführen, und es werden daneben Verluste durch Verdampfung und Entzündungsgefahren während des gesamten Verfahrens auf ein Minimum beschränkt. Diese gleiche Funktionalität von THAM kann in vorteilhafter Weise auch in jedem anderen Verfahren ausgenutzt werden, wo es wünschenswert ist, entweder aus Gleichgewichts­ gründen oder aus anderen Gründen, den entweder hergestellten oder im Verfahren anwesenden Acetaldehyd zu komplexieren, zu binden oder zu stabilisieren.

Der Acetaldehyd kann dann durch Destillation bei atmosphä­ rischem Druck oder durch Einstellung des pH-Wertes (vorzugs­ weise auf einen Bereich von etwa 6,0 bis etwa 6,8) und Vakuumdestillation bei erniedrigter Temperatur (beispielsweise 10°C bis 15°C) von THAM dekomplexiert werden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern eine Reihe von Merkmalen und Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung.

Beispiel I Ansatzweises Reaktorsystem (200 ml Arbeitsvolumen)

Eine Amicon H1P10 Hohlfaserpatrone (0,0924 qm Faser­ oberfläche), die in einem DH-4-Adapter befestigt war, wurde bei diesem Laborsystem gemäß dem schematischen Diagramm von Fig. 2 verwendet. Ein Sprenggefäß 101 (150 ml Kapazität) wurde nacheinander mit einer -30°C-Kondensiervorrichtung 102 und einer Falle mit flüssigem Stickstoff und einer Scheide­ wandöffnung zur Probenentnahme versehen.

Es wurden 200 ml Reaktionslösung hergestellt, die 0,2 M THAM-Glycinpuffer (pH-Wert 0,9), 750 mg NAD+ (5,3×10^-3 M), 3,0 g FMN (3,3×10^-2 M), ZnCl₂ (5×10^-4 M), 100 ml Orangen- Essenz und 1990 ppm Aceton (interner gaschromatographischer Standard) enthielt. Die anfänglichen Konzentrationen für Acet­ aldehyd und Äthanol in dieser Mischung lagen bei 310 mg/l bzw. 21 500 mg pro Liter.

110 ml dieser Lösung wurden in das Sprenggefäß 101, und der Rest in ein Enzymzuführungsgefäß 104 gegeben, enthaltend 40 mg ADH und 10 mg Katalase, und ausgerüstet mit einer Scheidewand. Die Ströme aus den Gefäßen 101 und 104 wurden dann durch die Fasereinheit 105 zirkuliert, wobei der Strom aus dem Gefäß 101 durch die Hohlfaser 106, und der Strom aus dem Gefäß 104 an der Außenseite der Fasern innerhalb der Patronenhülse 107 zirkulierten. Die Zirkulation dieser Ströme erfolgte im Gleichstrom bei einer Geschwindigkeit von 60 ml/min durch die Fasern und 80 ml/min durch die Patronen­ hülse. Das Sprengen bzw. Sprinkeln mit Sauerstoff wurde begon­ nen (kontrolliert durch Überwachung der Farbe mit dem Auge) und die Fluoreszenzlampe 110 eingeschaltet.

Die Analysen auf Acetaldehyd und Äthanol wurden auf einem Gaschromatographen durchgeführt, der auf bekannte Standardkonzentrationen dieser Verbindungen geeicht war, unter Verwendung von Aceton als internem Standard. Eine 182,4×0,32 cm Glassäule mit einer Tenax G.C.- Packung wurde verwendet, die einen Trägergasfluß von 10 ml/min aufwies. Aus der Scheidewandflasche wurden periodisch Proben (2 µl) entnommen und in die Säule eingespritzt. Die Ofentempe­ ratur lag bei 110°C. Der Gaschromatograph wurde so programmiert, daß die Ergebnisse in mg/l angegeben wurden.

Die Durchschnittsgeschwindigkeit der Acetaldehyderzeugung lag bei 488 ml/l/Stunde während 8½ Stunden, wobei die Reaktion nach diesem Zeitpunkt deutlich langsamer ablief. Die tatsäch­ liche in dem Reaktionsgefäß erzeugte Nettomenge an Acetaldehyd betrug 800 mg, was etwa einer zwölffachen Zunahme über die in der Ausgangsessenz vorliegenden Menge (62 mg) entsprach. Das Äthanol nahm um einen gleichen Betrag ab, entsprechend einer Nettooxidation von 18%. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn anstelle von Essenz wäßriges Äthanol verwendet wurde.

Bei dem Verfahren dieses Beispiels kann die Gesamtreaktions­ abfolge wie folgt dargestellt werden:

Beispiel II Halbkontinuierliches Reaktorsystem

Ein Laborreaktorsystem gemäß dem schematischen Diagramm von Fig. 1 wurde zur Behandlung von wäßrigem Äthanol (30 g/l) in einer Reaktionsmischung verwendet, die in jeder Hinsicht der­ jenigen von Beispiel I entsprach, mit der Ausnahme, daß THAM- HCl anstelle von THAM-Glycin und kein Acetonstandard verwendet wurden. Der Reaktor wurde wie in Beispiel I beladen, und es wurde mit der Zirkulation durch die Amicon H1P10-Einheit, dem Sprengen und der Belichtung begonnen. Abgewogene Mischun­ gen von NAD+, FMN und ZnCl₂ wurden bei 4°C aufbewahrt und nach Bedarf mit 100 ml Puffer/Äthanol-Lösung gemischt. Einmal pro Stunde wurden 50 ml Produkt durch die automatische Titrations­ zelle entnommen, wo der pH-Wert mit 2 N HCl auf 6,5 eingestellt wurde, und dann in ein mit einem Stopfen verschlossenes, auf einer Temperatur von 1°C gehaltenes Aufnahmegefäß gegeben. Ein entsprechendes Volumen frischer Reaktionsmischung wurde dann in das Sprenggefäß gegeben.

Die gaschromatographische Analyse wurde wie in Beispiel I durch­ geführt, mit der Ausnahme, daß die aus den Zirkulationsströmen entnommenen Proben direkt injiziert wurden und der Acetaldehyd­ gehalt durch Multiplizieren der groben Signalfläche mit dem Ansprechfaktor bestimmt wurde. Die Proben des aus der pH-Zelle ab­ fließenden Produktes wurden bestimmt, indem man 0,5 ml Aceton als interner Standard (1990 ppm) in einen 5-ml-Maßkolben gab und mit Probe auffüllte. Der Gaschromatograph wurde so programmiert, daß Acetaldehyd und Äthanol wie im Beispiel I in mg/l ange­ geben wurden, unter Verwendung eines Korrekturfaktors für die Verdünnung durch internen Standard und Säure.

Am Ende des Reaktorlaufes wurde der gesamte aus den Fasern ab­ fließende Strom über die pH-Zelle in den Aufnahmekolben ge­ pumpt und das Volumen gemessen. Das Volumen des Enzymstromes wurde gemessen, und der Acetaldehydgehalt dieses Materials zuzüglich des abfließenden Mischproduktes wurde mit Hilfe der oben beschriebenen internen Standardmethode bestimmt, um die insgesamt hergestellte Menge an Acetaldehyd zu berechnen.

Die gesamte Acetaldehydanreicherung nach 9 Stunden betrug 1,3 g. Die Anreicherungsgeschwindigkeit blieb während der gesamten Zeitspanne konstant, was anzeigt, daß die Enzym­ aktivität nicht nachgelassen hat. Ein gleichbleibender Zustand wurde während der neun Stunden angenähert, jedoch nicht er­ reicht, da die Bildungsgeschwindigkeit des Acetaldehyds die Verdünnungsgeschwindigkeit durch neues Substrat übertraf. Die Konzentration an Acetaldehyd in dem Enzym-Pool erreicht nähe­ rungsweise nach 9 Stunden 2,5 g/l. Die Konzentration im ab­ fließenden Produkt hinkte etwa 4 Stunden hinter derjenigen des Enzym-Pools hinterher und begann sich dann letzterer Konzen­ tration anzugleichen, wobei der gleichbleibende Zustand ange­ nähert wurde.

Beispiel III

Das ansatzweise Reaktorsystem von Beispiel I wurde, wie in Fig. 3 dargestellt, modifiziert, indem eine zweite Hohlfaser­ vorrichtung 200, ein Bioflow 20-Bechher, zwischen die Rückführung von dem Sprenggefäß 101 und die Ansaugseite der Pumpe, die zu dem Haupthohlfaserbündel 105 führt, hinzugefügt wurde. Die Bioflow 20-Fasern haben ein Grenzmolekulargewicht von 200 und gestatten deshalb nur den Durchtritt von Substrat, Produkt und Puffermolekülen, während sie gegenüber NAD+ und FMN als Barriere bzw. Sperre wirken. Der Reaktor wurde mit Enzymen und Reaktorflüssigkeit beladen (die Äthanol anstelle von Essenz enthielt). Eine Lösung (500 ml) von Äthanol der gleichen Konzentration (30 g/l) und 5×10^-4 M ZnCl₂ in 0,2 M THAM-HCl (pH-Wert 8,5) wurde durch die Hülle des Biofaser-Bechers unter kontinuierlichem magne­ tischen Rühren des Becherinhalts zirkuliert.

Nach 30 Stunden wurde der Reaktor abgestellt, und der Inhalt des Biofaserpermeat-Reservoirs durch Gasflüssigkeitschromato­ graphie analysiert. Ein aliquoter Teil von 300 ml des Permeats wurde in einen 1-Liter-Siedekolben überführt und im Vakuum bei 10 mm Hg und bei einer Temperatur von 4°C destilliert, wobei in einer Falle mit flüssigem Stickstoff 133 ml Destil­ lat aufgefangen wurden. Der Inhalt der Kühlfalle und derjenige des Siedekolbens wurden wie oben analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:

Nach der Ansäuerung der Topfflüssigkeit mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 6,5 erfolgte eine quantitative Destillation des restlichen Acetaldehyds.

Beispiel IV

Eine 100-ml-Reaktionsmischung, die 2 g NAD+, 0,2 M THAM/Glycin- Puffer (endgültiger pH-Wert 8,5), 4 g FMN, 10 ml Orangen- Essenz (endgültige Acetaldehyd-Konzentration von 64 ml/g; Äthanol 3600 mg/l) und 10 mg ADH enthielt, wurde hergestellt und eine Stunde bei Zimmertemperatur in einem verschlossenen 250-ml-Siedekolben inkubiert.

Der Kolben wurde in einen Rotationsverdampfer gegeben und die Hälfte des Inhalts bei einem Druck von 13 mbar und einer Temperatur von 6 bis 8°C destilliert, wobei das Destillat in einer Falle mit flüssigem Stickstoff gesammelt wurde. Der Kolben wurde entfernt, 50 ml Wasser hinzugefügt und der Inhalt wie oben bis zur Trockene nochmals destilliert.

Der Rückstand des Kolbens wurde in 50 ml Wasser aufgelöst und der pH-Wert mit 1 N HCl auf 6,0 eingestellt. Der Inhalt wurde wie oben zur Trockene destilliert und das Destillat in einer zweiten Falle mit flüssigem Stickstoff gesammelt.

Das Äthanol und der Acetaldehyd wurden in dem Material vor der Destillation, in dem kombinierten pH-Wert 8,5-Destillat und in dem pH-Wert 6,0-Destillat durch Gasflüssigchromatographie be­ stimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusam­ mengestellt:

Bei einem pH-Wert von 8,5 waren nach der Vakuumdestillation der ersten 50 ml weniger als 2% des gesamten Acetaldehyds im Destillat vorhanden. Die Zugabe von Wasser und Destillation zur Trockene, wobei die Topftemperatur 15°C erreichte, führte zu einer vollständigeren Gewinnung des Acetaldehyds (44%). Nach Erniedrigung des pH-Wertes auf 6,0 destillierte der Rest augenblicklich über. Nach der Destillation wurde eine gering­ fügig höhere Ausbeute an Acetaldehyd im Vergleich zu derjenigen der Vordestillationsmischung erreicht, vermutlich wegen der anhaltenden Enzymaktivität während der anfänglichen Destilla­ tionsstufe. Im Gegensatz hierzu destillierten anfänglich 90% des Äthanols bei einem pH-Wert von 8,5.

Eine zweite 150-ml-Reaktionsmischung wurde wie oben hergestellt und eine Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert. Durch Zugabe von 1 g Bromelain wurde ADH zerstört und der pH-Wert der Mi­ schung wurde mit 1 N HCl auf 6,0 eingestellt. Die angesäuerte Mischung wurde wie oben destilliert und in einer Falle mit flüssigem Stickstoff wurden 103 ml Destillat gesammelt. Die Gasflüssigkeitschromatographie-Analyse der Reaktionsmischung vor der Ansäuerung und diejenige des Destillats ergaben, daß von ursprünglich insgesamt 200 mg anwesendem Acetaldehyd 194 mg (97%) in den ersten 100 ml aus der angesäuerten Reaktions­ mischung überdestillierten. Das Äthanol destillierte ebenfalls quantitativ über.

Beispiel V

Proben von 0,1 M THAM (pH-Wert 8,7) und etwa 2100 mg/l Acet­ aldehyd in 0,1 M Ammoniumbicarbonat (pH-Wert 8,7) wurden in einem Spektrofotometer für UV- und sichtbares Licht von 190 bis 850 nm unter Verwendung von Wasser bzw. 0,1 M Ammonium­ bicarbonatlösung (pH-Wert 8,7) als Vergleichsproben vermessen.

THAM zeigt eine UV-Absorptionsbande mit einem Maximum bei 200 nm, und es ist oberhalb 240 nm transparent. Acetaldehyd zeigt eine schwache Carbonylabsorptionsbande mit einem Peak bei 280 nm in Wasser, deren Intensität in Abhängigkeit von dem Hydratationsgrad variiert.

Eine dritte Probe, die 2100 mg/l Acetaldehyd in 0,1 THAM (pH-Wert 8,7) enthielt, wurde unmittelbar nach dem Mischen vermessen. Die Acetaldehydcarbonyl-Absorption bei 280 nm war in dem Augenblick, in dem die Mischung vermessen wurde, voll­ ständig verschwunden. Die Ansäuerung mit 3,5 M HCl auf einen pH-Wert von 6,5 führte zu dem augenblicklichen Wiederauftauchen der Acetaldehydbande. Die gaschromatographische Analyse zeigte sowohl vor als auch nach der Ansäuerung die Anwesenheit von 2144 mg/l Acetaldehyd.

Eine vierte Probe, die 11 g/l (0,25 M) Acetaldehyd in 0,1 M THAM (pH-Wert 8,7) enthielt, wurde wie oben augenblicklich vermessen und dann in Intervallen von 10 Minuten. Die anfängliche Absorp­ tion bei 280 nm betrug 1,08 und nahm nach 70 Minuten, als das THAM durch Acetaldehyd abgesättigt war, auf 0,89 ab. Auf der Grundlage eines Extinktionskoeffizienten von 8,62 für Acet­ aldehyd betrug das Sättigungsverhältnis von Acetaldehyd : THAM 1,5 : 1. In beiden Proben wurden keine anderen Änderungen der UV-Absorptionskurven beobachtet.

Eine fünfte Probe wurde hergestellt, die 2000 mg/l Acetaldehyd und 0,1 M Äthanolamin (pH-Wert 9) enthielt, und ein aliquoter Teil wurde unmittelbar anschließend von 190 bis 390 nm und dann in Intervallen von 5 Minuten vermessen. Die Absorptionsbande bei 280 nm nahm ab und wurde schnell von einer gleichzeitig wachsenden intensiven Bande bei 227 nm, die charkateristisch für eine Schiff′sche Base ist, verdeckt. Nach dem Stehen über Nacht zeigte die Mischung, die nach einer Stunde klar war, eine leuchtende Korallenfarbe und eine neue Absorptionsbande bei 515 nm. Dieses Absorptionsmaximum bei 515 nm ist charakteristisch für Diazoverbindungen, von denen bekannt ist, daß sie sich durch Polymerisation von Schiff′schen Basen bilden. Sowohl vor als auch nach der Ansäuerung konnten durch Gasflüssigkeits­ chromatographie nur 20% des anfänglichen Acetaldehyd-Gehalts in dieser Mischung gefunden werden. Im Gegensatz hierzu begann die 11 g/1-0,1 M THAM-Probe erst nach mehrwöchigem Stehen bei Zimmertemperatur eine schwache Absorptionschulter bei 227 nm zu zeigen, die die Bildung einer Schiff′schen Base anzeigt.

Beispiel VI

Es wurde eine Lösung (100 ml) von 2 g/l Acetaldehyd in 0,1 M THAM (pH-Wert 8,5) hergestellt und in ein automatisches Titri­ metergefäß gegeben, das mit einem magnetischen Rührstab aus­ gerüstet war. Der Inhalt des Gefäßes wurde kontinuierlich durch eine Durchflußzelle in einem UV-Spektrofotometer zir­ kuliert. Die Vergleichszelle enthielt 0,1 M THAM (pH-Wert 8,5).

Es wurde zunächst eine erste Vermessung von 189,9 nm bis 390 nm durchgeführt und dann wurde die pH-Werteinstellung des Titri­ meters in Intervallen von 0,1 bis 0,4 pH-Wert-Einheiten ver­ ringert, wobei man nach jeder pH-Werteinstellung 2 Minuten zum Mischen mit dem 2 N HCl-Titranten verstreichen ließ, bevor erneut vermessen wurde. Das Volumen an zugefügter Säure wurde jedesmal zusammen mit der Absorption bei 278 nm aufgezeichnet. Die letzteren Werte wurden hinsichtlich der Verdünnung durch die Säure korrigiert. Der endgültige pH-Wert der Lösung betrug 3,2.

Eine "sigmoide" Dissoziationskurve wurde für THAM-Acetaldehyd erhalten, wobei bei einem pH-Wert von 6,5 ein Wendepunkt auf­ trat (pK_D) und zwischen einem pH-Wert von 3,3 und 5 eine 100%ige Dissoziation erreicht bzw. angenähert wurde. Während der Komplex bei einem pH-Wert von 6,5 nur zu 50% dissoziiert ist, ist eine quantitative Vakuumdestillation des Acetaldehyds bei diesem pH-Wert möglich, was dafür spricht, daß die Anzie­ hungskräfte in dem Komplex sehr schwach sind.

Beispiel VII

Es wurde eine Kontrollprobe von 2 g Acetaldehyd in 1 l Wasser hergestellt und wie oben beschrieben in einem UV-Spektrofoto­ meter vermessen. Die Probe wurde bei 100°C destilliert, wobei die ersten 90 ml Kondensat in einem 100-ml-Meßzylinder aufge­ fangen wurden, der anfänglich 8 ml Wasser in einem Eisbad enthielt. Ein Teil des Rohres der Kondensationsvorrichtungs­ spitze erstreckte sich bis unterhalb der Oberfläche des an­ fänglich anwesenden Wasservolumens.

Es wurde eine zweite Lösung (1 Liter) hergestellt, die 2 g Acetaldehyd und 0,1 M THAM (pH-Wert 8,7) enthielt, und es wurde ein Spektrum aufgenommen, um sicherzustellen, daß die Absorptionsbande für den freien Acetaldehyd nicht vorhanden war. Die Probe wurde wie oben beschrieben destilliert. Zu beiden Destillaten wurde Wasser hinzugefügt, um ein Volumen von 100 ml zu erhalten. Beide Destillatproben wurden dann wie oben beschrieben gaschromatographisch auf Acetaldehyd analysiert, und man erhielt einen Wert von 1900 mg/l an Acetaldehyd bei der Kontrollprobe und 2000 mg/l in der anderen Probe. Demzufolge ist die quantitative Gewinnung des Acetaldehyds aus dem alkali­ schen THAM-Komplex durch herkömmliche Destillation möglich.

Beispiel VIII

Es wurde eine Lösung hergestellt, die 2 g/l Acetaldehyd in 0,1 g THAM (pH-Wert 8,5) enthielt. Eine zweite Vergleichslösung wurde hergestellt, die nur 0,1 M THAM (pH-Wert 8,5) enthielt. Nach der Verdünnung beider Proben auf 1 : 50 wurde die Acetaldehyd/ alkalisches THAM-Probe mit Hilfe eines abgewandelten Verfahrens von Dickenson und Jacobsen (Chem. Commun. 1970, 1719) im Ver­ gleich zu der Vergleichsprobe untersucht. Bei diesem Verfahren wurden 37 mg/l Acetaldehyd in der verdünnten Probe gefunden (oder 1850 mg/l vor der Verdünnung). Dieses Untersuchungsver­ fahren ist für die Aldehydgruppe hochspezifisch und wird in einem alkalischen Medium durchgeführt in welchem der THAM/ Acetaldehyd-Komplex höchststabil ist. Die Tatsache, daß der Acetaldehyd in nahezu quantitativer Menge gefunden wurde, ist ein starker Hinweis dafür, daß zwischen dem THAM und dem Acetaldehyd keine Bindung ausgebildet wird.

Aus der obigen Beschreibung ergibt sich, daß die vorliegende Erfindung neue Maßnahmen und Mittel zur Verfügung stellt für die enzymkatalysierte Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd. So werden bei der Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd durch Umsetzung des Äthanols in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase und ihres Cofaktors Nicotinamid-adenin-dinucleotid Maßnahmen und Mittel zur Verfügung gestellt, um eine zweite Zone, die Äthanol oder ein Äthanol enthaltendes Substrat enthält, mit einer ersten Zone in Berührung zu bringen, die Alkoholdehydro­ genase und Nicotinamid-adenin-dinucleotid enthält, wobei die Zonen durch eine semi-permeable Membrane getrennt sind, die geeignet ist, die Alkoholdehydrogenase in der ersten Zone zurückzuhalten, während sie eine freie Wanderung des Äthanols, des Cofaktors und der bei der Umsetzung erzeugten Produkte zwischen der ersten und der zweiten Zone gestattet. In weiteren Ausführungsformen werden Mittel und Maßnahmen zur Behandlung lediglich der zweiten Zone zur Verfügung gestellt, um darin erhaltene Materialien zu regenerieren und/oder zu gewinnen, einschließlich Belichtungs- und Oxidationsmittel und -maß­ nahmen.

Im Hinblick auf die bevorzugte Anwendung der vorliegenden Erfindung, das heißt die Behandlung von Orangen-Essenz auf natürlichem Wege, um eine in situ-Erzeugung von darin enthaltenem Acet­ aldehyd aus Äthanol herbeizuführen, ergibt das enzymkatalysierte Reaktionsschema ein Flüchtigkeitsprofil des Essenzproduktes, das mit Ausnahme von Äthanol/Acetaldehyd im Vergleich zu dem Ausgangs- bzw. Quellenmaterial im wesentlichen unverändert ge­ blieben ist. Diejenigen wenigen Einzelkomponenten der Essenz, bei denen Änderungen beobachtet werden, bewegen sich aber immer noch innerhalb der natürlich vorkommenden Bereiche für diese Bestandteile. In bestimmten frühen Experimenten wurde eine verringerte Konzentration an Äthylbutyrat in der Essenz als Folge des erfindungsgemäßen Verfahrens beobachtet. Es wurde später jedoch festgestellt, daß diese unerwünschte Abnahme durch die Verwendung eines verunreinigten Katalaseenzyms (ent­ haltend Esteraseaktivität) und nicht durch ein inhärentes Merkmal oder eine inhärente Bedingung des Verfahrens per se verursacht wurde.

Claims (18)

1. Verfahren für die enzymkatalysierte Umwandlung von Ätha­ nol zu Acetaldehyd, bei welchem Äthanol in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase und Nicotinamid-adenin-dinucleo­ tid zu Acetaldehyd umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Umsetzung in Gegenwart von Tri-(hydroxymethyl)- methylamin unter solchen Bedingungen durchführt, bei denen der durch die Umsetzung gebildete Acetaldehyd mit dem Tri-(hydroxymethyl)-methylamin einen Anlagerungs­ komplex bildet, wobei die Temperatur im Bereich von etwa 18°C bis etwa 40°C und der pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 9,0 liegen und das Tri-(hydroxymethyl)- methylamin bei der Umsetzung in einer solchen Menge vor­ handen ist, daß sich ein Molverhältnis von etwa 0,5 : 1 bis etwa 5,0 : 1, bezogen auf den bei der Umsetzung gebil­ deten Acetaldehyd, ergibt und daß man den Acetaldehyd aus dem Anlagerungskomplex gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das bei der Umsetzung reduzierte Nicotinamid- adenin-dinucleotid oxidiert, um zusätzliches Nicotin­ amid-adenin-dinucleotid für die Umsetzung mit Äthanol zur Verfügung zu stellen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation die Umsetzung des reduzierten Nicotinamid- adenin-dinucleotids mit einem wasserlöslichen Oxidations­ mittel umfaßt, welches seinerseits bei dieser Umsetzung reduziert wird, wobei das Verfahren zusätzlich den Schritt umfaßt, daß man das reduzierte Oxidationsmittel oxidiert, um zusätzliche Mengen an Oxidationsmittel für die Oxidation des reduzierten Nicotinamid-adenin-di­ nucleotids zur Verfügung zu stellen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das zur Oxidation des reduzierten Nicotinamid-adenin- dinucleotids eingesetzte Oxidationsmittel Flavinmono­ nucleotid umfaßt und die Oxidation in Gegenwart von Licht durchgeführt wird, und die in dem zusätzlichen Schritt erfolgende Oxidation die Umsetzung des reduzierten Flavinmononucleotids mit Sauerstoff umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des reduzierten Flavinmonomucleotids mit Sauerstoff zur Bildung von Wasserstoffperoxid führt und das Wasserstoffperoxid anschließend enzymatisch zu Was­ ser und Sauerstoff umgewandelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Umwandlung des Wasserstoffperoxids die Umsetzung von Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Kata­ lase umfaßt.

8. Verfahren zur enzymkatalysierten Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd in flüssiger Phase nach Anspruch 1, da­ durch gekennzeichnet, daß man

• (a) eine erste Zone schafft, die Äthanol, Alkoholde­ hydrogenase, Nicotinamid-adenin-dinucleotid und Tri- (hydroxymethyl)-methylamin enthält;
• (b) eine zweite Zone schafft, die Äthanol, Nicotinamid- adenin-dinucleotid und Tri-(hydroxymethyl)-methyl­ amin enthält, wobei Alkoholdehydrogenase in dieser zweiten Zone nicht anwesend ist;

und wobei die erste und die zweite Zone durch eine semi- permeable Membrane mit solchen Abmessungen getrennt ist, daß die Alkoholdehydrogenase in der ersten Zone zurück­ gehalten und allen anderen Ausgangsmaterialien und aus diesen erhaltenen Reaktionsprodukten eine freie Wanderung zwischen der ersten und der zweiten Zone gestattet wird;

• (c) die Umsetzung des Äthanols zu Aldehyd in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase, Nicotinamid-adenin-dinucleo­ tid und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin in der ersten Zone durchführt; und
• (d) aus der zweiten Zone den Anlagerungskomplex aus Acetaldehyd und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin ge­ winnt, der sich bei der Umsetzung in der ersten Zone gebildet hat und durch die semi-permeable Membrane in die zweite Zone gewandert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Zone jeweils weiterhin ein Oxi­ dationsmittel zum Oxidieren des reduzierten Nicotinamid- adenin-dinucleotids enthalten, das sich aufgrund der Reaktion des Äthanols gebildet hat, um das Nicotinamid- adenin-dinucleotid für die weitere Unterhaltung der Reak­ tion des Äthanols zu regenerieren.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Oxidationsmittel Flavinmononucleotid umfaßt und daß die Oxidation des reduzierten Nicotinamid-adenin-dinucleo­ tids mit demselben dadurch ausgeführt wird, daß man nur die Bestandteile der zweiten Zone einer Beleuchtung aus­ setzt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestandteile der zweiten Zone solchen Bedingungen unterworfen werden, bei denen das reduzierte Flavinmono­ nucleotid, das sich durch die Oxidation des reduzierten Nicotinamid-adenin-dinucleotids gebildet hat, oxidiert wird, um das Flavinmononucleotid zu regenerieren.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß diese Bedingungen zur Oxidation des reduzierten Flavin­ mononucleotids die Zuführung von Sauerstoff nur zu den Bestandteilen der zweiten Zone umfassen.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasserstoffperoxid, das sich bei der Oxidation des reduzierten Flavinmononucleotids gebildet hat, zu Wasser und Sauerstoff umgewandelt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwandlung des Wasserstoffperoxids die Zersetzung des Wasserstoffperoxids in Gegenwart von Katalase in der zweiten Zone umfaßt.

15. Verfahren zur kontinuierlichen enzymkatalysierten Umwand­ lung von Äthanol zu Acetaldehyd in flüssiger Phase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

• (a) einen ersten, kontinuierlich fließenden, rezirkulie­ renden Strom schafft aus Äthanol, Alkoholdehydrogena­ se, Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Flavinmononucleo­ tid und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin;
• (b) einen zweiten, kontinuierlich fließenden Strom schafft aus Äthanol, Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Flavinmonomucleotid und Tri-(hydroxymethyl)-methyl­ amin, wobei dieser zweite Strom keine Alkoholdehydro­ genase enthält, und wobei der erste und der zweite Strom durch eine semi-permeable Membrane von solchen Abmessungen getrennt sind, daß die Alkoholdehydro­ genase in der ersten Zone zurückgehalten wird, wäh­ rend eine freie Wanderung aller anderen in dem ersten und in dem zweiten Strom enthaltenen Materialien, einschließlich der aus ihnen erhaltenen Reaktions­ produkte, zwischen dem ersten und dem zweiten Strom möglich ist;
• (c) die Ströme kontinuierlich auf solche Weise fließen läßt, daß alle in ihnen enthaltenen Materialien auf dem Wege der Durchdringung der semi-permeablen Membrane unter solchen Bedingungen miteinander in Berührung gebracht werden, bei denen Äthanol zu Acetaldehyd umgewandelt wird und der Acetaldehyd mit dem Tri-(hydroxymethyl)-methylamin einen Anlagerungs­ komplex bildet;
• (d) anschließend den kontinuierlich fließenden zweiten Strom einer Beleuchtung unterwirft, um darin ent­ haltenes reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid in Nicotinamid-adenin-dinucleotid umzuwandeln;
• (e) anschließend Sauerstoff zu dem kontinuierlich fließenden zweiten Strom unter solchen Bedingungen hinzufügt, bei denen bei der Umwandlung in Stufe (d) reduziertes Flavinmononucleotid regeneriert wird;
• (f) anschließend den kontinuierlich fließenden zweiten Strom solchen Bedingungen unterwirft, bei denen Was­ serstoffperoxid, das bei der Regenerierung in Stufe (e) gebildet wird, zu Sauerstoff und Wasser umgewan­ delt wird;
• (g) anschließend den zweiten Strom rezirkuliert, um ihn durch die semi-permeable Membrane hinduch mit dem ersten Strom in Berührung zu bringen, um eine weitere Umsetzung des Äthanols zu Acetaldehyd herbeizuführen, wobei der Anlagerungskomplex aus Acetaldehyd und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin wenigstens periodisch aus dem zweiten Strom entfernt wird;

und die Materialien des ersten und des zweiten Stromes wenigstens periodisch mit den erforderlichen Mengen ergänzt werden, um die gewünschten Umsetzungen herbei­ zuführen und ausreichende Konzentrationsgradienten zu erzeugen, um die Durchdringung der Materialien zu und von den jeweiligen Strömen durch die semi-permeable Membrane hindurch zu verursachen.

16. Verfahren zur Umwandlung von Äthanol in Acetaldehyd nach Anspruch 1 in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase und einem dafür ge­ eigneten Cofaktor, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umwandlung in einer ersten Reaktionszone durchführt, in welcher Äthanol in Kontakt mit der Alkoholdehydro­ genase und ihrem Cofaktor steht, und man eine zweite Zone vorsieht, die von der ersten Reaktionszone durch eine semi-permeable Membrane von solchen Abmessungen ge­ trennt ist, daß die Alkoholdehydrogenase, jedoch nicht ihr Cofaktor, daran gehindert wird, in die zweite Zone zu gelangen, um die bei der Umsetzung erzeugten Produkte aufzunehmen.